JP2000505641A

JP2000505641A - 生物学的に活性なｆｖフラグメント生産用発現分泌ベクター

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Publication number: JP2000505641A
Application number: JP05510854A
Authority: JP
Inventors: シャイチュンング; ジェイムズジーアンソニー; スイ−ラムウォン
Original assignee: ザユニバーシティーオブカルガリー; シャイチュンング; ジェイムズジーアンソニー; スイ−ラムウォン
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 2000-05-16
Also published as: EP0618977A4; WO1993012246A1; EP0618977A1

Abstract

(57)【要約】生物学的に活性なFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を生産することができる発現分泌ベクター、これら発現分泌ベクターを含む宿主細胞、および生物学的に活性なFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を生産する方法。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的に活性なFVフラグメント生産用発現分泌ベクター発明の背景 Fvフラグメントは目下知られている最小の完全抗原結合部位である。このフラグメントは免疫グロブリン可変Ｈ(V_H)および可変Ｌ(V_L)鎖の可変領域より成るに過ぎない。小さいサイズのFvフラグメントは抗体およびタンパク質工学の分野においてイメージ、治療学、および構造研究におけるその可能性のある用途のために大いに関心を抱かれている。Fvを生産する最初の試験は全抗体をタンパク質分解により切断して行われた。しかし、この方法は質および収量を制御する困難性により妨げられた〔インバー(Inbar)等の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」69、2659[ 1972]〕。後に組換えDNA法が細菌細胞で天然Fvを発現させる試験に用いられた。若干のグループは個々にV_HおよびV_L、鎖を発現させインビトロで鎖を再結合させる試験を行った。細胞内のこれらタンパク質の生産は結果として不溶性タンパク質を生じ、これらを変性し復元して機能し得る抗体を生成させる必要があった。変性剤にさらすことが天然抗体構造に何をするのかは明らかでなく従ってこれら系は決して理想的でない。さらに最近、可溶性天然Fv〔スケラ(Skerra)およびプラクサン（Pluckthun）の「Science」240、1038[1988]〕および他の関連するフラグメント〔ベター(Better)等の「Science」240、1041[1988]〕の生産が報告されている。しかし、これらの系で報告されている天然Fvの収量は種々の実際の用途（例えば、3-D NMR分析のための同位体標識）にとって極めて低い。生物学的に活性なFvフラグメントおよび単鎖Fv分子を生産するために発現分泌系を開発することは有益である。発明の開示本発明は生物学的に活性なFvフラグメントおよび単鎖Fv分子を生産するための発現分泌系に関する。特に、本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖(V_H )の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖（V_L）の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターに関する。また本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターを含む宿主細胞に関する。そのうえ本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するD NA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを発現分泌し得る条件下に生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターを含む宿主細胞を培養することから成る生物学的に活性なFvフラグメントを生産する方法に関する。さらに本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖 Fv分子を暗号化するDNA配列、およびシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を有する生物学的に活性な単鎖Fv(sFv)分子を生産することができる発現分泌ベクターに関する。図面の簡単な説明図１は抗ジゴキシンモノクローナル抗体26-10の(A)V_H[SEQ.ID NO.1]および(B) V_L［SEQ.ID NO.2］部分のヌクレオチドと導き出されたアミノ酸配列を示す。制限部位を示す。図２はシグナルペプチド配列(A)ompA[SEQ.ID NO.3]および(B)phoA[SEQ.ID NO. 4]を暗号化する修飾したDNA配列およびその導き出されたアミノ酸配列を示す。矢印は所望の制限酵素認識部位を生成させるためにこれら特定の位置でヌクレオチドを変化させたことを示す。図３はプラスミドFvpD生成において生産される種々のプラスミド：(A)プラスミドV_H pDの作製；(B)プラスミドV_L pDの作製；(C)プラスミドV_L pD-Xbalの作製；(D)プラスミドFvpDの作製を示す。図４は26-10のFvフラグメントの生成を示すドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルである。