KR970007861B1 - 세균성 발현 시스템내에서 항체의 작용성 Fv 단편을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

요약 없음

Description

세균성 발현 시스템내에서 항체의 작용성 Fv단편을 제조하는 방법
본 발명은 유전공학을 이용한 항체의 제조방법, 구체적으로는 세균성 발현시스템내에서 항체의 작용성 Fv단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
효모에 있어서 항체의 발현에 관해서는 문헌[참조 : C.R.Wood, M.A. Boss, J.H. Kenten, J.E. Calvert, N.A. Roberts and J.S. Emtage, Nature 314, 446(1985)]에 기술되어 있으나, 발현된 단백질중 단지 매우 적은 부분만이 작용성인 것으로 입증되었다. 이. 콜라이(E. coli)내에서는 현재까지 단지 변성된 형태의 항체 단백질만을 수득할 수 있었다[참조 : M.A. Boss, J.H. Kenten, C.R. Wood and J.S. Emtage, Nucleic Acids Res. 12, 3791(1984) ; S. Cabilly, A.D. Riggs, H. Pande, J.E. Shively, W.E. Holmes, M. Rey, L.J.Perry, R. Wetzel and H.L. Heyneker, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3273(1984)]. 효모 또는 기타 미생물로부터의 활성 항체 또는 항체 단편의 정제에 관하여는 기술되어 있지 않다. 단백질 폴딩(folding)을 시도해도 현재까지는 매우 적은 퍼센트만이 정확히 폴딩된 재조합 항체 단백질을 생성하고 있다. 또한, 목적하지 않은 비-작용성 단백질로부터 목적하는 작용성 단백질을 분리하기가 어려워, 결합상수의 정확한 측정, 폴딩수율, 스펙트럼 특성 등 및 치료 및 산업상 이용을 어렵게 하였다. 따라서 폴딩조건의 최적화는 극히 어려운데, 이는 특히 재폴딩에 대한 입증된 공정 및 측정방법이 없기 때문이다.
세균성 발현 시스템에서 항체의 작용성 결합 도메인(domain) 또는 완전한 작용성 항체의 발현에 관하여는 현재까지 밝혀져 있지 않고, 밝혀질 전망도 거의 없는 것으로 평가되어 왔다[참조 : S.L. Morrison, Science 229, 1202(1985), M.A. Boss and C.R. Wood, Immunol. Today 6, 12(1985)].
그러나 시스템은 유전공학 공정이 특히 이.콜라이에 대하여 완전히 수행되며, 급속한 성장에 따른 대량생산이 용이하여 경제적으로 상당히 중요하기 때문에 매우 바람직할 것이다.
따라서 본 발명은 세균, 바람직하게는 그람-음성 세균, 특히 이.콜라이내에서의 작용성 항체, 이의 작용성 단편, 또는 항체 도메인과 기타 단백질로 이루어진 융합 단백질의 제조에 관한 것이다. 본 발명의 공정은, 항체 분자 또는 이의 단편의 개개의 쇄에 대한 유전자를 각각, 세포질 막을 통해 상기 쇄의 수송을 유도한 뒤 제거될 수 있는 시그날 서열과 커플링시키고, 이러한 유전자 구조물을 발현시킨 후 페리플라스믹(periplasmic) 공간 또는 매질로부터 작용성 단백질을 분리시킴을 포함한다.
제공된 개개의 쇄에 대한 유전자와 시그날 서열과의 커플링은 바람직하게는 공동 컨트롤(control) 영역에 의한 동시적 발현을 초래하는 조절가능한 오페론 시스템의 방식으로 발생한다. 이 방식으로, 개개의 단백질 쇄는 대략 화학량론적 비로 함께 발현되며, 페리플라스믹 공간으로 수송되는데, 여기에서 작용성 분자를 형성하는 결합이 일어난다. 단백질은 예를 들어 유럽 특허 명세서 제0,006,694호에 기술된 바와 같이 본 분야에 공지된 방법에 의해 세포질로부터 수송된다.
