TW202000692A - 包含GpIbα的多肽和組合物、編碼該多肽的核酸及包含該多肽或該核酸的細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明的各種態樣關於特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽。所述重組多肽典型包括血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其典型包含選自G233T、D235V和K237V中的至少一種突變，且所述重組多肽視需要地包括寡聚化結構域。

Description

包含GpIbα的多肽和組合物、編碼該多肽的核酸及包含該多肽或該核酸的細胞
本發明關於一種包含GpIbα的多肽和組合物、編碼該多肽的核酸及包含該多肽或該核酸的細胞。
馮威里氏病(von Willebrand Disease；vWD)是一種常見可遺傳的輕度出血性疾病，已知會帶來重大的診斷挑戰。患有vWD的患者在其日常生活中可能不會出血，但是在止血挑戰期間(例如，牙科作業、手術、分娩或輸血)可能會發生問題。在止血性挑戰的程序之前，醫師慣常會訂購止血板，其通常會導致特定於vWD的額外測試。
馮威里氏因子(von Willebrand Factor；vWF)與許多不同的細胞外和細胞表面分子結合，且在止血和凝血中起重要作用。 vWF在血小板栓塞的形成中特別重要，並且它特異性地結合許多血小板細胞表面蛋白複合物，包括醣蛋白Ibα-V-IX複合物，其交聯血小板和其他細胞外分子(例如，內皮下膠原蛋白)。醣蛋白Ibα-V-IX複合物由四個次單元GPIbα、GPIbβ、GPV和GPIX組成，並存在於血小板的膜中。GPIbα和GPIbβ經由二硫鍵鏈接，而GPV和GPIX與複合物非共價結合。GPIbα次單元攜帶vWF、α-凝血酶、白細胞整聯蛋白αMβ2和P-選擇蛋白的結合位點。
vWD診斷由於其各種類型而變得複雜，傳統上需要多次測試以提供對潛在疾病(underlying disease)機制的清楚理解。1型vWD是由vWF的定量缺乏引起的。2型vWD是由定量vWF缺乏引起的。2型vWD進一步細分為2A型，由降低功能性vWF多聚體比例的突變引起，其降低血小板黏附；2B型，由vWF突變引起，其增加血小板-vWF結合；2M型，由降低vWF依賴性血小板黏附的突變引起；及2N型，由損害與因子VIII結合的突變引起。3型vWD是由幾乎完全缺乏vWF和減少的因子VIII引起的，因子VIII通常經由循環vWF穩定。獲得性vWD是一種相對罕見的獲得性出血性異常，通常發生在老年患者中，與另一種潛在病理相關。最後，血小板型vWD是由vWF與醣蛋白Ibα(GPIbα)的增強結合引起，其由編碼GPIbα的基因的突變引起。已經開發了不同的測定來量化vWF活性，例如vWF抗原測定(vWF：Ag)，其測量血漿中vWF的總濃度，或瑞斯特黴素(ristocetin)輔因子測定(vWF：RCo)，其測量由抗生素瑞斯特黴素誘導的凝集過程期間vWF與血小板GPIbα的結合。然而，vWF：Ag測定僅提供關於患者血漿中存在的vWF的定量水平的資訊，而沒有關注存在的vWF的質量。因此，vWF：Ag本身不允許檢測許多定量缺陷。反過來，由於膽紅素、血紅素；人類抗-小鼠抗體(HAMA)類風濕因子和三酸甘油酯的干擾，vWF：RCo測定可能會受到不精確的影響。進一步增加測定的不精確性是在瑞斯特黴素結合位點處的遺傳變異和多態性。隨著vVWF：Ag濃度的降低，vWF：RCo的準確度特別低。
所述測定依賴於vWF與醣蛋白Ibα的細胞外結構域的結合。然而，在不存在醣蛋白Ibα-V-IX複合物和剪切應力的情況下，vWF以相對弱的4.5μM親和力結合至醣蛋白Ibα。在患有血小板型vWD的患者中鑑定到對醣蛋白Ibα的自然發生突變包括W230L、G233V、G233S、D235Y、M239V和M239I，它們各自增加vWF和醣蛋白Ibα之間的結合親和力[1]-[9] 。
由於vWD的複雜性，沒有一個實驗室測試能夠提供完整的診斷。目前對vWD的診斷報告不足，世界衛生組織報告其患病率為1.14/100,000，而診斷性研究報告的患病率約為一般人群的1%。有多種測試可用於診斷，但專家意見往往是慎重的。準確的測試和明確的診斷標準可以改善許多其疾病未確診的患者的醫療結果。
本發明的發明人已經鑑定了Gp1bα β-髮夾中的新突變，其改善與vWF A1結構域的結合。本發明的發明人亦開發了包含所述突變的新穎重組多肽，來用於診斷vWD。
實施例的多種態樣關於一種重組多肽，其特異性結合人類馮威里氏因子。重組多肽典型包括血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其典型包含相對於SEQ ID NO：19之選自G233T、D235V和K237V中的至少一種突變。重組多肽典型缺乏跨膜結構域。
在一些實施例中，重組多肽對人類血液樣本或人類血漿樣本的馮威里氏因子的結合親和力高於一對照多肽，其不包含所述至少一種突變但在其他方面與所述重組多肽相同。
在一些實施例中，重組多肽和人類馮威里氏因子的Kd小於1μM、750nM、500nM、250nM或100nM。Kd可以(例如)藉由螢光各向異性或表面電漿共振來測定，儘管測定Kd的方法不是特別限制的。螢光各向異性分析可以(例如)在螢光標記的馮威里氏因子和與慢翻滾顆粒結合的重組多肽上進行。表面電漿共振可以(例如)在表面結合的馮威里氏因子和可溶性重組多肽上進行。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之突變C65S和G233T；突變C65S和D235V；突變C65S和K237V；或突變C65S、G233T和M239T。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列的至少約250個連續胺基酸具有至少約95%的序列同源性。例如，修飾的細胞外結構域可視需要地包含SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的至少約250個連續胺基酸具有至少約95%的序列同源性。例如，修飾的細胞外結構域可視需要地包含SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含交聯結構域。交聯結構域視需要地包含C-末端半胱胺酸、帶負電的C-末端結構域和鏈黴親和素(streptavidin)結合蛋白中的一種或多種。在一些實施例中，交聯結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；或SEQ ID NO：18所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含親和性標籤。親和性標籤可視需要地選自多組胺酸標籤、Snap標籤、Clip標籤、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、Strep-標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、FLAG-標籤、V5-標籤、Myc-標籤、HA-標籤、NE-標籤、AviTag、調鈣素-標籤、聚麩胺酸、S-標籤、SBP-標籤、Softag 1、Softag 3、TC標籤、VSV-標籤、Xpress標籤、Isopeptag、生物素羧基載體蛋白、綠色螢光蛋白-標籤、Nus-標籤、硫氧還蛋白-標籤和抗體的Fc結構域，儘管親和性標籤的選擇沒有特別限制。在一些實施例中，親和性標籤為包含6至8個組胺酸殘基的多組胺酸標籤。在一些實施例中，親和性標籤的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：46所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含寡聚化結構域。寡聚化結構域可能能夠形成二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，例如同源-二聚體、同源-三聚體、同源-四聚體或同源-五聚體。寡聚化結構域可以衍生自p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域。在一些實施例中，寡聚化結構域選自由p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域所組成之群。在一些實施例中，寡聚化結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ ID NO：46所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列具有至少約95%的序列同源性。在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41所組成之群。