レーン１〜４：ウワバインカラムから溶出した画分番号３〜６。Fvのピークは画分３である。レーン５：タンパク質サイズ標準16.9 、14.4、8.2kd。レーン６：予め染色したタンパク質サイズ標準110、84、47、33 、24、16kd。レーン７：カラム精製前のFvペリプラズム画分。図５はプラスミドpT7PhoA26-10sFvの作製を示す。図６は26-10の単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列およびそのアミノ酸配列を示す。制限部位および若干の５’および３’非コーディング配列を示す。発明の詳細な説明本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターに関する。また本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列、およびシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を有する生物学的に活性な単鎖Fv(sFv)分子を生産することができる発現分泌ベクターに関する。生物学的に活性なFvフラグメントまたはsFv分子は真正のＮ末端を有するのが好ましい（すなわち、成熟FvフラグメントまたはsFv分子はシグナルペプチド配列のカルボキシ末端と免疫グロブリンのＨまたはＬ鎖の可変領域のアミノ末端間でペプチド結合を切断することにより生じる）。さらにシグナルペプチド配列がompAおよびphoAである発現分泌ベクターが好ましい。そのうえシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を修飾してシグナルペプチド配列のアミノ酸配列を変えることなく他の制限酵素部位を生じた発現分泌ベクターが好ましい。また免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列に機能的に結合させたT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA 配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターが好ましい。このような関係において用いた、「機能的に結合させる」とはT7プロモーターが免疫グロブリンＨまたはＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列の転写を指示することができることを意味する。ここで用いた、「Fvフラグメント」とは抗原と結合し得るが免疫グロブリンＨまたはＬ鎖の不変部のエフェクター機能を欠いた免疫グロブリンＨまたはＬ鎮の非共有結合可変領域(non-covalently associated variable domains)を意味する。ここで用いた、「単鎖Fv分子」とは抗原と結合し得るが免疫グロブリンＨまたはＬ鎖の不変部のエフェクター機能を欠いた免疫グロブリンＨまたはＬ鎖の可変領域がアミノ酸リンカーを用いて連結される分子を意味する。ここで用いた、「生物学的に活性なFvフラグメント」または「生物学的に活性なsFv分子」とはFvフラグメントまたはsFv分子が抗原から誘導された完全な長さの抗体と同様の抗原の１種以上を特異的に結合することができることを意味する。本発明で役に立つ発現分泌ベクターは多くの場合「プラスミド」の形態であり、ベクターの形態で、染色体に結合しない環状二本鎖DNAである。しかし、本発明には同等に機能を果たし次いでこれに関して業界で知られるようになるかかる他の形態の発現分泌ベクターが含まれる。本発明の生物学的に活性なFvフラグメントを最低限生産することができる発現分泌ベクターはT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎮の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列（例えば、ompA、phoA、pelB）および残りのベクター部分が含まれる。本発明の生物学的に活性なsFv分子を最低限生産することができる発現分泌ベクターはT7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列、およびシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列および残りのベクター部分が含まれる。ompAおよびphoAは大腸菌(E.coli)のompAおよびphoA座に一致するかまたはそれらから誘導されたDNA配列により暗号化されたシグナルペプチド配列である。ompA座は大腸菌外膜タンパク質の構造遺伝子であり、phoA座は大腸菌アルカリホスファターゼの構造遺伝子である。もちろん、残りのベクター部分は複製の開始点、例えば複製のcolEI開始点を含む必要がある。また発現分泌ベクターはこの業界において既知の他のDNA配列、例えば、プラスミドに安定性を提供する安定性先導配列(stability leader sequence)、転写終結配列、調節されるべき（例えば、栄養素または増殖培地中の他の誘導物質の存在あるいは欠損により）構造遺伝子の発現分泌を可能にする調節配列、形質転換宿主細胞で表現型選択を提供することができるマーカー配列（例えば、アンピシリンおよびカナマイシン耐性のための）、および制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位を提供する配列を含む場合がある。用いられる実際の発現分泌ベクターの特徴は使用されるべき宿主細胞と和合性である必要がある。例えば細菌系におけるクローニングの際、発現分泌ベクターはその系で機能することができるDNA配列（例えば、T7プロモーター）を含む必要がある。