ES2675784T3 - Polipéptidos de fusión que comprenden ligador de polipéptidos de dominio de mucina - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que tiene bioactividad mejorada que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido, en la que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador de polipéptido de dominio de mucina, en el que la bioactividad de la proteína de fusión se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador de polipéptido de dominio de mucina, en el que; a) el ligador de polipéptido de dominio de mucina comprende todo o una porción de una secuencia de polipéptido de dominio de mucina codificada por un gen MUC seleccionado del grupo que consiste de MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC 16, MUC 17, MUC 19, MUC20, y MUC21 o una variante de la secuencia de polipéptidos de dominio de mucina con por lo menos 90% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido; b) el primer socio de fusión se selecciona del grupo que consiste de sTNFR2, CTLA4, TACI, LFA, IL-1RI, IL-1Ra, IL- 1RAcP, receptor de VEGF, GLP-1, exendina-4 y una secuencia de aminoácidos homóloga a cualquiea de los anteriores con por lo menos 95% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido; y c) el segundo socio de fusión de polipéptido comprende un dominio Fc de inmunoglobulina
Description
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DESCRIPCION
Polipéptidos de fusión que comprenden ligador de polipéptidos de dominio de mucina Antecedentes de la invención
La construcción de una proteína de fusión implica la unión de dos proteínas o dominios de proteínas mediante un ligador peptídico. La selección de una secuencia de ligador apropiada es importante, ya que puede afectar la función y propiedades físicas de la proteína de fusión resultante. A menudo, los ligadores flexibles e hidrófilos se eligen para no restringir excesivamente y por lo tanto perturbar las funciones de los dominios. Los ligadores se pueden utilizar para controlar la distancia y la orientación de los dominios. La fusión de una proteína o péptido bioactivo a menudo da como resultado la pérdida de bioactividad, probablemente debido a la interferencia estérica del socio de fusión. Adicionalmente, en el caso de las fusiones de Fc, debido a su naturaleza dimérica, también se puede producir interferencia entre las dos copias de la proteína heteróloga.
Las proteínas de mucina y los dominios de mucina de proteínas contienen un alto grado de glucosilación que permite estructuralmente que las proteínas de mucina y otros polipéptidos que comprenden dominios de mucina se comporten como espirales aleatorios rigidizados. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que esta estructura en espiral aleatoria reforzada en combinación con los carbohidratos hidrofílicos ramificados hidrófilos que constituyen los dominios de mucina fuertemente glucosilados es particularmente útil como un ligador en una proteína de fusión. La naturaleza de tipo varilla de los dominios de mucina puede separar rígidamente la proteína bioactiva del socio de fusión, y por lo tanto ser menos susceptible a la pérdida de actividad. En el caso de fusiones de Fc, la proyección rígida lejos de la Fc dará como resultado una mayor separación entre cada copia de la proteína de interés, permitiendo también que las proteínas de fusión más grandes se expresen como fusiones de Fc. También debido al alto nivel de glucosilación, la adición de un dominio de mucina tiene el potencial de modificar las propiedades fisicoquímicas de una proteína tales como la carga, la solubilidad y las propiedades viscoelásticas de soluciones concentradas de la proteína activa.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que tiene bioactividad mejorada que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido, en el que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador de polipéptido de dominio de mucina, en el que la bioactividad de la proteína de fusión se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador del polipéptido del dominio mucina, en el que;
a) el ligador de polipéptido de dominio de mucina comprende todo o una porción de una secuencia de polipéptido de dominio de mucina codificada por un gen MUC seleccionado del grupo que consiste de MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC 16, MUC 17, MUC 19, MUC20, y MUC21 o una variante de la secuencia de polipéptidos de dominio de mucina con por lo menos 90% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido;
b) el primer socio de fusión se selecciona del grupo que consiste de sTNFR2, CTLA4, TACI, LFA, IL-1RI, IL-1Ra, IL- 1RAcP, VEGF receptor, GLP-1, exendin-4 y una secuencia de aminoácidos homóloga a cualquiera de los anteriores con por lo menos 95% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido; y
c) el segundo socio de fusión de polipéptido comprende un dominio Fc de inmunoglobulina.
Se divulgan en este documento proteínas de fusión que tienen bioactividad mejorada que comprenden un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido en el que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador del polipéptido del dominio mucina y en el que la bioactividad de la proteína de fusión de la invención se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador del polipéptido del dominio mucina. Los ligadores de polipéptido de dominio de mucina comprenden un dominio de mucina que es rico en sitios potenciales de glucosilación, y tiene un alto contenido de serina y/o treonina y prolina, que pueden representar más de 40% de los aminoácidos dentro del dominio de mucina y comprenden adicionalmente por lo menos aproximadamente 60% de su masa debido a los glicanos. Los ligadores de polipéptido de dominio de mucina pueden comprender unidades de repetición de aminoácido en tándem (también mencionadas en este documento como TR) que puede variar en longitud desde aproximadamente 8 aminoácidos a 150 aminoácidos por cada unidad de repetición en tándem. El ligador de polipéptido de dominio de mucina puede comprender por lo menos una secuencia de repetición en tándem que comprende la SEQ ID NO: 14. El número de unidades de repetición en tándem puede variar entre 1 y 5 en un ligador de polipéptido de dominio de mucina de la invención.