實施例的多種態樣關於特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之突變C65A、G233V和M239V。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；或SEQ ID NO：28所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽具有對人類血液樣本或人類血漿樣本的馮威里氏因子相較於一對照多肽的更高結合親和力，所述對照多肽不包含相對於SEQ ID NO：19之突變C65A、G233V和M239V，但在其他方面與所述重組多肽相同。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含交聯結構域。交聯結構域視需要地包含C-末端半胱胺酸、帶負電的C-末端結構域和鏈黴親和素結合蛋白中的一種或多種。在一些實施例中，交聯結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；或SEQ ID NO：18所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含親和性標籤。親和性標籤可視需要地選自多組胺酸標籤、Snap標籤、Clip標籤、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、Strep-標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、FLAG-標籤、V5-標籤、Myc-標籤、HA-標籤、NE-標籤、AviTag、調鈣素-標籤、聚麩胺酸、S-標籤、SBP-標籤、Softag 1、Softag 3、TC標籤、VSV-標籤、Xpress標籤、Isopeptag、生物素羧基載體蛋白、綠色螢光蛋白-標籤、Nus-標籤、硫氧還蛋白-標籤和抗體的Fc結構域，儘管親和性標籤的選擇沒有特別限制。在一些實施例中，親和性標籤為包含6至8個組胺酸殘基的多組胺酸標籤。在一些實施例中，親和性標籤的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：46所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含寡聚化結構域。寡聚化結構域可能能夠形成二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，例如同源-二聚體、同源-三聚體、同源-四聚體或同源-五聚體。寡聚化結構域可以衍生自p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域。在一些實施例中，寡聚化結構域選自由p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域所組成之群。在一些實施例中，寡聚化結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ ID NO：46所組成之群。
實施例的多種態樣關於特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之A238V突變。所述重組多肽典型具有對人類血液或人類血漿樣本的馮威里氏因子相較於一對照多肽的更低結合親和力，所述對照多肽不包含A238V突變，但在其他方面與所述重組多肽相同。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：36。
實施例的多種態樣關於特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之D(229-240)突變。所述重組多肽典型具有對人類血液或人類血漿樣本的馮威里氏因子相較於一對照多肽的更低結合親和力，所述對照多肽不包含D(229-240)突變，但在其他方面與所述重組多肽相同。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：38。
實施例的多種態樣關於特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之A238V突變或D(229-240)突變。所述重組多肽典型具有對人類血液或人類血漿樣本的馮威里氏因子相較於一對照多肽的更低結合親和力，所述對照多肽不包含A238V突變或D(229-240)突變，但在其他方面與所述重組多肽相同。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含交聯結構域。交聯結構域視需要地包含C-末端半胱胺酸、帶負電的C-末端結構域和鏈黴親和素結合蛋白中的一種或多種。在一些實施例中，交聯結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；或SEQ ID NO：18所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含親和性標籤。親和性標籤可視需要地選自多組胺酸標籤、Snap標籤、Clip標籤、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、Strep-標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、FLAG-標籤、V5-標籤、Myc-標籤、HA-標籤、NE-標籤、AviTag、調鈣素-標籤、聚麩胺酸、S-標籤、SBP-標籤、Softag 1、Softag 3、TC標籤、VSV-標籤、Xpress標籤、Isopeptag、生物素羧基載體蛋白、綠色螢光蛋白-標籤、Nus-標籤、硫氧還蛋白-標籤和抗體的Fc結構域，儘管親和性標籤的選擇沒有特別限制。在一些實施例中，親和性標籤為包含6至8個組胺酸殘基的多組胺酸標籤。在一些實施例中，親和性標籤的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：46所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含寡聚化結構域。寡聚化結構域可能能夠形成二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，例如同源-二聚體、同源-三聚體、同源-四聚體或同源-五聚體。寡聚化結構域可以衍生自p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域。在一些實施例中，寡聚化結構域選自由p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、或抗體的Fc結構域所組成之群。在一些實施例中，寡聚化結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ ID NO：46所組成之群。
在一些實施例中，重組多肽進一步包含前導肽。在一些實施例中，前導肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：20。
在一些實施例中，重組多肽的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41所組成之群。
本發明的多種態樣關於一種寡聚多肽，包含本文所述之重組多肽的至少兩種。
本發明的多種態樣關於一種細胞，包含本文所述之重組多肽或寡聚多肽。所述細胞可視需要地選自CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa或Jurkat細胞。
本發明的多種態樣關於一種核酸，包含編碼本文所述之重組多肽的核苷酸序列。所述核酸典型亦包含啟動子，其可操作地連接至編碼重組多肽的核苷酸序列(例如，使得啟動子可驅動核苷酸序列在合適的表現細胞中的轉錄)。
本發明的多種態樣關於一種包含本文所述之核酸的細胞(例如，參見上文)。所述細胞可以是表現細胞(例如，CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa或Jurkat細胞)或選殖細胞(cloning cell) (例如，大腸桿菌)。
本發明的多種態樣關於一種組合物，包含本文所述之重組多肽或寡聚多肽及固體撐體，其中，重組多肽或寡聚多肽係(a)共價結合或非共價結合至固體撐體及/或(b)直接結合或間接結合至固體撐體。
固體撐體可視需要地為或包含顆粒、珠粒、膜、表面、多肽晶片、微量滴定板或色譜管柱的固相。例如，在一些實施例中，固體撐體為乳膠顆粒。
在一些實施例中，組合物進一步包含馮威里氏因子(例如，人類馮威里氏因子)。
在一些實施例中，組合物包含固體撐體，其包含複數個顆粒或珠粒、及馮威里氏因子交聯複數個顆粒或珠粒中的顆粒或珠粒。
在一些實施例中，組合物進一步包含血漿(例如，人類血漿)。
在一些實施例中，組合物進一步包含血小板(例如，人類血小板)。
以下描述僅意欲說明本揭示內容之各種實施例。因而，所論述的特定修改不意欲為限制性的。熟習此項技術者將明白，各種等效物、改變、及修改可在不脫離本文提出的標的之精神或範疇的情況下做出，且應瞭解此等等效實施例將包括在本文中。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式“一(a/an)”及“所述(the)”包括複數指示物，除非內容另外清楚地指定。
遍及本說明書，除非上下文另外需要，否則詞語“包含(comprise)”或變化形式諸如“包含(comprise)”或“包含(comprising)”將理解為暗示包括所述元件或整數或元件或整數之群組，但不排除任何其他元件或整數或元件或整數之群組。
除非另外明確說明，否則本說明書中之每一實施例應比照適用於每一其他實施例。
