KR20190102214A - 재조합 ＧｐＩｂα 수용체 단백질을 포함하는 조성물 - Google Patents

재조합 ＧｐＩｂα 수용체 단백질을 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 다양한 측면은 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 G233T, D235V 및 K237V로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 전형적으로 포함하는 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 전형적으로 포함하고, 이러한 재조합 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 임의로 포함한다.

Description

재조합 ＧｐＩｂα 수용체 단백질을 포함하는 조성물
폰빌레브란트병(von Willebrand Disease; vWD)은 심각한 진단 문제를 제기하는 것으로 알려진 흔한 유전성의 경미한 출혈 장애이다. vWD 환자는 그들의 일상 생활 동안 출혈에 시달리지 않을 수 있지만, 지혈 시도 기간 동안(예를 들어, 치과 치료, 수술, 출산 또는 수혈)에는 문제가 일어날 수 있다. 지혈 시도 과정 전에 의사는 일상적으로 지혈 패널(hemostasis panel)을 주문하고, 이는 종종 vWD에 대한 특정한 추가 검사로 이어진다.
폰빌레브란트 인자(vWF)는 많은 상이한 세포외 분자와 세포-표면 분자에 결합하고 지혈 및 응고에서 중요한 역할을 한다. vWF는 혈소판 응괴의 형성에서 특히 중요하며, 혈소판과 다른 세포외 분자(예를 들어, 내피하 콜라겐)를 가교결합시키는 당단백질 Ibα-V-IX 복합체를 포함하는 수많은 혈소판 세포-표면 단백질 복합체에 특이적으로 결합한다. 당단백질 Ibα-V-IX 복합체는 4 개의 서브유닛 GPIbα, GPIbβ, GPV 및 GPIX로 구성되며, 혈소판의 막 내에 존재한다. GPIbα 및 GPIbβ는 디설파이드 가교에 의해 결합되는 반면, GPV 및 GPIX는 복합체와 비공유 회합한다. GPIbα 서브유닛은 vWF, α-트롬빈, 백혈구 인테그린 αMβ2 및 P-셀렉틴에 대한 결합 부위를 지닌다.
vWD 진단은 이의 다양한 유형으로 인해 복잡하며, 이것은 전통적으로 기저 질환 기전의 명확한 이해를 제공하기 위해 다수의 검사를 필요로 한다. 1형 vWD는 vWF의 양적 결핍에 의해 유발된다. 2형 vWD는 질적 vWF 결핍에 의해 유발된다. 2형 vWD는 혈소판 부착을 감소시키는 기능적 vWF 다량체의 비율을 감소시키는 돌연변이에 의해 유발되는 2A형; 혈소판-vWF 결합을 증가시키는 vWF의 돌연변이에 의해 유발되는 2B형; vWF-의존적 혈소판 부착을 감소시키는 돌연변이에 의해 유발되는 2M형; 및 인자 VIII에 대한 결합을 손상시키는 돌연변이에 의해 유발되는 2N형으로 추가 세분된다. 3형 vWD는 vWF의 사실상 완전한 결핍 및 정상적으로는 순환 vWF에 의해 안정화되는 인자 VIII 감소에 의해 유발된다. 후천성 vWD는 일반적으로 또 다른 기저 병리상태와 관련하여 노령 환자에서 발생하는 비교적 희귀한 후천성 출혈 장애이다. 마지막으로, 혈소판형 vWD는 GPIbα를 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 당단백질 Ibα(GPIbα)에 대한 vWF 결합의 증진으로 인해 발생한다. 혈장 중의 총 vWF 농도를 측정하는 vWF 항원 분석법(vWF:Ag) 또는 항생제 리스토세틴에 의해 유도되는 응집 동안 혈소판의 GPIbα에 대한 vWF 결합을 측정하는 리스토세틴 보조인자 분석법(vWF:RCo)과 같은 상이한 분석법들이 vWF 활성을 정량하기 위해 개발되었다. 그러나, vWF:Ag 분석법은 존재하는 VWF의 질에 상관없이 환자의 혈장 중에 존재하는 vWF의 정량적 수준에 관한 정보만을 제공한다. 따라서, VWF:Ag는 그 자체만으로는 많은 질적 결함을 검출할 수 있게 하지 않을 것이다. 결국, vWF:RCo 분석법은 빌리루빈, 헤모글로빈, 인간 항-마우스 항체(HAMA) 류마티스인자 및 트리글리세라이드의 간섭으로 인한 부정확성에 시달릴 수 있다. 분석법의 부정확성에 더 추가되는 것은 리스토세틴 결합 부위에서의 유전적 변이 및 다형성이다. vWF:RCo의 정확도는 vVWF:Ag 농도가 감소될 때 특히 낮다.
상기 분석법들은 당단백질 Ibα의 세포외 도메인에 대한 vWF 결합에 의존한다. 그러나, 당단백질 Ibα-V-IX 복합체 및 전단 응력의 부재 하에, vWF는 비교적 약한 4.5 μM 친화성으로 당단백질 Ibα에 결합한다. 혈소판형 vWD 환자에서 확인된 당단백질 Ibα의 천연 발생 돌연변이는 W230L, G233V, G233S, D235Y, M239V 및 M239I를 포함하며, 각각 vWF와 당단백질 Ibα 사이의 결합 친화성을 증가시킨다([1] 내지 [9]).
vWD의 복잡성으로 인해, 완전한 진단을 제공할 수 있는 단일 실험실 검사는 없다. vWD의 진단은 현재 축소 보고되어 세계보건기구는 이의 유병률이 100,000 명 중 1.14 명이라 보고하고 있는 한편, 진단 연구는 유병률이 전체 인구의 약 1 %라 보고하고 있다. 진단을 위한 다양한 검사가 이용 가능하지만, 종종 전문가 의견에 심하게 편중된다. 정확한 검사 및 명확히 정의된 진단 기준은 그 질환의 진단이 여전히 미확정인 많은 환자에 대한 의학적 결과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 발명자들은 vWF A1 도메인에 대한 결합을 향상시키는 Gp1bα β-헤어핀 내의 신규 돌연변이를 발견하였다. 본 발명자들은 또한 vWD의 진단에서 사용될 상기 돌연변이를 포함하는 신규 재조합 폴리펩티드를 개발하였다.
실시형태의 다양한 측면은 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 재조합 폴리펩티드는 서열번호 19와 비교하여, G233T, D235V 및 K237V로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 전형적으로 포함하는 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 전형적으로 포함한다. 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 막관통 도메인(transmembrane domain)이 결여되어 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드 및 인간 폰빌레브란트 인자의 Kd는 1 μM, 750 nM, 500 nM, 250 nM 또는 100 nM 미만이다. Kd를 결정하는 방법이 특별히 한정되지는 않지만, Kd는 예를 들어 형광 비등방성 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 형광 비등방성 분석은, 예를 들어 느린-텀블링(slow-tumbling) 입자에 결합된 형광 표지된 폰빌레브란트 인자 및 재조합 폴리펩티드상에서 수행될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 표면-결합된 폰빌레브란트 인자 및 가용성 재조합 폴리펩티드상에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 19와 비교하여 돌연변이 C65S 및 G233T; 돌연변이 C65S 및 D235V; 돌연변이 C65S 및 K237V; 또는 돌연변이 C65S, G233T 및 M239T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250 개의 연속적 아미노산과 적어도 약 95 % 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 임의로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250 개의 연속적 아미노산과 적어도 약 95 % 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 임의로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 가교결합 도메인을 추가로 포함한다. 가교결합 도메인은 C-말단 시스테인, 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 스트렙타비딘 결합 단백질 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 16; 서열번호 17; 또는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 친화성 태그(tag)를 추가로 포함한다. 친화성 태그의 선택이 특별히 한정되지는 않지만, 친화성 태그는 임의로 폴리히스티딘 태그, Snap 태그, Clip 태그, HaloTag, SnoopTag, SpyTag, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, 칼모둘린-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, 바이오틴 카르복실 운반체 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그 및 항체의 Fc 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 6 개 내지 8 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 폴리히스티딘 태그이다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 43, 서열번호 44; 서열번호 45; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 추가로 포함한다. 올리고머화 도메인은 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 또는 동종오량체와 같은 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 형성할 수 있다. 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 33; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 % 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 33; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태의 다양한 측면은 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 돌연변이 C65A, G233V 및 M239V를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 26; 서열번호 27; 또는 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는, 서열번호 19와 비교하여 돌연변이 C65A, G233V 및 M239V를 포함하지 않지만 그 외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 가교결합 도메인을 추가로 포함한다. 가교결합 도메인은 임의로 C-말단 시스테인, 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 스트렙타비딘 결합 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가교결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 16; 서열번호 17; 또는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 친화성 태그를 추가로 포함한다. 친화성 태그의 선택은 특별히 한정되지는 않지만, 친화성 태그는 임의로 폴리히스티딘 태그, Snap 태그, Clip 태그, HaloTag, SnoopTag, SpyTag, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, 칼모둘린-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, 바이오틴 카르복실 운반체 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그 및 항체의 Fc 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 6 개 내지 8 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 폴리히스티딘 태그이다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 43, 서열번호 44; 서열번호 45; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 추가로 포함한다. 올리고머화 도메인은 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 또는 동종오량체와 같은 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 형성할 수 있다. 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태의 다양한 측면은 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 A238V 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 A238V 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 36이다.
실시형태의 다양한 측면은 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 Δ(229-240) 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 Δ(229-240) 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 38이다.