本発明により意図されたような発現分泌ベクターは複製および免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の可変領域または単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列の複製ならびに発現を指示することができる。 FvpDもしくはpT7PhoA26-10sFvと称され、次に記載した発現分泌ベクター、またはFvpDもしくはpT7PhoA26-10sFvの同一の特性(identifying characteristic)を有する発現分泌ベクターが特に好ましい。所望の暗号および制御配列を含む適当な発現分泌ベクターをこの業界で既知の標準組換えDNA技術を用いて作製することができ、これらの多くはマニアティス，ティー(Maniatis,T)等の「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー研究所(1982)に記載されている。もちろん、本発明の発現分泌ベクターの必須成分は免疫グロブリンのV_Hおよび V_L鎖または単鎖Fv分子の遣伝暗号を指定するDNA配列である。かかるDNA配列は種々の方法で作成することができる。１つの方法として、免疫グロブリンのV_HおよびV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定する本発明のDNA配列を化学的に合成することができる。例えば、免疫グロブリンのV_HおよびV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列を連続した100塩基オリゴヌクレオチドとして合成することができその際オリゴヌクレオチドは連続して連結され（適当な末端制限部位を介して）ヌクレオチドの正確な直線配列を形成する（V_MおよびV_L鎖または単鎖Fv分子のヌクレオチド配列が知られている条件で）。第２の方法として、免疫グロブリンのV_HおよびV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列をポリメラーゼ鎖成長反応(PCR)を用いて作成することができる。簡単には、標的（鋳型）DNA配列の反対の鎖にハイブリッダイゼーションする少なくとも15塩基の長さの一組の合成DNAオリゴヌクレオチド(PCRプライマー）を用いて標的配列上のDNAの介在領域を酵素により増幅する。適当な鋳型DNA配列を、例えば、興味のあるハイブリドーマからmRNAを単離しこのmRNAを逆転写することにより作成することができる。適当なPCRプライマーは化学的に合成することができ、興味あるハイブリドーマからのmRNAをシークエンシング(sequencing)することにより、抗体分子自体をシークエンシングし縮重した(degenerate)プライマーを作成することにより、または一般的なプライマーを用いること〔オルランジ(Orlandi)等の「Proc.Natl.Acad.Sc i.USA」86、3833(1989)；サストリー(Sastry)等の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」8 6、5728(1989)を参照〕により設計することができる。適当な５’プライマーは、例えば、免疫グロブリンのV_HおよびV_L、鎖の成熟末端に基づくものを含み、適当な３’プライマーは、例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖のＪ領域に基づくものを含む。鋳型の熱変性の繰り返しサイクル、プライマーのアニーリングおよびDNAポリメラーゼを用いたアニール化プライマーの３’末端の伸長はPCRプライマーの５’ 末端により決定されるセグメントを増幅させる。米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照。さらに本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA 配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターを含む宿主細胞に関する。また本発明はT7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列およびシグナルペプチド配列を暗号化するD NA配列を有する生物学的に活性な単鎖Fv分子を生産することができる発現分泌ベクターを含む宿主細胞に関する。生物学的に活性なFvフラグメントまたは単鎖Fv分子は真正のＮ末端を有するのが好ましい（すなわち、成熟Fvフラグメントまたは単鎖Fv分子はシグナルペプチド配列のカルボキシ末端と免疫グロブリンのＨまたはＬ鎖の可変領域のアミノ末端間でペプチド結合を切断することにより生じる）。さらにシグナルペプチド配列がompAおよびphoAである発現分泌ベクターが好ましい。そのうえシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列が修飾されてシグナルペプチド配列のアミノ酸配列を変えることなく他の制限酵素部位を生じた発現分泌ベクターが好ましい。また免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列に機能的に結合させたT7プロモーターを暗号化するDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができる発現分泌ベクターが好ましい。適当な宿主細胞には、E.coli MC1061細胞のような大腸菌細胞が含まれる。他の適当なE.coli株はGM-1、SG-935および1023が含まれる。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の組み込みコピーを含む、例えばE.coli株JM109/DE3およびBL21/DE3/pLysS が特に好ましい。本発明の発現分泌ベクターをこの業界で既知の種々の方法により宿主細胞に導入することができる。