BR112020013419A2 - composição compreendendo proteína receptora de gplb¿lfa recombinante - Google Patents

Abstract

Vários aspectos da invenção referem-se a polipeptídeos recombinantes que ligam especificamente Fator von Willebrand humano. Tais polipeptídeos recombinantes tipicamente incluem domínio extracelular modificado de Ibalfa de glicoproteína de plaqueta que tipicamente compreende pelo menos uma mutação selecionada de G233T, D235V, e K237V, e tais polipeptídeos recombinantes opcionalmente incluem um domínio de oligomerização.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO PROTEÍNA RECEPTORA DE GPIBALFA RECOMBINANTE",. Descrição Antecedentes

[0001] Doença von Willebrand (vWD) é um distúrbio de sangra- mento suave, que pode ser herdado, comum, conhecido possuir signi- ficantes desafios diagnósticos. Pacientes com vWD podem não sofrer de sangramento durante sua vida diária, mas durante períodos de de- safio hemostático (por exemplo, trabalho dentário, cirurgia, parto ou transfusão) podem ocorrer problemas. Antes de procedimentos de de- safio hemostático, médicos rotineiramente ordenam um painel de he- mostasia que frequentemente conduz a adicionais testes específicos para vuWD.

[0002] Fator von Willebrand (vWF) se liga a muitas diferentes mo- léculas extracelulares e de superfície de célula e desempenha um pa- pel importante em hemostasia e coagulação. vWF é particularmente importante na formação de um tampão de plaquetas, e se liga especi- ficamente a um número de complexos de proteína de superfície de cé- lula de plaqueta incluindo o complexo Iba-V-IX de glicoproteína, que reticula plaquetas e outras moléculas extracelulares (por exemplo, co- lágeno subendotelial). O complexo Iba-V-IX de glicoproteína é com- posto por quatro subunidades, GPlba, GPIbB, GPV e GPIX, e está presente na membrana de plaquetas. GPlba e GPIbB são ligadas por pontes dissulfeto, enquanto o GPV e GPIX associam-se não covalen- temente com o complexo. A subunidade GPla transporta o sítio de li- gação para vWF, a-trombina, leucócito integrina aMB2 e P-selectina.

[0003] Diagnóstico de vWD é complicado por seus vários tipos, o que tradicionalmente requer múltiplos testes para provimento de um claro entendimento dos mecanismos de doença subjacente. vWD Tipo

1 é causada por uma deficiência quantitativa de vWF. vWD Tipo 2 é causada por uma deficiência qualitativa de vWF. vWD Tipo 2 ainda é subdividida em Tipo 2A, causado por mutações que diminuem a pro- porção de multímeros vWF funcionais, que diminui adesão de plaque- ta; tipo 2B, causado por mutações para vuWF que aumentam ligação de plaqueta — vWF; tipo 2M, causado por mutações que diminuem ade- são de plaqueta dependente — vWF; e tipo 2N, causado por mutações que prejudicam ligação a fator VIIl. vWD Tipo 3 é causado por uma deficiência virtualmente completa de vWF e fator VIII diminuído, que é normalmente estabilizada por vuWF circulante. vWD adquirido é um dis- túrbio de sangramento adquirido relativamente raro que usualmente ocorre em pacientes idosos, em associação com uma outra patologia subjacente. Finalmente, vWD tipo — plaqueta resulta de aperfeiçoada ligação de vWF a glicoproteína lba (GPlba), causada por mutação do gene codificando GPlba. Diferentes ensaios foram desenvolvidos para quantificar atividade de vWF, tal como o ensaio de antígeno vWF (VWF:Ag), que mede a concentração total de VvWF em plasma, ou o en- saio de cofator ristocetina (v«WF:RCo) que mede ligação de vWF a GPlba de plaquetas durante aglutinação induzida pelo antibiótico ristocetina. En- tretanto, ensaio vWWF:Ag somente provê informação sobre nível quantitati- vo de vWF presente em um plasma de paciente sem relação à qualidade do VWF presente. Assim, o VWF:Ag por si próprio não permite detecção de muitos defeitos qu8alitativos. Por sua vez, o ensaio vWF:RCo pode sofrer de imprecisão devido a interferência a partir de bilirrubina, he- moglobina, fator reumatóide de anticorpos anticamundongo humano (HAMA), e triglicerídeos. Ainda adição para a imprecisão do ensaio é a variância genética e polimorfismos no sítio de ligação de Ristocetina. A precisão do vWEF:RCo é especialmente baixa com diminuídas concen- trações de vWVWF:Ag.

[0004] Os ditos ensaios se baseiam na ligação de vWF ao domínio extracelular de glicoproteína Iba. Na ausência do complexo Iba-V-IX glicoproteína e tensão de cisalhamento, entretanto, vWF se liga a lba glicoproteína com afinidade de 4,5 uM relativamente fraca. Mutações ocorrendo naturalmente para glicoproteína Iba identificadas em paci- entes com vWD tipo plaqueta incluem W230L, G233V, G233S, D235Y, M239V, e M239], cada uma das quais aumenta a afinidade de ligação entre vuWWF e glicoproteína Iba [1] a [9].

[0005] Devido à complexidade de vWD, nenhum teste simples de laboratório é capaz de prover um diagnóstico completo. Diagnóstico de vVWD é correntemente sub-reportado de modo que a Organização Mundial de Saúde reporta sua predominância em 1,14 em 100.000 enquanto estudos diagnósticos reportam a predominância em -1% da população geral. Uma variedade de testes é disponível para diagnósti- co, mas opinião de expert é frequentemente intensamente pesada. Testes acurados e critérios de diagnósticos claramente definidos po- dem aperfeiçoar resultados médicos para muitos pacientes cuja doen- ça permanece não diagnosticada.

[0006] Os inventores da presente invenção identificaram novas mutações na Gp 1ba B-grampo de cabelo que aperfeiçoam ligação a domínio A1 de vWF. Os inventores também desenvolveram novos po- lipeptídeos recombinantes compreendendo as ditas mutações para serem usados no diagnóstico de vWD. Sumário

[0007] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que se liga especificamente a Fator von Willebrand humano. Um polipeptídeo recombinante tipicamente inclui um domínio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta, que tipi- camente compreende pelo menos uma mutação selecionada de G233T, D235V, e K237V, em relação a SEQ ID Nº: 19. Um polipeptí- deo recombinante tipicamente carece de um domínio transmembrana.

[0008] Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante tem uma maior afinidade de ligação para o Fator de von Willebrand de uma amostra de sangue humano ou amostra de plasma de sangue humano que um polipeptídeo controle que não compreende a pelo menos uma mutação mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombi- nante.

[0009] Em algumas modalidades, a Kd do polipeptídeo recombi- nante e Fator von Willebrand humano é de menos que 1 uM, 750 nM, 500 nM, 250 nM, ou 100 nM. Kd pode ser determinada, por exemplo, através de anisotropia de fluorescência ou ressonância plásmon de superfície, embora o método para determinar Kd não seja particular- mente limitante. Análise de anisotropia de fluorescência pode ser reali- zada, por exemplo, sobre Fator von Willebrand marcado fluorescente- mente e polipeptídeo recombinante ligado a partículas de lento revol- vimento. Ressonância plásmon de superfície pode ser realizada, por exemplo, sobre Fator von Willebrand ligado a superfície e polipeptídeo recombinante solúvel.

[0010] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do compreende mutações C65S e G233T; mutações C65S e D235V; mutações C65S e K237V; ou mutações C65S, G233T, e M239T, em relação a SEQ ID Nº: 19.

[0011] Em algumas modalidades, um domínio extracelular modifi- cado tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com pelo menos cerca de 250 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; ou SEQ ID Nº: 9. Por exemplo, um domínio extracelular modificado opcionalmente pode compreender a sequência de aminoácidos mos- trada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; ou SEQ ID Nº: 9.

[0012] Em algumas modalidades, um domínio extracelular modifi- cado tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com pelo menos cerca de 250 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4 ou SEQ ID Nº: 5. Por exemplo, um domínio extracelular modificado opcionalmente pode compreender a sequência de aminoácidos mos- trada em SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; ou SEQ ID Nº: 5.

[0013] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de reticulação. Um domínio de reticu- lação opcionalmente compreende uma ou mais de uma cisteína termi- nal-C, um domínio terminal — C carregado negativamente, e proteína ligante estreptavidina. Em algumas modalidades, a sequência de ami- noácidos do domínio de reticulação é selecionada do grupo consistin- do em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº:16; SEQ ID Nº: 17; ou SEQ |D Nº: 18.