Los ligadores de polipéptido de dominio de mucina son capaces de separar de forma rígida el primer y segundo socios de fusión de polipéptido reduciendo de esta manera la posibilidad de que un socio de fusión interferirá con la
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actividad biológica del otro socio de fusión. El alto nivel de glucosilación de los ligadores de polipéptido de mucina proporciona protección contra la proteólisis y potencialmente aumenta la solubilidad de uno o ambos de los socios de fusión. Cuando la proteína de fusión es un ligador de dominio de mucina terapéutico humano se puede derivar de secuencias completamente humanas y el alto nivel de glucosilación también reduce el riesgo de inmunogenicidad en un humano. El grado de separación deseado entre los socios de fusión se puede personalizar para proporcionar la actividad máxima de la proteína de fusión al variar el número de repeticiones en tándem que comprenden el polipéptido del dominio de mucina.
Por lo menos uno del primer socio de fusión o el segundo socio de fusión es una proteína activa de longitud completa circularmente permutada, un fragmento circularmente permutado de una proteína activa o una variante de secuencia permutada circularmente de una proteína activa, en la que la proteína permutada circularmente, fragmento o variante de secuencia retiene por lo menos una actividad biológica de la proteína activa nativa.
El primer socio de fusión puede ser IL-1RI o una secuencia de aminoácidos homóloga al mismo con por lo menos 95% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido.
La proteína de fusión de la invención puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 o una secuencia de aminoácidos homóloga al mismo con por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia. La proteína de fusión de la invención puede tener la secuencia de aminoácidos de residuos 24-452 de la SEQ ID NO.2.
La bioactividad mejorada de la proteína de fusión puede ser vida media aumentada.
Se puede utilizar un ligador de polipéptido de dominio de mucina solo o en combinación con una secuencia de ligadores flexible adicionales, y también puede comprender una etiqueta para purificación. El ligador de polipéptido de dominio de mucina también puede impartir propiedades mejoradas (por ejemplo propiedades farmacocinéticas y/o fisicoquímicas) sobre la proteína de fusión comparación con la proteína de fusión que no comprende un ligador de polipéptido de dominio de mucina.
También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y métodos para elaborar los polipéptidos métodos para elaborar los polipéptidos. Por lo tanto, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión del primer aspecto.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión del primer aspecto, opcionalmente que comprende adicionalmente una secuencia reguladora recombinante ligada operablemente a la secuencia de polinucleótidos.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector de expresión del tercer aspecto. Las proteínas de fusión de esta invención se puede elaborar al transformar células anfitrionas con ácido nucleico que codifica la fusión, cultivar la célula anfitriona y recuperar la fusión del cultivo, o alternativamente al generar una construcción de ácido nucleico que codifica la fusión y producir el polipéptido mediante síntesis libre de células, cuya síntesis puede incluir reacciones de transcripción y traducción acopladas.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la bioactividad de una proteína de fusión que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido, el método comprende las etapas de:
a) proporcionar un primer socio de fusión de polipéptido, un segundo socio de fusión de polipéptido y un ligador de polipéptido de dominio de mucina;
b) ligar el primer socio de fusión de polipéptido al segundo socio de fusión de polipéptido mediante el ligador de polipéptido de dominio de mucina para formar una proteína de fusión que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido en el que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador de polipéptido de dominio de mucina;
c) medir por lo menos una medida de bioactividad de la proteína de fusión de la etapa (b) con una proteína de fusión que comprende el primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador de polipéptido de dominio de mucina; y
d) determinar que la bioactividad medida de la proteína de fusión de la etapa (b) se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador de polipéptido de dominio de mucina; en el que la proteína de fusión creada en la etapa b) comprende la proteína de fusión del primer aspecto.
Las proteínas de fusión se pueden purificar y formular en vehículos farmacológicamente aceptables para administración a un paciente.
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Por lo tanto, en un sexto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión del primer aspecto y por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se proporciona la composición farmacéutica del sexto aspecto para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno o afección.
La enfermedad o trastorno o afección se puede seleccionar de: diabetes tipo 2, hemofilia, neutropenia, anemia, trombocitopenia, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, osteoartritis; y/o la composición farmacéutica se puede administrar por vía subcutánea, vía intramuscular o vía intravenosa.
Dichas proteínas de fusión encuentran uso como reactivos inmunológicamente específicos; por ejemplo, para aumentar la vida media en plasma de un polipéptido de interés o para dirigir la proteína a un tipo de célula particular.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Construcciones base y construcciones que contienen un ligador de mucina. RDB1800 es una proteína de fusión IL-1Ra_Fc, RDB1819 análoga a RDB1800 pero contiene una secuencia de mucinas intermedia entre los dominios IL-1Ra y Fc. De manera similar, RDB1601 es una proteína de fusión gp130(D1-D3)_Fc, con los dominios D1 a D3 de gp130 directamente ligados a un dominio IgG1 Fc, y RDB1613 contiene una secuencia de mucinas entre gp130 (D1-D3) y los dominios Fc.
Figura 2: Inhibición de la señalización de IL1(3 por IL-1Ra f-®-), RDB1800 ('■") y RDB1819 (■A"1) en el ensayo de células HEK-blue™. Los valores estimados de IC50 se reportan en la esquina superior derecha de la figura.
Figura 3: Cromatograma de filtración en gel de RDB1800 (gris claro) y RDB1819 (discontinuo, gris oscuro) y estándares de tamaño molecular (sólido, gris oscuro). Los pesos moleculares de los estándares se enumeran anteriormente de sus picos de elución.
Figura 4: Los efectos inhibidores de una sola inyección de 20 mg/kg de RDB1800 y RDB1819 en el modelo de inflamación CAIA de ratón. Las flechas negras indican los días de inyección con el cóctel de anticuerpos monoclonales (mAb) y con LPS y molécula de tratamiento. El % de reducción en el edema de la pata se calculó para cada compuesto en comparación con el control de la solución salina. Se utilizó un grupo de diez ratones para cada tratamiento.