실시형태의 다양한 측면은 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 A238V 돌연변이 또는 Δ(229-240) 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 A238V 돌연변이 또는 Δ(229-240) 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 36 또는 서열번호 38이다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 가교결합 도메인을 추가로 포함한다. 가교결합 도메인은 임의로 C-말단 시스테인, 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 스트렙타비딘 결합 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가교결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 16; 서열번호 17; 또는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 친화성 태그를 추가로 포함한다. 친화성 태그의 선택은 특별히 한정되지는 않지만, 친화성 태그는 임의로 폴리히스티딘 태그, Snap 태그, Clip 태그, HaloTag, SnoopTag, SpyTag, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, 칼모둘린-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, 바이오틴 카르복실 운반체 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그 및 항체의 Fc 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 6 개 내지 8 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 폴리히스티딘 태그이다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그의 아미노산 서열은 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 43, 서열번호 44; 서열번호 45; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 올리고머화 도메인을 추가로 포함한다. 올리고머화 도메인은 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 또는 동종오량체와 같은 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 형성할 수 있다. 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인은 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 리더 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 20이다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드들 중 적어도 2 개를 포함하는 올리고머 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 임의로 CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa 또는 저캣(Jurkat) 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 전형적으로 (예를 들어, 프로모터가 적절한 발현 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 구동할 수 있도록) 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 있는 프로모터를 또한 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서(예를 들어, 상기)에서 설명되는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 세포는 발현 세포(예를 들어, CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa 또는 저캣 세포) 또는 클로닝 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli))일 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드 및 고체 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드가 (a) 고체 지지체에 공유 또는 비공유 결합되고/되거나 (b) 고체 지지체에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있는 조성물에 관한 것이다.
고체 지지체는 임의로 입자, 비드, 막, 표면, 폴리펩티드 칩, 마이크로티터 플레이트 또는 크로마토그래피 컬럼의 고체상일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 라텍스 입자이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 폰빌레브란트 인자(예컨대, 인간 폰빌레브란트 인자)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 복수의 입자 또는 비드를 포함하는 고체 지지체를 포함하고, 폰빌레브란트 인자는 상기 복수의 입자 또는 비드의 입자 또는 비드에 가교결합한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 혈장(예컨대, 인간 혈장)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 혈소판(예컨대, 인간 혈소판)을 추가로 포함한다.
도 1은 각종 재조합 폴리펩티드의 발현 및 순도를 확인시켜 주는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔의 사진을 포함한다. 겔의 레인은 다음과 같이 번호가 매겨진다: (1) 분자량 표준; (2) C65S 및 G233T 돌연변이, IgG1 Fc 이량체화 도메인 및 8-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(화살표; 하단 밴드는 뮤린 IgG1 불변 도메인에 상응한다)(서열번호 21); (3) C65S 및 G233T 변이체, p53 사량체화 도메인 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 22); (4) C65S, G233V 및 M239V 돌연변이, p53 사량체화 도메인 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 23); (5) C65S 및 G233T 돌연변이, 6-His 친화성 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 24); (6) C65S 및 G233T 돌연변이, 스트렙타비딘 결합 단백질 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 25); (7) C65A, G233V 및 M239V 돌연변이, p53 사량체화 도메인 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 26); (8) 분자량 표준; (9) 분자량 표준; (10) C65A, G233V 및 M239V 돌연변이 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 27); (11) C65A, G233V 및 M239V 돌연변이, 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 28); (12) G233V 및 M239V 돌연변이, FLAG 태그 및 6-His 친화성 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 29).
도 2는 형광 표지된 재조합 폰빌레브란트 인자 A1 도메인과, x-축에 표시된 바와 같은 돌연변이 및 C65S 돌연변이를 포함하는 각각 이량체화 도메인 및 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는 2 개의 재조합 폴리펩티드 서브유닛을 포함하는 입자-결합된 이량체 폴리펩티드 또는 입자-결합된 단량체 폴리펩티드 대조군(G233V, M239V - noFc (서열번호 35)) 사이의 형광 비등방성에 의해 평가된 해리 상수(Kd; y-축)를 나타내는 막대 그래프이다. 평가된 이량체 폴리펩티드들은 서열번호 38(Δ(229-240)); 서열번호 37(WT); 서열번호 36(A238V); 서열번호 34(G233V, M239V); 서열번호 32(G233V); 서열번호 33(G233T, M239T); 서열번호 21(G233T); 서열번호 30(D235V); 서열번호 31(K237V)에 상응한다. 돌연변이를 포함하지 않는 이량체 폴리펩티드는 약 1.25 μM의 Kd를 나타냈다. G233T, D235V 또는 K237V 돌연변이 중 하나를 포함한 재조합 폴리펩티드는 각각 500 nM 미만의 Kd를 나타냈다(예를 들어, 단일 돌연변이에 대해 각각 약 67 nM, 약 250 nM 및 약 300 nM).
도 3은 G233T 돌연변이를 포함하는 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는 가용성 재조합 폴리펩티드 및 표면-결합된 폰빌레브란트 인자의 비아코어(Biacore) 표면 플라스몬 공명 분석의 선 그래프이다. 본 분석은 폰빌레 브란트 인자와 G233T 재조합 폴리펩티드 사이의 해리 상수(Kd)가 58 nM였음을 제시하며, 이는 G233T 돌연변이체에 대해 Kd가 67 nM로 측정된 도 2의 형광 비등방성 Kd 측정치를 확인시켜 준다.
도 4a는 도 4b 내지 도 4d의 데이터를 생성하는 데 사용된 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 도식이다. 고체 지지체를 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드(CD42b; GPIbα; GP1b 작제물)를 고정시키는 데 사용된 항-당단백질 Ibα 항체(항-CD42b)로 코팅하였다. 이어서, 고체 지지체를 인간 혈장, 폰빌레브란트 인자 캘리브레이터(calibrator) 또는 폰빌레브란트 인자 대조군과 접촉시켰다. 이어서, 고체 지지체를 호스래디쉬 퍼옥시다제가 접합된 다클론 토끼 항-인간 폰빌레브란트 인자 항체와 접촉시켰다. 이어서, 조성물을 450 nm에서 강한 흡광도로 HRP에 의해 생성물로 전환될 수 있는 기질과 접촉시키고, 흡광도를 측정하였다.
도 4b는 C65S 및 D235V 돌연변이를 포함하는 혈소판 당단백질 Ibα의 변형 된 세포외 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 30)를 사용하는 도 4a의 ELISA에 대한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. x-축상의 처음 4 개 샘플은 각각 공지된 1형, 2B형, 3형 및 1형 폰빌레브란트병을 갖는 샘플(즉, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1))에 상응한다. 제5 샘플과 제6 샘플은 풀링된(pooled) 인간 혈장을 포함하는 대조 샘플(즉, DG-C1; DG-C2)이다. 제7 샘플은 염소 혈청 대조군(폰빌레브란트 인자가 결여됨)이다. 제8 내지 제17 샘플은 폰빌레브란트병이 없는 인간 혈장 샘플("정상")이다. 제18 내지 제22 샘플은 희석되지 않은 것(1:1)부터 16배 희석된 것(1:16)까지의 풀링된 인간 혈장의 참조 표준물의 연속 희석액에 상응한다. y-축은 450 nm에서의 흡광도(Abs)에 상응하고, 증가된 흡광도는 결합된 폰빌레브란트 인자의 증가에 상응한다.
도 4c는 C65S 및 K237V 돌연변이를 포함하는 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 31)를 사용하는 도 4a의 ELISA에 대한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. x-축상의 처음 4 개 샘플은 각각 공지된 1형, 2B형, 3형 및 1형 폰빌레브란트병을 갖는 샘플(즉, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1))에 상응한다. 제5 샘플과 제6 샘플은 풀링된 인간 혈장을 포함하는 대조 샘플(즉, DG-C1; DG-C2)이다. 제7 샘플은 염소 혈청 대조군(폰빌레브란트 인자가 결여됨)이다. 제8 내지 제17 샘플은 폰빌레브란트병이 없는 인간 혈장 샘플("정상")이다. 제18 내지 제22 샘플은 희석되지 않은 것(1:1)부터 16 배 희석된 것(1:16)까지의 풀링된 인간 혈장의 참조 표준물의 연속 희석액에 상응한다. y-축은 450 nm에서의 흡광도(Abs)에 상응하고, 증가된 흡광도는 결합된 폰빌레브란트 인자의 증가에 상응한다.
도 4d는 C65S 및 G233T 돌연변이를 포함하는 혈소판 당 단백질 Ibα의 변형 된 세포외 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 21)를 사용하는 도 4a의 ELISA에 대한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. x-축상의 처음 4 개 샘플은 각각 공지된 1형, 2B형, 3형 및 1형 폰빌레브란트병을 갖는 샘플(즉, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1))에 상응한다. 제5 샘플과 제6 샘플은 풀링된 인간 혈장을 포함하는 대조 샘플(즉, DG-C1; DG-C2)이다. 제7 샘플은 염소 혈청 대조군(폰빌레브란트 인자가 결여됨)이다. 제8 내지 제17 샘플은 폰빌레브란트병이 없는 인간 혈장 샘플("정상")이다. 제18 내지 제22 샘플은 희석되지 않은 것(1:1)부터 16 배 희석된 것(1:16)까지의 풀링된 인간 혈장의 참조 표준물의 연속 희석액에 상응한다. y-축은 450 nm에서의 흡광도(Abs)에 상응하고, 증가된 흡광도는 결합된 폰빌레브란트 인자의 증가에 상응한다.