[0014] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende uma etiqueta de afinidade. Um etiqueta de afinida- de opcionalmente pode ser selecionada de etiqueta poli histidina, eti- queta Snap, etiqueta Clip, etiqueta Halo, etiqueta Snoop, etiqueta Spy, proteína ligante quitina, proteína ligante maltose, etiqueta Strep, gluta- tiona-S-transferase, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi, etiqueta calmodulina, poliglutamato, eti- queta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta isopep, proteína carreadora de carboxila bio- tina, etiqueta de proteína fluorescente verde, etiqueta Nus, etiqueta tiorredoxina, e o domínio Fc de um anticorpo, embora a escolha da etiqueta de afinidade não seja particularmente limitante. Em algumas modalidades a etiqueta de afinidade é uma etiqueta poli histidina com- preendendo entre 6 e 8 resíduos histidina. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da etiqueta de afinidade é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 15; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 43; SEQ ID Nº: 44; SEQ ID Nº: 45; ou SEQ ID NO; 46.

[0015] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de oligomerização. Um domínio de oli- gomerização pode ser capaz de formar um dímero, trímero, tetrâmero, ou pentâmero tal como um homodímero, homotrímero, homotetrâmero ou homopentâmero. O domínio de oligomerização pode ser derivado de p53, GCNA, clatrina, pent-etiqueta, ou o domínio Fc de um anticor- po. Em algumas modalidades, o domínio de oligomerização é selecio- nado do grupo consistindo em p53, GCNA, clatrina, pent-etiqueta, ou o domínio Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio de oligomerização é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 13; SEQ ID Nº: 14; ou SEQ ID Nº: 46.

[0016] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante tem pelo menos cerca de 95% de identida- de de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41. Em algumas modalidades a sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41.

[0017] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que se liga especificamente a Fator von Willebrand humano, compreendendo um domínio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta, onde o domínio extracelular modificado compreende mutações C65A, G233V e M239V, em relação a SEQ ID

Nº: 19. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio extracelular modificado compreende a sequência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID Nº: 42. Em algumas modalidades a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 27; ou SEQ ID Nº:

28.

[0018] Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante tem uma afinidade ligante maior para o Fator von Willebrand de uma amos- tra de sangue humano ou amostra de plasma de sangue humano do que um polipeptídeo controle que não compreende as mutações C65A, G233V e M239V, em relação a SEQ ID Nº: 19, mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombinante.

[0019] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de reticulação. Um domínio de reticu- lação opcionalmente compreende um ou mais de uma cisteína termi- nal-C, um domínio terminal-C carregado negativamente, e proteína de ligação de estreptavidina. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio de reticulação é selecionada do grupo consis- tindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº:17; ou SEQ |D Nº: 18.

[0020] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende uma etiqueta de afinidade. Uma etiqueta de afini- dade opcionalmente pode ser selecionada de etiqueta poli histidina, etiqueta Clip, etiqueta Halo, etiqueta Snoop, etiqueta Spy, proteína de ligação de quitina, proteína de ligação maltose, etiqueta Strep, glutati- ona-S-transferase, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi, etiqueta calmodulina, poliglutamato, eti- queta S, etiqueta SBP, softtag 1, softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta isopep, proteína carreadora de carboxil bioti- na, etiqueta de proteína fluorescente verde, etiqueta Nus, etiqueta tior-

redoxina e o domínio Fc de um anticorpo, embora a escolha da etique- ta de afinidade não seja particularmente limitante. Em algumas moda- lidades a etiqueta de afinidade é uma etiqueta poli histidina compreen- dendo entre 6 e 8 resíduos histidina. Em algumas modalidades, a se- quência de aminoácidos da etiqueta de afinidade é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 15; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 43; SEQ ID Nº: 44; SEQ ID Nº: 45; ou SEQ ID Nº: 46.

[0021] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de oligomerização. Um domínio de oli- gomerização pode ser capaz de formar um dímero, trímero, tetrâmero ou pentâmero tal como um homodímero, homotrímero, homotetrâmero ou homopentâmero. O domínio de oligomerização pode ser derivado de p53, GCNA, clatrina, etiqueta pent, ou o domínio Fc de um anticor- po. Em algumas modalidades, o domínio de oligomerização é selecio- nado do grupo consistindo em p53, GCNA, clatrina, etiqueta pent, ou o domínio Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio de oligomerização é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 13; SEQ ID Nº: 14; ou SEQ ID Nº: 46.

[0022] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que liga especificamente Fator von Willebrand hu- mano, compreendendo um domínio extracelular modificado de Ibade glicoproteína de plaqueta, onde o domínio extracelular modificado compreende a mutação A238V, em relação a SEQ ID Nº: 19. Tais po- lipeptídeos recombinantes têm tipicamente uma menor afinidade de ligação para Fator von Willebrand de uma amostra de sangue humano ou uma amostra de plasma de sangue humano do que um polipeptí- deo controle que não compreende a mutação A238V, mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombinante. Em algumas moda-

lidades, a sequência de aminoácidos do domínio extracelular modifi- cado compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 6. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do poli- peptídeo recombinante é SEQ ID Nº: 36.

[0023] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que liga especificamente Fator Willebrand huma- no, compreendendo um domínio extracelular modificado de Iba de gli- coproteína de plaqueta, onde o domínio extracelular modificado com- preende a mutação A(229-240), em relação a SEQ ID Nº: 19. Tais po- lipeptídeos recombinantes têm tipicamente uma afinidade de ligação para Fator von Willebrand de uma amostra de sangue humano ou amostra de plasma de sangue humano menor que um polipeptídeo controle que não compreende a mutação A(229-240) mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombinante.

[0024] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio extracelular modificado compreende a sequência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID Nº: 9. Em algumas modalidades, a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante é SEQ ID Nº:

38.

[0025] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que liga especificamente Fator von Willebrand hu- mano, compreendendo um domínio extracelular modificdo de lba de glicoproteína de plaqueta, onde o domínio extracelular modificado compreende a mutação A238V ou a mutação A(229-240), em relação a SEQ ID Nº: 19. Tais polipeptídeos recombinantes tipicamente têm uma afinidade de ligação para Fator von Willebrand de uma amostra de sangue humano ou de plasma de sangue humano menor que um polipeptídeo controle que não compreende a mutação A238V ou a mu- tação A(229-240) mas é de outro modo idêntico ao polipeptídeo re- combinante.

[0026] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio extracelular modificado compreende a sequência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID Nº: 6 ou SEQ ID Nº: 9. Em algumas moda- lidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante é SEQ IN NO: 36 ou SEQ ID Nº: 38.

[0027] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de reticulação. Um domínio de reticu- lação opcionalmente compreende uma ou mais cisteína terminal-C, um domínio terminal-C carregado negativamente, e proteína de ligação de estreptavidina. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio de reticulação é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; ou SEQ ID Nº: 18.

[0028] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende uma etiqueta de afinidade. Uma etiqueta de afini- dade opcionalmente pode ser selecionada de etiqueta poli histidina, etiqueta Snap, etiqueta Clip, etiqueta Halo, etiqueta Snoop, etiqueta Spy, proteína de ligação de quitina, proteína de ligação de maltose, etiqueta Strep, glutationa-S transferase, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi,m etiqueta calmo- dulina, poliglutamato, etiqueta S, etiqueta SBP, etiqueta Sof 1, etiqueta Sof 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta isopep, proteína carreadora de carboxila de biotina, etiqueta de proteína fluo- rescente verde, etiqueta Nus, etiqueta tiorredoxina, e o domínio Fc de um anticorpo, embora a escolha da etiqueta de afinidade não seja par- ticularmente limitante. Em algumas modalidades a etiqueta de afinida- de é uma etiqueta poli histidina compreendendo entre 6 e 8 resíduos histidina. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da etiqueta de afinidade é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 15; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17;

SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 43; SEQ ID Nº: 44; SEQ ID Nº: 45; ou SEQ ID Nº: 46.

[0029] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante ainda compreende um domínio de oligomerização. Um domínio de oli- gomerização pode ser capaz de formar um dímero, trímero, tetrâmero ou pentâmero tal como um homodímero, homotrímero, homotetrâmero ou homopentâmero. O domínio de oligomerização pode ser derivado de p53, GCNA, clatrina, etiqueta pent, ou o domínio Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de oligomerização é selecionado do grupo consistindo em p53, GCNA, clatrina, etiqueta pent, ou o domí- nio Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio de oligomerização é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 13; SEQ ID Nº: 14; ou SEQ ID Nº: 46.

[0030] Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante ainda compreende um peptídeo líder. Em algumas modalidades, a se- quência de aminoácidos do peptídeo líder é SEQ ID Nº: 20.