Figura 5: Inhibición de la diferenciación mediada por IL-6 de células M1 RDB1601 (~®~) y RDB1613 ("A1 ). Los valores estimados de IC50 se reportan en la tabla.
Figura 6: Inhibición de la diferenciación mediada por IL-6 de células M1 por RDB1542 y RDB1562.
Figura 7: Señalización dependiente de IL-1p en células IL-1 p HEK-Blue™ por RDB1840 y RDB1841 Descripción detallada de la invención
Sigue una descripción de las realizaciones preferidas de la invención.
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.
Como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, que incluyen mezclas de las mismas.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y se puede interrumpir por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado, por ejemplo, mediante formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como la conjugación con un componente de marcado.
Como se utiliza en este documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen, pero no se limitan a, glicina y ambos isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Los códigos estándar de una o tres letras se utilizan para designar aminoácidos.
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El término "de origen no natural", como se aplica a las secuencias y como se utiliza en el presente documento, significa secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas que no tienen un equivalente, no son complementarias, o no tienen un alto grado de homología con una secuencia de tipo natural o de origen natural que se encuentra en un mamífero. Por ejemplo, un polipéptido de origen no natural puede compartir no más del 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% o incluso menos identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia natural cuando se alinee de forma adecuada.
Los términos "glucosilación" y "glucosilada" se utilizan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a la porción de carbohidrato de una proteína o al proceso mediante el cual los azúcares se unen postraduccionalmente a proteínas durante su producción en células para formar glucoproteínas. La glucosilación de proteínas ligadas a O es un evento postraduccional y se refiere a la unión de glicanos a serina y treonina y, en menor medida, a hidroxiprolina e hidroxilisina.
Un "fragmento" es una forma truncada de una proteína activa nativa que retiene por lo menos una porción de la actividad terapéutica y/o biológica. Una "variante" es una proteína con homología de secuencia con la proteína activa nativa que retiene por lo menos una porción de la actividad terapéutica y/o biológica de la proteína activa. Por ejemplo, una proteína variante puede compartir por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína activa de referencia. Como se utiliza en el presente documento, el término "fracción de proteína activa" incluye proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, inserciones, o accidentalmente a través de mutaciones.
Una "célula anfitriona" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para los vectores del sujeto. Las células anfitrionas incluyen la progenie de una única célula anfitriona. La progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en genómica del complemento de ADN total) a la célula pariente original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula anfitriona incluye células transfectadas in vivo con un vector de esta invención.
"Aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos divulgados en el presente documento, significa polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Como es evidente para aquellos expertos en la técnica, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos del mismo de origen no natural no requiere "aislamiento" para distinguirlo de su equivalente natural. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, "concentrado", "separado" o "diluido", o fragmentos del mismo, se distinguen de su equivalente natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es generalmente mayor que aquel de su equivalente de origen natural. En general, un polipéptido producido por medios recombinantes y expresado en una célula anfitriona se considera "aislado".
Un ácido nucleico que codifica un polinucleótido o polipéptido "aislado" u otro ácido nucleico que codifica un polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aislado es distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos aislados se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido específico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aislado incluye moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos contenidos en células que ordinariamente expresan el polipéptido en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica o extracromosómica diferente de aquella de las células naturales.
"Conjugado", "ligado", "fusionado" y "fusión" se utilizan de forma intercambiable en este documento. Estos términos se refieren a la unión de dos o más elementos o componentes químicos, por cualquier medio que incluye conjugación química o medios recombinantes. Por ejemplo, un promotor o potenciador se liga operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "operativamente unida" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas, y en fase de lectura o en marco. Una "fusión en el marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) para formar un ORF continuo más largo, de una manera que mantiene el marco de lectura correcto de los ORF originales. Por lo tanto, la proteína de fusión recombinante resultante es una sola proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están tan unidos en la naturaleza).
En el contexto de polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección terminal amino a carboxilo en la que los residuos que se encuentran próximos en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido. Una "secuencia parcial" es una secuencia lineal de parte de un polipéptido que se sabe que comprende residuos adicionales en una o ambas direcciones.
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, una secuencia rica en glicina eliminada de su secuencia codificante nativa y unida
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operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es una secuencia heteróloga rica en glicina. El término "heterólogo” como se aplica a un polinucleótido, un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad genotípicamente distinta de aquella del resto de la entidad con la que se compara.
Los términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos", "nucleótidos" y "oligonucleótidos" se utilizan de forma intercambiable. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definido a partir del análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si está presente, pueden impartirse modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un
"Recombinante” como se aplica a un polinucleótido significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de clonación in vitro, etapas de restricción y/o ligación, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que se puede expresar potencialmente en una célula anfitriona.
Los términos "gen" o "fragmento de gen" se utilizan de forma intercambiable en este documento. Se refieren a un polinucleótido que contiene por lo menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una proteína particular después de transcribirse y traducirse. Un gen o fragmento de gen puede ser genómico o de ADNc, siempre que el polinucleótido contenga por lo menos un marco de lectura abierto, que puede cubrir toda la región de codificación o un segmento de la misma. Un "gen de fusión" es un gen compuesto mediante por lo menos dos polinucleótidos heterólogos que están unidos entre sí.
"Homología" u "homólogo" se refiere a la similitud de secuencia o intercambiabilidad entre dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. Cuando se utiliza un programa como BestFit para determinar la identidad, similitud u homología de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos diferentes, se pueden utilizar las configuraciones predeterminadas, o se puede seleccionar una matriz de puntuación apropiada, tal como blosum45 o blosum80, para optimizar los puntajes de identidad, similitud u homología. Preferiblemente, los polinucleótidos que son homólogos son aquellos que se hibridan bajo condiciones rigurosas como se define en este documento y tienen por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 97%, más preferiblemente 98%, e incluso más preferiblemente el 99% de identidad de secuencia con aquellas secuencias.