하기 설명은 단지 본 발명의 다양한 실시형태를 설명하고자 의도된다. 이와 같이, 논의되는 구체적 변형은 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다양한 등가물, 변화 및 변형이 본 발명에 제시된 주제의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이며, 이러한 등가 실시형태들은 본 발명에 포함된다는 것이 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용하는 경우, 단수형(원문의 "a", "an" 및 "the")은 내용상 분명히 다르게 표시하지 않는 한 복수형의 지시대상 (reference)을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)"란 단어 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형어는 언급된 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 군을 제외하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서의 각 실시형태는, 달리 명백하게 언급하지 않는 한, 모든 다른 실시형태에도 마찬가지로 적용할 수 있다
다음 용어들은, 달리 나타내지 않는 한, 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:
본 명세서에 사용되는 경우, "재조합체(recombinant)"란 용어는 (1) 이의 천연 발생 환경으로부터 제거되었거나, (2) 유전자가 천연에서 발견된 폴리펩티드의 모두 또는 일부분과 관련되지 않거나, (3) 이것이 천연에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는 생체분자, 예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드를 가리킨다. "재조합체"란 용어는 클로닝된 DNA 단리체, 화학적으로-합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라, 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질 및/또는 mRNA를 언급하는 데 사용될 수 있다
본 명세서에서 사용되는 경우, "핵산"이란 용어는 DNA 또는 RNA로 구성된 임의의 물질을 가리킨다. 핵산은 합성에 의해 또는 살아있는 세포에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 뉴클레오티드의 중합체 쇄를 가리킨다. 상기 용어에는 DNA 분자(예: cDNA, 또는 게놈 또는 합성 DNA) 및 RNA 분자(예: mRNA 또는 합성 RNA)뿐만 아니라, 비-천연 뉴클레오티드 유사체, 비-천연 뉴클레오시드간 결합 또는 이들 둘 다를 함유하는 DNA 또는 RNA 유사체가 포함된다. 핵산은 어떠한 위상적 입체형태라도 될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-가닥, 사중-가닥, 부분적인 이중-가닥, 분지쇄, 헤어핀, 원형, 또는 자물쇄 입체형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "단백질"이란 용어는 아미노산 잔기의 하나 이상의 쇄로 이루어진 대형 생물학적 분자 또는 거대분자를 가리킨다. 많은 단백질은 생화학적 반응을 촉매하고 대사작용에 중요한 효소이다. 단백질은 또한 근육 내의 액틴과 미오신 및 세포 형상을 유지하는 지지체 시스템을 형성하는 세포골격 내의 단백질과 같은 구조적 또는 기계적 기능을 갖는다. 기타 단백질은 세포 신호전달, 면역반응, 세포 부착 및 세포 주기에서 중요하다. 그러나, 단백질은 완전히 인공 또는 재조합체일 수 있고, 즉 천연적으로는 생물학적 시스템에 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "폴리펩티드"란 용어는 천연 발생 및 비-천연 발생 단백질 둘 다 및 이들의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체를 가리킨다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다. 폴리펩티드는 각각이 하나 이상의 별개의 활성을 갖는 다수의 상이한 도메인을 포함할 수 있다.
"야생형 서열" 또는 "야생형 유전자"란 용어는 숙주 세포 내의 고유한 또는 천연적으로 발생하는 서열을 가리키기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발점인 관심대상의 서열을 가리킨다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질 중 하나를 코딩할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포가 간섭 없이 생성할 수 있는 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 간섭이 없다면 생성하지 않을 단백질이다.
"변형된 서열" 및 "변형된 유전자"란 용어는 적어도 천연 발생 핵산 서열의 치환, 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 가리키기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자"란 용어는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 적어도 하나의 코돈에서의 변경을 갖는 서열을 가리킨다. 상기 적어도 하나의 코돈에서의 변경은 "돌연변이"라고도 지칭된다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 능력(예를 들어, 향상된 결합 친화성)을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "샘플"이란 용어는 대상체 또는 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 물질을 가리킨다. 일 측면에서, 샘플은 혈액, 복막액, "CSF", 타액 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 샘플로부터 농축된 B 세포 및 배양된 세포(예를 들어, 대상체 유래의 B 세포)를 포함할 수 있다. 샘플은 또한 생검 또는 신경 조직을 포함하는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 샘플은 세포 전체 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 실시형태의 다양한 측면은, 당단백질 Ibα-V-IX 복합체와 전단 응력 둘 다의 부재 하에 야생형에 비해서 vWF에 대한 결합 친화성을 증가시키는, 천연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 당단백질 Ibα 세포외 도메인의 돌연변이를 포함하는 신규 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 개시되는 실시형태의 다양한 측면은 당단백질 Ibα-V-IX 복합체와 전단 응력 둘 다의 부재 하에 올리고머화 도메인이 결여된 폴리펩티드에 비해서 vWF에 대한 재조합 폴리펩티드의 결합 친화성을 증가시키는 올리고머화 도메인 및 당단백질 Ibα 세포외 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 명세서에서 개시되는 실시형태의 다양한 측면은 강력한 발현 및 적절한 폴딩이 가능하고 복합적 기능 분석될 수 있는 신규 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에서 개시되는 많은 재조합 폴리펩티드는 응고에서의 작은 결함을 구별할 수 있고 이러한 결함을 vWF로 귀속시킬 수 있다.
I. 재조합 폴리펩티드
실시형태의 다양한 측면은 혈소판 당단백질 Ibα(GPIbα)의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자(vWF)에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다.
"특이적으로 결합하다"란 용어는, 예를 들어 생리학적 조건 하에, 예컨대 인간 혈장 또는 HEPES 또는 포스페이트 완충액 중에서 예를 들어 재조합 폴리펩티드(또는 이의 올리고머 폴리펩티드)와 야생형 인간 vWF 사이의, 10 μM 이하, 예컨대 약 6 μM, 5 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 950 nM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM 또는 50 nM 이하 또는 약 10 μM, 6 μM, 5 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 950 nM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 또는 50 nM 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 상호작용을 가리킨다. 재조합 폴리펩티드가 특정 해리 상수로 인간 vWF에 특이적으로 결합하는지 여부는, 예를 들어, 본 명세서에서 이하 설명하는 형광 비등방성 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
재조합 폴리펩티드는 전형적으로 약 250 개 아미노산 내지 약 1000 개 아미노산, 예컨대 약 250 개 내지 약 550 개, 약 500 개 내지 약 750 개, 약 600 개 내지 약 800 개, 약 750 개 내지 약 1000 개, 약 250 개 내지 약 300 개, 약 290 개 내지 약 350 개, 약 300 개 내지 약 400 개, 약 350 개 내지 약 450 개, 약 400 개 내지 약 500 개, 약 450 개 내지 약 550 개, 약 500 개 내지 약 600 아미노산s, 약 550 개 내지 약 650 개, 약 600 개 내지 약 700 개, 약 650 개 내지 약 750 개, 약 700 개 내지 약 800 개, 약 750 개 내지 약 850 개, 약 800 개 내지 약 900 개, 약 850 개 내지 약 950 개 또는 약 900 개 내지 약 1000 개 아미노산의 길이를 갖는다.
재조합 폴리펩티드는 전형적으로 약 25 킬로달톤(kDa) 내지 약 100 kDa, 예컨대 약 25 내지 약 55, 약 50 내지 약 75, 약 60 내지 약 80, 약 75 내지 약 100, 약 25 내지 약 30, 약 29 내지 약 35, 약 30 내지 약 40, 약 35 내지 약 45, 약 40 내지 약 50, 약 45 내지 약 55, 약 50 내지 약 60 아미노산, 약 55 내지 약 65, 약 60 내지 약 70, 약 65 내지 약 75, 약 70 내지 약 80, 약 75 내지 약 85, 약 80 내지 약 90, 약 85 내지 약 95 또는 약 90 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다.
본 명세서에서 개시되는 이와 같은 재조합 폴리펩티드는 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 이와 같은 재조합 폴리펩티드는 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 즉 재조합 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열은 천연 발생 아미노산 서열이 아니다.
A. 변형된 세포외 도메인
GPIbα의 변형된 세포외 도메인은 적어도 하나의 "기능획득" 또는 "기능상실" 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 하위서열에 상응하는 GPIbα의 vWF-결합 도메인이다. 기능획득 또는 기능상실 돌연변이는 vWF에 대한 변형된 세포외 도메인의 결합 친화성을 변형된 세포외 도메인과 동일한 GPIbα의 아미노산 서열에 걸쳐있는 야생형 세포외 도메인과 비교해 증가 또는 감소시킨다. 천연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 기능획득 돌연변이는 G233T, D235V 및 K237V(즉, 여기서 아미노산은 서열번호 19에서와 같이 번호가 매겨져 있다)를 포함한다. 천연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 기능상실 돌연변이는 A238V 또는 Δ(229-240)(즉, 서열번호 19에서와 같이 번호가 매겨짐)를 포함한다.