예를 들어 lac, tac, trp 또는 합성 서열과 같은 모든 적합한 조절가능한 유전자 조절 영역이 컨트롤 영역으로서 적합하다. 확실히 턴 오프(turn off)될 수 있는 조절 영역이 특히 바람직하다.
단백질은 수집된 세포상에 가벼운 삼투성 쇼크를 가한 뒤 이에 따라 수득된 액체상을 한외여과에 의해 농축시키거나, 또는 예를 들어 암모늄 설페이트와 같은 염으로 침전시킴으로써 페리플라스믹 공간으로부터 분리시키는 것이 바람직하다.
"가벼운" 삼투성 쇼크로 세포질막은 완전한 상태로 남아있는 상태에서 페리플라즘을 용출시킨다.
단백질 농축물은 편리하게는 투석 후에, 유리하게는, 적합한 항원 또는 합텐이 부하된 친화성 컬럼의 형태로 흡착체에 적용한다. 이어서 항체 또는 작용성 항체 단편은, 유리하게는 항원 또는 합텐과 함께 적합한 용출에 의해 수득된다.
진핵 세포에서, 항체는 소포체의 루멘(lumen)에서, 대개는 디설파이드 이소머라제, 피롤린 시스-트랜스 이소머라제 및 혹은 기타 효소 또는 단백질의 협력으로 형성된다. 세균 세포도 또한 대략 동일한 화학량론적 양으로 두개의 쇄를 제조하고, 그 두개의 전구체 단백질을 페리플라스믹 공간 또는 그를 둘러싼 매질로 수송하고, 정확히 시그날 서열을 제거하고, 구형 및 가용성 도메인을 정확히 폴딩시키고, 분자내 디설파이드 결합을 형성하고, 두개의 쇄를 합하여 헤테로다이머를 형성할 수 있음은, 세균 세포가 이러한 특성 및 동일한 작용을 나타내는 효소를 가지고 있음은 불가능하다고 추측되었으므로, 매우 놀라운 것이다. 따라서, 놀랍게도 그람-음성 세균인 경우에 세균의 페리플라즘은 이 점에 있어서 진핵성 소포체의 루멘과 작용상 동등하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 방법은 여러가지 장점을 갖는다. 이미 언급한 바와 같은 용이하고도 저렴한 생산가로 대량으로 세균의 발효가 가능한은 차치하고라도, 작용성 단백질의 직접적인 형성이 있게 되고, 따라서 이는 융합 단백질의 절단이 이후의 목적 단백질 또는 단백질 단편의 분리, 그의 산화 또는 시험관내 재폴딩과 함께 회피되어짐을 의미한다.
본 발명에 따른 공정에서는 세포내 프로테아제에 의한 문제점을 발견되지 않았다. 결국, 이러한 세포내 프로테아제로 인해 단백질은 세균내에서 융합 단백질의 형태로, 특히 불용성 봉입체로서 정상적으로 발현되는 것으로 공지되어 있으나, 이는 언급된 정교한 추가의 프로세싱 단계와 관련된다. 반대로, 분리 및 균질성에 이르는 정제는 본 발명에 따른 방법으로 신속하고도 간단하다.
따라서, 본 발명은 항체, 이의 작용성 단편 및 아미노산의 삽입, 제거 및/또는 교환에 의해 천연 항체와는 상이한 변형된 항체로의 접근을 용이하게 한다. 따라서, 예를 들어 바람직하지 않은 폴딩을 억제하기 위해 시스테인을 제거하거나 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 이는 쥐과(murine) 항체를 사람의 항체로 전환시키거나 다른 돌연변이를 도입시키는 것과 동일한 방식으로 가능하다. 따라서, 가능한 약리학적 및 산업적 적용 외에도, 항체 구조와 작용 및 효소적 촉매작용의 기초 연구에 대한 접근이 용이하다[참조 : V. Raso and B.D. Stollar, Biochemistry 14, 584(1975) ; V. Raso and B.D. Stollar, Biochemistry 14, 591(1975) ; A. Tramontano, K.D. Janda R.A. Lerner, Science 234, 1566(1985) ; S.J.Pollack, J.W. Jacobs and P.G. Schultz, Science 234, 1570(1986) ; J. Jacobs, P.G. Schultz, R. Sugasawara and M. Powell, J. Am. Chem. Soc. 109, 2174(1987)].