Los términos "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" incluyen referencias a condiciones bajo las cuales un polinucleótido se hibridará con su secuencia objetivo, en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente). Generalmente, la rigurosidad de la hibridación se expresa, en parte, con referencia a la temperatura y la concentración de sal bajo la cual se lleva a cabo la etapa de lavado. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente ión de Na 1.5 M, normalmente aproximadamente concentración de iones Na de 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para polinucleótidos cortos (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para polinucleótidos largos (por ejemplo, más de 50 nucleótidos), por ejemplo, las "condiciones rigurosas" pueden incluir hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37 °C, y tres lavados durante 15 minutos cada uno en 0.1 X SSC/SDS al 1% a 60 a 65 °C. Alternativamente, se pueden utilizar temperaturas de aproximadamente 65 °C, 60 °C, 55 °C o 42 °C. La concentración de SSC puede variar desde aproximadamente 0.1 a 2XSCS, estando presente SDS a aproximadamente 0.1%. Dichas temperaturas de lavado normalmente se seleccionan para que estén aproximadamente 5 °C. a 20 °C por debajo del punto de fusión térmico para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Una ecuación para calcular la Tm y las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos es bien conocida y se puede encontrar en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.; específicamente, véase el Volumen 2 y Capítulo 9. Normalmente, los reactivos de bloqueo se utilizan para bloquear la hibridación no específica. Dichos reactivos de bloqueo incluyen, por ejemplo, ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado a aproximadamente 100-200 pg/ml. El solvente orgánico, tal como formamida a una concentración de aproximadamente 35-50% v/v, también se puede utilizar bajo circunstancias particulares, tal como para hibridaciones de ARN: ADN. Las variaciones útiles sobre estas condiciones de lavado serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.
Los términos "porcentaje de identidad" y "% de identidad", como se aplican a secuencias de polinucleótidos, se refieren al porcentaje de coincidencias de residuos entre por lo menos dos secuencias de polinucleótidos alineadas
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utilizando un algoritmo estandarizado. Dicho algoritmo se puede insertar, de forma estandarizada y reproducible, los huecos en las secuencias que se están comparando para optimizar la alineación entre dos secuencias y, por lo tanto, lograr una comparación más significativa de las dos secuencias. El porcentaje de identidad se puede medir a lo largo de una secuencia de polinucleótidos definida completa, por ejemplo, como se define mediante un número de SEQ ID particular, o se puede medir en una longitud más corta, por ejemplo, sobre la longitud de un fragmento tomado de una secuencia de polinucleótidos definida más grande, por ejemplo, un fragmento de por lo menos 45, por lo menos 60, por lo menos 90, por lo menos 120, por lo menos 150, por lo menos 210 o por lo menos 450 residuos contiguos. Dichas longitudes son solo a modo de ejemplo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento soportada por las secuencias mostradas en este documento, en las Tablas, Figuras o Listado de Secuencias, se puede utilizar para describir una longitud sobre la que se puede medir el porcentaje de identidad.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos", con respecto a las secuencias de polipéptidos identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de consulta que son idénticos a los residuos de aminoácidos de una segunda secuencia de polipéptidos de referencia o una porción de la misma, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software de computadora disponible públicamente tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen los algoritmos necesarios para lograr una alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. El porcentaje de identidad se puede medir a lo largo de una secuencia de polipéptidos definida completa, por ejemplo, como se define mediante un número de SEQ ID particular, o se puede medir en una longitud más corta, por ejemplo, a lo largo de un fragmento tomado de una secuencia de polipéptidos definida, más grande, por ejemplo, un fragmento de por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 70 o por lo menos 150 residuos contiguos. Dichas longitudes son solo a modo de ejemplo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento soportada por las secuencias mostradas en este documento, en las Tablas, Figuras o Listado de Secuencias, se puede utilizar para describir una longitud sobre la que se puede medir el porcentaje de identidad.
Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, preferiblemente autorreplicante en un anfitrión apropiado, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre células anfitrionas. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula, la replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriores. Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula anfitriona apropiada, se puede transcribir y traducir en un polipéptido. Un "sistema de expresión" normalmente connota una célula anfitriona adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.
"Resistencia a la degradación", tal como se aplica a un polipéptido, se refiere a la capacidad de los polipéptidos para resistir la degradación en sangre o componentes de la misma, que normalmente implica proteasas en el suero o plasma, o dentro de una formulación destinada a almacenamiento o vehículo de suministro para una proteína. La resistencia a la degradación se puede medir al combinar la proteína con sangre, suero, plasma o una formulación humana (o ratón, rata, mono, según corresponda), normalmente durante un rango de días (por ejemplo, 0.25, 0,5, 1, 2, 4,8, 16 días), a temperaturas específicas tales como -80 °C, -20 °C, 0 °C, 4 °C, 25 °C y 37 °C. La proteína intacta en las muestras se mide utilizando técnicas estándar de cuantificación de proteínas. El punto de tiempo en el que se degrada el 50% de la proteína es la "vida media de degradación" de la proteína.
El término "vida media" se refiere normalmente al tiempo requerido para que la concentración en plasma de un fármaco se reduzca a la mitad. Los términos "vida media", "W, "vida media de eliminación" y "vida media circulante" se utilizan de forma intercambiable en este documento.
"Peso molecular aparente" es un término que se refiere a una medida del aumento o disminución relativa del peso molecular aparente exhibido por una secuencia de aminoácidos particular. El peso molecular aparente se determina utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y métodos similares en comparación con los estándares de proteínas globulares y se mide en unidades "kD aparentes".