[0031] Em algumas modalidades a sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 23; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 27; SEQ ID Nº: 28; SEQ ID Nº: 29; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 32; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 34; SEQ ID Nº: 35; SEQ ID Nº: 36; SEQ ID Nº: 37; SEQ ID Nº: 38; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41.

[0032] Vários aspectos da invenção referem-se a um polipeptídeo oligomérico compreendendo pelo menos dois dos polipeptídeos re- combinantes aqui descritos.

[0033] Vários aspectos da invenção referem-se a uma célula com- preendendo um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico aqui descrito. A célula opcionalmente pode ser selecionada de uma célula CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa ou Jurkat.

[0034] Vários aspectos da invenção referem-se a um ácido nuclei- co compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo recombinante aqui descrito. O ácido nucleico tipicamente também compreende um promotor que está operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo recombinante (por exemplo, de modo que o promotor possa dirigir transcrição da se- quência de nucleotídeos em uma apropriada célula de expressão).

[0035] Vários aspectos da invenção referem-se a uma célula com- preendendo um ácido nucleico aqui descrito (por exemplo, supra). À célula pode ser uma célula de expressão (por exemplo, uma célula CHO, HEK, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa ou Jurkat) ou uma célula de clonagem (por exemplo, E. coli).

[0036] Vários aspectos da invenção referem-se a uma composição compreendendo um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligo- mérico aqui descrito e um suporte sólido, onde o polipeptídeo recom- binante ou polipeptídeo oligomérico é (a) covalentemente ou não cova- lentemente ligado ao suporte sólido e/ou (b) ligado diretamente ou indi- retamente ao suporte sólido.

[0037] O suporte sólido opcionalmente pode ser ou compreender uma partícula, uma pérola, uma membrana, uma superfície, um chip de polipeptídeo, uma placa de microtitulação, ou a fase sólida de uma coluna de cromatografia. Por exemplo, em algumas modalidades, o suporte sólido é uma partícula de látex.

[0038] Em algumas modalidades, uma composição ainda compre- ende Fator von Willebrand (tal como Fator von Willebrand humano).

[0039] Em algumas modalidades, uma composição compreende um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de partículas ou pérolas, e Fator von Willebrand reticula as partículas ou pérolas da pluralidade de partículas ou pérolas.

[0040] Em algumas modalidades, uma composição ainda compre- ende plasma de sangue (tal como plasma de sangue humano).

[0041] Em algumas modalidades, uma composição ainda compre- ende plaquetas (tal como plaquetas humanas). Breve Descrição dos Desenhos

[0042] A Figura 1 contém fotografias de géis de eletroforese de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) que confirmam a expressão e pureza de vários polipeptídeos recombinantes. As fai- xas dos géis são numeradas como se segue: (1) padrão de peso mo- lecular; (2) polipeptídeo recombinante compreendendo as mutações C65S e G233T, domínio de dimerização Fc de IgG1, e etiqueta de afi- nidade 8-His (ponta de flecha; a banda inferior corresponde ao domí- nio constante I9gG1 murino) (SEQ ID Nº: 21); (3) polipeptídeo recombi- nante compreendendo as mutações C65S e G233T, domínio de tetra- merização p53, e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 22); (4) poli- peptídeo recombinante compreendendo as mutações C65S, G233V, e M239V, domínio de tetramerização p53, e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 23); (5) polipeptídeo recombinante compreendendo as mutações C65S e G233T, etiqueta de afinidade 6-His, e cisteína ter- minal-C (SEQ ID Nº: 24); (6) polipeptídeo recombinante compreenden- do as mutações C65S e G233T, proteína de ligação estreptavidina, e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 25); (7) polipeptídeo recombi- nante compreendendo as mutações C65A, G233V, e M239V, domínio de tetramerização p53, e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 26); (8) padrão de peso molecular; (9) padrão de peso molecular; (10) poli- peptídeo recombinante compreendendo as mutações C65A, G233V, e M239V e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 27); (11) polipeptídeo recombinante compreendendo as mutações C65A, G233V, e M239V, domínio terminal-C carregado negativamente, e etiqueta de afinidade

6-His (SEQ ID Nº: 28); (12) polipeptídeo recombinante compreendendo as mutações G233V e M239V, etiqueta FLAG e etiqueta de afinidade 6-His (SEQ ID Nº: 29).

[0043] A Figura 2 é um gráfico de barra mostrando constantes de dissociação (Kd; eixo-y) como avaliadas por anisotropia de fluorescência entre domínio A1A1 de Fator von Willebrand recombinante rotulado fluo- rescentemente e polipeptídeos diméricos ligados a partícula compreen- dendo duas subunidades de polipeptídeo recombinante cada compreen- dendo um domínio de dimerização Fc e um domínio extracelular modi- ficado de lba de glicoproteína de plaqueta, que inclui mutações como indicado sobre o eixo-x e mutação C65S, ou um controle polipeptídeo monomérico ligado a partícula (G233V, M239V — noFc (SEQ |D Nº: 35)). Os polipeptídeos diméricos avaliados correspondem a SEQ ID Nº: 38 (A(229-240)); SEQ ID Nº: 37 (WT); SEQ ID Nº: 36 (A238V); SEQ ID Nº: 34 (G233V, M239V); SEQ ID Nº: 32 (G233V); SEQ ID Nº: 33 (G233T, M239T); SEQ ID Nº: 21 (G233T); SEQ ID Nº: 30 ((D235V); SEQ ID Nº: 31 (K237V). Polipeptídeo dimérico que não inclui uma mu- tação mostrou uma Kd de cerca de 1,25 uM. Polipeptídeos recombi- nantes que incluíram uma das mutações G233T, D235V, ou K237V, cada um, mostraram Kds de menos que 500 nM (por exemplo, -67 NM, —250 nM, e -300 nM, respectivamente, para mutantes simples).

[0044] A Figura 3 é um gráfico de linha de uma análise de resso- nância plásmon de superfície Biacore de fator von Willebrand ligado a superfície e polipeptídeo recombinante solúvel compreendendo um domínio extracelular modificado de lba de glicoproteína de plaqueta que inclui a mutação G233T. Esta análise sugere que a constante de dissociação (Kd) entre o Fator von Willebrand e polipeptídeo recombi- nante G233T foi 58 nM, o que confirma as medições Kd de anisotropia de fluorescência de Figura 2, que mediu uma Kd de 67 nM para mu- tante G233T.

[0045] A Figura 4A é um esboço do ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) usado para gerar os dados na Figura 4B-4D. Um suporte sólido foi revestido com anticorpo Iba anti-glicoproteína (anti- CD42b), que foi usado para imobilizar polipeptídeo recombinante com- preendendo um domínio extracelular modificado de lba de glicoproteí- na de plaqueta (construções CD42b; GPlba; GP1b). O suporte sólido foi então contatado com plasma de sangue humano, calibradores de Fator von Willebrand, ou controles de Fator von Willebrand. O suporte sólido foi então contatado com um anticorpo Fator von Willebrand anti- humano de coelho policlonal ao qual foi conjugada peroxidase de raiz forte (HRP). A composição foi então contatada com um substrato ca- paz de ser convertido em um produto por HRP com uma forte absor- bância em 450 nm, e absorbância foi medida.

[0046] A Figura 4B é um gráfico de barras mostrando resultados para o ELISA de Figura 4A usando polipeptídeo recombinante com- preendendo um domínio extracelular modificado de l|ba de glicoproteí- na de plaqueta incluindo as mutações C65S e D235V (SEQ ID Nº: 30). As quatro primeiras amostras sobre o eixo-x correspondem a amostras com conhecida Doença von Willebrand tipo 1, tipo 2B, tipo 3, e tipo 1, respectivamente (isto é, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1)). A quinta e sexta amostras são amostras controles com- preendendo plasma humano reunido (isto é, DG-C1; DG-C2). A sétima amostra é um controle de soro de sangue de cabra (que carece de Fa- tor von Willebrand). As amostras oito até dezessete são amostras de plasma de sangue humano sem Doença de von Willebrand ("normal"). As amostras dezoito a vinte e dois correspondem a uma diluição serial de um padrão de referência de plasma humano reunido a partir de ne- nhuma diluição (1:1) a diluição de 16 vezes (1:16). O eixo-y corres- ponde a absorbância (Abs) em 450 nm, e absorbância aumentada cor- responde a aumentada ligação de Fator von Willebrand.