例えば、発現分泌ベクターを用いた宿主細胞の形質転換は Maniatis等の前記に記載されているように実施することができる。しかし、また発現分泌ベクターを宿主細胞に導入する他の方法では、例えば、エレクトロポレーション、リポソーム融合(liposomal fusion)、またはウイルスもしくはファージ感染を用いることができる。活性のあるFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を生産しT7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する発現分泌ベクターを含み、あるいはT7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列、およびシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を有する発現分泌ベクターを含む宿主細胞は４種の一般的方法：(a)DNA-DNAハイブリダイゼーション；(b)マーカー遺伝子機能の存在または欠損；(c)宿主細胞における免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子mRNAの写し(transcript)により測定されるような転写のレベルの評価；および(d)遺伝子産物の生物学的検出の１種以上により確認することができる。第１の方法において、免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列の存在はこのDNA配列に相補的なプローブを用いるDNA- DNAまたはRNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出され得る。第２の方法において、組換え発現分泌ベクター宿主系を確認し特定のマーカー遺伝子機能（例えば、抗生物質アンピシリンおよびカナマイシン耐性）の存在または欠損に基づき選択することができる。マーカー遺伝子を同様または異なるプロモーターの調節下に免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列が用いられ免疫グロブリンのV_HおよびV_L鎖または単鎖Fv 分子の暗号配列を調節するのと同様なプラスミド中に配置することができる。マーカー遺伝子の発現を用いて免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列を有するプラスミドが含まれる細胞を選択することができる。第３の方法において、免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子mRNA の写しの生産をハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。例えば、すべてのRNAを単離しRNA配列に相補的なプローブを用いるノザンブロッティングまたはヌクレアーゼ保護アッセイ（nuclease protectionassay)により分析することができる。第４の方法において、免疫グロブリンのV_HもしくはV_L鎖または単鎖Fv分子の発現は生物学的に、例えば、ウェスターンブロッティングもしくは抗原に対する結合により、またはタンパク質産物のシークエンシングにより評価され得る。発現分泌ベクターが適当な宿主細胞に導入されると、宿主細胞は多量のFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を発現し得る条件下に培養され得る。かかるFvフラグメントまたは単鎖Fv分子は誘導される完全な長さの抗体分子と同様の方法で用いられ得る。例えば、これらをインビボおよびインビトロの免疫学的な診断法に用いることができ、治療上単独であるいは薬物および毒素に結合させて用いることができる。またこれらは、例えば、核磁気共鳴(NMR)およびＸ線結晶学を利用した構造研究に用いることができる。所望の場合、この方法で生産したFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を単離し種々のタンパク質精製方法を用いて若干の程度精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法を用いることができる。本発明の発現分泌ベクターのDNA配列、ブラスミドまたはDNA分子をこの業界で既知の種々の方法により決定することができる。例えば、サンガー(Sanger)等の「Proc.Nat1.Acad.Sci.USA」74、5463〜5467(1977)に記載されているようなジデオキシ鎖成長停止法、または「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」74、560〜564(1977)に記載されているようなマクサムギルバート法を用いることができる。ここに記載した原理体系を用いてマウス以外の種の動物から誘導したFvフラグメントまたは単鎖Fv分子、および広範な種類の異種抗原、例えば、ジゴキシンおよびフィブリンに対するFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を調製することができることを認識する必要がある。またここに記載した原理体系を修飾したFvフラグメントまたは単鎖Fv分子の生産に用いることができる。この場合、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域、もしくは免疫グロブリンＬ鎖の可変領域、または両者、あるいは単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列を修飾し（すなわち、突然変異させて）突然変異したコドンにより暗号化されたアミノ酸配列が変化する種々の突然変異体を作成することができる。