El "radio hidrodinámico" es el radio aparente (Rh en nm) de una molécula en una solución calculada a partir de propiedades difusionales. El "radio hidrodinámico" de una proteína afecta su velocidad de difusión en solución acuosa así como su capacidad para migrar en geles de macromoléculas. El radio hidrodinámico de una proteína está influenciado por su peso molecular así como por su estructura, que incluye forma y compatibilidad, y su estado de hidratación. Los métodos para determinar el radio hidrodinámico son bien conocidos en la técnica, tal como mediante el uso de DLS y cromatografía de exclusión por tamaño. La mayoría de las proteínas tienen estructura globular, que es la estructura tridimensional más compacta que una proteína puede tener con el radio hidrodinámico más pequeño. Algunas proteínas adoptan una conformación aleatoria y abierta, no estructurada o "lineal" y como
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resultado tienen un radio hidrodinámico mucho mayor en comparación con las proteínas globulares típicas de peso molecular similar.
Las "condiciones fisiológicas" se refieren a un conjunto de condiciones en un anfitrión vivo así como en condiciones in vitro, que incluyen temperatura, concentración de sal, pH, que imitan esas condiciones de un sujeto vivo. Se ha establecido un anfitrión de condiciones fisiológicamente relevantes para su uso en ensayos in vitro. Generalmente, un tampón fisiológico contiene una concentración fisiológica de sal y se ajusta a un pH neutro que varía de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.8, y preferiblemente de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.5. Una variedad de tampones fisiológicos se enumera en Sambrook et al. (1989). La temperatura fisiológicamente relevante varía desde aproximadamente 25 °C. a aproximadamente 38 °C, y preferiblemente desde aproximadamente 35 °C a aproximadamente 37 °C.
"Agente de liberación controlada", "agente de liberación lenta", "formulación de depósito" o "agente de liberación sostenida" se utilizan de forma intercambiable para referirse a un agente capaz de extender la duración de la liberación de un polipéptido de la invención en relación con la duración de liberación cuando el polipéptido se administra en ausencia de agente.
El término "antagonista", como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido nativo divulgado en este documento. Los métodos para identificar antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido nativo con una molécula antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido nativo. En el contexto de la presente invención, los antagonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anticuerpos o cualquier otra molécula que disminuya el efecto de una proteína activa.
El término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido nativo divulgado en este documento. Las moléculas agonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas nativos, etc. Los métodos para identificar agonistas de un polipéptido nativo pueden comprender poner en contacto un polipéptido nativo con una molécula agonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido nativo.
"Actividad" para los propósitos del presente documento se refiere a una acción o efecto de un componente de una proteína de fusión compatible con aquella de la proteína activa nativa correspondiente, en la que la "actividad biológica" o "bioactividad" según se utilizan estos términos de forma intercambiable se refiere aquí a una función o efecto biológico in vitro o in vivo, que incluye, pero no se limita a, unión a receptor, actividad antagonista, actividad agonista o una respuesta celular o fisiológica.
Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" o "tratar" o "aliviar" o "mejorar" se utilizan de forma intercambiable en el presente documento. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o la mejora del trastorno subyacente que se está tratando. También, se logra un beneficio terapéutico con la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente de tal manera que se observa una mejora en el sujeto, a pesar de que el sujeto todavía puede estar afectado por el trastorno subyacente. Para beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un sujeto que reporta uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque no se haya realizado un diagnóstico de esta enfermedad.
Un "efecto terapéutico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un efecto fisiológico, que incluye pero no se limita a la cura, mitigación, mejora o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o para mejorar el bienestar físico o mental de humanos o animales, provocado por una proteína de fusión de la invención distinta de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por la proteína activa. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en este documento.
Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" y "dosis terapéuticamente efectiva", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una cantidad de una proteína activa, ya sea solo o como parte de una composición de proteína de fusión, que es capaz de tener cualquier cantidad detectable, efecto beneficioso sobre cualquier síntoma, aspecto, parámetro medido o características de un estado de enfermedad o afección cuando se administra en una o dosis únicas repetidas a un sujeto. Dicho efecto no necesita ser absoluto para ser beneficioso.
El término "régimen de dosificación terapéuticamente efectivo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un programa para dosis administradas consecutivamente de una proteína activa, solo o como parte de una composición de proteína de fusión, en la que las dosis se administran en cantidades terapéuticamente efectivas para
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dar como resultado un efecto beneficioso sostenido sobre cualquier síntoma, aspecto, parámetro medido o características de un estado de enfermedad o afección.
Proteínas de Fusión
Se divulgan en el presente documento las proteínas de fusión que comprenden un primer socio de fusión de polipéptido unido a un segundo socio de fusión de polipéptido por un ligador de polipéptido de dominio de mucina. Como se utiliza en este documento, los términos "proteína de fusión" o "polipéptido de fusión" o equivalentes gramaticales del presente documento significan una proteína compuesta de una pluralidad de componentes de proteína, que normalmente no están unidos en su estado nativo pero están unidos por sus respectivos terminales amino y carboxilo a través de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina de la invención. "Proteína" en este contexto incluye proteínas, polipéptidos y péptidos. La pluralidad en este contexto significa por lo menos dos, y las realizaciones preferidas generalmente utilizan un primer y un segundo socio de fusión de polipéptidos unidos a través de un ligador de polipéptido de dominio de mucina de acuerdo con la invención.
Por lo menos uno o ambos del primer y segundo socios de fusión de polipéptidos son proteínas activas y/o proteínas terapéuticas activas según se define dicho término en este documento. De acuerdo con la invención, la actividad terapéutica/biológica de por lo menos uno de los socios de fusión de polipéptidos mejora cuando se une al otro socio de fusión a través de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina de acuerdo con la invención en comparación con los mismos socios de fusión de polipéptidos no ligados a través de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina de acuerdo con la invención.