[0047] A Figura 4C é um gráfico de barras mostrando o resultado para o ELISA de Figura 4A usando polipeptídeo recombinante com- preendendo um domínio extracelular modificado de lba de glicoproteí- na de plaqueta incluindo as mutações C65S e K237V (SEQ ID Nº: 31). As quatro primeiras amostras sobre o eixo-x correspondem a amostras com Doença von Willebrand tipo 1, tipo 2B, tipo 3 e tipo 1 conhecida, respectivamente (isto é, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1)). A quinta e sexta amostras são amostras controles com- preendendo plasma humano reunido (isto é, DG-C1; DG-C2). A sétima amostra é um controle de soro de sangue de cabra (que carece de Fa- tor von Willebrand). A oitava até décima sétima amostras são amos- tras de plasma de sangue humano sem Doença von Willebrand ("nor- mal"). A décima oitava a vigésima segunda amostras correspondem a uma diluição serial de um padrão referência de plasma humano reuni- do a partir de sem diluição (1:1) a diluição de 16-vezes (1:16). O eixo-y corresponde a absorbância (Abs) em 450 nm, e absorbância aumenta- da corresponde a aumentada ligação de Fator von Willebrand.

[0048] A Figura 4D é um gráfico de barras mostrando resultados para o ELISA de Figura 4A usando polipeptídeo recombinante com- preendendo um domínio extracelular modificado de l|ba de glicoproteí- na de plaqueta incluindo mutações C65S e G233T (SEQ ID Nº: 21). As quatro primeiras amostras sobre o eixo-x correspondem a amostras com Doença von Willebrand tipo 1, tipo 2B, tipo 3, e tipo 1 conhecida, respectivamente (isto é, GK1422 (1); GH1423 (2B); GK1419 (3); GK1425 (1)). A quinta e sexta amostras são amostras controles com- preendendo plasma humano reunido (isto é, DG-C1; DG-C2). A sétima amostra é um controle de soro de sangue de cabra (que carece de Fa- tor von Willebrand). A oitava até décima sétima amostras são amos- tras de plasma de sangue humano sem Doença von Willebrand ("nor- mal"). A décima oitava a vigésima segunda amostras correspondem a uma diluição serial de um padrão de referência de plasma humano reunido a partir de nenhuma diluição (1:1) a diluição de 16-vezes (1:16). O eixo-y corresponde à absorbância (Abs) em 450 nm, e dimi- nuída absorbância corresponde a aumentada ligação de Fator von Wil- lebrand. Descrição Detalhada

[0049] A seguinte descrição é meramente pretendida para ilustrar várias modalidades da presente exposição. Como tal, as específicas modificações discutidas não são pretendidas serem limitantes. Será aparente para aqueles versados na técnica que vários equivalentes, mudanças, e modificações podem ser feitas sem fugir do espírito ou escopo das matérias objetos aqui apresentadas, e é entendido que tais modalidades equivalentes são para serem aqui incluídas.

[0050] Como usadas neste relatório descritivo e as reivindicações apostas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências plurais a menos que o conteúdo claramente dite de outro modo.

[0051] Por todo este relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra "compreende", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", será entendida para implicar a inclusão de um elemento ou inteiro estabelecido ou grupo de elemen- tos ou inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou in- teiro ou grupo de elementos ou inteiros.

[0052] Cada modalidade neste relatório descritivo é para ser apli- cada mutatis mutandis para toda outra modalidade a menos que ex- pressamente estabelecido de outro modo.

[0053] Os seguintes termos, a menos que de outro modo indicado, devem ser entendidos para terem os seguintes significados:

[0054] Como aqui usado, o termo "recombinante" refere-se a uma biomolécula, por exemplo, um gene ou proteína, que (1) foi removido de seu ambiente de ocorrência natural, (2) não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o gene é encontra-

do em natureza, (3) está operativamente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado em natureza, ou (4) não ocorre em natureza. O termo "recombinante" pode ser usado em referência a isolados de DNA clonado, análogos de polinucleotídeo sintetizado quimicamente, ou análogos de polinucleotídeo que são sintetizados biologicamente através de sistemas heterólogos, assim como proteínas e/ou MRNAs codificados por tais ácidos nucleicos.

[0055] Como aqui usado, o termo "ácido nucleico" refere-se a quaisquer materiais compreendidos por DNA ou RNA. Ácidos nucleicos podem ser obtidos sinteticamente ou através de células vivas.

[0056] Como aqui usado, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma cadeia polimérica de nucleotídeos. O termo inclui moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico ou sintético) e moléculas de RNA (por exemplo, mMRNA ou RNA sintético), assim como análogos de DNA ou RNA contendo análogos de nucleotídeos não naturais, li- gações internucleosídeos não nativas, ou ambos. O ácido nucleico po- de estar em qualquer conformação topológica. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser de fita simples, fita dupla, fita tripla, quadruplexada, parcialmente de fita dupla, ramificada, grampo de cabelo, ou em uma conformação de cadeado.

[0057] Como aqui usado, o termo "proteína" ou refere-se a molé- culas biológicas grandes, ou macromoléculas, consistindo em uma ou mais cadeias de resíduos de aminoácidos. Muitas proteínas são enzi- mas que catalisam reações bioquímicas e são vitais para metabolismo. Proteínas também têm funções estruturais ou mecânicas, tais como actina e miosina em músculo e as proteínas no citoesqueleto, que for- mam um sistema de tablado que mantém forma de célula. Outras pro- teínas são importantes em sinalização de célula, respostas imunes, adesão de célula, e o ciclo de célula. Entretanto, proteínas podem ser completamente artificiais ou recombinantes, isto é, não existindo natu-

ralmente em um sistema biológico.

[0058] Como aqui usado, o termo "polipeptídeo" refere-se a prote- Ínas, e seus fragmentos, mutantes, derivados e análogos ocorrendo naturalmente e não naturalmente. Um polipeptídeo pode ser monomé- rico ou polimérico. Um polipeptídeo pode compreender um número de diferentes domínios cada um dos quais tem uma ou mais atividades distintas.

[0059] Os termos "sequência tipo selvagem" ou "gene tipo selva- gem" são aqui usados intercambiavelmente, para referirem-se a uma sequência que é nativa ou ocorrendo naturalmente em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência tipo selvagem re- fere-se a uma sequência de interesse que é o ponto de partida de um projeto de engenharia de proteína. A sequência tipo selvagem pode codificar uma proteína homóloga ou heteróloga. Uma proteína homó- loga é uma que a célula hospedeira pode produzir sem intervenção. Uma proteína heteróloga é uma que a célula hospedeira não pode produzir sem intervenção.

[0060] Os termos "sequência modificada" e "genes modificados" são aqui usados intercambiavelmente para referirem-se a uma se- quência que inclui pelo menos uma substituição, supressão, inserção ou interrupção de sequência de ácido nucleico ocorrendo naturalmen- te.

[0061] Como usados, os termos "sequência mutante" e "gene mu- tante" são usados intercambiavelmente e referem-se a uma sequência que tem uma alteração em pelo menos um códon ocorrendo em uma sequência tipo selvagem de célula hospedeira. A dita alteração em pe- lo menos um códon também é chamada "mutação". O produto de ex- pressão da sequência mutante é uma proteína com uma sequência de aminoácido alterada em relação ao tipo selvagem. O produto de ex- pressão pode ter uma capacidade funcional alterada (por exemplo,

aperfeiçoada afinidade de ligação).

[0062] O termo "amostra", como aqui usado, refere-se a qualquer material biológico obtido de um sujeito ou paciente. Em um aspecto, uma amostra pode compreender sangue, fluido peritoneal, CSF, saliva ou urina. Em outros aspectos, uma amostra pode compreender san- gue integral, plasma de sangue, soro de sangue, células B enriqueci- das de amostras de sangue, e células cultivadas (por exemplo, células B de um sujeito). Uma amostra também pode incluir uma biopsia ou amostra de tecido incluindo tecido neural. Ainda em outros aspectos, uma amostra pode compreender células integrais e/ou um lisado das células.

[0063] Vários aspectos das modalidades aqui mostradas referem- se a novos polipeptídeos recombinantes compreendendo mutações para um domínio extracelular lba de glicoproteína, as quais não são conhecidas ocorrerem em natureza, que aumentam sua afinidade de ligação para vWF em relação a tipo selvagem na ausência de ambos, complexo Iba-V-IX de glicoproteína e tensão de cisalhamento. Vários aspectos das modalidades aqui mostradas referem-se a polipeptídeos recombinantes compreendendo um domínio extracelular Iba de glico- proteína e domínio de oligomerização que aumentam a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante para vWF em relação a polipep- tídeos carecendo de um domínio de oligomerização na ausência de ambos, o complexo Iba-V-IX de glicoproteína e tensão de cisalhamen- to.

[0064] Vários aspectos das modalidades referem-se à determina- ção de que os novos polipeptídeos recombinantes aqui mostrados são ambos, capazes de expressão robusta e adequada dobra e suscetí- veis a ensaios funcionais complexos. Em particular, muitos dos poli- peptídeos recombinantes aqui mostrados são capazes de distinguir pequenos defeitos em coagulação e atribuição destes defeitos a vuWF.