GPIbα의 변형된 세포외 도메인은 G233T, D235V 및 K237V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드 또는 이의 올리고머 폴리펩티드는 (a) 재조합 폴리펩티드와 동일한 GPIbα의 하위서열을 포함하고 (b) 하나 이상의 돌연변이가 결여되어 있는 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 vWF에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는다(예를 들어, 여기서 재조합 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 내의 하나 이상의 돌연변이의 존재와 대조 폴리펩티드 내의 하나 이상의 돌연변이의 결여를 제외하고는 동일하다). 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드 또는 이의 올리고머 폴리펩티드 및 인간 vWF의 Kd는, 예를 들어 생리학적 조건 하에, 예컨대 인간 혈장 또는 HEPES 또는 포스페이트 완충액 중에서 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 950 nM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM 또는 50 nM 미만이다. Kd는 예를 들어 느린-텀블링 입자에 결합된 형광 표지된 vWF 및 재조합 폴리펩티드의 형광 비등방성 분석에 의해 또는 표면-결합된 vWF 및 가용성 재조합 폴리펩티드의 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정될 수 있지만, 수많은 다른 방법들도 재조합 폴리펩티드 또는 이의 올리고머 폴리펩티드와 vWF 사이의 Kd를 결정하는 데 유용하다.
GPIbα의 변형된 세포외 도메인은 A238V 돌연변이를 포함할 수 있다.
변형된 세포외 도메인은 전형적으로 인간 vWF에 특이적으로 결합하기에 충분한 인간 GPIbα의 1 차 구조를 포함한다. 변형된 세포외 도메인은 예를 들어 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250, 260, 270, 280 또는 290 개의 연속적 아미노산과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 9; 또는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250, 260, 270, 280 또는 290 개의 연속적 아미노산과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 9; 또는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250, 260, 270, 280 또는 290 개의 연속적 아미노산과 100 %의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 9; 또는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변형된 세포외 도메인은 서열번호 1; 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 9; 또는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
변형된 세포외 도메인은 전형적으로 야생형 인간 GPIbα의 분자내 디설파이드 결합 패턴을 포함한, 야생형 인간 GPIbα vWF-결합 도메인과 유사한 2 차 및 3 차 구조를 포함한다. 야생형 인간 GPIbα의 2 차 및 3 차 구조는 vWF에 대한 친화성이 낮은 입체형태와 vWF에 대한 친화성이 높은 입체형태 사이의 동적 평형 상태로 존재한다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 예를 들어 재조합 폴리펩티드 또는 이의 올리고머 폴리펩티드와 vWF 사이의 해리 상수의 측정으로 평가된 바와 같이 vWF에 대한 높은 친화성을 갖는 입체형태를 촉진한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 야생형 인간 GPIbα 단백질에서 발견되는 글리코실화 및/또는 기타 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 천연에 존재하는 야생형 인간 GPIbα의 글리코형(glycoform)에 상응한다.
재조합 폴리펩티드는 전형적으로 서열번호 19에 기재된 vWF-결합 도메인에 뒤따르는 GPIbα의 아미노산 291 번 내지 517 번에 상응하는 내재적으로 무질서화된 세포외 영역이 결여되어 있다. 재조합 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 내재적으로 무질서화된 세포외 영역에 뒤따르는 아미노산 518 번 내지 540 번에 상응하는 GPIbα의 막관통 도메인이 결여되어 있다. 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 임의의 막관통 도메인이 결여되어 있다. 재조합 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 발생 GPIbα 내의 막관통 도메인에 뒤따르는 GPIbα의 세포질 도메인이 결여되어 있다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 C65S 또는 C65A(즉, 아미노산 C65이 서열번호 19에서 번호가 매겨져 있는 바와 같음)와 같은, C65의 돌연변이를 포함한다.
변형된 세포외 도메인은 예를 들어 돌연변이 C65S 및 G233T, 돌연변이 C65S 및 D235V, 돌연변이 C65S 및 K237V, 또는 돌연변이 C65S, G233T 및 M239T를 포함할 수 있다.
변형된 세포외 도메인은 예를 들어 돌연변이 C65A, G233V 및 M239V를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 야생형 GPIbα 아미노산의 β-분지형 아미노산(예를 들어, 발린 또는 트레오닌)으로의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 야생형 GPIbα 아미노산은 β-분지형 아미노산이 아니다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 야생형 GPIbα 아미노산의 하이드록실을 포함하는 아미노산(예를 들어, 트레오닌)으로의 돌연변이를 포함하고, 여기서 상기 GPIbα 아미노산은 하이드록실을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 야생형 GPIbα 아미노산의 하이드록실을 포함하는 β-분지형 아미노산(예를 들어, 트레오닌)으로의 돌연변이를 포함하고, 여기서 상기 야생형 GPIbα 아미노산은 하이드록실을 포함하는 β-분지형 아미노산이 아니다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 천연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 생리학적 pH에서 변형된 세포외 도메인과 동일한 아미노산 스트레치에 걸쳐 있는 야생형 세포외 도메인의 정전하와 상이한 정전하를 갖는다(예를 들어, 정전하는 야생형과 적어도 약 0.5, 예컨대 약 1.0만큼 상이하다).
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 야생형 GPIbα 아미노산의, 야생형 아미노산보다 더 낮은 입체형태 엔트로피를 갖는 아미노산으로의 돌연변이, 예컨대 글리신의 트레오닌으로의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 19의 아미노산 226 번, 227 번, 228 번, 229 번, 230 번, 231 번, 232 번, 233 번, 234 번, 235 번, 236 번, 237 번, 238 번, 239 번, 240 번, 241 번, 242 번, 243 번 또는 244 번의 돌연변이로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이가 결여되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 C65A, N226V, Y228V, W230L, K231V, Q232V, G233V, G233S, D235V, D235Y, K237V, A238V, M239S, M239V, M239I, T240V 및 A244V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이가 결여되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 A238V 돌연변이를 포함하고, 재조합 폴리펩티드는, (a) 재조합 폴리펩티드와 동일한 GPIbα의 하위서열을 포함하고 (b) A238V 돌연변이가 결여되어 있는 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 vWF에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다(예를 들어, 여기서 재조합 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 내의 A238V 돌연변이의 존재와 대조 폴리펩티드 내의 A238V 돌연변이의 결여를 제외하고는 동일하다). 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 19와 비교하여 아미노산 229 번 내지 240 번의 결실(Δ(229-240) 돌연변이)을 포함하고, 재조합 폴리펩티드는, (a) 재조합 폴리펩티드와 동일한 GPIbα의 하위서열을 포함하고 (b) Δ(229-240) 돌연변이가 결여되어 있는 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 vWF에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는다(예를 들어, 여기서 재조합 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 내의 Δ(229-240) 돌연변이의 존재와 대조 폴리펩티드 내의 Δ(229-240) 돌연변이의 결여를 제외하고는 동일하다). 일부 실시형태에서, 변형된 세포외 도메인은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
B. 가교결합 도메인
실시형태의 다양한 측면은 가교결합 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 가교결합 도메인은 전형적으로 재조합 폴리펩티드가 가용성 분자 또는 고체 지지체에 공유 또는 비공유 가교결합될 수 있게 한다.
본 발명자들은, 재조합 폴리펩티드의 1 급 아민(예를 들어, 라이신) 또는 카르복실(예를 들어, 아스파르테이트, 글루타메이트, C-말단)을 예컨대 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC) 또는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 화학작용에 의해 고체 지지체 또는 분석법의 다른 성분에 무작위적으로 가교결합시키는 전통적인 화학작용이 분석법 정확도 및 정밀도를 감소시키는 기능적 결함을 야기한다는것을 밝혀내고 이것을 개시하였다. 무작위 가교결합(cross-linking)이 분석법에서 가교결합된 분자의 각 표면과 이들의 결합 파트너 사이의 상호작용을 가능하게 하는 다수의 상이한 배향으로 가교결합된 분자의 집단을 제공하기 때문에, 무작위 가교결합은 종종 분석법 개발을 위한 우수한 전략이다. 방향성 가교결합은, 특히 분자가 고체 지지체에 가교결합되는 경우에, 가교결합된 분자의 표면을 차폐하고 각 분자의 구조 및 동력학에 균일한 방식으로 영향을 미칠 뿐만 아니라 이들의 결합 파트와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있어 분석법에 시스템 오류를 도입하기 때문에, 방향성 가교결합은 분석법 개발에 있어 무작위 가교결합보다 종종 열등하다. 또한, 예를 들어 방향성 가교결합은, 어떤 설계라도 시스템 오류를 피할 것이라는 보장이 없이, 재조합 폴리펩티드의 설계, 클로닝, 발현 및 분석과 방향성 가교결합된 재조합 폴리펩티드를 이용하는 분석법의 검증 둘 다를 필요로 하기 때문에, 방향성 가교결합은 일반적으로 무작위 가교결합에 비해서 힘이 들며 비용이 많이 든다.
실시형태의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드의 C-말단에 의해 매개되는 고체 지지체에 대한 재조합 폴리펩티드의 가교결합이 무작위 가교결합에 비해서 우수한 정밀도와 정확도를 갖는 분석법을 가능하게 한다는 조사 결과에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 가교결합 도메인을 포함한다. 가교결합 도메인은 음으로 하전된 C-말단 도메인을 임의로 포함할 수 있다. 음으로 하전된 C-말단 도메인은 전형적으로 중성 pH에서 순 음전하, 예컨대 약 -1, -2, -3, -4, -5 또는 -6 미만의 순전하를 갖는 3 내지 20 개의 아미노산(즉, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산)의 스트레치를 포함한다. 음으로 하전된 C-말단 도메인이 재조합 폴리펩티드의 C-말단 아미노산을 포함할 수 있지만, "음으로 하전된 C-말단 도메인"이란 용어는 음으로 하전된 C-말단 도메인의 아미노산 서열이 재조합 폴리펩티드의 C-말단의 아미노산을 포함함을 반드시 의미하지는 않는다. 대신에 "C-말단"은 재조합 폴리펩티드 내에서 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인과 비교한 음으로 하전된 도메인의 위치를 가리키며, 즉 음으로 하전된 C-말단 도메인은 변형된 세포외 도메인과 비교해 C-말단에 있다.
