JP2020514269A - 組換えGpIbα受容体タンパク質を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibα(GPIbα)の修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子(vWF)に特異的に結合する組換えポリペプチドに関する。
GPIbαの修飾された細胞外ドメインは、少なくとも1つの「機能獲得」又は「機能喪失」変異を含む1つ又は複数の変異を含有する、配列番号19に記載のアミノ酸配列、又はそのサブ配列に対応するGPIbαのvWF-結合ドメインである。機能獲得及び機能喪失変異は、それぞれ、修飾された細胞外ドメインと同一の、GPIbαのアミノ酸配列に及ぶ野生型細胞外ドメインに比べて、vWFに対する修飾された細胞外ドメインの結合親和性を増加又は減少させる。天然で生じることが知られていない機能獲得変異は、G233T、D235V、及びK237Vを含む(すなわち、アミノ酸は配列番号19におけるようにナンバリングされる)。天然で生じることが知られていない機能喪失変異は、A238V又はΔ(229〜240)を含む(すなわち、配列番号19におけるようにナンバリングされる)。
実施形態の種々の態様は、架橋ドメインを含む組換えポリペプチドに関する。架橋ドメインは、典型的には、組換えポリペプチドが、可溶性分子又は固体支持体に共有結合的又は非共有結合的に架橋されるのを可能とする。
組換えポリペプチドは、任意選択で、親和性タグを含み得る。親和性タグは精製で有用であり、それらは、組換えポリペプチドを利用するアッセイにおいても有用であり得る。例示的な親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインを含むが、親和性タグの選択は特に制限されない。組換えポリペプチドは、それにもかかわらず、例えば、親和性タグが使用後に除去される場合、又は親和性タグを必要としない戦略を用いて組換えポリペプチドが精製される場合、親和性タグを欠如し得る。例示的な親和性タグは、典型的には、6個又は8個の連続ヒスチジンを含むアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグであるが、ヒスチジン残基の数は特に制限されない(例えば、配列番号15〜18、43、44、46参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、グリシンリンカーを含み得る(例えば、配列番号44参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、抗体のFcドメインを含み得る(例えば、配列番号46参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、抗体のFcドメインである(例えば、配列番号11又は12参照)。
組換えポリペプチドは、任意選択で、オリゴマー化ドメインを含み得る。オリゴマー化ドメインは、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、及び/又はより高次のオリゴマー等のオリゴマーの形成を可能とする。オリゴマー化ドメインは、特定の化学量論にとって有利であり得、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、若しくはペンタマー、又はオリゴマー化ドメインは、異なる化学量論を有するオリゴマーの分布を可能とし得る。オリゴマー化ドメインは、ホモ-オリゴマーを形成するように設計され得るが、ホモ-オリゴマーとヘテロ-オリゴマーとの間の区別は特に制限されない。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、ホモ-ダイマー、ホモ-トリマー、ホモ-テトラマー、又はホモ-ペンタマーを形成することができ、例えば、組換えポリペプチドのオリゴマー化の結果、圧倒的に単分散のオリゴマーがもたらされる。オリゴマー化ドメインは、例えば、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからのオリゴマー化ドメインであり得る。
本明細書中に開示された組換えポリペプチドは、典型的には、ヒト細胞等の哺乳動物細胞等の、発現ベクターの細胞膜を横切っての組換えポリペプチドの移行にとって有利なように、リーダーペプチド配列を含む。組換えポリペプチドは、それにもかかわらず、例えば、リーダーペプチド配列が酵素的又は化学的切断によって組換えポリペプチドから切断される場合、リーダーペプチド配列を欠如し得る。合成により生じた組換えポリペプチドは、同様に、リーダーペプチド配列を欠如し得る。
実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された2個、3個、4個、又はそれを超える組換えポリペプチド(サブユニット)を含むオリゴマーポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、オリゴマーポリペプチドは、ダイマーポリペプチド、すなわち、2個のサブユニットを含むオリゴマーポリペプチドであり、各サブユニットは本明細書中に記載された組換えポリペプチドである。修飾語「オリゴマー」、「ダイマー」、又はマルチサブユニット形態への他の明示的な言及なしに用いられる用語「ポリペプチド」とは、ダイマー、トリマー、又はテトラマー等のオリゴマーに存在してもしよいし、していなくてもよい組換えポリペプチドを指す。
本明細書中に記載された実施形態は、本明細書中に記載された修飾された細胞外ドメイン(例えば、配列番号1〜9、又は42)及び/又は組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。核酸は、DNA又はRNAであり得る。本明細書中に記載された組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAは、典型的には、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、好ましくは、目的の発現細胞におけるヌクレオチド配列の構成的又は誘導性発現を駆動することができる。核酸の正確なヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が本明細書中に記載された組換えポリペプチドをコードする限り、特に制限されない。コドンは、例えば、目的の発現細胞(例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞)のコドンバイアスと適合するように、及び/又はクローニングの間の便宜のために選択され得る。DNAは、例えば、(例えば、原核生物細胞におけるプラスミドの複製のために)複製起点を含み得るプラスミドであり得る。