除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義。
如本文所使用，術語“重組”係指生物分子，例如，基因或蛋白質，其(1)已自其天然存在的環境移除，(2)不與其中在自然界發現基因的多核苷酸之全部或一部分相關聯，(3)可操作地連接至本質上不與其有關的多核苷酸，或(4)在自然界不存在。術語“重組”可用於提及經選殖的DNA分離物、化學上合成的多核苷酸類似物、或藉由異源系統生物合成的多核苷酸類似物、以及藉由此種核酸編碼的蛋白質及/或mRNA。
如本文所使用，術語“核酸”係指包含DNA或RNA的任何物質。核酸可以合成方式製得或藉由活細胞來製得。
如本文所使用，術語“多核苷酸”係指核苷酸之聚合鏈。術語包括DNA分子(例如，cDNA或基因組或合成DNA)及RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸類似物、非原生內核苷鍵、或兩者的DNA或RNA之類似物。核酸可呈任何拓撲學構形。例如，核酸可為單鏈、雙鏈、三鏈、四鏈體、部分雙鏈、分支鏈、髮夾形、環形、或呈掛鎖式構形。
如本文所使用，術語“蛋白質”係指大的生物分子或巨分子，其由胺基酸殘基之一個或多個鏈組成。許多蛋白質為催化生物化學反應且對新陳代謝至關重要的酶。蛋白質亦具有結構或機械功能，諸如肌肉中之肌動蛋白及肌球蛋白及細胞骨架中之蛋白質，所述細胞骨架形成維持晶胞形狀之支架系統。其他蛋白質在細胞傳訊、免疫反應、細胞黏著、及細胞週期中為重要的。然而，蛋白質可為完全人工或重組的，亦即，在生物系統中不是天然存在的。
如本文所使用，術語“多肽”係指天然存在及非天然存在的蛋白質兩者，及其片段、突變體、衍生物及類似物。多肽可為單體的或聚合的。多肽可包含許多不同的結構域，其每一者具有一種或多種不同的活性。
術語“野生型序列”或“野生型基因”在本文可互換地使用來指代在寄主細胞中原生或天然存在的序列。在一些實施例中，野生型序列係指所關注的序列，其為蛋白質基因工程計劃之起始點。野生型序列可編碼同源蛋白或是異源蛋白。同源蛋白為寄主細胞將在無介入情況下產生的蛋白質。異源蛋白為寄主細胞若是沒有介入就不會產生的蛋白質。
術語“經修飾序列”及“經修飾基因”在本文中可互換地使用來指代至少包括天然存在的核酸序列之缺失、插入或中斷的序列。
如本文所使用，術語“突變序列”及“突變基因”可互換地使用，且係指在寄主細胞之野生型序列中具有發生至少一個密碼子之改變的一序列。所述至少一個密碼子之改變也稱為“突變”。突變序列的表現產物為相對於野生型具有經改變的胺基酸序列的蛋白質。表現產物可具有經改變的功能性能力(例如，增強的結合親和力)。
如本文所使用的術語“樣本”係指自受試者或患者所獲得的任何生物材料。在一個態樣中，樣本可包含血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其他態樣中，樣本可包含全血、血漿、血清、自血液樣本富集的B細胞、及經培養的細胞(例如，來自受試者的B細胞)。樣本亦可包括包括神經組織的活體組織切片或組織樣本。在再一其他態樣中，樣本可包含整個細胞及/或細胞的裂解產物。
本文所揭露的實施例的多種態樣關於一種新穎重組多肽，其包含醣蛋白Ibα細胞外結構域的突變，其在自然界中不清楚是否在不存在醣蛋白Ibα-V-IX複合物和剪切應力兩者的情況下，在相對於野生型會增加其對vWF的結合親和力。本文所揭露的實施例的多種態樣關於一種包含醣蛋白Ibα細胞外結構域和寡聚化結構域的重組多肽，其在不存在醣蛋白Ibα-V-IX複合物和剪切應力兩者的情況下，在相對於缺乏寡聚化結構域的多肽增加重組多肽對vWF的結合親和力。
實施例的多種態樣關於確定本文所揭露的新穎重組多肽能夠穩定表現和正確折疊二者，並且能夠進行複雜的功能性測定。特別地，本文所揭露的許多重組多肽能夠區分凝血中的小缺陷，且這些缺陷乃歸因於vWF。
I. 重組多肽
實施例的多種態樣關於一種特異性結合人類馮威里氏因子(vWF)的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα(GPIbα)之修飾的細胞外結構域。
術語“特異性結合”係指具有解離常數(Kd)的相互作用不超過10μM，諸如不超過約6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM或50nM，或小於約10μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM或50nM，例如在生理條件下，諸如在人類血漿中或在HEPES或磷酸鹽緩衝液中，且例如在重組多肽(或其寡聚多肽)與野生型人類vWF之間。是否重組多肽特異性結合具有特定解離常數的人類vWF(例如)可以藉由本文所述的螢光各向異性或表面電漿共振來確定，如下所述。
重組多肽典型具有長度為約250個胺基酸至約1000個胺基酸，諸如約250個胺基酸至約550個胺基酸，約500個胺基酸至約750個胺基酸，約600個胺基酸至約800個胺基酸，約750個胺基酸至約1000個胺基酸，約250個胺基酸至約300個胺基酸，約290個胺基酸至約350個胺基酸，約300個胺基酸至約400個胺基酸，約350個胺基酸至約450個胺基酸，約400個胺基酸至約500個胺基酸，約450個胺基酸至約550個胺基酸，約500個胺基酸至約600個胺基酸，約550個胺基酸至約650個胺基酸，約600個胺基酸至約700個胺基酸，約650個胺基酸至約750個胺基酸，約700個胺基酸至約800個胺基酸，約750個胺基酸至約850個胺基酸，約800個胺基酸至約900個胺基酸，約850個胺基酸至約950個胺基酸，或約900個胺基酸至約1000個胺基酸。
重組多肽典型具有分子量為約25千道耳頓(kDa)至約100kDa，諸如約25kDa至約55kDa，約50kDa至約75kDa，約60kDa至約80kDa，約75kDa至約100kDa，約25kDa至約30kDa，約29kDa至約35kDa，約30kDa至約40kDa，約35kDa至約45kDa，約40kDa至約50kDa，約45kDa至約55kDa，約50kDa至約60kDa，約55kDa至約65kDa，約60kDa至約70kDa，約65kDa至約75kDa，約70kDa至約80kDa，約75kDa至約85kDa，約80kDa至約90kDa，約85kDa至約95kDa，或約90kDa至約100kDa。
本文所揭露種類的重組多肽可具有所示的胺基酸序列為SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41。本文所揭露種類的重組多肽可具有胺基酸序列，其與SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同源性，亦即，其中重組多肽的完整胺基酸序列不是天然存在的胺基酸序列。
A. 修飾的細胞外結構域
GPIbα之修飾的細胞外結構域是GPIbα的vWF-結合結構域，對應於SEQ ID NO：19或其子序列所示的胺基酸序列，其含有一個或多個突變，包括至少一個“功能獲得型”或“功能喪失型”突變。功能獲得型和功能喪失型突變分別增加或減少修飾之細胞外結構域對vWF相對於野生型細胞外結構域的結合親和力，所述野生型細胞外結構域跨越與修飾之細胞外結構域相同的GPIbα胺基酸序列。在自然界中未知會發生的功能獲得型突變包括G233T、D235V和K237V(亦即，其中胺基酸如SEQ ID NO：19所編號者)。在自然界中未知會發生的功能喪失型突變包括A238V或D(229-240) (亦即，如SEQ ID NO：19所編號者)。
GPIbα之修飾的細胞外結構域可包括選自G233T、D235V和K237V的一種或多種突變。在一些實施例中，重組多肽或其寡聚多肽具有對人類血液樣本或人類血漿樣本的vWF相較於一對照多肽的更高結合親和力，所述對照多肽(a)包含與重組多肽相同的GPIbα子序列、及(b)缺少一種或多種突變(例如，其中重組多肽和對照多肽是相同的，除了重組多肽中存在一種或多種突變和對照多肽中缺少一種或多種突變)兩者。在一些實施例中，重組多肽或其寡聚多肽和人類vWF的Kd係小於4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、或50nM，例如，在生理條件下，諸如在人類血漿中或在HEPES或磷酸鹽緩衝液中。Kd可以(例如)藉由螢光標記的vWF的螢光各向異性分析和與慢翻滾顆粒結合的重組多肽或藉由表面結合的vWF和可溶性重組多肽的表面電漿共振分析來判定，儘管許多不同的方法也可用於測定重組多肽或其寡聚多肽與vWF之間的Kd。
GPIbα之修飾的細胞外結構域可包括A238V突變。
修飾的細胞外結構域典型包括足夠的人類GPIbα的一級結構以特異性地結合人類vWF。修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的至少約250個、260個、270個、280個或290個連續胺基酸可具有(例如)至少約95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同源性。修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列的至少約250個、260個、270個、280個或290個連續胺基酸可具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同源性。修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列的至少約250個、260個、270個、280個或290個連續胺基酸可具有100%的序列同源性。修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列可具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同源性。修飾的細胞外結構域可具有SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