これら修飾したDNA配列を、例えば、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域、もしくは免疫グロブリンＬ鎖の可変領域、または両者、あるいは単鎖Fv分子の遺伝暗号を指定するDNA配列を突然変異させることにより作成することができ、その結果この突然変異がこの業界で既知の種々の方法を用いる暗号化ポリペプチド中の１種以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を起こす。例えば、テイラー，ジェイ．ダブリュー.(Taylor,J.W.)等の「Nucl .Acids.Res.」13、8749〜8764(1985)およびクンケル，ジェー．エー.(Kunkel,J.A.)の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」82、482〜492(1985)に記載された部位特異的突然変異誘発の方法を用いることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発のためのキットは商業上の提供者から入手することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を実施するためのキットはアマシャム社(Amersham Corp.)〔米国イリノイ州アーリントンハイツ（Arlington Hights)所在〕から入手することができる。意図した改変には、例えば、マウスから誘導したFvフラグメントの人間化(humanization)が含まれる。ジョーンズ(Jones)等の「Nature」3 21、522(1986)を参照。すべてのかかる変更は本発明の範囲内に含まれる。前記および本明細書の他の所に用いた、「修飾した」とは、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する場合に、天然に見出される野性型配列とは異なるヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。さらに次の実施例は本発明の実例となる。これら実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の理解を一層深める。実施例１抗体フラグメントを暗号化する遺伝子のクローニング抗ジゴキシンモノクローナル抗体26-10はウシ血清アルブミンに結合させたジゴキシンに対し生成した高親和性(5×10⁹M^-1）抗体である〔マドゲット−ハンター(Mudgett-Hunter)等の「Mol.Immunol.」22、477(1985)〕。26-10抗体のV_HおよびV_L部分を暗号化する遺伝子のcDNAクローンを2610ハイブリドーマから単離した mRNAの逆転写で生じたcDNAをPCR増幅させて作成しジデオキシ鎖成長停止法により配列決定した（図１-A[SEQ.ID N0.1]および１-B［SEQ.ID N0.2]）。DNA配列をゲノム2610配列〔ニアー，アール．アイ．（Near,R.I.)等の「Mol.Immunol.」27、901〜909(1990)を参照〕と比較し26-1 0を暗号化する真正の遺伝子がクローニングされたことを証明した。実施例２発現分泌ベクターの基礎を形成するT7プロモーターの作製発現分泌ベクターの基礎を形成するT7プロモーターをテイバー，エス.(Tabor, S.)等の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」82、1074(1985)に記載されたpT7-7プラスミドの修飾を介して作成した。pT7-7のポリリンカー領域中の制限部位は人工オペロンと同様のプラスミド上で通常の制限部位が26-10V_HおよびV_Lならびにこれら各々のシグナル配列（図２［SEQ.ID NO.3およびSE0.ID NO.4]）を含むDNAフラグメントをクローニングするために有効であるような同様の方法で変化させた。シグナル配列、ompA〔モバ(Movva)等の「J.Biol.Chem.」255、27(1980)〕およびph oA〔イノウエ(Inoue)等の「J.Bacteriol.」149、434(1982)〕をシグナルペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく新規な制限部位を生ずるように操作した。従って、正しい処理は両鎖の真正のＮ末端配列を生じることおよびタンパク質に対してペリプラズム間隙に分泌されることが期待される。鋳型としてE.coli染色体DNAを用いるPCRによりこれら修飾したシグナル配列を作成した。ompAに対して、次のオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いた：修飾シグナル配列を図２［SEQ.ID N0.3およびSEQ.ID NO.4]に示す。両場合に、さらにすべてのPCR方法に対して、PCR法をGeneAmpキット〔米国コネティカット州ノーウォーク所在のパーキン−エルマーシータス(Perkin-Elmer Cetus)〕を用いて製造業者が推薦するように実施した。発現分泌ベクターの作製における最初の段階はpT7-7ポリリンカー領域の前述した修飾であった。 26-10V_H領域（図3Aを参照）を含むプラスミドを作成するために、pT7-7プラスミドをBamH1およびSal1で切断し、次いでクレノウで満たしpT7-7ポリリンカー中のBamH1、Sal1およびXba1部位を効果的に破壊した。次いで得られたベクターをX ba1で切断しクレノウで満たしリボソーム結合部位の上流のXba1部位を破壊した。次いでこのプラスミドをSma1で切断しT4 DNAリガーゼを用いてXba1リンカーと連結してpT7-11ベクターを作成した。pT7-11プラスミドをNdelおよびEcoR1で切断しT4 DNAリガーゼを用いてompAシグナル配列を含むNdel/EcoR1フラグメントと連結して、pT7-11 OmpAベクターを作成した。