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、固体支持体に直接的又は間接的に結合している、組成物に関する。用語「直接的」結合とは、本明細書中で用いる場合、固体支持体への分子の直接的コンジュゲーション、例えば、組換えポリペプチドのシステインチオールを金表面に結合する金-チオール相互作用を指す。用語「間接的」結合は、本明細書中で用いる場合、固体支持体に直接的に結合した別の分子への組換えポリペプチドの特異的結合を含み、例えば、組換えポリペプチドは、固体支持体に直接的に結合した抗体に結合でき、それにより、組換えポリペプチドを固体支持体に間接的に結合する(例えば、図4A参照)。用語「間接的」結合は、(a)分子のデイジー鎖(daisy chain)の間の各相互作用が特異的若しくは共有結合相互作用であり、(b)デイジー鎖の末端分子が固体支持体に直接的に結合している限り、組換えポリペプチドと固体支持体との間の分子の数から独立している(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、抗vWF抗体、vWF、及び組換えポリペプチド(「GPIbα」)が、各々、抗CD42b抗体の固体支持体への直接的結合を介して固体支持体に間接的に結合している図4A参照)。
組換えポリペプチドの発現及び精製
290個のアミノ酸からなる糖タンパク質Ibα(GPIbα)のフォンヴィレブランド因子(vWF)-結合ドメイン(配列番号19)を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターからのN末端リーダーペプチド(配列番号20)及びC末端ポリヒスチジンタグ(配列番号15、16、17、18、43、44又は46)を伴う形でクローニングした。選択したアミノ酸変異をGPIbαのvWF-結合ドメインに導入した。オリゴマー化ドメイン及び架橋ドメインを選択した構築物にクローニングした。構築物を、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で一過的に又は安定に発現させた。0.02%のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PPS)移動相を用いる固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)によって、組換えポリペプチドを細胞培養上清から精製した。組換えポリペプチドの純度は、4〜15%のTGX(商標)ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad社、California)中での還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。選択した組換えポリペプチドを含有するゲルの像を、図1に示す。
vWFと組換えポリペプチドとの間の結合親和性(Kd)の測定
vWFと選択したダイマーポリペプチド若しくはポリマーポリペプチド対照(G233V、M239V-noFc(配列番号35))との間の解離定数(Kd)を、蛍光異方性によって評価した。各ダイマーポリペプチドは、各々が、ネズミFcダイマー化ドメイン及びGPIbαの修飾された細胞外ドメインを含む、2個の組換えポリペプチドサブユニットを含んだ。評価したダイマーポリペプチドは、配列番号38(Δ(229〜240));配列番号37(WT);配列番号36(A238V);配列番号34(G233V、M239V);配列番号32(G233V);配列番号33(G233T、M239T);配列番号21(G233T);配列番号30(D235V);配列番号31(K237V)に対応する。GPIbα vWF-結合ドメインに特異的に結合するvWF A1ドメイン(ヒトvWFのアミノ酸1277〜1453)を、システイン-チオール-マレイミド化学反応を用いて、AlexaFluor(商標)488蛍光標識(Molecular Probes社、Oregon)にコンジュゲートした。組換えポリペプチドは、ゆっくりと転動する粒子にコンジュゲートした。5μM〜9.75nMの各組換えポリペプチドの2倍系列希釈を、室温にて、150nMのvWF A1-AlexaFluor(商標)488種と共に30分を超えてインキュベートし、次いで、蛍光異方性を測定した。結果を図2に示す。変異を含まなかった組換えポリペプチドは、約1.25μMのKdを示した。G233T、D235V、又はK237V変異の1種を含んだ組換えポリペプチドは、各々、500nM未満のKdを示した(すなわち、それぞれ、単一の変異体について、約67nM、約250nM、及び約300nM)。G233T、D235V、又はK237V変異体の相対的結合親和性は、ELISAによって確認した(それぞれ、図4D、図4B及び図4C、並びに以下の実施例3参照)。
組換えポリペプチドは、ELISAによってvWF結合における質的欠陥を検出することができる
酵素免疫吸着検定法(ELISA)を用いて、G233T(配列番号21)、D235V(配列番号30)、及びK237V(配列番号31)変異を含む組換えポリペプチドが、vWF結合親和性における質的差を検出することができることを決定した。図4Aは、ELISAアッセイの略画を示す。簡単に述べれば、組換えポリペプチドのGPIbαの修飾された細胞外ドメインに特異的に結合し、マルチ-ウェルプレート(すなわち、固体支持体)へ組換えポリペプチドを間接的に架橋するのに用いた抗CD42b抗体でマルチ-ウェルプレートのウェルをコーティングした。種々の対照試料、標準、及びその系列希釈を、1型、2B型、及び3型のフォンヴィレブランド病に関連する血漿試料、プールされたヒト血漿の対照試料、フォンヴィレブランド病を有しないことが知られているヒト血漿の対照試料、希釈なし〜16倍希釈のプールされたヒト血漿の参照標準の2倍系列希釈、及び陰性対照としてのヤギ血清を含む、マルチ-ウェルプレートの異なるウェルに添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたポリクローナルウサギ抗ヒトvWF抗体と接触させた。450nmにおける吸収分光法によってホースラディッシュペルオキシダーゼ基質の生成物への変換をモニターすることによって、結合したvWFを定量した。
Claims (34)
- 血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
組換えポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如し、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、G233T、D235V、及びK237Vから選択される少なくとも1種の変異を含む、組換えポリペプチド。 - 前記少なくとも1種の変異を含まないがその他の点では前記組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して高い結合親和性を有する、請求項1に記載の組換えポリペプチド。
- 組換えポリペプチド及びヒトフォンヴィレブランド因子のKdが、1μM、750nM、500nM、250nM、又は100nM未満である、請求項1又は2に記載の組換えポリペプチド。