修飾的細胞外結構域典型包括類似於包括野生型人類GPIbα的分子內二硫鍵結合模式的野生型人類GPIbα vWF結合結構域的二級結構和三級結構。野生型人類GPIbα的二級結構和三級結構存在於對vWF具有低親和力的構形與對vWF具有高親和力的構形之間的動態平衡中。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域有利於對vWF具有高親和力的構形，例如，藉由測量重組多肽或其寡聚多肽與vWF之間的解離常數來評估。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括在野生型人類GPIbα蛋白中發現的醣化作用及/或其他轉譯後修飾。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域對應於天然存在的野生型人類GPIbα的醣型。
重組多肽典型缺乏對應於GPIbα之胺基酸291-517的固有無序細胞外區域，其遵循SEQ ID NO：19所示的vWF結合結構域。重組多肽較佳缺乏GPIbα的跨膜結構域，對應於胺基酸518-540，其遵循固有無序的細胞外區域。重組多肽典型缺乏任何跨膜結構域。重組多肽較佳缺乏GPIbα的胞質結構域，其遵循天然存在GPIbα中的跨膜結構域。
在某些較佳的實施例中，修飾的細胞外結構域包含C65的突變，例如C65S或C65A(亦即，如胺基酸C65在SEQ ID NO：19中編號)。
修飾的細胞外結構域可包括(例如)突變C65S和G233T、突變C65S和D235V、突變C65S和K237V，或突變C65S、G233T和M239T。
修飾的細胞外結構域可包括(例如)突變C65A、G233V和M239V。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括野生型GPIbα胺基酸突變為β-分支鏈胺基酸(例如纈胺酸或蘇胺酸)，其中野生型GPIbα胺基酸不是β-分支鏈胺基酸。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括野生型GPIbα胺基酸突變為包含羥基的胺基酸(例如蘇胺酸)，其中野生型GPIbα胺基酸不包含羥基。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括野生型GPIbα胺基酸突變為包含羥基的β-分支鏈胺基酸(例如蘇胺酸)，其中野生型GPIbα胺基酸不是包含羥基的β-分支鏈胺基酸。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括在自然界中未知會發生的突變。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域在生理pH下具有靜電荷，其不同於野生型細胞外結構域的靜電荷，所述野生型細胞外結構域跨越與修飾的細胞外結構域相同的胺基酸伸展(例如，其中靜電荷與野生型相差至少約0.5，例如約1.0)。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包括野生型GPIbα胺基酸突變為具有比野生型胺基酸更低的構形熵的胺基酸，例如甘胺酸突變為蘇胺酸。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域缺少選自突變為SEQ ID NO：19的胺基酸編號226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243或244中的一種或多種突變。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域缺少選自C65A、N226V、Y228V、W230L、K231V、Q232V、G233V、G233S、D235V、D235Y、K237V、A238V、M239S、M239V、M239I、T240V和A244V中的一種或多種突變。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含A238V突變，並且重組多肽具有對人類血液樣本或人類血漿樣本的vWF相較於對照多肽更低的結合親和力，所述對照多肽(a)包含與重組多肽相同的GPIbα子序列、及(b)缺乏A238V突變(例如，其中重組多肽和對照多肽是相同的，除了重組多肽中存在A238V突變和對照多肽中缺乏A238V突變)兩者。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之胺基酸229至240的缺失(D(229-240)突變)，並且重組多肽具有對人類血液樣本或人類血漿樣本的vWF相較於對照多肽更低的結合親和力，所述對照多肽(a)包含與重組多肽相同的GPIbα子序列、及(b)缺乏D(229-240)突變(例如，其中重組多肽和對照多肽是相同的，除了重組多肽中存在D(229-240)突變和對照多肽中缺乏D(229-240)突變)兩者。在一些實施例中，修飾的細胞外結構域包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
B. 交聯域
實施例的多種態樣關於一種包含交聯結構域的重組多肽。交聯結構域典型允許重組多肽與可溶性分子或固體撐體共價交聯或非共價交聯。
本案發明人已發現並揭露將重組多肽的一級胺(例如，賴胺酸)或羧基(例如，天門冬胺酸、麩胺酸、C-末端)隨機交聯至固體撐體或測定的其他組分的傳統化學物質，例如藉由1-乙基-3-(-3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺(EDAC)或N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)化學物質導致功能性缺陷，這降低了測定準確度和精確度。隨機交聯通常是測定開發的優異策略，因為隨機交聯提供多個不同方向的交聯分子群，這允許在測定中交聯分子的每個表面與其結合配偶體之間的相互作用。定向交聯通常不如隨機交聯用於測定開發，因為定向交聯掩蓋了交聯分子的表面，特別是當分子與固體撐體交聯時，可能以均勻的方式影響每個分子的結構和動力學，以及它們與結合配偶體的相互作用，從而將系統誤差引入測定中。定向交聯一般也是費力且昂貴的，例如，相對於隨機交聯，這是因為定向交聯需要重組多肽的設計、選殖、表現和測定以及利用定向交聯的重組多肽之測定的驗證兩者，不保證任何設計都能避免系統誤差。
實施例的多種態樣關於發現，如本文所述的重組多肽與由重組多肽的C-末端介導的固體撐體的交聯允許相對於隨機交聯具有優異的準確度和精確度的測定。
在一些實施例中，重組多肽包含交聯結構域。交聯結構域可視需要地包含帶負電的C-末端結構域。帶負電的C-末端結構域典型包括3到20個胺基酸(亦即，3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個胺基酸)的拉展，其在中性pH下具有淨負電荷，諸如小於約-1、-2、-3、-4、-5或-6的淨電荷。術語“帶負電的C-末端結構域”不一定意指帶負電的C-末端結構域的胺基酸序列包括重組多肽的C-末端的胺基酸，儘管帶負電的C-末端結構域可包括C-末端胺基酸。“C-末端”相反是指相對於重組多肽中血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域的負電荷結構域的定位，亦即，帶負電的C-末端結構域是相對於修飾的細胞外結構域的C-末端。
帶負電的C-末端結構域典型包括諸如麩胺酸和天門冬胺酸的胺基酸 (例如，至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個麩胺酸和天門冬胺酸)，並且缺少諸如精胺酸、賴胺酸和組胺酸的胺基酸(例如，不超過6個、5個、4個、3個、2個或1個精胺酸、賴胺酸和組胺酸)。帶負電的C-末端結構域亦可視需要地包括顯示高度構形熵的小的親水性胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸)及/或脯胺酸，其可適用於不利於二級結構。
在一些實施例中，交聯結構域可包含帶負電的C-末端結構域和親和性標籤。在一些實施例中，親和性標籤是多組胺酸標籤。在包含多組胺酸標籤和帶負電的C-末端結構域的重組多肽中，帶負電的C-末端結構域典型位於修飾的細胞外結構域與多組胺酸標籤之間。包含帶負電的C-末端結構域和多組胺酸標籤的胺基酸序列的實例係顯示在SEQ ID NO：17中。
在包含親和性標籤和帶負電的C-末端結構域兩者的重組多肽中，帶負電的C-末端結構域典型位於修飾的細胞外結構域與親和性標籤之間。