次いでpT7- 11 OmpAプラスミドをNru1およびEcoR1で切断し鋳型として2610ハイブリドーマから単離したmRNAおよび次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR法により作成した2610のV_H 鎖を暗号化するフラグメントとフレーム中でT4 DNAリガーゼを用いて連結した：増幅のために用いたオリゴヌクレオチドは増幅V_Hフラグメントの、５’および３’末端それぞれに、Nru1およびEcoR1部位を生じた。得られたプラスミドをV_H pDとした。 26-10V_L領域（図3Bを参照）を含むプラスミドを作成するために、phoAシグナル配列をPCR増幅し未修飾pT7-7中にNdel/EcoR1フラグメントとしてクローニングした。26-10V_L DNAを以下に示したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR法により増幅し発現分泌ベクターをpT7phoA中にクローニングするのに適当なフラグメントを生成した：増幅した26-10V_LフラグメントをSty1で切断しsty1およびSma1 で切断したpT7phoAプラスミドとT4 DNAリガーゼを用いて連結し、結果的にsty1/ 平滑末端フラグメントとして26-10V_Lの連結を生じた。得られたプラスミドをV_L pDとした。次いでV_L pDプラスミドをBamH1およびSal1で切断し、クレノウで満たしT4 DNA リガーゼで連結してプラスミドV_L pD-XbaI（図3C）を作成した。次いでV_H pDおよびV_L、pD-Xba1プラスミドを用いFvpD発現分泌ベクターを作製した。V_L pD-Xba1プラスミドをXba1およびHind111で切断してシグナル配列は含むがT7プロモーター配列を欠いたＬ鎖を放出した。次いでこのフラグメントをT4 DNAリガーゼを用いてXba1/Hind111切断V_H pDと連結してFvpDを作成した（図3D ）。最終的構成体(FvpD)ならびに中間構成体をジデオキシDNAシークエンシングにより配列決定してこれらの作製／増幅の間に発生したアミノ酸配列に影響を与える変化のないことを確実にした。実施例３プラスミドFvpDからの26-10Fvの発現 FvpDからの26-10Fvを発現させるために、Gp1-2と称する第２の和合性プラスミド（Tabor等の前記）、これは温度感受性ラムダcIリプレッサーの制御下のT7 RN Aポリメラーゼ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含む、をManiatis等の前記に記載されたようにMC1061 E.coli細胞中にFvpDを用いて共形質転換し(co-tra nsform)アンピシリンおよびカナマイシン耐性形質転換細胞について選択した。M C1061細胞はクロンテク(Clontech)（米国カリフォルニア州パロアルト所在）またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（米国メリーランド州ロックビル所在）から入手することができる。形質転換細胞を20μg/mlのカナマイシンおよび50μg/mlのアンピシリンを含む２×YT培地に接種し、26-10Fvの誘導前に25℃でOD₆₀₀=2.0まで増殖させた。Gp1-2プラスミドを含む細胞を30分間42℃にシフトさせた際これは温度感受性リプレッサータンパク質を不活化してT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現させる。その後T7 RNAポリメラーゼタンパク質は26-10V_HおよびV_L遺伝子の上流に存在するT7プロモーターを利用してこれら遺伝子の転写を増進させることができる。次いで細胞を30分間25℃にシフトさせてV_HおよびV_Lポリペプチドの適当なプロセッシングおよびアッセンブリーを促進した。図４（レーン７）に示すように、Gp1-2およびFvpDプラスミドを含む温度誘導細胞は12kdおよび15kdの明確な分子量を示して移動した２種のポリペプチドを発現した。12kdポリペプチドのサイズは26-10V_L DNA配列により暗号化されたポリペプチドから予想された26-10V_L 鎖(12.2kd)のサイズと本質的に一致した。15kdポリペプチドは26-10V_H DNA配列により暗号化されたポリペプチドの予想されたサイズ(13.2kd)よりゆっくり移動したことが明白であった。またこれら２種のポリペプチドはペリプラズム画分に著しく豊富であることが見出されたので適当に配置されていると思われた。26-1 0Fvはペリプラズム画分をウワバインセファロースアフィニティカラム（ウワバインはジゴキシン同族体である）のアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。ペリプラズム画分をスケラ(Skerra)等の「Science」240、1038(1988)に記載されたように浸透圧衝撃により収集した。すべての段階を氷上または４℃で実施した。誘導後、1L培養物からの細胞を4,000×gで10分間遠心分離することにより収集した。細胞ペレットを10mlのTES緩衝液(0.2M トリス塩酸 pH8.0、0.5mM EDTA、0.5Mショ糖）に懸濁した。次いで懸濁細胞に15mlの希釈TES (TESを水で1:4に希釈）の添加により浸透圧衝撃を与えてペリプラズム間隙に存在するタンパク質を放出させた。氷上で30分間インキュベーションした後、細胞を連続した遠心分離5,000×gで10分間および38,000gで15分間により除去した。次いでペリプラズム画分を含む上清をアフィニティクロマトグラフィーにかけた。20mMのウワバインと結合した物質を溶出した際、画分３および４（図４、レーン１および２）は選択的に精製された正確な(correct)サイズの２種のポリペプチドを現した。