음으로 하전된 C-말단 도메인은 전형적으로 글루타메이트 및 아스파르테이트(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 글루타메이트 및 아스파르테이트)와 같은 아미노산을 포함하며 아르기닌, 라이신 및 히스티딘(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개 이하의 아르기닌, 라이신 및 히스티딘)과 같은 아미노산이 결여되어 있다. 음으로 하전된 C-말단 도메인은 또한 고도의 입체형태 엔트로피를 나타내는 소형 친수성 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 세린) 및/또는 프롤린을 임의로 포함할 수 있으며, 이러한 아미노산들은 2 차 구조를 피하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 가교결합 도메인은 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 친화성 태그를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 폴리히스티딘 태그와 음으로 하전된 C-말단 도메인 둘 다를 포함하는 재조합 폴리펩티드에서, 음으로 하전된 C-말단 도메인은 전형적으로 변형된 세포외 도메인과 폴리히스티딘 태그 사이에 위치한다. 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 폴리히스티딘 태그를 포함하는 아미노산 서열의 일례는 서열번호 17로 나타내져 있다.
친화성 태그와 음으로 하전된 C-말단 도메인 둘 다를 포함하는 재조합 폴리펩티드에서, 음으로 하전된 C-말단 도메인은 전형적으로 변형된 세포외 도메인과 친화성 태그 사이에 위치한다.
가교결합 도메인은 임의로 C-말단 시스테인을 포함할 수 있다. C-말단 시스테인은 예를 들어 티올-말레이미드 화학작용 또는 티올-금 상호작용을 사용하여 재조합 폴리펩티드를 고체 지지체 또는 분석법의 다른 성분에 가교결합시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 가교결합 도메인은 C-말단 시스테인 및 친화성 태그를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 폴리히스티딘 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하는 아미노산 서열의 일례는 서열번호 16에 기재되어 있다.
C-말단 시스테인이 C-말단 아미노산일 수 있지만, "C-말단 시스테인"이란 용어는 C-말단 시스테인이 재조합 폴리펩티드의 C-말단 아미노산임을 반드시 의미하지는 않는다. 대신에 "C-말단"은 재조합 폴리펩티드 내에서 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인과 비교한 C-말단 시스테인의 위치를 가리키며, 즉 C-말단 시스테인은 변형된 세포외 도메인과 비교해 C-말단에 있다.
가교결합 도메인은 임의로 스트렙타비딘 결합 단백질 또는 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 스트렙타비딘 결합 단백질은 재조합 폴리펩티드를 스트렙타비딘에 비공유 가교결합시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 가교결합 도메인은 스트렙타비딘 결합 단백질 및 친화성 태그를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 스트렙타비딘 결합 단백질 및 폴리히스티딘 태그를 포함하는 아미노산 서열의 일례는 서열번호 18에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 가교결합 도메인은 항체의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 항체의 Fc 도메인을 포함하는 아미노산 서열의 일례는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 가교결합 도메인은 서열번호 11; 서열번호 12, 서열번호 16; 서열번호 17; 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
C. 친화성 태그
재조합 폴리펩티드는 임의로 친화성 태그를 포함할 수 있다. 친화성 태그는 정제에 유용하며, 또한 재조합 폴리펩티드를 이용하는 분석법에서 유용할 수 있다. 친화성 태그의 선택이 특별히 한정되지는 않지만, 예시적인 친화성 태그에는 폴리히스티딘 태그, Snap 태그, Clip 태그, HaloTag, SnoopTag, SpyTag, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, 칼모둘린-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, 바이오틴 카르복실 운반체 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그 및 항체의 Fc 도메인이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 친화성 태그가 사용 후에 제거되는 경우 또는 재조합 폴리펩티드를 친화성 태그를 필요로 하지 않는 전략을 사용하여 정제하는 경우에, 재조합 폴리펩티드는 친화성 태그가 결여될 수 있다. 히스티딘 잔기의 수가 특별히 한정되지는 않지만, 예시적인 친화성 태그는 전형적으로 6 개 또는 8 개의 연속적 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘 태그이다(예를 들어, 서열번호 15 내지 18, 43, 44, 46을 참조한다). 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 글리신 링커를 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호 44를 참조한다). 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 항체의 Fc 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호 46을 참조한다). 일부 실시형태에서, 친화성 태그는 항체의 Fc 도메인이다(예를 들어, 서열번호 11 또는 12를 참조한다).
본 발명에 따른 친화성 태그는 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 또는 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
C. 올리고머화 도메인
재조합 폴리펩티드는 임의로 올리고머화 도메인을 포함할 수 있다. 올리고머화 도메인은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및/또는 더 고차의 올리고머와 같은 올리고머의 형성을 가능하게 한다. 올리고머화 도메인은 특정 화학양론, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 촉진할 수 있거나, 올리고머화 도메인은 상이한 화학양론을 갖는 올리고머의 분포를 가능하게 할 수 있다. 동종올리고머와 이종올리고머 간의 구분이 특별히 한정되지 않지만, 올리고머화 도메인은 동종올리고머를 형성하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인은 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체 또는 동종오량체를 형성할 수 있으며, 예를 들어 여기서 재조합 폴리펩티드의 올리고머화는 주로 단분산 올리고머를 생성한다. 올리고머화 도메인은 예를 들어 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로부터의 올리고머화 도메인일 수 있다.
올리고머화 도메인은 분석법에서 사용되는 재조합 폴리펩티드에 몇가지 이점을 제공한다. 올리고머화 도메인은 재조합 폴리펩티드를 서로에 대해 배향시킬 수 있으며, 이것은 예를 들어 혈소판의 지질 이중층 내의 천연 GPIbα의 배향과 비슷할 수 있다. 올리고머화 도메인은 또한, 예를 들어 vWF가 다가이기 때문에, vWF에 대한 재조합 폴리펩티드의 친화성을 증가시킬 수 있고, vWF에 대한 올리고머 폴리펩티드의 다수의 변형된 세포외 도메인들의 결합은 vWF에 대한 단일의 변형된 세포외 도메인의 결합보다 본질적으로 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
예시적인 올리고머화 도메인은 항체 Fc 도메인 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 앞서 기재한 올리고머화 도메인의 이점 이외에도, Fc 도메인은 종종 발현 세포에서 재조합 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비를 증가시킨다.
항체 Fc 도메인의 종은 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드의 목적하는 용도에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 Fc 도메인의 종은 특정 시약이 분석법에서 항체 Fc 도메인을 표적으로 하거나 무시할 수 있도록 선택될 수 있다. 마우스 Fc 도메인은, 예를 들어 항-마우스 2 차 항체가 분석법에서 다른 마우스 항체를 검출하는 데 사용되지 않는다면 유용할 수 있다. 마찬가지로, 마우스 Fc 도메인은 항-마우스 항체를 사용하여 재조합 폴리펩티드를 고체 지지체 또는 분석법의 다른 성분에 가교결합시키는 데 유용할 수 있다. Fc 도메인의 종이 특별히 한정되지는 않지만, Fc 도메인의 종은 인간, 마우스, 토끼, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 염소, 양, 말, 닭 또는 상기 종들 중 임의의 것의 키메라일 수 있다.
예시적인 올리고머화 도메인은 힌지 영역을 포함하는 마우스 IgG Fc 도메인으로, 이것은 이 올리고머화 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 공유 동종이량체를 형성할 수 있게 한다. 이량체 마우스 IgG Fc 도메인은 서열번호 11 또는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 방법이 잘 알려져 있으므로 Fc 도메인은 재조합 폴리펩티드의 정제를 도울 수도 있다. Fc 도메인은 또한 가교 결합 도메인으로서 작용할 수 있다. Fc 도메인은 또한 친화성 태그로서 작용할 수 있다.
다른 예시적인 올리고머화 도메인은 p53 사량체화 도메인이다. p53 사량체화 도메인은 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예시적인 올리고머화 도메인은 GCN4 삼량체화 도메인이다. GCN4 삼량체화 도메인은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. GCN4-유사 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드는 예를 들어 평행 삼량체(parallel trimer)로 설계될 수 있다. 대안적인 GCN4-유사 서열을 당업계에 공지된 바와 같이 설계하여 평행 또는 역-평행 구성을 갖는 이량체, 삼량체 및 사량체 올리고머를 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌[Harbury, Zhang, Kim, and Alber, "A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants", Science (1993) 262:1401]을 참조).
또 다른 예시적인 올리고머화 도메인은 클라트린 삼량체화 도메인이다. 클라트린 삼량체화 도메인은 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인은 친화성 태그를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머화 도메인은 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 또는 서열번호 46에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고머화 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드와 vWF 사이의 해리 상수(Kd)는 (a) 재조합 폴리펩티드와 동일한 GPIbα의 하위서열 또는 이의 돌연변이 하위서열을 포함하고 (b) 올리고머화 도메인이 결여되어 있는 대조 폴리펩티드와 vWF 사이의 해리 상수보다 작다(예를 들어, 여기서 재조합 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 내의 올리고머화 도메인의 존재와 대조 폴리펩티드 내의 올리고머화 도메인의 결여를 제외하고는 동일하다). 이러한 재조합 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드 사이의 해리 상수(Kd)의 차이는 전형적으로 재조합 폴리펩티드 및 대조 폴리펩티드의 올리고머화 상태에 주로 또는 단독으로 기인한다.