LL Polipeptídeos Recombinantes

[0065] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante que liga especificamente Fator von Willebrand hu- mano (vWF) compreendendo um domínio extracelular modificado de lba de glicoproteína de plaqueta (GPlba).

[0066] O termo "liga especificamente" refere-se a uma interação tendo uma constante de dissociação (Kd) de não mais que 10 uM, tal como não mais que cerca de 6 uM, 5 uM, 4 uM, 3 uM, 2 uM, 1 uM, 950 NM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 nM, 550 NM, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 NM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, ou 50 nM, ou menos que cerca de 10 uM, 6 uM, 5 uM 4 UM, 3 uM, 2 uM, 1 uM, 950 nM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, ou 50 nM, por exemplo, sob condições fisiológicas, tal como em plasma de sangue humano ou em tampão fosfato ou HEPES, e, por exemplo, entre o polipeptídeo recombinante (ou um seu polipeptídeo oligomérico) e vWF humano tipo selvagem. Se um polipeptídeo recombinante liga especificamente vWF humano com uma específica constante de dissociação pode ser determinado, por exemplo, através de anisotropia de fluorescência ou ressonância plásmon de superfície como aqui descrito, infra.

[0067] Um polipeptídeo recombinante tem tipicamente um com- primento de cerca de 250 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos tal como cerca de 250 a cerca de 550, cerca de 500 a cerca de 750, cerca de 600 a cerca de 800, cerca de 750 a cerca de 1000, cerca de 250 a cerca de 300, cerca de 290 a cerca de 350, cerca de 300 a cer- ca de 400, cerca de 350 a cerca de 450, cerca de 400 a cerca de 500, cerca de 450 a cerca de 550, cerca de 500 a cerca de 600 aminoáci- dos, cerca de 550 a cerca de 650, cerca de 600 a cerca de 700, cerca de 650 a cerca de 750, cerca de 700 a cerca de 800, cerca de 750 a cerca de 850, cerca de 800 a cerca de 900, cerca de 850 a cerca de 950, ou cerca de 900 a cerca de 1000 aminoácidos.

[0068] Um polipeptídeo recombinante tem tipicamente um peso molecular de cerca de 25 kilodáltons (kDa) a cerca de 100 kDa tal co- mo cerca de 25 a cerca de 55, cerca de 50 a cerca de 75, cerca de 60 a cerca de 80, cerca de 75 a cerca de 100, cerca de 25 a cerca de 30, cerca de 29 a cerca de 35, cerca de 30 a cerca de 40, cerca de 35 a cerca de 45, cerca de 40 a cerca de 50, cerca de 45 a cerca de 55, cerca de 50 a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 55 a cerca de 65, cerca de 60 a cerca de 70, cerca de 65 a cerca de 75, cerca de 70 a cerca de 80, cerca de 75 a cerca de 85, cerca de 80 a cerca de 90, cerca de 85 a cerca de 95, ou cerca de 90 a cerca de 100 kDa.

[0069] Um polipeptídeo recombinante do tipo aqui mostrado pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 23; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 27; SEQ ID Nº: 28; SEQ ID Nº: 29; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 32; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 34; SEQ ID Nº: 35; SEQ ID Nº: 36; SEQ ID Nº: 37; SEQ ID Nº: 38; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41. Um polipeptídeo recombinante do tipo aqui mostrado pode ter uma sequência de aminoácidos que tenha pelo me- nos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 23; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 27; SEQ ID Nº: 28; SEQ ID Nº: 29; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 32; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 34; SEQ ID Nº: 35; SEQ ID Nº: 36; SEQ ID Nº: 37; SEQ ID Nº: 38; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41, isto é, onde a completa sequência de ami- noácidos do polipeptídeo recombinante não é uma sequência de ami-

noácidos ocorrendo naturalmente. A. “Domínios Extracelulares Modificados

[0070] Domínios extracelulares modificados de GPlba são domí- nios de ligação de vWF de GPlba, correspondendo à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 19, ou uma sua subsequência, que contém uma ou mais mutações incluindo pelo menos uma mutação de "ganho-de-função" ou "perda-de-função". Mutações de ganho-de- função e perda-de-função aumentam ou diminuem, respectivamente, a afinidade de ligação do domínio extracelular modificado para vWF em relação a um domínio extracelular tipo selvagem que estende a mes- ma sequência de aminoácidos de GPlba como o domínio extracelular modificado. Mutações de ganho-de-função que não são conhecidas ocorrer em natureza incluem G233T, D235V e K237V (isto é, onde os aminoácidos são numerados como em SEQ ID Nº: 19). Mutações de perda-de-função que não são conhecidas ocorrer em natureza incluem A238V ou A(229-240) (isto é, como numeradas em SEQ ID Nº: 19).

[0071] Um domínio extracelular modificado de GPlba pode incluir uma ou mais mutações selecionadas de G233T, D235V, e K237V. Em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante ou um seu poli- peptídeo oligomérico tem uma maior afinidade de ligação para o vuWF de uma amostra de sangue humano ou uma amostra de plasma de sangue humano do que um polipeptídeo controle que (a) compreende a mesma subsequência de GPlba como o polipeptídeo recombinante e (b) carece de uma ou mais mutações (por exemplo, onde o polipeptí- deo recombinante e polipeptídeo controle são idênticos exceto pela presença de uma ou mais mutações no polipeptídeo recombinante e a falta de uma ou mais mutações no polipeptídeo controle). Em algumas modalidades, a Kd do polipeptídeo recombinante ou um seu polipeptí- deo oligomérico e vWF humano é de menos que 4 UM, 3 uM, 2 uM, 1 UM, 950 nM, 900 nM, 850 nM, 800 nM, 750 nM, 700 nM, 650 nM, 600 NM, 550 nM, 500 nM, 450 nM, 400 nM , 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200

NM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, ou 50 nM, por exemplo, sob condições fisiológicas, tal como em plasma de sangue humano ou em tampão HEPES ou fosfato. A Kd pode ser determina- da, por exemplo, tanto através de uma análise de anisotropia de fluo- rescência de vWF rotulado fluorescentemente e polipeptídeo recombi- nante ligado a partículas de lenta desarrumação ou através de análise de ressonância plásmon de superfície de vWF ligado a superfície e polipeptídeo recombinante solúvel, embora um número de diferentes métodos também seja útil para determinar a Kd entre um polipeptídeo recombinante ou seu polipeptídeo oligomérico e vWF.

[0072] Um domínio extracelular modificado de GPlba pode incluir a mutação A238V.

[0073] Um domínio extracelular modificado inclui suficiente estrutu- ra primária de GPlba humana para ligar especificamente vWF huma- no. Um domínio extracelular modificado pode ter, por exemplo, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência com pelo menos cerca de 250, 260, 270, 280, ou 290 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 19. Um domínio extracelular modificado pode ter pelo me- nos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência com pelo menos cerca de 250, 260, 270, 280, ou 290 ami- noácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 9; ou SEQ ID Nº: 42. Um domínio extracelular modificado pode ter 100% de identi- dade de sequência com pelo menos cerca de 250, 260, 270, 280, ou 290 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 9; ou SEQ ID Nº: 42. Um domínio extracelular modificado pode ter pelo me-

nos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 9; ou SEQ ID Nº: 42. Um domínio extracelular modificado pode ter a sequência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 6; SEQ ID Nº: 7; SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 9; ou SEQ ID Nº: 42.

[0074] Um domínio extracelular modificado tipicamente inclui es- trutura secundária e terciária similar ao domínio de ligação de uWF GPlba humano tipo selvagem, incluindo o padrão de ligação dissulfeto intramolecular de GPlba humana tipo selvagem. A estrutura secundá- ria e terciária de GPlIba humana tipo selvagem existe em um equilíbrio dinâmico entre conformações que têm baixa afinidade para VWF e conformações que têm alta afinidade para vWF. Em algumas modali- dades, o domínio extracelular modificado favorece conformações que têm alta afinidade para vWF como avaliado, por exemplo, pela medi- ção de uma constante de dissociação entre o polipeptídeo recombi- nante ou seu polipeptídeo oligomérico e vWF.

[0075] Em algumas modalidades, um domínio extracelular modifi- cado inclui glicosilação e/ou outras modificações pós-traducionais que são encontradas em proteínas GPlba humanas tipo selvagem. Em al- gumas modalidades, um domínio extracelular modificado corresponde a uma forma glico de GPlba humana tipo selvagem que existe em na- tureza.

[0076] Um polipeptídeo recombinante tipicamente carece de regi- ão extracelular intrinsecamente desordenada correspondendo a ami- noácidos 291-517 de GPlba, que segue o domínio de ligação de vWF mostrado em SEQ ID Nº: 19.