交聯結構域可視需要地包含C-末端半胱胺酸。C-末端半胱胺酸可適用於將重組多肽交聯至固體撐體或測定的其他組分，例如，使用硫醇-馬來醯亞胺化學或硫醇-金相互作用。在一些實施例中，交聯結構域可包含C-末端半胱胺酸和親和性標籤。在一些實施例中，親和性標籤是多組胺酸標籤。包含多組胺酸標籤和C-末端半胱胺酸的胺基酸序列的實例在SEQ ID NO：16中列出。
術語“C-末端半胱胺酸”不一定意指C-末端半胱胺酸是重組多肽的C-末端胺基酸，儘管C-末端半胱胺酸可以是C-末端胺基酸。“C-末端”相反是指C-末端半胱胺酸相對於重組多肽中血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域的定位，亦即，C-末端半胱胺酸是相對於修飾的細胞外結構域的C-末端。
交聯結構域可視需要地包含鏈黴親和素結合蛋白或其功能等同物。鏈黴親和素結合蛋白可適用於將重組多肽非共價交聯至鏈黴親和素。在一些實施例中，交聯結構域可包含鏈黴親和素結合蛋白和親和性標籤。在一些實施例中，親和性標籤是多組胺酸標籤。包含鏈黴親和素結合蛋白和多組胺酸標籤的胺基酸序列的實例在SEQ ID NO：18中列出。
在一些實施例中，交聯結構域可包含抗體的Fc結構域。包含抗體的Fc結構域的胺基酸序列的實例在SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中列出。
根據本發明的交聯結構域可具有SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；或SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。
C. 親和性標籤
重組多肽可視需要地包括親和性標籤。親和性標籤可適用於純化，並且它們亦可適用於利用重組多肽的測定中。例示性親和性標籤包括多組胺酸標籤、Snap標籤、Clip標籤、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、Strep-標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、FLAG-標籤、V5-標籤、Myc-標籤、HA-標籤、NE-標籤、AviTag、調鈣素-標籤、聚麩胺酸、S-標籤、SBP-標籤、Softag 1、Softag 3、TC標籤、VSV-標籤、Xpress標籤、Isopeptag、生物素羧基載體蛋白、綠色螢光蛋白-標籤、Nus-標籤、硫氧還原蛋白-標籤和抗體的Fc結構域，儘管親和性標籤的選擇沒有特別限制。重組多肽可能缺乏親和性標籤，例如，如果在使用後去除親和性標籤或者如果使用不需要親和性標籤的策略純化重組多肽。例示性親和性標籤為多組胺酸標籤，其典型包括包含6個或8個連續組胺酸的胺基酸序列，儘管組胺酸殘基的數量沒有特別限制(參見，例如，SEQ ID NO：15-18、43、44、46)。在一些實施例中，親和性標籤可包含甘胺酸連接子(參見，例如，SEQ ID NO：44)。在一些實施例中，親和性標籤可包含抗體的Fc結構域(參見，例如，SEQ ID NO：46)。在一些實施例中，親和性標籤為抗體的Fc結構域(參見，例如，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12)。
根據本發明的親和性標籤可具有SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；或SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
C. 寡聚化結構域
重組多肽可視需要地包含寡聚化結構域。寡聚化結構域允許寡聚物的形成，例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體及/或更高級的寡聚物。寡聚化結構域可以有利於特定的化學計量，例如二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，或者寡聚化結構域可以允許具有不同化學計量的寡聚物的分布。可以設計寡聚化結構域以形成同源-寡聚體，儘管同源-寡聚體與異型-寡聚體之間的區別不是特別限制的。在一些實施例中，寡聚化結構域能夠形成同源-二聚體、同源-三聚體、同源-四聚體或同源-五聚體，例如，其中重組多肽的寡聚化產生主要是單分散的寡聚體。寡聚化結構域可以是，例如，來自p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤或抗體的Fc結構域的寡聚化結構域。
寡聚化結構域對用於測定的重組多肽提供了若干優點。寡聚化結構域可以相對於彼此定向重組多肽，其可以近似於(例如)血小板的脂質雙層中天然GPIbα的取向。寡聚化結構域亦可以增加重組多肽對vWF的親和力，例如，因為vWF是多價的，且寡聚多肽的多個修飾的細胞外結構域與vWF的結合本身具有比單個修飾的細胞外結構域與vWF的結合更高的結合親和力。
例示性寡聚化結構域包括抗體Fc結構域鉸鏈區的胺基酸序列。除了上述的寡聚化結構域的益處之外，Fc結構域通常增加表現細胞中重組多肽的表現及/或分泌。
可以基於重組多肽或寡聚多肽所欲的用途來選擇抗體Fc結構域的種類。例如，可以選擇抗體Fc結構域的種類，使得特定試劑在測定中靶向或是忽略抗體Fc結構域。例如，如果在測定中沒有使用抗-小鼠二級抗體來檢測其他小鼠抗體，則小鼠Fc結構域可能是有用的。類似地，小鼠Fc結構域可適用於使用抗-小鼠抗體將重組多肽交聯至固體撐體或測定的其他組分。Fc結構域的種類可以是人類、小鼠、兔、大鼠、倉鼠、豚鼠、山羊、綿羊、馬、雞或任何前述物種的嵌合體，儘管Fc結構域的種類不是特別限制的。
例示性寡聚化結構域是包含鉸鏈區的小鼠IgG Fc結構域，其允許包含寡聚化結構域的重組多肽來形成共價同源二聚體。二聚體小鼠IgG Fc結構域可具有SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列。
Fc結構域亦可助於重組多肽的純化，因為純化包含Fc結構域的多肽的方法是眾所周知的。Fc結構域亦可充當交聯結構域。Fc結構域亦可充當親和性標籤。
另一個例示性寡聚化結構域為p53四聚化結構域。p53四聚化結構域可具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列。
另一個例示性寡聚化結構域為GCN4三聚化結構域。GCN4三聚化結構域可具有SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列。可將包含GCN4-樣(GCN4-like)序列的重組多肽設計為例如平行三聚體。可如本領域中已知者設計交替GCN4-樣序列，以根據本領域已知的方法製備具有平行或反平行組織的二聚體、三聚體和四聚體的寡聚物(參見，例如，Harbury, Zhang, Kim, and Alber, “A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants”, Science (1993) 262:1401)。
另一個例示性寡聚化結構域為網格蛋白三聚化結構域。網格蛋白三聚化結構域可具有SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列。
在一些實施例中，寡聚化結構域可包括親和性標籤。
根據本發明的寡聚化結構域可具有SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，vWF與包含寡聚化結構域的重組多肽之間的解離常數(Kd)小於vWF與對照多肽之間的解離常數，所述對照多肽(a)包含與重組多肽相同的GPIbα子序列或其突變子序列、及(b)缺少寡聚化結構域(例如，其中對照多肽和重組多肽是相同的，除了重組多肽中存在寡聚化結構域和對照多肽中缺少寡聚化結構域)。這種重組多肽與對照多肽之間的解離常數(Kd)的差異典型主要或僅僅歸因於重組多肽和對照多肽的寡聚化狀態。
其他寡聚化結構域是本領域已知者，並且寡聚化結構域的特定選擇不是特別限制的。鏈黴親和素(例如)可以是特別有用的寡聚化結構域，因為它形成四聚體並且還結合生物素，這可助於純化並且亦可用於各種測定。
D.前導肽序列
本文所揭露的重組多肽典型包含前導肽序列，以促進重組多肽跨越表現載體(諸如哺乳動物細胞，諸如人類細胞)的細胞膜的轉譯。然而，重組多肽可能缺少前導肽序列，例如，如果前導肽序列係藉由酶催化或化學切割從重組多肽所切割。合成產生的重組多肽可能類似地缺少前導肽序列。
前導肽序列典型包含在重組多肽的N-末端。在重組多肽於真核細胞中轉譯後，前導肽序列較佳足以將重組多肽轉位到真核細胞(例如，哺乳動物細胞，諸如人類細胞)的細胞表面膜外，儘管重組多肽的其他序列基序亦可助於轉位。
例示性前導肽序列具有SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，其是人類組織纖維蛋白溶酶原訊號肽。此充分表徵的序列能夠將多肽從人類細胞和其他哺乳動物細胞兩者中轉位出來。
II. 寡聚化多肽
實施例的多種態樣關於一種包含2個、3個、4個或更多個如本文所述的重組多肽(次單位)的寡聚化多肽。在一些實施例中，寡聚化多肽為二聚體多肽，亦即，包含兩個次單元的寡聚化多肽，其中每個次單元為本文所述的重組多肽。在沒有修飾語“寡聚化”、“二聚體”或其他明確提及多單元形式(multi-subunit form)的情況下使用的術語“多肽”是指可存在於或不存在於寡聚體(諸如二聚體、三聚體或四聚體)中的重組多肽。