다른 올리고머화 도메인은 당업계에 공지되어 있고, 올리고머화 도메인의 구체적 선택은 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어, 스트렙타비딘은 사량체를 형성하고 또한 바이오틴에 결합하기 때문에 특히 유용한 올리고머화 도메인일 수 있으며, 이는 정제를 도울 수 있고 다양한 분석법에서 또한 유용할 수 있다.
D. 리더 펩티드 서열
본 명세서에서 개시되는 재조합 폴리펩티드는 전형적으로 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 발현 벡터의 세포막을 가로지르는 재조합 폴리펩티드의 전위를 촉진하는 리더 펩티드 서열을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 리더 펩티드 서열이 효소적 또는 화학적 절단에 의해 재조합 폴리펩티드로부터 절단되는 경우, 재조합 폴리펩티드는 리더 펩티드 서열이 결여될 수 있다. 합성적으로 생산된 재조합 폴리펩티드도 마찬가지로 리더 펩티드 서열이 결여될 수 있다.
리더 펩티드 서열은 전형적으로 재조합 폴리펩티드의 N-말단에 포함된다. 재조합 폴리펩티드의 다른 서열 모티프도 전위를 도울 수 있지만, 리더 펩티드 서열은 바람직하게는 진핵 세포에서 재조합 폴리펩티드의 번역 후에 진핵 세포(예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)의 세포 표면 막의 외부로 재조합 폴리펩티드를 전위시키기에 충분하다.
예시적인 리더 펩티드 서열은 인간 조직 플라스미노겐 신호 펩티드인 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 잘 특성규명된 서열은 인간 세포와 다른 포유동물 세포 둘 다의 외부로 폴리펩티드를 전위시킬 수 있습니다.
II. 올리고머 폴리펩티드
실시형태의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 2, 3, 4 개 이상의 재조합 폴리펩티드(서브유닛)를 포함하는 올리고머 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 올리고머 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드, 즉 2 개의 서브유닛을 포함하는 올리고머 폴리펩티드이고, 여기서 각각의 서브유닛은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드이다. 수식어 "올리고머", "이량체" 또는 다중-서브유닛 형태에 대한 다른 명시적인 언급 없이 사용되는 "폴리펩티드"란 용어는 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 올리고머 내에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 재조합 폴리펩티드를 가리킨다.
올리고머 폴리펩티드의 상이한 서브유닛들은 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 올리고머 폴리펩티드의 각 서브유닛은 전형적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이종이량체 폴리펩티드는, 예를 들어, 제1 서브유닛의 시스테인 티올을 이탈기(예: 2-2'디티오-비스-(5-니트로피리딘))를 이용하여 활성화시키고, 제2 서브유닛의 티올을 (예를 들어, β-머캅토에탄올 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀)을 이용하여) 환원시킨 다음, 제1 서브유닛과 제2 서브유닛을 접촉시켜 제조할 수 있다. 대안적으로, 서브유닛은 무작위로 가교결합시킨 다음, 정제할 수 있다. 동종이량체 폴리펩티드는 유사한 전략을 사용하여 제조할 수 있다. 올리고머 폴리펩티드를 올리고머화 후에 정제하여, 단량체 서브유닛 및 다른 목적하지 않는 종으로부터 목적하는 올리고머 폴리펩티드를 분리할 수 있다.
올리고머 폴리펩티드는 대칭일 수 있거나 올리고머 폴리펩티드는 대칭성이 결여될 수 있다. 예를 들어, 올리고머 폴리펩티드는 "분자간" 디설파이드 결합 패턴을 형성하여 대칭성이 결여된 4차 구조를 생성할 수 있다.
올리고머 폴리펩티드는 비공유 또는 공유 상호작용에 의해 가교결합될 수 있다. 비공유 상호작용의 예는 GCN4 또는 클라트린 올리고머화 도메인의 삼량체화 또는 p53 올리고머화 도메인의 사량체화이다. 공유 상호작용의 일례는 항체 Fc 도메인 힌지 영역의 디설파이드-결합 매개 이량체화이다. 디설파이드 결합의 수가 특별히 한정되지는 않지만, 항체 Fc 도메인을 포함하는 서브유닛을 갖는 이량체 폴리펩티드는 적어도 하나의 디설파이드 결합, 전형적으로 2 개의 디설파이드 결합(예를 들어, IgG1 및 IgG4 유래의 Fc 도메인의 경우) 또는 4 개의 디설파이드 결합(예를 들어, IgG2 유래의 Fc 도메인의 경우)에 의해 공유 가교결합될 수 있다. IgG3은 예를 들어 11개의 디설파이드 결합에 의해 가교결합될 수 있다.
이량체 폴리펩티드는 2 개의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 서브유닛은 항체 Fc 도메인을 포함하고 항체 Fc 도메인은 이량체 폴리펩티드의 2 개의 서브유닛에 가교결합한다.
삼량체 폴리펩티드는 3 개의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 서브유닛은 GCN4 삼량체화 도메인을 포함하고, GCN4 삼량체화 도메인은 삼량체 폴리펩티드의 3 개의 서브유닛에 비공유 가교결합한다. 삼량체 폴리펩티드는 3 개의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 서브유닛은 클라트린 삼량체화 도메인을 포함하고, 클라트린 삼량체화 도메인은 삼량체 폴리펩티드의 3 개의 서브유닛에 비공유 가교결합한다.
사량체 폴리펩티드는 4 개의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 서브유닛은 p53 사량체화 도메인을 포함하고, p53 사량체화 도메인은 사량체 폴리펩티드의 4 개의 서브유닛에 비공유 가교결합한다.
본 발명의 다양한 실시형태는 이량체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 이량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않는다. 조성물은 이량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드가 결여될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태는 삼량체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 삼량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않는다. 조성물은 삼량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드가 결여될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태는 사량체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 사량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않는다. 조성물은 사량체 폴리펩티드가 아닌 올리고머 폴리펩티드가 결여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 단량체 재조합 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 올리고머 폴리펩티드를 본질적으로 함유하지 않는다. 조성물은 올리고머 폴리펩티드가 결여될 수 있다.
III. 핵산, 클로닝 세포 및 발현 세포
본 명세서에서 설명되는 실시형태는 또한 본 명세서에서 설명되는 변형된 세포외 도메인(예를 들어, 서열번호 1 내지 9 또는 42) 및/또는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA는 전형적으로 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 바람직하게는 관심대상의 발현 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 발현을 유도할 수 있다. 뉴클레오티드 서열이 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 한, 핵산의 정확한 뉴클레오티드 서열은 특별히 한정되지 않는다. 코돈은 예를 들어 관심대상의 발현 세포(예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)의 코돈 편중(codon bias)과 일치하도록 및/또는 클로닝 동안의 편의를 위해 선택될 수 있다. DNA는, 예를 들어, (예를 들어, 원핵 세포에서의 플라스미드 복제를 위해) 복제 기점을 포함할 수 있는 플라스미드일 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 변형된 세포외 도메인 및/또는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 세포는 발현 세포 또는 클로닝 세포일 수 있다. 다른 클로닝 세포가 사용될 수 있지만, 핵산은 전형적으로 이. 콜라이에 클로닝된다. 세포가 발현 세포인 경우, 핵산은 임의로 염색체의 핵산이며, 즉 이후에 핵산이 예를 들어 염색체외 DNA로서 발현 세포 내에 존재할 수 있지만 뉴클레오티드 서열은 염색체 내로 통합된다.
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드(예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체 폴리펩티드)를 포함하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 측면은 세포, 세포 배양 배지 및 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 세포는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드의 서브유닛을 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 세포 배양 배지는 이 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 세포가 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 세포 배양 배지 중으로 분비하기 때문에). 세포는 전형적으로 발현 세포이다. 발현 세포의 성질은 특별히 한정되지 않는다. 포유동물 발현 세포가 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드의 유리한 폴딩, 번역 후 변형 및/또는 분비를 허용할 수 있지만, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포도 발현 세포로서 사용될 수 있다. 예시적인 발현 세포는 CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa 및 저캣 세포를 포함한다.
IV. 분석법과 관련된 조성물 및 방법
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드가 고체 지지체에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "직접" 결합이란 용어는 고체 지지체에 대한 분자의 직접적 접합, 예를 들어 재조합 폴리펩티드의 시스테인 티올을 금 표면에 결합시키는 금-티올 상호 작용을 가리킨다. 본 명세서에서 사용되는 "간접" 결합이란 용어는 고체 지지체에 직접 결합되어 있는 다른 분자에 대한 재조합 폴리펩티드의 특이적 결합을 포함하며, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 고체 지지체에 직접 결합되어 있는 항체에 결합할 수 있고 이로써 재조합 폴리펩티드를 고체 지지체에 간접적으로 결합시킬 수 있다(예를 들어, 도 4a를 참조). "간접" 결합이란 용어는, (a) 분자들의 데이지 체인(daisy chain) 사이의 상호작용이 특이적 또는 공유 상호작용이고 (b) 데이지 체인의 말단 분자가 고체 지지체 직접 결합되어 있는 한, 재조합 폴리펩티드와 고체 지지체 사이의 분자의 수와 무관하다(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 항-vWF 항체, vWF 및 재조합 폴리펩티드("GPIbα")가 고체 지지체에 대한 항-CD42b 항체의 직접 결합을 통해 각각 고체 지지체에 간접적으로 결되어 있는 도 4a를 참조).