[0077] Um polipeptídeo recombinante preferivelmente carece de domínio transmembrana de GPlba, correspondendo a aminoácidos 518-540, que segue a região extracelular intrinsecamente desordena- da. Um polipeptídeo recombinante tipicamente tem falta de qualquer domínio transmembrana. Um polipeptídeo recombinante preferivel- mente tem falta de domínio citosólico de GPlba, que segue o domínio transmembrana em GPlba ocorrendo naturalmente.

[0078] Em certas modalidades preferidas, o domínio extracelular modificado compreende uma mutação para C65 tal como C65S ou C65A (isto é, como o aminoácido C65 é numerado em SEQ ID Nº: 19).

[0079] Um domínio extracelular modificado pode incluir, por exem- plo, mutações C65S e G233T, mutações C65S e D235V, mutações C65S e K237V, ou mutações C65S, G233T e M239T.

[0080] Um domínio extracelular modificado pode incluir, por exem- plo, mutações C65A, G233V e M239V. Em algumas modalidades, o domínio extracelular modificado compreende a sequência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID Nº: 42.

[0081] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do inclui uma mutação de um aminoácido de GPlba tipo selvagem pa- ra um aminoácido B-ramificado (por exemplo, valina ou treonina), onde o aminoácido de GPlba tipo selvagem não é um aminoácido B- ramificado. Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifi- cado inclui uma mutação de um aminoácido de GPlba tipo selvagem para um aminoácido compreendendo uma hidroxila (por exemplo, tre- onina), onde o aminoácido de GPlba tipo selvagem não compreende uma hidroxila. Em algumas modalidades, o domínio extracelular modi- ficado inclui uma mutação de um aminoácido de GPlba tipo selvagem para um aminoácido ramificado-B compreendendo uma hidroxila (por exemplo, treonina), onde o aminoácido de GPlba tipo selvagem não é um aminoácido ramificado-B compreendendo uma hidroxila.

[0082] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica-

do inclui uma mutação que não é conhecida ocorrer em natureza.

[0083] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do tem uma carga eletrostática em pH fisiológico que difere da carga ele- trostática de um domínio extracelular tipo selvagem que se espalha no mesmo estiramento de aminoácidos como o domínio extracelular modifi- cado (por exemplo, onde a carga eletrostática difere de tipo selvagem por pelo menos cerca de 0,5 tal como por cerca de 1,0).

[0084] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do inclui uma mutação de um aminoácido GPlba tipo selvagem para um aminoácido que tem menor entropia conformacional que o aminoá- cido tipo selvagem tal como uma mutação de glicina para treonina.

[0085] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do carece de uma ou mais mutações selecionadas de mutação para o aminoácido número 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, ou 244 de SEQ ID Nº: 19.

[0086] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do tem falta de uma ou mais mutações selecionadas de C65A, N226V, Y228V, W230L, K231V, Q0232V, G233V, G233S, D235V, D235Y, K237V, A238V, M239S, M239V, M239I, T240V, e A244V.

[0087] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica- do compreende a mutação A238V, e o polipeptídeo recombinante tem uma menor afinidade para o vWF de uma amostra de sangue humano ou uma amostra de plasma de sangue humano que um polipeptídeo controle que (a) compreende a mesma subsequência de GPlba como o polipeptídeo recombinante e (b) carece de mutação A238V (por exemplo, onde o polipeptídeo recombinante e polipeptídeo controle são idênticos exceto pela presença da mutação A238V no polipeptídeo recombinante a falta da mutação A238V no polipeptídeo controle). Em algumas modalidades, o domínio extracelular modificado compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 6.

[0088] Em algumas modalidades, o domínio extracelular modifica-

do compreende a supressão de aminoácidos 229 a 240 (mutação A(229-240)), em relação a SEQ ID Nº: 19, e o polipeptídeo recombi- nante tem uma menor afinidade de ligação para vWF de uma amostra de sangue humano ou uma amostra de plasma de sangue humano que um polipeptídeo controle que compreende ambos (a) a mesma subsequência de GPlba como o polipeptídeo recombinante e (b) falta de mutação A(229-240) (por exemplo, onde o polipeptídeo recombi- nante e o polipeptídeo controle são idênticos exceto para a presença da mutação A(229-240) no polipeptídeo recombinante e a falta da mu- tação A(229-240) no polipeptídeo controle). Em algumas modalidades, o domínio extracelular modificado compreende a sequência de amino- ácidos mostrada em SEQ ID Nº: 9.

B. "Domínios de Reticulação

[0089] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo recombinante compreendendo um domínio de reticulação. Um domínio de reticulação tipicamente permite que o polipeptídeo recom- binante seja covalentemente ou não covalentemente reticulado a uma molécula solúvel ou suporte sólido.

[0090] Os inventores verificaram e mostram que tradicionais qui- micas para reticulação randômica de aminas primárias (por exemplo, lisina) ou carboxilas (por exemplo, aspartato, glutamato, término-C) de um polipeptídeo recombinante para suportes sólidos ou outros compo- nentes de um ensaio tal como através de químicas de 1-etil-3-(3- dimetil amino propil) carbo diimida (EDAC) ou N-hidroxissuccinimida (NHS) resultam em defeitos funcionais, que reduzem acurácia e preci- são de ensaio. Reticulação randômica é frequentemente uma estraté- gia superior para desenvolvimento de ensaio porque reticulação ran- dômica provê uma população de moléculas reticuladas em múltiplas orientações diferentes, o que permite interações entre cada superfície das moléculas reticuladas e seus parceiros de ligação em um ensaio.

Reticulação direcional é frequentemente inferior a reticulação randômi- ca para desenvolvimento de ensaio porque reticulação direcional mas- cara uma superfície da molécula reticulada, particularmente quando a molécula é reticulada para um suporte sólido, e pode afetar a estrutura e dinâmicas de cada molécula em uma maneira uniforme, assim como suas interações com parceiros de ligação, pelo que introduzindo erro sistemático em um ensaio. Reticulação direcional também é geralmen- te laboriosa e cara em relação à reticulação randômica, por exemplo, porque reticulação direcional requer o desenho, clonagem, expressão, e análise de polipeptídeo recombinante e a validação de ensaios que utilizam o polipeptídeo recombinante direcionalmente reticulado sem garantia de que qualquer desenho evitará erro sistemático.

[0091] Vários aspectos das modalidades referem-se à verificação de que a reticulação de um polipeptídeo recombinante como aqui des- crito a um suporte sólido como mediada pelo término-C do polipeptí- deo recombinante permite ensaios com superior precisão e acurácia em relação à reticulação randômica.

[0092] Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante compreende um domínio de reticulação. O domínio de reticulação op- cionalmente pode compreender um domínio terminal-C carregado ne- gativamente. Um domínio terminal-C carregado negativamente tipica- mente inclui um estiramento de 3 a 20 aminoácidos (isto é, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos) que tem uma carga negativa líquida em pH neutro tal como uma carga lí- quida de menos que cerca de -1, -2, -3, -4, -5, ou -6. O termo "domínio terminal-C carregado negativamente" necessariamente não significa que a sequência de aminoácidos do domínio terminal-C carregado ne- gativamente inclui o aminoácido do término-C de um polipeptídeo re- combinante, embora um domínio terminal-C carregado negativamente possa incluir o aminoácido terminal-C. "terminal-C" ao invés refere-se ao posicionamento do domínio carregado negativamente em relação ao domínio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta em um polipeptídeo recombinante, isto é, um domínio terminal-C car- regado negativamente é terminal-C em relação ao domínio extracelular modificado.

[0093] O domínio terminal-C carregado negativamente tipicamente inclui aminoácidos tais como glutamato e aspartato (por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 glutamatos e aspartatos) e tem alta de aminoácidos tais como arginina, lisina e histidina (por exemplo, não mais que 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 arginina, lisina e histidina). O domínio ter- minal-C carregado negativamente opcionalmente também pode incluir aminoácidos hidrofílicos, pequenos que mostram um alto grau de en- tropia conformacional (por exemplo, glicina, alanina, serina) e/ou proli- na, que são úteis para desfavorecer estrutura secundária.

[0094] Em algumas modalidades, o domínio de reticulação pode compreender um domínio terminal-C carregado negativamente e uma etiqueta de afinidade. Em algumas modalidades a etiqueta de afinida- de é uma etiqueta poli histidina. Em polipeptídeos recombinantes que incluem ambos, uma etiqueta poli histidina e um domínio terminal-C carregado negativamente, o domínio terminal-C carregado negativa- mente está tipicamente posicionado entre o domínio extracelular modi- ficado e a etiqueta de poli histidina. Um exemplo de uma sequência de aminoácidos que inclui um domínio terminal-C carregado negativa- mente e uma etiqueta poli histidina é mostrado em SEQ ID Nº: 17.