Las proteínas de mucina y los dominios de mucina de proteínas contienen un alto grado de glucosilación que permite estructuralmente que las proteínas de mucina y otros polipéptidos que comprenden dominios de mucina se comporten como espirales aleatorios rigidizados. Como tales, los dominios de mucina están presentes en una variedad de moléculas y receptores de adhesión anclados a la membrana (que incluyen, pero no se limitan a, receptor de LDL, CD164, endosialina, fractalquina, las selectinas, TIM (mucina Ig de transmembrana), en la que su función es para extender el dominio "activo" lejos de la superficie de la célula para una interacción óptima (Fong et al., J. Biol.Chem, 275 (6), (2000)). Por analogía, la estructura enrollada aleatoria rígida en combinación con los carbohidratos hidrofílicos ramificados hidrófilos que componen los dominios de mucina fuertemente glucosilados puede ser particularmente útil para proporcionar control de la separación entre los dos socios de fusión en cuanto al control de la longitud y rigidez de la separación entre dos socios de fusión.
Adicionalmente, los carbohidratos hidrofílicos ramificados hidrófilos que constituyen los dominios de mucina fuertemente glucosilados del ligador de polipéptidos del dominio de mucina son deseables para aumentar el radio hidrodinámico de la proteína de fusión más allá de lo que se esperaría solo con base en el peso molecular agregado. Dicho aumento en el radio hidrodinámico imparte cualidades deseables sobre la proteína de fusión tal como, por ejemplo, el aumento de la vida media en suero de una proteína de fusión terapéutica.
El alto nivel de glucosilación proporcionado por la adición de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina también tiene el potencial de modificar las propiedades fisicoquímicas de una proteína tal como la carga, la solubilidad y las propiedades viscoelásticas de las soluciones concentradas de la proteína activa.
Un diseño de proteína de fusión combina la región o regiones de unión de un primer socio de fusión de polipéptidos a través de un ligador de la invención, a un segundo socio de fusión de polipéptido que es la totalidad o una porción de una inmunoglobulina. Generalmente, como el término se utiliza en la especificación, "inmunoglobulina" o "dominio de inmunoglobulina" pretende incluir todos los tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc.) de todas las fuentes (por ejemplo, humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otro mamífero, pollo, pavo, emú, otras aves, etc.). Se prefieren inmunoglobulinas de humanos cuando las proteínas de fusión de la invención se utilizan para tratar humanos.
En una realización, uno o más socios de fusión de inmunoglobulina comprenden las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Normalmente, en dichas fusiones de terminal N, el polipéptido de fusión codificado retendrá por lo menos los dominios de bisagra, CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan en el extremo C de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente en el extremo N del CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera.
El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; los sitios particulares son bien conocidos y se pueden seleccionar para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de las proteínas de fusión. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención se ensamblan como monómeros, o hetero- u homo-multímeros, y particularmente como dímeros o tetrámeros como se conoce en la técnica. Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina, puede estar presente una cadena ligera de inmunoglobulina asociada covalentemente o fusionada directamente al polipéptido.
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Los socios de fusión divulgados en este documento comprenden albúmina de suero o un dominio de albúmina de suero. Se puede preferir la albúmina sérica humana cuando las proteínas de fusión divulgadas en este documento se utilizan para tratar seres humanos. Los socios de fusión pueden comprender transferrina humana.
De particular interés son las proteínas de fusión para las que se busca un aumento en la bioactividad de la proteína de fusión en comparación con la misma fusión de proteínas activas en ausencia de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina. También son de interés las proteínas de fusión para las cuales se busca un aumento en un parámetro farmacocinético tal como vida media en suero, solubilidad incrementada, estabilidad incrementada o alguna otra propiedad farmacéutica mejorada en comparación con la misma fusión de proteínas activas en ausencia de un ligador de polipéptido de dominio de mucina.
La actividad de las composiciones de proteína de fusión de la invención, que incluyen las características funcionales o la actividad biológica y farmacológica y los parámetros que resultan, se pueden determinar mediante cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica para medir la característica deseada. La actividad y estructura de las proteínas de fusión se pueden medir mediante ensayos descritos en el presente documento, ensayos de los Ejemplos o mediante métodos conocidos en la técnica para determinar la vida media, el grado de solubilidad, la estructura y la retención de la actividad biológica de las proteínas de fusión de la invención así como las comparaciones con proteínas activas que no son proteínas de fusión de la invención. La cuantificación de los ensayos de actividad biológica (potencia) incluye, pero no se limita por, ensayos de unión in vitro (tales como ELISA, resonancia de plasmón superficial, ensayos de cambio térmico, RMN, sedimentación, proximidad de centelleo, FRET, anisotropía de fluorescencia), ensayos con base en células in vitro (tales como gen informador, fosforilación, diferenciación celular, crecimiento o viabilidad celular, complementariedad de enzimas, marcaje celular) y actividades farmacológicas in vivo (que incluyen modelos animales de enfermedad).
Las proteínas de fusión de la invención se pueden producir a través de medios de expresión estándar sin la necesidad de otras etapas de conjugación y purificación. Los ligadores de polipéptidos de dominio de mucina se pueden ligar a uno o ambos socios de fusión a través del extremo N o C del socio de fusión. Los ligadores de polipéptidos de dominio de mucina son estructuralmente menos restrictivos que otros socios de fusión porque son proteínas monoméricas no globulares que tienen un volumen reducido y un riesgo reducido de impacto sobre la bioactividad.