또한 본 발명은 추가로 작용성 항체가 형성되는 세균 세포에 시험 시스템(검정)의 직접적인 적용을 가능하게 하므로, 가능하게 돌연변이된 항체의 신속한 조사를 가능케 한다.
개개의, 또는 약간의 아미노산을 변경시키는 것에 의한 항체 분자내의 언급된 변이 외에, 항체 유전자내에 다른 유전자 영역을 삽입하거나, 비-결정적 유전자영역 부분을 교환하는 것도 또한 가능하다. 이런식으로, 마커(marker) 효소[참조 : M.S.Neuberger, G.T. Williams and R.O. Fox, Nature 312, 604(1984)], 톡신[참조 : G. Moller(ed.) "Antibody carriers of drugs and toxins in tumor therapy", Immunol. Rev. 62, Munksgaard, Copenhagen(1982)] 또는 또다른 계열의 면역글로불린 영역[참조 : M.S. Neuberger, G.T. Williams, E.B. Mitchell, S.S. Jouhal, J.G. Flanagan, and T.H. Rabbitts, Nature 314, 268(1985)] 또는 또다른 종의 면역글로불린 영역[참조 : P.T. Jones, P.H. Dear, J. Foote, M.S. Neuberger, and G.Winter, Nature 321,522(1986)]을 항체 분자에 커플링시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 하기에서 포스포릴콜린-결합 항체 골수종 단백질 McPC603의 가변 도메인[variable domain]을 실시예로 설명한다. 이와 같은 마우스 면역글로불린 A의 3차원 구조는 공지되어 있다[참조 : D.M. Segal, E.A. Padlan, G.H. Cohen, S. Rudikoff, M. Potter and D.R. Davies, Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 4298(1974)]. 가변 경쇄 VL및 중쇄 VH에 대한 합성 유전자를 사용한다. 이러한 합성 유전자는 독일연방공화국 공개 특허공보 제3,715,033호, 유럽공개 특허공보 제0,290,005호 및 오스트레일리아 공개 특허공보 제15631/88호(표 1 및 2)에 제시되어 있다. 이러한 합성 유전자의 특히 유리한 양태는 표에 나타내며, 여기서 완전한 발현 플라스미드의 DNA 서열을 제시하고 두개의 쇄에 대한 유전자를 아미노산을 지정하여 강조한다. 이.콜라이에 의해 드물게 사용되는 코돈은 본 DNA 서열의 작제에서 피한다. 더우기, 독특한 제한 효소 절단 부위를 결합시켜 RNA의 2차 구조를 설명한다.
모델로 사용되는 작용성 항체 단편에서, 각 도메인은 분자내 디설파이드 브릿지(VL에서는 Cys 23으로부터 Cys 94까지의 브릿지 및 VH에서는 Cys 22에서부터 Cys 98까지의 브릿지)를 갖는다.
쇄들간에는 디설파이드 브릿지도 없고 유리된 시스테인도 존재하지 않는다. 사용된 발현 벡터, pASK 22는 다음과 같이 도식화하여 묘사할 수 있다.
Figure kpo00001
여기세어 VL및 VH도메인에 대한 합성 유전자는 한편으로는 외막 단백질 A(ompA)의 세균성 시그날 서열 및 다른 한편으로는 알칼린 포스파타제(phoA)의 세균성 시그날 서열에 대한 유전자 단편과 커플링되어 있다. 두개의 전구체 단백질에 대한 유전자는 lac 프로모터의 합성 오페론-유사 구조 하부에 위치하여, 이들 두 유전자가 동시적 유도, 공동발현 및 공동분비를 진행함이 확실하다.
유전자 발현의 유도 후, 세포를 수집하여 가벼운 삼투성 쇼크에 노출시킨다.