次の証拠はこれが26-10Fvであることを示した：(1)これが拮抗的 RIAアッセイにおいて¹²⁵I-26-10のすべての抗体と競合した；(2)これが26-10のすべての抗体に対してのK_A=５×10⁹M^-1に比較してK_Aが1.3×10⁹M^-1である¹²⁵I− ジゴキシンに結合した；(3)V_HおよびV_L可変領域のＮ末端シークエンシングが正しいプロセッシングおよび所望のＮ末端配列を示した。精製Fvの収量は１mg/Lであることが示された。さらに宿主としてプロテアーゼ欠損株を用いることにより、発酵条件の至適化により、他のシグナル配列を用いることにより、ならびに酵素および哺乳類細胞において免疫グロブリン鎖アッセンブリーのために通常用いられるシャペローン(chaperones)（例えば、Ｈ鎖結合タンパク質[BIP]）を共発現させること(co-expressing)により収量を改善することが可能である。この方法により作成された26-10FvはnM範囲のタンパク質濃度で４℃に貯蔵された場合、少なくとも２ヵ月間安定であり、おそらく一層長く安定である。実施例４ FvpD からの26-10Fvの他の発現また第２の方法をFvpDからの26-10Fvの発現に用いた。この方法では、FvpDプラスミドでE.coli株JM109/DE3〔プロメガ(Promega)；またスタディア，エフ．ダブリュー.(Studier,F.W.)等の「Methods in Enzymology」185、60〜88｛ディー．ブイ．ゴーデル(D.V.Goeddel)編｝アカデミックプレス(1990)を参照〕に形質転換を起こさせた。JM109/DE3はlacプロモーターの制御下にT7 RNAポリメラーゼの組み込みコピーを有する。FvpDプラスミドを含むJM109/DE3細胞を改変した２ ×YT培地〔２％バクトトリプトン(bacto tryptone)、１％酵母抽出エキス、0.5 ％塩化ナトリウム、0.2％グリセロール、50mMリン酸カリウムpH7.2〕およびグルコース(0.4％)、アンピシリン(50mg/L)中37℃で細胞のA600nmが1.0〜2.4間になるまで増殖させた。次いで細胞を24℃に冷却した。次いで、イソプロピルβ-D− チオガラクトシド(IPTG)を0.05mMの終濃度まで添加してT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の転写を誘導した。IPTGの添加後、細胞を24℃で16時聞インキュベーションし、さらにペリプラズムタンパク質について選抜した。浸透圧衝撃上清（FvpDプラスミドを含むIPTG処理JM109/DE3細胞からのペリプラズム画分）が加熱処理したMC1061/Gp1-2細胞で見出されたタンパク質と共に泳動する２種のタンパク質を含むことを見出した。これら２種のポリペプチドは浸透圧衝撃上清に著しく豊富であった。26-10Fvを浸透圧衝撃上清からウワバインセファロースカラムを用いて精製した場合（実施例３参照）、26-10V_HおよびV_L 鎖(15および12kD）に対して予想された適当なサイズの２種のポリペプチドを単離した。JM109/ DE3株からアフィニティで精製した26-10Fvの収量は14mg/Lであった。JM109/DE3 株において、最大レベルの26-10Fv蓄積は誘導後約16時間で観察され、一方MC106 1/Gp1-2（実施例３）において、最大レベルの26-10Fv蓄積は誘導開始後１時間で生じた。SDS-PAGEにより分離したタンパク質画分のクーマシー染色はJM109/DE3 およびMC1061/Gp1-2（実施例３）において、ほとんどの26-10Fvタンパク質がペリプラズム中に見出されたことを示した。JM109/DE3が生産したタンパク質のＮ末端タンパク質配列分析はV_H（約15kD）およびV_L（12kD）鎖が細菌の輸出系(exp ort system)により正しく処理されたことを明らかにした。JM109/DE3およびMC10 61/Gp1-2（実施例３）株において、タンパク質誘導後に細胞を25℃に冷却する必要があった。27℃を超えた温度でのインキュベーションはウワバインセファロースカラムに結合しない約17kDおよび12kDのタンパク質の蓄積を起こした。実施例５生物学的に活性な単鎖Fvの発現また本発明の発現系を生物学的に活性な単鎖Fv(sFv)分子を発現するために使用した。 26-10抗体のsFv形態は突然変異オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅により作製されて新規な制限部位が形成された（さらに２種の鎖間にペプチドリンカーを暗号化する配列が挿入された）。簡単に、図５に要約しているように、可変領域のＬ(V _L)およびＨ(V_H)鎖を暗号化する遺伝子を実施例２に記載した条件下に鋳型として26-10抗体のV_HおよびV_L部分（実施例１を参照）を暗号化する遺伝子のc DNAクローンならびに次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて別々にPCR増幅させた：これらオリゴヌクレオチドは相補的配列を有しており、さらにV_LおよびV_H鎖間に設計されるペプチドリンカーを暗号化する配列を含み、その結果V_LおよびV_H配列は、第２回のPCR増幅後に、次の配列： -Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser [SEQ.ID NO.17] を有する15個のアミノ酸リンカーを含む単鎖Fv分子を暗号化する完全な２本鎖DN A分子を後で形成することができた。このDNA構成体をPCR増幅26-10sFvと称した。PCR増幅26 -10 FvおよびpT7PhoAと称するプラスミド（実施例２を参照）を共に制限酵素Bst E2およびSal1で切断して連結しpT7PhoA26-10sFvと称するプラスミドを作成した。このプラスミドは次の領域を有する単鎖タンパク質を暗号化する（Ｎ末端からＣ末端に至る：PhoAリーダー−26-10可変Ｌ鎖−リンカー−26-10可変Ｈ鎖）（この構成体のDNAおよび暗号化アミノ酸配列に対する図６［SEQ.ID NO.18]を参照）。 