Cuando se hace referencia a la proteína de fusión, el término "ligado" o "fusionado" o "fusión" pretende indicar que los ligadores de polipéptidos de dominio de mucina y los socios de fusión de polipéptido se expresan como un único polipéptido en células de una manera que permite la glucosilación ligada a O del polipéptido del dominio de mucina y mantiene la actividad de la proteína activa.
Una proteína de fusión de la invención se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, al emplear extremos terminados romos o escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los términos apropiados, rellenando de extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden hibridar posteriormente y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente para ayudar a las fracciones de fusión y se analizarán con más detalle a continuación.
Ligadores de polipéptidos de dominio de mucina
Un "ligador de polipéptido de dominio de mucina" se define en el presente documento como cualquier proteína que comprende un "dominio de mucina" capaz de unirse a uno o más socios de polipéptidos de fusión. Un dominio de mucina es rico en sitios de glucosilación potenciales, y tiene un alto contenido de serina y/o treonina y prolina, que puede representar más del 40% de los aminoácidos dentro del dominio de mucina. Un dominio de mucina está muy glucosilado con glicanos predominantemente enlazados a O. Un polipéptido de dominio de mucina tiene por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos 80%, o por lo menos 90% de su masa debido a los glucanos. Los dominios de mucina pueden comprender unidades de repetición de aminoácidos en tándem (también denominadas aquí TR) que pueden variar en longitud desde aproximadamente 8 aminoácidos hasta 150 aminoácidos por cada unidad de repetición en tándem. El número de unidades de repetición en tándem puede variar entre 1 y 25 en un polipéptido de dominio de mucina de la invención.
Los ligadores de polipéptidos de dominio de mucina de la invención comprenden la totalidad o una porción de una secuencia de polipéptidos de dominio de mucina codificada por un gen mUc seleccionado del grupo que consiste en MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7. , MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC 15, MUC16, MUC 17, MUC 19, MUC20, MUC21. Una "porción del mismo" significa que el ligador
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depolipéptido de mucina comprende por lo menos un dominio de mucina de una proteína de mucina. El dominio de mucina de una proteína de mucina está normalmente flanqueado en ambos lados por regiones de aminoácidos no repetitivas. Un polipéptido de dominio de mucina puede comprender la totalidad o una porción de una proteína de mucina (por ejemplo, MUC20). Un polipéptido de dominio de mucina puede comprender la totalidad o una porción de una proteína de mucina de una proteína de mucina soluble. Preferiblemente, el polipéptido de dominio de mucina comprende la porción extracelular de una proteína de mucina.
Un polipéptido de dominio de mucina también puede comprender la totalidad o una porción de una proteína que comprende un dominio de mucina pero que no está codificada por un gen de MUC. Dichas proteínas de origen natural que no están codificadas por un gen MUC pero que comprenden dominios de mucina incluyen, pero no se limitan a, proteínas ancladas a membrana tales como inmunoglobulina de transmembrana y proteínas de la familia del dominio de mucina (TIM), fractalquina (neurotactina), selectina P ligando glicoproteico 1 (PSGL-1, CD162), CD34, CD43 (leucosialina, sialophorina), Cd45, CD68, CD96, CD164, GlyCAM-1, MAdCAM, E-selectina, P- selectina, L-selectina, glicoplasas de glóbulos rojos , glucocalicina, glucoforina, LDL-R, ZP3, endosialina, factor de aceleración de decaimiento (daf, CD55), podocalixina, endoglican, alfa-distroglican, neurofascin, EMR1, EMR2, EMR3, EMR4, ETL y epiglicanina.
Un ligador de polipéptido de dominio de mucina también puede comprender un polipéptido no natural que tiene un dominio de mucina según se define dicho término en el presente documento. El polipéptido de dominio de mucina se puede diseñar de novo para que comprenda un dominio de mucina de acuerdo con la invención.
El ligador de polipéptidos del dominio de mucina puede no estar glucosilado por a1,3, galactosiltransferasa o (31,6- acetilglucosaminiltransferasa. La proteína de fusión puede no unirse a un anticuerpo específico para un aGal. La proteína de fusión de la invención puede no unir un anticuerpo específico Gal a1, Gal.
Un ligador de polipéptidos de dominio de mucina puede comprender dominios de repeticiones de aminoácidos en tándem que son ricas en Pro, Ser y Thr. En una realización de la invención, el número de unidades de repetición en tándem dentro de un ligador de polipéptidos de dominio de mucina de la invención está entre 1 y 25. Preferiblemente, el número de unidades de repetición en tándem dentro de un ligador de polipéptido de dominio de mucina está entre 2 y 20. Más preferiblemente, el número de unidades de repetición en tándem dentro de un polipéptido de dominio de mucina es por lo menos aproximadamente 4. El porcentaje de restos de serina y/o treonina y prolina dentro de un polipéptido de dominio de mucina de la invención puede ser de por lo menos 10%. Preferiblemente, el porcentaje de residuos de serina y/o treonina y prolina dentro de un polipéptido de dominio de mucina de la invención es por lo menos 20%. Más preferiblemente, el porcentaje de residuos de serina y/o treonina y prolina dentro de un polipéptido de dominio de mucina de la invención es mayor que 30%. Cada unidad de repetición de aminoácidos en tándem dentro del dominio de mucina puede estar compuesta de por lo menos 8 aminoácidos. Preferiblemente, cada unidad está compuesta de por lo menos 16 aminoácidos. Más preferiblemente, cada unidad está compuesta por por lo menos 19 aminoácidos, y cada unidad puede variar en longitud desde aproximadamente 19 aminoácidos hasta 150 aminoácidos.