본 발명의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드가 고체 지지체에 공유 또는 비공유 결합되어 있는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "비공유 결합된"이란 용어는, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 단백질과 스트렙타비딘 또는 항체 및 이의 항원(예를 들어, 도 4a를 참조)로 예시되는, 항체와 이의 항원, 리간드와 이의 수용체, 또는 효소와 이의 기질 사이의 결합과 같은 특이적 결합을 가리킨다. 특이적 결합은 일반적으로 약 10 μM 미만, 예컨대 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 10 nM 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 상호 작용을 가리킨다.
고체 지지체는 입자, 비드, 막, 표면, 폴리펩티드 칩, 마이크로티터 플레이트 또는 크로마토그래피 컬럼의 고체상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 라텍스 비드일 수 있다.
조성물은 복수의 비드 또는 입자를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 복수의 비드 또는 입자의 각 비드 또는 입자는 본 명세서에서 설명되는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있다. 조성물은 복수의 비드 또는 입자를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 복수의 비드 또는 입자의 각 비드 또는 입자는 본 명세서에서 설명되는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드에 공유 또는 비공유 결합되어 있다.
조성물은 폰빌레브란트 인자를 포함할 수 있다. 조성물은, 예를 들어 전혈 또는 혈장과 같은 이의 분획과 같은 수용액 또는 현탁액 중에 인간 vWF를 포함할 수 있다. 조성물은 고체 지지체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 고체 지지체는 복수의 비드 또는 입자를 포함하고, vWF는 복수의 입자 또는 비드의 입자 또는 비드에 가교결합한다.
조성물은 인간 혈장을 포함할 수 있다. 조성물은 인간 혈소판을 포함할 수 있다. 조성물은 인간 혈장 및 인간 혈소판을 포함할 수 있다.
조성물은 예를 들어 항체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서 상기 항체는 인간 항체가 아니다. 항체의 종이 특별히 한정되지는 않지만, 항체는 예를 들어 마우스, 토끼, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 염소, 양, 말, 닭 또는 상기 종들의 키메라일 수 있다. 조성물은 항-vWF 항체, 바람직하게는 항-인간 vWF 항체를 포함할 수 있다. 조성물은 형광-표지된 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-인간 vWF 항체는 직접 또는 간접적으로 염료, 형광발색단 또는 효소에 결합된다.
조성물은 HEPES 또는 포스페이트 완충액과 같은 pH 완충액을 포함할 수 있다. 조성물은 폴리비닐피롤리돈(PVP), Tween(예를 들어, Tween 20) 또는 덱스트란 -500을 포함할 수 있다.
조성물은 리스토세틴을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 재조합 폴리펩티드의 한 가지 이점은 리스토세틴을 필요로하지 않는 분석법의 개발이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 조성물은 리스토세틴이 결여되어 있다.
실시형태의 다양한 측면은 본 명세서에서 설명되는 조성물 및 사용 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
실시예
실시예 1. 재조합 폴리펩티드의 발현 및 정제
290개의 아미노산으로 이루어진 당단백질 Ibα(GPIbα)의 폰빌레브란트 인자(vWF)-결합 도메인(서열번호 19)을 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자 유래의 N-말단 리더 펩티드(서열번호 20) 및 C-말단 폴리히스티딘 태그(서열번호 15, 16, 17, 18, 43, 44 또는 46)과 함께 클로닝하였다. 선택된 아미노산 돌연변이를 GPIbα의 vWF-결합 도메인에 도입시켰다. 올리고머화 도메인과 가교결합 도메인을 선택된 작제물에 클로닝시켰다. 상기 작제물을 인간 배아 신장(human embryonic kidney; HEK) 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포에서 일시적으로 또는 안정하게 발현되었다. 재조합 폴리펩티드를 0.02 % 나트륨 아지드를 포함하는 포스페이트 완충된 염수(PBS) 이동상을 사용하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 재조합 폴리펩티드 순도는 4 내지 15 % TGX™ 폴리아크릴 아미드 겔(Bio-Rad, California)에서 환원 조건 하에 나트륨 도데실 설페이트 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 평가하였다. 선택된 재조합 폴리펩티드를 함유하는 겔의 영상은 도 1에 나타내져 있다.
실시예 2. vWF와 재조합 폴리펩티드 사이의 결합 친화성(Kd)의 측정
vWF와 선택된 이량체 폴리펩티드 또는 단량체 폴리펩티드 대조군(G233V, M239V - noFc(서열번호 35)) 사이의 해리 상수(Kd)를 형광 비등방성에 의해 평가하였다. 각각의 이량체 폴리펩티드는 각각 뮤린 Fc 이량체 도메인 및 GPIbα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는 2 개의 재조합 폴리펩티드 서브유닛을 포함하였다. 평가 된 이량체 폴리펩티드는 서열번호 38(Δ(229-240)); 서열번호 37(WT); 서열번호 36 (A238V); 서열번호 34(G233V, M239V); 서열번호 32(G233V); 서열번호 33(G233T, M239T); 서열번호 21(G233T); 서열번호 30(D235V); 서열번호 31(K237V)에 상응한다. GPIbα vWF-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 vWF A1 도메인(인간 vWF의 아미노산 1277번 내지 1453번)을 시스테인-티올-말레이미드 화학품을 사용하여 AlexaFluor™ 488 형광 표지(Molecular Probes, Oregon)에 접합시켰다. 재조합 폴리펩티드를 느린-텀블링 입자에 접합시켰다. 5 μM 내지 9.75 nM의 각 재조합 폴리펩티드의 2× 연속 희석액을 실온에서 150 nM의 vWF A1-AlexaFluor™ 488 종과 함께 30 분 넘게 항온배양한 다음, 형광 비등방성을 측정하였다. 결과는 도 2에 나타내져 있다. 돌연변이를 포함하지 않은 재조합 폴리펩티드는 약 1.25 μM의 Kd를 나타냈다. G233T, D235V 또는 K237V 돌연변이 중 하나를 포함한 재조합 폴리펩티드는 각각 500nM 미만의 Kd를 나타냈다(즉, 단일 돌연변이체에 대해 각각, 약 67 nM, 약 250 nM 및 약 300 nM). G233T, D235V 또는 K237V 돌연변이체의 상대적 결합 친화성은 ELISA에 의해 확인하였다(각각, 도 4d, 도 4b 및 도 4c 및 하기 실시예 3을 참조).
형광 비등방성 결과는 Biacore™(Biacore, Sweden)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 확인하였다(도 3). vWF A1 도메인을 Biacore CM5 칩에 접합시켰다. GPIbα 세포외 도메인의 G233T 돌연변이, C-말단 뮤린 Fc 도메인 및 C-말단 8-His 태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드(서열번호 21)의 회합속도(on-rate) 및 해리속도(off-rate)를 측정하였고, 해리 상수는 약 58 nM으로서 계산되었으며, 이는 형광 비등방성에 의해 얻어진 약 67 nM 측정치와 일치한다.
실시예 3. 재조합 폴리펩티드는 ELISA에 의하면 vWF 결합의 질적 결함을 검출할 수 있다
G233T(서열번호 21), D235V(서열번호 30) 및 K237V(서열번호 31) 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드가 돌연변이체의 vWF 결합 친화성의 질적 차이를 검출할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 효소 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하였다. 도 4a는 ELISA 분석의 도식을 나타낸다. 간략하게 언급하면, 다중웰 플레이트의 웰을 재조합 폴리펩티드의 GPIbα의 변형된 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항 -CD42b 항체로 코팅하고, 재조합 폴리펩티드를 다중웰 플레이트(즉, 고체 지지체)에 간접적으로 가교결합시키는 데 사용하였다. 1형, 2B형 및 3형 폰빌레브란트병과 관련된 혈장 샘플, 풀링된 인간 혈장의 대조 샘플, 폰빌레브란트병을 갖지 않는 것으로 알려진 인간 혈장의 대조 샘플, 희석되지 않은 것부터 16 배 희석된 것까지의 풀링된 인간 혈장의 참조 표준물의 2× 연속 희석액 및 음성 대조군으로서 염소 혈청을 포함하는 다양한 대조 샘플, 표준물 및 이의 연속 희석액을 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 첨가하였다. 항온배양 후, 웰을 세척한 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 다클론 토끼 항-인간 vWF 항체와 접촉시켰다. 결합된 vWF는 450 nm에서 흡수 분광법에 의해 호스래디쉬 퍼옥시다제 기질의 생성물로의 전환을 모니터링함으로써 정량하였다.
G233T, D235V 또는 K237V 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드 각각은, 예를 들어, 정상 혈장 샘플 및 대조 샘플과 비교하여 1형, 2B형 및 3형 폰빌레브란트병과 관련된 혈장 샘플에서 결함을 검출할 수 있었다(도 4b 내지 도 4d). G233T, D235V 및 K237V 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드 각각은 또한 연속 희석 및 흡광도 측정의 5개 샘플들 간의 정확한 상관관계를 허용하였다. 이러한 결과들은 G233T, D235V 및 K237V 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 본 명세서에서 설명되는 재조합 폴리펩티드가 폰빌레브란트병을 검출하기 위한 분석법에서 사용될 수 있고 이러한 분석법이 10 배수 이상에 걸친 동적 범위에서 혈장 중의 vWF 농도 및/또는 결합 친화성을 정확히 측정할 수 있게 함을 입증한다.