寡聚化多肽的每個次單元典型具有相同的胺基酸序列，儘管寡聚化多肽的不同次單元可具有不同的胺基酸序列。異二聚體多肽可以(例如)藉由用離去基團(例如，用2-2’-二硫代-雙-(5-硝基吡啶))活化第一次單元的半胱胺酸硫醇來製備，從而還原第二次單元的硫醇(例如，用β-巰基乙醇或三(2-羧乙基)膦)，然後使第一次單元和第二次單元接觸。可供選擇地，次單元可以隨機交聯然後純化。可以使用類似的策略製備同源-二聚體多肽。可以在寡聚化之後純化寡聚化多肽，以將所欲的寡聚化多肽與單體次單元和其他不需要的物質分離。
寡聚化多肽可以是對稱的，或者寡聚化多肽可以缺乏對稱性。例如，寡聚化多肽可形成“分子間”二硫鍵結合模式，導致四元結構缺乏對稱性。
寡聚化多肽可以藉由非共價或共價相互作用來交聯。非共價相互作用的實例為GCN4或網格蛋白寡聚化結構域的三聚化或p53寡聚化結構域的四聚化。共價相互作用的實例為二硫鍵介導的抗體Fc結構域鉸鏈區的二聚化。具有包含抗體Fc結構域的次單元的二聚體多肽可以藉由至少1個二硫鍵(典型為2個二硫鍵)共價地交聯(例如，對於IgG1 和IgG4 衍生的Fc結構域)或4個二硫鍵(例如，對於IgG2 衍生的Fc結構域)，儘管二硫鍵的數量沒有特別限制。IgG3 可以與(例如)11個二硫鍵交聯。
二聚體多肽可包含2個次單元，其中每個次單元包含抗體Fc結構域，並且抗體Fc結構域交聯二聚體多肽的2個次單元。
三聚體多肽可包含3個次單元，其中每個次單元包含GCN4三聚化結構域，並且GCN4三聚化結構域非共價交聯三聚體多肽的3個次單元。三聚體多肽可包含3個次單元，其中每個次單元包含網格蛋白三聚化結構域，並且網格蛋白三聚化結構域非共價交聯三聚體多肽的3個次單元。
四聚體多肽可包含4個次單元，其中每個次單元包含p53四聚化結構域，並且p53四聚化結構域非共價交聯四聚體多肽的4個次單元。
本發明的多種實施例包括含有二聚體多肽的組合物，其中所述組合物基本上不含非二聚體多肽的寡聚化多肽。組合物可能缺少非二聚體多肽的寡聚化多肽。
本發明的多種實施例包括含有三聚體多肽的組合物，其中所述組合物基本上不含非三聚體多肽的寡聚化多肽。組合物可能缺少非三聚體多肽的寡聚化多肽。
本發明的多種實施例包括含有四聚體多肽的組合物，其中所述組合物基本上不含非四聚體多肽的寡聚化多肽。組合物可能缺少非四聚體多肽的寡聚化多肽。
在一些實施例中，組合物包含單體重組多肽，其中所述組合物基本上不含寡聚化多肽。組合物可能缺乏寡聚化多肽。
III. 核酸、選殖細胞和表現細胞
本文描述的實施例還包括核酸，其包含編碼修飾的細胞外結構域的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1-9，或SEQ ID NO：42)及/或本文所述的重組多肽。核酸可以是DNA或RNA。包含編碼本文所述的重組多肽的核苷酸序列的DNA典型包含與核苷酸序列可操作連接的啟動子。啟動子較佳能夠在感興趣的表現細胞中驅動核苷酸序列的組成型或誘導型表現。核酸的精確核苷酸序列不受特別限制，只要該核苷酸序列編碼本文所述的重組多肽即可。例如，可經選擇密碼子以匹配感興趣的表現細胞(例如哺乳動物細胞，諸如人類細胞)的密碼子偏好性及/或為了方便選殖。DNA可以是質體，例如，其可以包含複製起點(例如，用於在原核細胞中複製質體)。
實施例的多種態樣關於一種包含核酸的細胞，所述核酸包含編碼本文所述的修飾的細胞外結構域及/或重組多肽的核苷酸序列。細胞可以是表現細胞或選殖細胞。典型將核酸選殖到大腸桿菌中，但也可以使用其他選殖細胞。如果細胞是表現細胞，則核酸可視需要地是染色體的核酸，亦即，其中核苷酸序列被整合到染色體中，儘管然後核酸可以存在於表現細胞中，例如，作為染色體外DNA。
實施例的多種態樣關於一種包含如本文所述的重組多肽或寡聚多肽(例如二聚體、三聚體或四聚體多肽)的細胞。實施例的多種態樣關於一種包含細胞、細胞培養基、及如本文所述的重組多肽或寡聚多肽的組合物，其中所述細胞包含編碼重組多肽或寡聚多肽的次單元的核酸，且所述細胞培養基包含重組多肽或寡聚多肽(例如，因為細胞將重組多肽或寡聚多肽分泌到細胞培養基中)。細胞典型是表現細胞。表現細胞的性質不被特別限制。哺乳動物表現細胞可允許有利的折疊、轉譯後修飾及/或重組多肽或寡聚多肽的分泌，儘管其他真核細胞或原核細胞可用作表現細胞。例示性表現細胞包括CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa和Jurkat細胞。
IV. 與測定有關的組合物和方法
本發明的多種態樣關於一種包含如本文所述的重組多肽或寡聚多肽的組合物，其中重組多肽或寡聚多肽直接或間接結合於固體撐體。如本文所用的術語“直接”結合是指分子與固體撐體的直接綴合(conjugation)，例如，將重組多肽的半胱胺酸硫醇結合至金表面的金-硫醇相互作用。如本文所用的術語“間接”結合包括重組多肽與直接結合至固體撐體的另一分子的特異性結合，例如，重組多肽可結合直接結合至固體撐體的抗體，從而間接結合重組多肽到固體撐體(參見，例如，圖4A)。術語“間接”結合係與重組多肽和固體撐體之間的分子數無關，只要(a)分子的菊鏈(daisy chain)之間的每個相互作用是特異性或共價相互作用，和(b)菊鏈的末端分子係直接結合至固體撐體(參見，例如，圖4A，其中辣根過氧化物酶(HRP)、抗-vWF抗體、vWF、和重組多肽(“GPIbα”)通過抗-CD42b抗體的直接結合至固體撐體各自間接結合至固體撐體)。
本發明的多種態樣關於一種包含如本文所述的重組多肽或寡聚多肽的組合物，其中所述重組多肽或寡聚多肽共價結合或非共價結合至固體撐體。如本文所用的術語“非共價結合”是指特異性結合，諸如抗體及其抗原之間，配體及其受體之間，或酶及其受質之間的結合，例如藉由鏈黴親及素結合蛋白和鏈黴親和素或抗體及其抗原之間的相互作用舉例說明(參見，例如，圖4A)。特異性結合一般是指解離常數(Kd)小於約10μM，諸如小於約1μM，小於約100nM，或小於約10nM的相互作用。
固體撐體可包括顆粒、珠粒、膜、表面、多肽晶片、微量滴定板或色譜管柱的固相。例如，固體撐體可以是乳膠珠粒。
組合物可包含複數個珠粒或顆粒，其中複數個珠粒或顆粒中的每個珠粒或顆粒係直接結合或間接結合至如本文所述的重組多肽或寡聚多肽的至少一種。組合物可包含複數個珠粒或顆粒，其中複數個珠粒或顆粒中的每個珠粒或顆粒係共價結合或非共價結合至如本文所述的重組多肽或寡聚多肽的至少一種。
組合物可包含馮威里氏因子。組合物可包含人類vWF，例如，在水溶液或懸浮液中，諸如全血或其餾分，諸如血漿。組合物可包含固體撐體，其中固體撐體包含複數個珠粒或顆粒，並且vWF交聯複數個顆粒或珠粒中的顆粒或珠粒。
組合物可包含人類血漿。組合物可包含人類血小板。組合物可包含人類血漿和人類血小板。
組合物可包含抗體，例如，其中所述抗體不是人類抗體。抗體可以是(例如)小鼠、兔、大鼠、倉鼠、豚鼠、山羊、綿羊、馬、雞或前述物種的嵌合體，儘管前述物種抗體沒有特別限制。組合物可包含抗-vWF抗體，較佳為抗-人類vWF抗體。組合物可包含螢光標記的抗體。在一些實施例中，抗-人類vWF抗體直接結合或間接結合染料、螢光團或酶。
組合物可包含pH緩衝劑，諸如HEPES或磷酸鹽緩衝劑。組合物可包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、，吐溫(Tween)(例如，Tween 20)或葡聚醣-500。
組合物可進一步包含瑞斯特黴素。本文揭露的重組多肽的一個優點是其開發不需要瑞斯特黴素的測定法。在一些實施例中，本文揭露的組合物缺乏瑞斯特黴素。
實施例的多種態樣關於一種包含如本文所述的組合物和使用說明書的套組。
範例
實例1. 重組多肽的表現和純化
用來自人類組織纖維蛋白溶酶原活化子(SEQ ID NO：20)的N末端前導肽和C末端多組胺酸標籤(SEQ ID NO：15、16、17、18、43、44或46)選殖由290個胺基酸組成的醣蛋白Ibα(GPIbα)的馮威里氏因子(vWF)結合結構域(SEQ ID NO：19)。將選擇的胺基酸突變引入GPIbα的vWF結合結構域。將寡聚化結構域和交聯結構域選殖到選擇的構建體中。構建體在人類胎腎(HEK)細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中瞬時或穩定表現。使用包含0.02%疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)流動相，藉由固定化金屬親和性層析(IMAC)從細胞培養上清液中純化重組多肽。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件下於4-15%TGXTM 聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad，California)中評估重組多肽純度。含有選擇的重組多肽的凝膠圖像顯示在圖1中。
實例2. vWF與重組多肽之間的結合親和力(Kd)的測量