El polipéptido de dominio de mucina puede comprender por lo menos 32 aminoácidos, que comprenden por lo menos 40% de serina, treonina y prolina. En una realización, un polipéptido de dominio de mucina de acuerdo con la invención comprende por lo menos 2, 4, 8, 10 o 12 unidades de repetición de aminoácidos en tándem de por lo menos 8 aminoácidos de longitud por unidad de repetición en tándem. Las secuencias de aminoácidos preferidas de una unidad de repetición en tándem incluyen, pero no se limitan a aquellas de la Tabla I. El polipéptido del dominio de mucina y/o ácidos nucleicos que codifican el polipéptido del dominio de mucina se pueden construir utilizando secuencias codificadoras de proteínas del dominio de mucina que son conocidos en la técnica y están disponibles públicamente a través de fuentes como GenBank.
Claims (17)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Una proteína de fusión que tiene bioactividad mejorada que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido, en la que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador de polipéptido de dominio de mucina, en el que la bioactividad de la proteína de fusión se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador de polipéptido de dominio de mucina, en el que;a) el ligador de polipéptido de dominio de mucina comprende todo o una porción de una secuencia de polipéptido de dominio de mucina codificada por un gen MUC seleccionado del grupo que consiste de MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC 16, MUC 17, MUC 19, MUC20, y MUC21 o una variante de la secuencia de polipéptidos de dominio de mucina con por lo menos 90% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido;b) el primer socio de fusión se selecciona del grupo que consiste de sTNFR2, CTLA4, TACI, LFA, IL-1RI, IL-1Ra, IL- 1RAcP, receptor de VEGF, GLP-1, exendina-4 y una secuencia de aminoácidos homóloga a cualquiea de los anteriores con por lo menos 95% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido; yc) el segundo socio de fusión de polipéptido comprende un dominio Fc de inmunoglobulina.
- 2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que por lo menos uno del primer socio de fusión o el segundo socio de fusión es una proteína activa de longitud completa circularmente permutada, un fragmento circularmente permutado de una proteína activa o una variante de secuencia permutada circularmente de una proteína activa, en el que la proteína permutada circularmente, fragmento o variante de secuencia retiene por lo menos una actividad biológica de la proteína activa nativa.
- 3. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, en la que el ligador de polipéptido de dominio de mucina comprende por lo menos una secuencia de repetición en tándem que comprende la SEQ ID NO: 14.
- 4. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente en la que el ligador de polipéptido de dominio de mucina comprende entre 1 y 5 repeticiones en tándem.
- 5. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en la que el primer socio de fusión es IL-1RI o una secuencia de aminoácidos homóloga al mismo con por lo menos 95% de identidad de secuencia en el nivel de aminoácido.
- 6. La proteína de fusión de la reivindicación 3, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia.
- 7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, que tiene la secuencia de aminoácidos de residuos 24-452 de la SEQ ID NO.2
- 8. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente.
- 9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente que comprende adicionalmente una secuencia reguladora recombinante ligada operablemente a la secuencia de polinucleótidos.
- 10. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.
- 11. Un método para aumentar la bioactividad de una proteína de fusión que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido, el método comprende las etapas de:a) proporcionar un primer socio de fusión de polipéptido, un segundo socio de fusión de polipéptido y un ligador de polipéptido de dominio de mucina;b) ligar el primer socio de fusión de polipéptido al segundo socio de fusión de polipéptido mediante el ligador de polipéptido de dominio de mucina para formar una proteína de fusión que comprende un primer socio de fusión de polipéptido y un segundo socio de fusión de polipéptido en el que el primer socio de fusión se liga al segundo socio de fusión mediante un ligador de polipéptido de dominio de mucina;c) medir por lo menos una medida de bioactividad de la proteína de fusión de la etapa (b) con una proteína de fusión que comprende el primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador de polipéptido de dominio de mucina; yd) determinar que la bioactividad medida de la proteína de fusión de la etapa (b) se mejora cuando se compara con la fusión del primer socio de fusión de polipéptido y el segundo socio de fusión de polipéptido en la ausencia del ligador del polipéptido del dominio mucina; en el que la proteína de fusión creada en la etapa b) comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.5
- 12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
- 13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno o 10 afección.
- 14. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13, en la que;a) la enfermedad o trastorno o afección se selecciona de: diabetes tipo 2, hemofilia, neutropenia, anemia, 15 trombocitopenia, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante,osteoartritis; y/ob) la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, vía intramuscular o vía intravenosa.20RD8ÍSOOftpemsRDB1S01
imagen1 = gp13G D1-D3imagen2 = Dominio Fes Dominio de Mucina^ = Bisagra de IgC Enlaces de disulfuro:imagen3 imagen4 ) ............-..... I--------------------------T—-------------------------»1 10 100 1000Concentración (nM)FIG.2enCT>imagen5 RDB1S19 95 224*Cálculo basado en la composición de aminoácidos, no incluye glucosilación—— Estándares de peso molecular RDB1SÜO — - ROB1819Vacioimagen6 ÍT 1 ViTimagen7 Volumen de retención (mL)FIG. 3El tratamiento RBD reduce el enema de pata.; (Porcentaje de reducción comparado con controles no tratados)imagen8 mAb LPS yTratamientoFÍG. 460 nenooCDJO<o I 40'_i oa»■a £_ M^ o -g O:> -§ •MO -sO<20-10'1SeqlBRDB1601RDB1613Antagonismo de actividad de IL-6RDS1601imagen9 Dominios/mutación IC50 (nM)DI-D3 gpl30:Fc 20.1D1-D3 gp 130 + 2 Muc20 TR + Fe 25FÍG. 5Fia 6Actividad de IL-6 (% de CD32 + células)enimagen10 X X O Q 00 CD<Ji gno ^NS NJ> - 81.03-90-639Z90088I-3205O
imagen11 enSI<04— - 0.01
imagen12 - 0.1
imagen13 FIG.7
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