pT7PhoA26-10sFvプラスミドは塩化カルシウム法（Maniatis等の前記を参照）によりE.coli株BL21/DE3/pLysS〔Studier,F.W.等の「Methods in Enzymology」1 85、60〜88、D.V.Goeddel編アカデミックプレス(1990)を参照〕に形質転換を起こさせた。pT7PhoA26-10sFvプラスミドを含む細胞は最少培地（7.6mMNH₄SO₄、11 .0mM酢酸ナトリウム、12.7mMコハク酸、60.3mM K₂HPO₄、68μM CaCl₂.2H₂O、35 μM ZnSO₄.７H₂O、59μM Mnso₄.H₂O、741μMチアミン、2032μMナイアシン、12 μMビオチン、40μM FeCl₃.6H₂O、3μmM Na₂MoO₄.2H₂O、3μM CUSO₄.5H₂O、3μM H₃BO₃、3μMビタミンB-12、4mM MgSO₄、22mMグルコース、50μg/mlアンピシリン、20μg/mlクロラムフェニコール）中37℃で一晩増殖させ、次いで37℃で２× YT培地（実施例４に示すような）中で1:20に希釈して細胞のA_600nmが0.5〜1.0の間を示すまで増殖させた。次いで細胞を24℃に冷却した。次いでIPTGを0.2mMの終濃度まで添加してT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の転写を誘導した。IPTGの添加後、細胞を24℃で16時間インキュベーションし、さらにペリプラズムタンパク質および培養上清中のタンパク質について選抜した。これら条件下で、1Lの細胞培養物当たりアフィニティで精製した26-10sFvタンパク質を3〜10mgの収量で得た。アフィニティで精製した物質はSDS- PAGEにより示されるように、約29kDの分子量を有していた。26-10sFvタンパク質が生物学的に活性であるという事実をこれがウワバインセファロースアフィニティカラム（実施例３を参照）に結合しこれを用いて精製され得ることにより示した。ここで言及したすべての出版物および特許文献は特別にまた個別に参考としてここに組み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人ウォンスイ−ラムカナダ国アルバータカルガリーエヌダブリューランチグレンドライブ 38 (72)発明者ングシャイチュンアメリカ合衆国ニュージャージ州 08648 ローレンスヴィルアンソニーレイン６ (72)発明者アンソニージェイムズジーアメリカ合衆国ペンシルベニア州 18940 ニュートンチェサピーケドライブ 102 (72)発明者ウォンスイ−ラムカナダ国アルバータカルガリーエヌダブリューランチグレンドライブ 38

Claims

【特許請求の範囲】１．T7プロモーターを暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、さらに１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができることを特徴とする発現分泌ベクター。２．T7プロモーターを暗号化するDNA配列、単鎖Fv分子を暗号化するDNA配列、およびシグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を有する生物学的に活性な単鎖F v分子を生産することができることを特徴とする発現分泌ベクター。３．Fvフラグメントが真正のＮ末端を有することを特徴とする請求の範囲１記載の発現分泌ベクター。４．シグナルペプチド配列を暗号化するDNA配列を修飾してシグナルペプチド配列のアミノ酸配列を変えることなく他の制限酵素部位を生じさせたることを特徴とする請求の範囲１記載の発現分泌ベクター。５．シグナルペプチド配列がompAおよびphoAであることを特徴とする請求の範囲１記載の発現分泌ベクター。６．シグナルペプチド配列がphoAであることを特徴とする請求の範囲２記載の発現分泌ベクター。７．免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、もしくは免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、または両者を暗号化するDNA配列を修飾することによりFvフラグメントを変更したことを特徴とする請求の範囲１記載の発現分泌ベクター。８．免疫グロブリンＨ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を暗号化するDNA配列、および１種以上のシグナルペプチド配列を暗号化する１種以上のDNA配列に機能的に結合させたT7プロモーターを暗号化するD NA配列を有する生物学的に活性なFvフラグメントを生産することができることを特徴とする発現分泌ベクター。９．請求の範囲１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の発現分泌ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。１０．宿主細胞がT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の安定に組み込まれたコピーを含むことを特徴とする請求の範囲９記載の宿主細胞。１１．宿主細胞がE.coli株JM109/DE3またはE.coli株BL21/DE3/pLysSであることを特徴とする請求の範囲１０記載の宿主細胞。１２．生物学的に活性なFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を発現し得る条件下で請求の範囲９記載の宿主細胞を培養することを特徴とする生物学的に活性なFvフラグメントまたは単鎖Fv分子を生産する方法。１３．ジゴキシンと特異的に結合する生物学的に活性なFvフラグメントを含むことを特徴とするポリペプチド分子。