[0095] Em polipeptídeos recombinantes que incluem ambos, uma etiqueta de afinidade e um domínio terminal-C carregado negativa- mente, o domínio terminal-C carregado negativamente está tipicamen- te posicionado entre o domínio extracelular modificado e a etiqueta de afinidade.

[0096] Um domínio de reticulação opcionalmente pode compreen-

der uma cisteína terminal-C. Cisteínas terminais-C são úteis para reti- culação de polipeptídeos recombinantes a um suporte sólido ou outro componente de um ensaio, por exemplo, usando química tiol - malei- mida ou uma interação tiol — ouro. Em algumas modalidades, o domí- nio de reticulação pode compreender uma cisteína terminal-C e uma etiqueta de afinidade. Em algumas modalidades a etiqueta de afinida- de é uma etiqueta poli histidina. Un exemplo de uma sequência de aminoácidos compreendendo uma etiqueta poli histidina e uma cisteí- na terminal-C é mostrado em SEQ ID Nº: 16.

[0097] O termo "cisteína terminal-C" não significa necessariamente que a cisteína terminal-C seja o aminoácido terminal-C de um polipep- tídeo recombinante, embora uma cisteína terminal-C possa ser o ami- noácido terminal-C. "Terminal-C" ao invés refere-se ao posicionamento da cisteína terminal-C em relação ao domínio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta em um polipeptídeo recombinante, isto é, uma cisteína terminal-C é terminal-C em relação ao domínio ex- tracelular modificado.

[0098] Um domínio de reticulação opcionalmente pode compreen- der uma proteína de ligação de estreptavidina ou um seu equivalente funcional. Proteína de ligação de estreptavidina é útil para reticular não covalentemente polipeptídeos recombinantes a estreptavidina. Em al- gumas modalidades, o domínio de reticulação pode compreender uma proteína de ligação de estreptavidina e uma etiqueta de afinidade. Em algumas modalidades a etiqueta de afinidade é uma etiqueta poli- histidina. Um exemplo de uma sequência de aminoácidos compreen- dendo proteína de ligação de estreptavidina e uma etiqueta poli- histidina é mostrado em SEQ ID Nº: 18.

[0099] Em algumas modalidades, o domínio de reticulação pode compreender o domínio Fc de um anticorpo. Um exemplo de uma se- quência de aminoácidos compreendendo o domínio Fc de um anticor-

po é mostrado em SEQ ID Nº: 11 ou SEQ ID Nº: 12.

[00100] Um domínio de reticulação de acordo com a presente in- venção pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; ou SEQ ID Nº: 18. C. Etiquetas de Afinidade

[00101] Um polipeptídeo recombinante opcionalmente pode incluir uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade são úteis para purifi- cação, e elas também podem ser úteis em ensaios que utilizam um polipeptídeo recombinante. Etiquetas de afinidade exemplares incluem etiqueta poli histidina, etiqueta Snap, etiqueta Clip, etiqueta Halo, eti- queta Snoop, etiqueta Spy, proteína de ligação de quitina, proteína de ligação maltose, etiqueta Strep, glutationa-S-transferase, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi, etiqueta calmodulina, poliglutamato, etiqueta S, etiqueta SBPSof- tag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta isopep, proteína carreadora de carboxila de biotina, etiqueta de proteí- na fluorescente verde, etiqueta Nus, etiqueta tiorredoxina e o domínio Fc de um anticorpo, embora a escolha de etiqueta de afinidade não seja particularmente limitante. Um polipeptídeo recombinante não obs- tante pode precisar de uma etiqueta de afinidade, por exemplo, se a etiqueta de afinidade é removida após uso ou se o polipeptídeo re- combinante é purificado usando uma estratégia que não requer uma etiqueta de afinidade. Uma etiqueta de afinidade exemplar é etiqueta poli histidina, que tipicamente inclui uma sequência de aminoácidos compreendendo seis ou oito histidinas consecutivas embora o número de resíduos histidina não seja particularmente limitante (ver, por exemplo, SEQ ID Nº: 15-18, 43, 44, 46). Em algumas modalidades, a etiqueta de afinidade pode compreender um ligador glicina (ver, por exemplo, SEQ ID Nº: 44). Em algumas modalidades, a etiqueta de afi- nidade pode compreender o domínio Fc de um anticorpo (ver, por exemplo, SEQ ID Nº: 46). Em algumas modalidades, a etiqueta de afi- nidade é o domínio Fc de um anticorpo (ver, por exemplo, SEQ ID Nº: 11 ou 12).

[00102] Uma etiqueta de afinidade para a presente invenção pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 15; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 43; SEQ ID Nº: 44; SEQ ID Nº: 45; ou SEQ ID Nº: 46. Domínios de Oligomerização

[00103] Um polipeptídeo recombinante opcionalmente pode com- preender um domínio de oligomerização. Um domínio de oligomeriza- ção permite a formação de oligômeros tais com os dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, e/ou oligômeros de ordem superior. Um do- mínio de oligomerização pode favorecer uma específica estequiome- tria, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, ou pentâmeros, ou um domínio de oligomerização pode permitir uma distribuição de oli- gômeros tendo diferentes estequiometrias. Um domínio de oligomeri- zação pode ser desenhado para formar homo-oligôêmeros, embora a distinção em ter homo-oligômeros e hetero-oligômeros não seja parti- cularmente limitante. Em algumas modalidades, o domínio de oligome- rização é capaz de formar um homodímero, homotrímero, homotetrâ- mero, ou homopentâmero, por exemplo, onde a oligomerização de um polipeptídeo recombinante resulta em um oligômero predominante- mente monodisperso. O domínio de oligomerização pode ser, por exemplo, um domínio de oligomerização a partir de p53, GCNA, clatri- na, etiqueta pent, ou o domínio Fc de um anticorpo.

[00104] Um domínio de oligomerização proporciona várias vanta- gens para polipeptídeos recombinantes que são usados em ensaios. Um domínio de oligomerização pode orientar polipeptídeos recombi- nantes uns em relação aos outros, o que pode aproximar, por exem- plo, a orientação de GPlba nativa na bicamada de lipídeo de uma pla-

queta. Um domínio de oligomerização também pode aumentar a afini- dade de um polipeptídeo recombinante para vWF, por exemplo, por- que vWF é multivalente, e a ligação dos múltiplos domínios extracelu- lares modificados de um polipeptídeo oligomérico a vuWF ter inerente- mente maior afinidade de ligação que a ligação de um domínio extra- celular modificado simples a vWF.

[00105] Um domínio de oligomerização exemplar inclui a sequência de aminoácidos de uma região de articulação de domínio Fc de anti- corpo. Em adição aos benefícios de domínios de oligomerização des- critos acima. Domínios Fc frequentemente aumentam a expressão e/ou secreção de um polipeptídeo recombinante em células de ex- pressão.

[00106] As espécies de um domínio Fc de anticorpo podem ser se- lecionadas baseado no desejado uso de um polipeptídeo recombinan- te ou polipeptídeo oligomérico. Por exemplo, as espécies de domínios Fc de anticorpo podem ser selecionadas de modo que um específico reagente tanto alveje como ignore o domínio Fc de anticorpo em um ensaio. Um domínio Fc de camundongo pode ser útil, por exemplo, se nenhum anticorpo secundário anticamundongo é usado para detectar outros anticorpos de camundongo em um ensaio. Similarmente, um domínio Fc de camundongo pode ser útil para reticular um polipeptí- deo recombinante para um suporte sólido ou outro componente de um ensaio usando um anticorpo anticamundongo. As espécies de domínio Fc podem ser humana, camundongo, coelho, hamster, porquinho da Índia, cabra, carneiro, cavalo, galinha, ou uma quimera de qualquer uma das espécies anteriores, embora as espécies de domínio Fc não sejam particularmente limitantes.

[00107] Um domínio de oligomerização exemplar é o domínio Fc de IgG de camundongo compreendendo a região de articulação, o que permite que polipeptídeos recombinantes compreendendo o domínio de oligomerização formem um homodímero covalente. Um domínio Fc de IgG de camundongo dimérico pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 11 ou SEQ ID Nº: 12 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 11 ou SEQ ID Nº: 12.

[00108] Domínios Fc também podem auxiliar a purificação de um polipeptídeo recombinante quando métodos de purificação de polipep- tídeos compreendendo domínios Fc são bem conhecidos. Domínios Fc também podem atuar como domínios de reticulação. Domínios Fc também podem atuar como etiquetas de afinidade.