이렇게 수득한, 페리플라스믹 단백질을 함유하는 액체상을 한외여과시켜 농축시키고, 투석시키며, 친화 리간드로서 포스포릴콜린 유도체[참조 : B. Chesebro and H. Metzger, Biochemistry 11, 766(1972)]를 함유한 친화성 컬럼에 직접 적용시킨다. 포스포릴콜린으로 용출시키면 겔 전기영동적으로 균질한 FV단편이 생성된다. SDS 폴리아크릴아미드 겔로부터, 정제된 FV단편의 두개의 쇄가 1 : 1의 몰비로 존재하며, 성숙 단백질의 예상 분자량이 VH13600 D, VL12400 D로 존재함을 추론할 수 있다. 두개의 시그날 서열의 정확한 제거를 입증하기 위해, 두개 쇄 모두의 6개 N-말단 아미노산을 서열분석 한다. 두개 쇄는 모두 성숙 단백질에 대한 정확한 N-말단을 갖는다고 판명되었다. 따라서, 두개의 이형 프리프로테인(preprotein)은 세균성 시그날 펩티다제에 의해 정확히 절단되며, 부정확한 프로세싱 또는 N-말단의 분해 반응이 발생한다는 인지할만한 증거도 없다.
McPC603의 재조합 FV단편의 친화 상수는 평형 투석으로 측정된다. 이에 사용되는 조건은 마우스 복수(ascite)로부터 분리된 천연 항체 McPC603의 친화 상수의 측정에 적용된 것과 동일하다. FV단편에 대해 측정된 1.21±0.06×105M-1의 값은 실험의 정밀성 범위내에서 천연 항체에 대해 보고된 1.6±0.4×105M-1의 값과 동일하다. 스캐차드(Scatchard) 결합 플롯[참조 : Ann, N.Y. Acad. Sci. 51, 660(1949)]은 선형이며, 약 1몰의 합텐이 FV단편 몰당 결합됨을 외삽하여 알 수 있다. 이는 FV단편당 단지 한 유형의 결합부위가 있으며, 분리된 단백질중에는 불활성 성분이 존재하지 않다는 것을 증명하는 것이다.
따라서, 놀랍게도, 항체 McPC603의 FV단편을 이.콜라이내에서 완전하게 작용성이며 안정한 단백질로서 제조할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 진핵세포의 소포체의 루멘내로의 수송과 세균 세포의 페리플라즘으로서의 수송과 작용점 동일성을 입증해준다.
이 동일성은, 현재까지 가장 잘 특성화되고 페리플라즘내에서의 가용성 헤테로다이머 단백질로서 정의될 수 있는 세균 단백질(이. 콜라이 페니실린아실라제)이 페리플라즘내에서 단일 쇄 전구체로부터 단백질 분해적 프로세싱에 의해 수득되기 때문에[참조 : G. Schumacher, D. Sizmann, H. Hang, P. Buckel and A. Bock, Nucleic Acids Res. 14, 5713(1986)], 기술된 바 없으며 전혀 예상되지도 않았다. 추가로, 현재까지의 지식으로는, 세균은 진핵세포에 있어서 폴딩에 관여하는 효소나 단백질을 갖고 있지 않는 것으로 이미 지적되었다.
또한, McPC603의 FV단편이 포스포릴 콜린에 대하여 본래의 항체 McPC 603 자체가 가진 바와 거의 동일한 친화 상수를 갖는다는 것은 놀라운 일이다. 이 발견은 FV단편의 작용성이 문헌[참조 : J. Sen and S. Beychok, Proteins 1,256(1986)]에 역행하는 것이므로 전혀 기대하지 않던 것이다. 이로써 작용성은 항상부 도메인의 변형 또는 심지어 완전한 결실시에도 유지될 수 있음이 밝혀졌다.
FV단편의 제조에 지금까지 사용되어온 유일한 방법, 즉 항체의 단백질 분해에 의한 것과는 달리, 본 발명의 방법에서는 비-작용성, 부정확한 폴딩, 부정확한 재결합 또는 화학적으로 변형된 단백질을 사용하는 경우의 문제가 발생치 않는다.