- 修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、
変異C65S及びG233T、
変異C65S及びD235V、
変異C65S及びK237V、又は
変異C65S、G233T、及びM239T
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。 - 修飾された細胞外ドメインが、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列の少なくとも約250個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- 修飾された細胞外ドメインが、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の組換えポリペプチド。
- C末端システイン、負に荷電したC末端ドメイン、及びストレプトアビジン結合タンパク質の1種又は複数を含む架橋ドメインを更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- 架橋ドメインのアミノ酸配列が、配列番号11;配列番号12;配列番号16;配列番号17;又は配列番号18からなる群から選択される、請求項7に記載の組換えポリペプチド。
- ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインから選択される親和性タグを更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- 親和性タグが、6個〜8個の間のヒスチジン残基を含むポリヒスチジンタグである、請求項9に記載の組換えポリペプチド。
- 親和性タグのアミノ酸配列が、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番44;配列番号45;又は配列番号46からなる群から選択される、請求項9又は10に記載の組換えポリペプチド。
- オリゴマー化ドメインを更に含み、前記オリゴマー化ドメインが、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はペンタマーを形成することができる、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- オリゴマー化ドメインが、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからなる群から選択される、請求項12に記載の組換えポリペプチド。
- オリゴマー化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46からなる群から選択される、請求項12又は13に記載の組換えポリペプチド。
- 組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する、請求項1から14のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- 組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41からなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- 血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、変異C65A、G233V及びM239Vを含む、組換えポリペプチド。 - 修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列が、配列番号42に記載のアミノ酸配列を含むか、又は組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号26;配列番号27;若しくは配列番号28からなる群から選択される、請求項17に記載の組換えポリペプチド。
- 血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、
A238V変異、又は
Δ(229〜240)変異
を含み、
前記A238V変異又はΔ(229〜240)変異を含まないがその他の点では前記組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して低い結合親和性を有する組換えポリペプチド。 - 修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列が、配列番号6若しくは配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むか、又は組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号36若しくは配列番号38である、請求項19に記載の組換えポリペプチド。
- リーダーペプチドを更に含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
- リーダーペプチドのアミノ酸配列が、配列番号20である、請求項21に記載の組換えポリペプチド。
- 少なくとも2個の請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドを含むオリゴマーポリペプチド。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチドを含む細胞。
- CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa、又はジャーカット細胞である、請求項24に記載の細胞。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター
を含む核酸。 - 請求項26に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチド、及び固体支持体を含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、固体支持体に共有結合的又は非共有結合的に結合している、組成物。
- 固体支持体が、粒子、ビーズ、膜、表面、ポリペプチドチップ、マイクロタイタープレート、又はクロマトグラフィーカラムの固相を含む、請求項28に記載の組成物。
- 固体支持体がラテックス粒子である、請求項29に記載の組成物。
- フォンヴィレブランド因子を更に含む、請求項28から30のいずれか一項に記載の組成物。
- 固体支持体が、複数の粒子又はビーズを含み、
フォンヴィレブランド因子が、複数の粒子又はビーズのうちの粒子又はビーズを架橋させる、請求項31に記載の組成物。 - ヒト血漿を更に含む、請求項31又は32に記載の組成物。
- ヒト血小板を更に含む、請求項33に記載の組成物。
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