참조문헌
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<110> GRIFOLS DIAGNOSTIC SOLUTIONS INC. <120> COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT GpIba RECEPTOR PROTEIN <130> 62/632870 <150> 62/632870 <151> 2018-02-20 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Synthetic <400> 1 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu 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Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 355 360 365 Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu 370 375 380 Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala 385 390 395 400 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro 405 410 415 Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys 420 425 430 Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr 435 440 445 Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr 450 455 460 Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu 465 470 475 480 Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser 485 490 495 Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser 500 505 510 His Ser Pro Gly Ile Gly His His His His His His His His 515 520 525 <210> 38 <211> 514 <212> PRT <213> Synthetic <400> 38 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe 180 185 190 Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu 195 200 205 Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Asn Ala 210 215 220 Glu Asn Val Tyr Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp 225 230 235 240 Lys Phe Pro Val Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly 245 250 255 Asp Glu Gly Asp Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr 260 265 270 Glu Gly Asp Lys Val Arg Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 275 280 285 Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 290 295 300 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 305 310 315 320 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 325 330 335 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 340 345 350 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 355 360 365 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 370 375 380 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 385 390 395 400 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 405 410 415 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 420 425 430 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 435 440 445 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 450 455 460 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 465 470 475 480 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 485 490 495 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile Gly His His His His His His 500 505 510 His His <210> 39 <211> 529 <212> PRT <213> Synthetic <400> 39 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe 180 185 190 Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu 195 200 205 Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Asn Ala 210 215 220 Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Thr Val Asp Val Lys Ala Met Thr 225 230 235 240 Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val 245 250 255 Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp 260 265 270 Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys 275 280 285 Val Arg Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 290 295 300 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 305 310 315 320 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 325 330 335 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 340 345 350 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 355 360 365 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 370 375 380 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 385 390 395 400 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 405 410 415 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 420 425 430 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 435 440 445 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 450 455 460 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 465 470 475 480 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 485 490 495 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 500 505 510 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly His His His His His His His 515 520 525 His <210> 40 <211> 323 <212> PRT <213> Synthetic <400> 40 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe 180 185 190 Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu 195 200 205 Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Asn Ala 210 215 220 Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Thr Val Asp Val Lys Ala Met Thr 225 230 235 240 Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val 245 250 255 Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp 260 265 270 Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys 275 280 285 Val Arg Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val 290 295 300 Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu His His His 305 310 315 320 His His His <210> 41 <211> 390 <212> PRT <213> Synthetic <400> 41 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ser Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe 180 185 190 Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu 195 200 205 Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Asn Ala 210 215 220 Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Thr Val Asp Val Lys Ala Met Thr 225 230 235 240 Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val 245 250 255 Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp 260 265 270 Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys 275 280 285 Val Arg Gly Ser His Met Trp Lys Gln Ser Val Glu Leu Ala Lys Lys 290 295 300 Asp Ser Leu Tyr Lys Asp Ala Met Gln Tyr Ala Ser Glu Ser Lys Asp 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ala Glu Glu Leu Leu Gln Trp Phe Leu Gln Glu Glu Lys 325 330 335 Arg Glu Cys Phe Gly Ala Cys Leu Phe Thr Cys Tyr Asp Leu Leu Arg 340 345 350 Pro Asp Val Val Leu Glu Leu Ala Trp Arg His Asn Ile Met Asp Phe 355 360 365 Ala Met Pro Tyr Phe Ile Gln Val Met Lys Glu Tyr Leu Thr Lys Val 370 375 380 His His His His His His 385 390 <210> 42 <211> 290 <212> PRT <213> Synthetic <400> 42 His Pro Ile Cys Glu Val Ser Lys Val Ala Ser His Leu Glu Val Asn 1 5 10 15 Cys Asp Lys Arg Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Asp Leu Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Leu His Leu Ser Glu Asn Leu Leu Tyr Thr Phe Ser Leu 35 40 45 Ala Thr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Leu Thr Gln Leu Asn Leu Asp Arg 50 55 60 Ala Glu Leu Thr Lys Leu Gln Val Asp Gly Thr Leu Pro Val Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Leu Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Val Leu Asp Val Ser Phe Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Ser Leu Pro Leu Gly Ala Leu Arg Gly Leu Gly Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Leu Lys Thr Leu Pro Pro Gly Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Thr Pro Lys Leu Glu Lys Leu Ser Leu Ala Asn Asn Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Glu Asn Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Leu Gln Glu Asn Ser Leu Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Phe Phe 180 185 190 Gly Ser His Leu Leu Pro Phe Ala Phe Leu His Gly Asn Pro Trp Leu 195 200 205 Cys Asn Cys Glu Ile Leu Tyr Phe Arg Arg Trp Leu Gln Asp Asn Ala 210 215 220 Glu Asn Val Tyr Val Trp Lys Gln Val Val Asp Val Lys Ala Val Thr 225 230 235 240 Ser Asn Val Ala Ser Val Gln Cys Asp Asn Ser Asp Lys Phe Pro Val 245 250 255 Tyr Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Cys Pro Thr Leu Gly Asp Glu Gly Asp 260 265 270 Thr Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Thr Glu Gly Asp Lys 275 280 285 Val Arg 290 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Synthetic <400> 43 His His His His His His His His 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic <400> 44 Gly His His His His His His His His 1 5 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Synthetic <400> 45 Glu Glu Asp Thr Glu Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 <210> 46 <211> 236 <212> PRT <213> Synthetic <400> 46 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu 1 5 10 15 Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr 20 25 30 Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val 50 55 60 His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 65 70 75 80 Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu 145 150 155 160 Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro 165 170 175 Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val 180 185 190 Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser 210 215 220 Pro Gly Ile Gly His His His His His His His His 225 230 235

Claims (34)

  1. 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서,
    상기 재조합 폴리펩티드가 막관통 도메인(transmembrane domain)이 결여되어 있고;
    상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 G233T, D235V 및 K237V로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드가, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 높은 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드와 인간 폰빌레브란트 인자의 Kd가 1 μM, 750 nM, 500 nM, 250 nM 또는 100 nM 미만인, 재조합 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여
    돌연변이 C65S 및 G233T;
    돌연변이 C65S 및 D235V;
    돌연변이 C65S 및 K237V; 또는
    돌연변이 C65S, G233T 및 M239T를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열의 적어도 약 250 개의 연속적 아미노산과 적어도 약 95 % 서열 동일성을 갖는, 재조합 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 4; 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 가교결합 도메인을 추가로 포함하고, 상기 가교결합 도메인이 C-말단 시스테인, 음으로 하전된 C-말단 도메인 및 스트렙타비딘 결합 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가교결합 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 16; 서열번호 17; 또는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리히스티딘 태그, Snap 태그, Clip 태그, HaloTag, SnoopTag, SpyTag, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, 칼모둘린-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, 바이오틴 카르복실 운반체 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그 및 항체의 Fc 도메인으로부터 선택된 친화성 태그를 추가로 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 친화성 태그가 6 개 내지 8 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 폴리히스티딘 태그인, 재조합 폴리펩티드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 친화성 태그의 아미노산 서열이 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 15; 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 43, 서열번호 44; 서열번호 45; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머화 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 상기 올리고머화 도메인이 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체를 형성할 수 있는, 재조합 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 올리고머화 도메인이 p53, GCN4, 클라트린, pent-태그 또는 항체의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 올리고머화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 10; 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 또는 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 33; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 % 서열 동일성을 갖는, 재조합 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 33; 서열번호 39; 서열번호 40; 또는 서열번호 41로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  17. 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서,
    상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여 돌연변이 C65A, G233V 및 M239V를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 26; 서열번호 27; 또는 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩티드.
  19. 혈소판 당단백질 Ibα의 변형된 세포외 도메인을 포함하는, 인간 폰빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드로서,
    상기 변형된 세포외 도메인이 서열번호 19와 비교하여
    A238V 돌연변이; 또는
    Δ(229-240) 돌연변이를 포함하고;
    상기 재조합 폴리펩티드가 A238V 돌연변이 또는 Δ(229-240) 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 재조합 폴리펩티드와 동일한 대조 폴리펩티드보다 인간 혈액 샘플 또는 인간 혈장 샘플의 폰빌레브란트 인자에 대한 더 낮은 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 변형된 세포외 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 6 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 36 또는 서열번호 38인, 재조합 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 펩티드를 추가로 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 리더 펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 20인, 재조합 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩티드를 적어도 2 개 포함하는 올리고머 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩티드 또는 제23항에 따른 올리고머 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세포가 CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa 또는 저캣(Jurkat) 세포인, 세포.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩티드 또는 제23항에 따른 올리고머 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    상기 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터
    를 포함하는 핵산.
  27. 제26항에 따른 핵산을 포함하는 세포.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩티드 또는 제23항에 따른 올리고머 폴리펩티드 및 고체 지지체를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 폴리펩티드 또는 올리고머 폴리펩티드가 상기 고체 지지체에 공유 또는 비공유 결합되어 있는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 고체 지지체가 입자, 비드, 막, 표면, 폴리펩티드 칩, 마이크로티터 플레이트 또는 크로마토그래피 컬럼의 고체상을 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 고체 지지체가 라텍스 입자인, 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폰빌레브란트 인자를 추가로 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 고체 지지체가 복수의 입자 또는 비드를 포함하고;
    상기 폰빌레브란트 인자가 상기 복수의 입자 또는 비드의 입자 또는 비드에 가교결합하는, 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 인간 혈장을 추가로 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 인간 혈소판을 추가로 포함하는 조성물.
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