더우기, 항원 또는 합텐-부하된 흡착체를 사용하는 바람직한 분리방법은 또한, 공지의 방법에 의해 수득된 FV단편을 정제하는데 적합한데, 이는 이러한 불순물들이 결합되지도 용출되지도 않을 것이기 때문이다.
실시예 1
플라스미드 pASK 22의 제조
발현 플라스미드 pASK 22는 널리 공지된 방법[참조 : T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982]을 사용하는 몇가지 단계에서 pUC 12의 대형 EcoR I-Hind III 단편[참조 : C. Yanisch-Perron, J. Vieira, and J. Messing, Gene 33, 103(1985)]; pIN III-OmpAl 벡터의 단편[참조 : Y. Masui, J. Coleman and M. Inouye in "Experimental manipulation of gene expression", M. Inouye, ed., Academic Press 1983] 및 pHI 61[참조 : H. Inouye, W. Barnes and J. Beckwith, J. Bacteriol 149, 434(1982)] 및 다양한 합성 DNA 단편들로부터 작제한다. 수득된 벡터 pASK 22의 완전한 DNA 서열이 표에 나타나 있다.
연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 세포를 형질전환시켜, 이를 암피실린 내성에 대해 선별한다. 목적하는 유전자 구조를 갖는 플라스미드를 제한분석 및 결정적 접합부위의 서열을 분석하여 성상 확인한다.
실시예 2
FV단편의 제조
pASK 22에 의해 형질전환된 이.콜라이 균주 W3110 배양물을 OD550이 0.5에 달할때까지 100mg/I 암피실린을 함유한 LB 배지에서 배양시킨다. 최종 농도가 1mM이 될 때까지 IPTG를 가하여 발현을 유도한다. 45분 후, 세포를 4000×g(4℃에서 10분)에서 원심분리하여 수거 한다. 세포 분획하는 본래의 배양물 10ml/ℓ중 TES 완충액(0.2M 트리스. HCl, pH 8.0 ; 0.5mM EDTA ; 0.5M 슈크로즈) 중에서 세포 펠렛을 재현탁시켜 수행한다. 물로 1 : 4 희석되고 2mM 포스포릴콜린을 함유하는 TES 완충액의 본래 배양물 15ml/ℓ를 첨가하여 세포에 가벼운 삼투성 쇼크를 가한다.
현탁액을 얼음상에서 30분 동안 배양한 후 10분간 5000xg에서 원심분리시키고, 상등액을 15분간 48000xg에서 다시 원심분리시킨다. 모든 가용성 페리플라스믹 단백질을 함유하는 수득된 상등액을 한외여과((R)AMICON YM5 막)하여 원 배양물 약 2.5ml/l의 용적으로 농축시킨 다음, BBS 완충액(0.2M 보레이트/NaOH, pH 8.0 ; 0.16M NaCl)에 대해 투석시킨다. 이 농축 용액을, 포스포릴콜린 유도체가 부하된 친화성 컬럼에 적용시키고[B. Chesebro and H. Metzger, loc. cit.](베드 용량 ml당 1 내지 4ml의 용액), 이를 BBS 완충액으로 세척한 후, 순수한 FV단편을 BBS 완충액중의 1mM 포스포릴콜린 용액으로 용출시킨다.
실시예 3
평형 투석
막의 각 면상에 100㎕ 용적의 투석 챔버내에서 BBS 완충액중의 정제된 FV단편 50㎕를 한면에 놓아 두고, BBS 완충액중의 포스포릴(메틸-14C) 콜린(50mCi/밀리몰) 50㎕ 용액을 다른 면에 놓아둔다. OD205값 6.85에서 측정된 FV단편의 농도는 0.22mg/ml이다[참조 : R.K. Scopes, Protein Purification-Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982, p. 241]. 실온에서 22시간 후, 평형에 도달되며, 각 용액의 샘플 20㎕를 신틸레이션 계수기[Beckman LS 1801]에서 측정하여 데이타를 스캐차드 플롯화(상기 참조)한다. 수득한 직선의 구배로부터 유도된 친화 상수 Ka는 1.21±0.06×105M-1이다.