藉由螢光各向異性評估vWF與選擇的二聚體多肽或單體多肽對照(G233V、M239V-noFc(SEQ ID NO：35))之間的解離常數(Kd)。每個二聚體多肽包括兩個重組多肽次單元，每個次單元包含鼠類Fc二聚體結構域和GPIbα之修飾的細胞外結構域。評估的二聚體多肽對應於SEQ ID NO：38(D(229-240))；SEQ ID NO：37(WT)；SEQ ID NO：36(A238V)；SEQ ID NO：34(G233V、M239V)；SEQ ID NO：32(G233V)；SEQ ID NO：33(G233T，M239T)；SEQ ID NO：21(G233T)；SEQ ID NO：30(D235V)；SEQ ID NO：31(K237V)。使用半胱胺酸-硫醇-馬來醯亞胺化學將特異性結合GPIbα vWF結合結構域的vWF A1結構域(人類vWF的胺基酸1277-1453)與AlexaFluorTM 488螢光標記(Molecular Probes，Oregon)綴合。將重組多肽與慢翻滾顆粒綴合。將5μM至9.75nM的每種重組多肽的2x連續稀釋液用150nM的vWF A1-AlexaFluorTM 488種類在室溫下培養 ＞30分鐘，然後測量螢光各向異性。結果顯示在圖2中。不包含突變的重組多肽顯示Kd為約1.25μM。包含G233T、D235V或K237V突變中之一種的重組多肽各自顯示小於500nM的Kd(亦即，對於單突變體，分別為~67nM、~250nM和~300nM)。藉由ELISA確認G233T、D235V或K237V突變體的相對結合親和力(分別參見圖4D、圖4B和圖4C，以及實例3，見下文)。
使用BiacoreTM (Biacore，Sweden)藉由表面電漿共振確認螢光各向異性結果(圖3)。將vWF A1結構域與Biacore CM5晶片綴合。測量包含G233T突變至GPIbα細胞外結構域、C末端鼠類Fc結構域和C末端8-His標籤(SEQ ID NO：21)的重組多肽的開啟和關閉速率，並且計算解離常數為~58nM，這與藉由螢光各向異性獲得的~67nM測量值一致。
實例3. 重組多肽能夠藉由ELISA檢測vWF結合的定性缺陷
酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)係用於測定包含G233T(SEQ ID NO：21)、D235V(SEQ ID NO：30)和K237V(SEQ ID NO：31)突變的重組多肽能夠檢測vWF結合親和力的定性差異。圖4A顯示ELISA測定的卡通圖。簡而言之，多孔板的孔係用抗-CD42b抗體包覆，該抗體特異性結合重組多肽的GPIbα之修飾的細胞外結構域，並用於間接地將重組多肽交聯到多孔板(亦即，固體撐體)。將各種對照樣本、標準品及其連續稀釋液加入到多孔板的不同孔中，該多孔板包括與1型、2B型和3型馮威里氏病相關的血漿樣本、混合的人類血漿的對照樣本、已知人類血漿不具有馮威里氏病的對照樣本、從無稀釋至16倍稀釋的混合人類血漿的參考標準品的2倍連續稀釋、以及作為陰性對照的山羊血清。培養後，洗滌該等孔，然後與多株兔抗-人類vWF抗體接觸，該抗體與辣根過氧化物酶綴合。在450nm處藉由吸收光譜經監測該辣根過氧化物酶基質轉化為產物來定量結合的vWF。
包含G233T、D235V或K237V突變的每種重組多肽能夠檢測與1型、2B型和3型馮威里氏病相關的血漿樣本中的缺陷，例如，相對於正常血漿樣本和對照樣本(圖4B至圖4D)。包含G233T、D235V和K237V突變的每種重組多肽也允許連續稀釋和吸光度測量的五個樣本之間的精確相關性。這些結果證明，本文所述的包含G233T、D235V和K237V突變中的至少一種的重組多肽可用於檢測馮威里氏病的測定，並且所述測定可以允許在跨度超過一個數量級的動態範圍內準確測量血漿中的vWF濃度及/或結合親和力。
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無
圖1包含十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠的照片，其證實各種重組多肽的表現和純度。凝膠的通道編號如下：(1)分子量標準；(2)包含C65S和G233T突變、IgG1 Fc二聚化結構域和8-His親和性標籤的重組多肽(箭頭所指；下部帶對應於鼠IgG1恆定結構域) (SEQ ID NO：21)；(3)包含C65S和G233T突變、p53四聚化結構域和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：22)；(4)包含C65S、G233V和M239V突變、p53四聚化結構域和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：23)；(5)包含C65S和G233T突變、6-His親和性標籤和C-末端半胱胺酸的重組多肽(SEQ ID NO：24)；(6)包含C65S和G233T突變、鏈黴親和素結合蛋白和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：25)；(7)包含C65A、G233V和M239V突變、p53四聚化結構域和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：26)；(8)分子量標準；(9)分子量標準；(10)包含C65A、G233V和M239V突變和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：27)；(11)包含C65A、G233V和M239V突變、帶負電的C-末端結構域和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：28)；(12)包含G233V和M239V突變、FLAG標籤和6-His親和性標籤的重組多肽(SEQ ID NO：29)。
圖2是長條圖，其描繪了經由螢光標記的重組馮威里氏因子A1結構域與和包含兩個重組多肽亞單元的顆粒結合的二聚體多肽之間的螢光各向異性評估的解離常數(Kd；y-軸)，所述重組多肽亞單元各自包含Fc二聚化結構域和血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域，其包括在x軸上指示的突變和C65S突變或顆粒結合的單體多肽對照(G233V、M239V-noFc(SEQ ID NO：35))。所評估的二聚體多肽對應於SEQ ID NO：38(D(229-240))；SEQ ID NO：37(WT)；SEQ ID NO：36(A238V)；SEQ ID NO：34(G233V、M239V)；SEQ ID NO：32(G233V)；SEQ ID NO：33(G233T、M239T)；SEQ ID NO：21(G233T)；SEQ ID NO：30(D235V)；SEQ ID NO：31(K237V)。不包含突變的二聚體多肽顯示出約1.25μM的Kd。包含G233T、D235V或K237V突變之一種的重組多肽各自顯示出小於500nM的Kd(例如，對於單突變體，分別為~67nM、~250nM和~300nM)。
圖3是表面結合馮威里氏因子和可溶性重組多肽的Biacore表面電漿共振分析的線圖，所述可溶性重組多肽包含其含有G233T突變的血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域。此分析表明，馮威里氏因子與G233T重組多肽之間的解離常數(Kd)為58nM，這證實了圖2的螢光各向異性Kd測量，其測量了G233T突變體的Kd為67nM。
圖4A是用於產生圖4B至圖4D中資料的酶聯免疫吸附測定(ELISA)的卡通圖。用抗-醣蛋白Ibα抗體(抗-CD42b)披覆固體撐體，其用於固定包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域(CD42b；GP1bα；GP1b構建體)的重組多肽。然後使固體撐體與人類血漿、馮威里氏因子校準物或馮威里氏因子對照接觸。然後使固體撐體與多株兔抗-人類馮威里氏因子抗體(辣根過氧化物酶(HRP)係與之共軛)接觸。然後使組合物與能夠經由在450nm處具有強吸光度的HRP轉化成產物的基質接觸，並測量吸光度。
圖4B是長條圖，其描繪了使用重組多肽的圖4A的ELISA結果，所述重組多肽包含其包括C65S和D235V突變的血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域(SEQ ID NO：30)。在x軸上的前四個樣本分別對應於已知1型、2B型、3型和1型馮威里氏因子的樣本(亦即，GK1422(1)；GH1423(2B)；GK1419(3)；GK1425(1))。第五和第六個樣本是包含混合的人類血漿的對照樣本(亦即，DG-C1；DG-C2)。第七個樣本是山羊血清對照(其缺乏馮威里氏因子)。第八至第十七個樣本是沒有馮威里氏因子(“正常”)的人類血漿樣本。第十八至第二十二個樣本對應於從無稀釋(1：1)至16倍稀釋(1：16)的混合的人類血漿之參考標準的連續稀釋。y軸對應於在450nm處的吸光度(Abs)，且增加的吸光度對應於增加的結合馮威里氏因子。
圖4C是長條圖，其描繪了使用重組多肽的圖4A的ELISA結果，所述重組多肽包含其包括C65S和K237V突變的血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域(SEQ ID NO：31)。在x軸上的前四個樣本分別對應於已知1型、2B型、3型和1型馮威里氏因子的樣本(亦即，GK1422(1)；GH1423(2B)；GK1419(3)；GK1425(1))。第五和第六個樣本是包含混合的人類血漿的對照樣本(亦即，DG-C1；DG-C2)。第七個樣本是山羊血清對照(其缺乏馮威里氏因子)。第八至第十七個樣本是沒有馮威里氏因子(“正常”)的人類血漿樣本。第十八至第二十二個樣本對應於從無稀釋(1：1)至16倍稀釋(1：16)的混合的人類血漿之參考標準的連續稀釋。y軸對應於在450nm處的吸光度(Abs)，且增加的吸光度對應於增加的結合馮威里氏因子。