[표] ompA-VH및 phoA-VL의 아미노산 서열을 갖는 pASK 22의 DNA 서열
Figure kpo00002
Figure kpo00003
Figure kpo00004
Figure kpo00005
Figure kpo00006

Claims (6)

  1. 항체의 작용성 FV단편의 두 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 각각에 대한 유전자를, 세균 세포의 세포질 막을 통해 상기 쇄를 수송시킨 후 제거되는 시그날 서열에 각각 커플링시키고, 세균내에서 유전자 구조물을 발현시킨 다음, 페리폴라스믹(periplasmic) 공간 또는 매질로부터 작용성 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 상기 항체의 작용성 FV단편을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세균이 그람-음성 세균인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 세균이 이.콜라이(E. coli)인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 두개의 프리펩타이드(prepeptide)에 대한 유전자를 조절가능한 오페론 시스템의 형태로 커플링시키는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 페리플라스믹 공간으로부터 작용성 단백질을 분리시키기 위하여, 분리한 세균을 삼투성 쇼크에 노출시켜 세포질은 완전한 상태로 유지된 상태에서 페리플라즘을 용출시키고, 이렇게 하여 수득된 액체상을 원심분리하여 증강시킨 다음, 이 농축물로부터 목적 단백질을 수득하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 작용성 단백질을 함유하는 용액을 적합한 항원 또는 합텐이 부하된 흡착제에 적용시키고, 상기 항원 또는 합텐이 함유된 용액으로 용출시켜 목적하는 단백질을 분리시키는 방법.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
GB9206318D0 (en) * 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6916605B1 (en) 1990-07-10 2005-07-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US7063943B1 (en) 1990-07-10 2006-06-20 Cambridge Antibody Technology Methods for producing members of specific binding pairs
SE9101433D0 (sv) * 1991-05-13 1991-05-13 Marianne Hansson Recombinant dna sequence and its use
US5962255A (en) * 1992-03-24 1999-10-05 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing recombinant vectors
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US5858657A (en) * 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Technology Ltd. Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0861893A3 (en) * 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
US6146850A (en) * 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5837491A (en) * 1991-11-04 1998-11-17 Xoma Corporation Polynucleotides encoding gelonin sequences
US5621083A (en) * 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JP2000505641A (ja) * 1991-12-18 2000-05-16 ザ ユニバーシティー オブ カルガリー 生物学的に活性なｆｖフラグメント生産用発現分泌ベクター
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
GB9705376D0 (en) * 1997-03-14 1997-04-30 Harris William J Antibody fragment formulations and assay formats for detecting the presence an d concentration of analytes
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
US20030077739A1 (en) * 2001-08-27 2003-04-24 Genentech, Inc. System for antibody expression and assembly
EP1908769A1 (en) * 2001-08-27 2008-04-09 Genentech, Inc. A system for antibody expression and assembly
PL2102354T3 (pl) * 2007-01-12 2018-01-31 Dow Global Technologies Llc Urządzenie i sposoby osmotycznego szokowania komórek
WO2015087271A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Koninklijke Philips N.V. Method to enable standard alternating current (ac)/direct current (dc) power adapters to operate in high magnetic fields

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
EP0196864A3 (en) * 1985-03-25 1988-03-23 Cetus Corporation Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences
JPS62201581A (ja) * 1986-02-28 1987-09-05 Rikagaku Kenkyusho 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質の製造方法
EP0234592A1 (en) * 1986-02-28 1987-09-02 Teijin Limited Plasmid containing DNA fragment coding for human immunoglobulin G Fc region protein and use thereof for production of said protein
WO1989000605A1 (en) * 1987-07-16 1989-01-26 Codon Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of obtaining the same
CA1341235C (en) * 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use

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Publication number Publication date
KR890010203A (ko) 1989-08-07
AU2761788A (en) 1989-07-06
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ATE102651T1 (de) 1994-03-15

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