圖4D是長條圖，其描繪了使用重組多肽的圖4A的ELISA結果，所述重組多肽包含其包括C65S和G233T突變的血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域(SEQ ID NO：21)。在x軸上的前四個樣本分別對應於已知1型、2B型、3型和1型馮威里氏因子的樣本(亦即，GK1422(1)；GH1423(2B)；GK1419(3)；GK1425(1))。第五和第六個樣本是包含混合的人類血漿的對照樣本(亦即，DG-C1；DG-C2)。第七個樣本是山羊血清對照(其缺乏馮威里氏因子)。第八至第十七個樣本是沒有馮威里氏因子(“正常”)的人類血漿樣本。第十八至第二十二個樣本對應於從無稀釋(1：1)至16倍稀釋(1：16)的混合的人類血漿之參考標準的連續稀釋。y軸對應於在450nm處的吸光度(Abs)，且增加的吸光度對應於增加的結合馮威里氏因子。
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Claims (34)

  1. 一種特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域； 其中，所述重組多肽缺乏跨膜結構域；以及 所述修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之選自G233T、D235V和K237V中的至少一種突變。
  2. 如請求項1所述之重組多肽，其中，所述重組多肽對人類血液樣本或人類血漿樣本的馮威里氏因子的結合親和力高於一對照多肽，所述對照多肽不包含所述至少一種突變但在其他方面與所述重組多肽相同。
  3. 如請求項1或2所述之重組多肽，其中，所述重組多肽和人類馮威里氏因子的Kd小於1 μM、750 nM、500 nM、250 nM或100 nM。
  4. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其中，所述修飾的細胞外結構域包含： 相對於SEQ ID NO：19之突變C65S和G233T； 突變C65S和D235V； 突變C65S和K237V；或 突變C65S、G233T和M239T。
  5. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其中，所述修飾的細胞外結構域與SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的至少約250個連續胺基酸具有至少約95%的序列同源性。
  6. 如請求項5所述之重組多肽，其中，所述修飾的細胞外結構域包含SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；或SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
  7. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其進一步包含交聯結構域，其中，所述交聯結構域包含C-末端半胱胺酸、帶負電的C-末端結構域和鏈黴親和素結合蛋白中的一種或多種。
  8. 如請求項7所述之重組多肽，其中，所述交聯結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；和SEQ ID NO：18所組成之群。
  9. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其進一步包含親和性標籤，所述親和性標籤選自多組胺酸標籤、Snap標籤、Clip標籤、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、幾丁質結合蛋白、麥芽糖結合蛋白、Strep-標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、FLAG-標籤、V5-標籤、Myc-標籤、HA-標籤、NE-標籤、AviTag、調鈣素-標籤、聚麩胺酸、S-標籤、SBP-標籤、Softag 1、Softag 3、TC標籤、VSV-標籤、Xpress標籤、Isopeptag、生物素羧基載體蛋白、綠色螢光蛋白-標籤、Nus-標籤、硫氧還原蛋白-標籤和抗體的Fc結構域。
  10. 如請求項9所述之重組多肽，其中，所述親和性標籤為包含6至8個組胺酸殘基的多組胺酸標籤。
  11. 如請求項9或10所述之重組多肽，其中，所述親和性標籤的胺基酸序列選由自SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；和SEQ ID NO：46所組成之群。
  12. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其進一步包含寡聚化結構域，其中，所述寡聚化結構域能夠形成二聚體、三聚體、四聚體或五聚體。
  13. 如請求項12所述之重組多肽，其中，所述寡聚化結構域選自由p53、GCN4、網格蛋白、pent-標籤、和抗體的Fc結構域所組成之群。
  14. 如請求項12或13所述之重組多肽，其中，所述寡聚化結構域的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；和SEQ ID NO：46所組成之群。
  15. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其中，所述重組多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列具有至少約95%的序列同源性。
  16. 如前述請求項中任一項所述之重組多肽，其中，所述重組多肽的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；和SEQ ID NO：41所組成之群。
  17. 一種特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域； 其中，所述修飾的細胞外結構域包含相對於SEQ ID NO：19之突變C65A、G233V和M239V。
  18. 如請求項17所述之重組多肽，其中，所述修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，或其中，所述重組多肽的胺基酸序列選自由SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；和SEQ ID NO：28所組成之群。
  19. 一種特異性結合人類馮威里氏因子的重組多肽，包含血小板醣蛋白Ibα之修飾的細胞外結構域； 其中，所述修飾的細胞外結構域包含： 相對於SEQ ID NO：19之A238V突變；或 D(229-240)突變；和 所述重組多肽對人類血液或人類血漿樣本的馮威里氏因子的結合親和力低於一對照多肽，所述對照多肽不包含A238V突變或D(229-240)突變但在其他方面與所述重組多肽相同。
  20. 如請求項19所述之重組多肽，其中，所述修飾的細胞外結構域的胺基酸序列包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，或其中，所述重組多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38。
  21. 如請求項13或14所述之重組多肽，其進一步包含前導肽。
  22. 如請求項21所述之重組多肽，其中，所述前導肽的胺基酸序列為SEQ ID NO：20。
  23. 一種寡聚多肽，包含如請求項1至22中任一項所述之重組多肽的至少兩種。
  24. 一種細胞，包含請求項1至22中任一項所述之重組多肽或請求項23所述之寡聚多肽。
  25. 如請求項24所述之細胞，其中，所述細胞為CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa或Jurkat細胞。
  26. 一種核酸，包含： 編碼請求項1至22中任一項所述之重組多肽或請求項23所述之寡聚多肽的核苷酸序列；以及 與所述核苷酸序列可操作連接的啟動子。
  27. 一種細胞，包含請求項26所述之核酸。
  28. 一種組合物，包含請求項1至22中任一項所述之重組多肽或請求項23所述之寡聚多肽；以及固體撐體，其中所述重組多肽或所述寡聚多肽與所述固體撐體共價結合或非共價結合。
  29. 如請求項28所述之組合物，其中，所述固體撐體包括顆粒、珠粒、膜、表面、多肽晶片、微量滴定板或色譜管柱的固相。
  30. 如請求項29所述之組合物，其中，所述固體撐體為乳膠顆粒。
  31. 如請求項28至30中任一項所述之組合物，其進一步包含馮威里氏因子。
  32. 如請求項31所述之組合物，其中，所述固體撐體包含複數個顆粒或珠粒；以及 所述馮威里氏因子交聯所述複數個顆粒或珠粒中的顆粒或珠粒。
  33. 如請求項31或32所述之組合物，其進一步包含人類血漿。
  34. 如請求項33所述之組合物，其進一步包含人類血小板。
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