[00109] “Um outro domínio de oligomerização exemplar é o domínio de tetramerização de p53. Um domínio de tetramerização de p53 pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 10 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 10.

[00110] Um outro domínio de oligomerização exemplar é o domínio de trimerização de GCN4. Um domínio de trimerização de GCN4 pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 13 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 13. Um polipeptídeo recombi- nante compreendendo uma sequência semelhante a GCN4 pode ser projetado, por exemplo, para ser um trímero paralelo. Sequências se- melhantes a GCNA4 alternadas podem ser projetadas como conhecido na técnica para preparação de oligômeros diméricos, triméricos e te- traméricos tanto com organização paralela como antiparalela de acor- do com métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harbury, Zhang, Kim, and Alber, "A switch between two-three-, and four-

stranded coiled coils in GCNA4 leucine zíper mutants", Science (1993) 262:1401).

[00111] Um outro domínio de oligomerização exemplar é o domínio de trimerização de clatrina. Um domínio de trimerização de clatrina pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 14 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 14.

[00112] Em algumas modalidades, o domínio de oligomerização pode incluir uma etiqueta de afinidade.

[00113] Um domínio de oligomerização de acordo com a presente invenção pode ter a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 13; SEQ ID Nº: 14; ou SEQ ID Nº: 46.

[00114] Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) entre uWF e um polipeptídeo recombinante compreendendo um domí- nio de oligomerização é menor que a constante de dissociação entre vVWF e um polipeptídeo controle compreendendo ambos (a) a mesma subsequência de GPlba ou sua subsequência mutante como o poli- peptídeo recombinante e (b) faltando o domínio de oligomerização (por exemplo, onde o polipeptídeo controle e o polipeptídeo recombinante são idênticos exceto pela presença do domínio de oligomerização no polipeptídeo recombinante e a falta do domínio de oligomerização no polipeptídeo controle). A diferença em constante de dissociação (Kd) entre tais polipeptídeos recombinantes e polipeptídeos controles é tipi- camente atribuível primária ou unicamente aos estados de oligomeri- zação dos polipeptídeos recombinantes e polipeptídeos controles.

[00115] Outros domínios de oligomerização são conhecidos na téc- nica, e a específica escolha de domínio de oligomerização não é parti- cularmente limitante. Estreptavidina, por exemplo, pode ser um domí-

nio de oligomerização particularmente útil porque forma um tetrâmero e também liga biotina, o que pode auxiliar purificação e que também pode ser útil em vários ensaios. D. “Sequências de Peptídeos Líderes

[00116] Polipeptídeos recombinantes aqui mostrados tipicamente compreendem uma sequência de peptídeo líder para favorecer trans- locação do polipeptídeo recombinante através de membrana de célula de um vetor de expressão, tal como uma célula mamífera, tal como uma célula humana. Um polipeptídeo recombinante não obstante pode ter falta de uma sequência de peptídeo líder, por exemplo, se a se- quência de peptídeo líder é clivada do polipeptídeo recombinante atra- vés de clivagem enzimática ou química. Polipeptídeos recombinantes produzidos sinteticamente similarmente podem ter falta de uma se- quência de peptídeo líder.

[00117] Uma sequência de peptídeo líder é tipicamente incluída no terminus-N de um polipeptídeo recombinante. Uma sequência de pep- tídeo líder é preferivelmente suficiente para translocar o polipeptídeo recombinante fora da membrana de superfície de célula de uma célula eucariótica (por exemplo, uma célula mamiífera, tal como uma célula humana) seguindo a tradução do polipeptídeo recombinante na célula eucariótica, embora outros motivos de sequência de um polipeptídeo recombinante também possam auxiliar translocação.

[00118] Uma sequência peptídeo líder exemplar tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 20, que é o peptídeo sinal de plasminogênio de tecido humano. Esta sequência bem caracterizada é capaz de translocar polipeptídeos fora de ambas, células humanas e outras células mamíferas. ll. — Polipeptídeos Oligoméricos

[00119] Vários aspectos das modalidades referem-se a um polipep- tídeo oligomérico compreendendo 2, 3, 4, ou mais polipeptídeos re-

combinantes (subunidades) como aqui descrito. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo oligomérico é um polipeptídeo dimérico, isto é, um polipeptídeo oligomérico compreendendo duas subunidades, onde cada subunidade é um polipeptídeo recombinante aqui descrito. O termo "polipeptídeo" como usado sem os modificadores "oligomérico", "dimérico", ou outra referência explícita a uma forma de multi- subunidades refere-se a um polipeptídeo recombinante que pode ou não estar presente em um oligômero tal como um dímero, trímero ou tetrâmero.

[00120] Cada subunidade de um polipeptídeo oligomérico tipica- mente tem a mesma sequência de aminoácidos, embora diferentes subunidades de um polipeptídeo oligomérico possam ter diferentes sequências de aminoácidos. Um polipeptídeo heterodimérico pode ser obtido, por exemplo, através de ativação de cisteína tióis de uma pri- meira subunidade com um grupo de saída (por exemplo, com 2-2"- ditio-bis-(5-nitro piridina)), redução de tióis de uma segunda subunida- de (por exemplo, com B-mercapto etanol ou tris (2-carboxi etil) fosfina), e então contatando a primeira subunidade e segunda subunidade. Al- ternativamente, as subunidades podem ser reticuladas randomicamen- te e então purificadas. Polipeptídeos homodiméricos podem ser obti- dos usando estratégias similares. Polipeptídeos oligoméricos podem ser purificados após oligomerização para separar o desejado polipep- tídeo oligomérico de subunidades monoméricas e outras espécies in- desejadas.

[00121] Um polipeptídeo oligomérico pode ser simétrico ou o poli- peptídeo oligomérico pode precisar de simetria. Por exemplo, um poli- peptídeo oligomérico pode formar um padrão de ligação de dissulfeto "intermolecular" resultando em estrutura quaternária que carece de simetria.

[00122] Um polipeptídeo oligomérico pode ser reticulado através de interações não covalentes ou covalentes. Um exemplo de uma intera- ção não covalente é a trimerização de um domínio de oligomerização GCNA4 ou clatrina ou a tetramerização de um domínio de oligomeriza- ção de p53. Um exemplo de uma interação covalente é a dimerização mediada por ligação dissulfeto de uma região de articulação de domí- nio Fc de anticorpo. Um polipeptídeo dimérico tendo subunidades que incluem domínios Fc de anticorpo pode ser covalentemente reticulado por pelo menos uma ligação dissulfeto, tipicamente 2 ligações dissulfe- to (por exemplo, para domínios Fc derivados de IgG: e IgG) ou 4 liga- ções dissulfeto (por exemplo, para domínios Fc derivados de |gG>), embora o número de ligações dissulfeto não seja particularmente limi- tante. IgG3's podem ser reticulados, por exemplo, com 11 ligações dis- sulfeto.

[00123] Um polipeptídeo dimérico pode compreender duas subuni- dades, onde cada subunidade compreende um domínio Fc de anticor- po, e o domínio Fc de anticorpo reticula as duas subunidades do poli- peptídeo dimérico.

[00124] Um polipeptídeo trimérico pode compreender três subuni- dades, onde cada subunidade compreende um domínio de trimeriza- ção GCNA4, e os domínios de trimerização GCNA4 reticulam não cova- lentemente as três subunidades do polipeptídeo trimérico. Um polipep- tídeo trimérico pode compreender três subunidades, onde cada subu- nidade compreende um domínio de trimerização clatrina, e os domí- nios de trimerização clatrina reticulam não covalentemente as três su- bunidades do polipeptídeo trimérico.

[00125] Um polipeptídeo tetramérico pode compreender quatro su- bunidades, onde cada subunidade compreende um domínio de tetra- merização p53, e os domínios de tetramerização p53 reticulam não covalentemente as quatro subunidades do polipeptídeo tetramérico.

[00126] Várias modalidades da invenção incluem uma composição compreendendo um polipeptídeo dimérico, onde a composição é es- sencialmente livre de polipeptídeos oligoméricos que não são polipep- tídeos diméricos. Uma composição pode precisar de polipeptídeos oli- goméricos que não são polipeptídeos diméricos.

[00127] Várias modalidades da invenção incluem uma composição compreendendo um polipeptídeo trimérico, onde a composição é es- sencialmente livre de polipeptídeos oligoméricos que não são polipep- tídeos triméricos. Uma composição pode precisar de polipeptídeos oli- goméricos que não são polipeptídeos triméricos.

[00128] Várias modalidades da invenção incluem uma composição compreendendo um polipeptídeo tetramérico, onde a composição é essencialmente livre de polipeptídeos oligoméricos que não são poli- peptídeos tetraméricos. Uma composição pode precisar de polipeptí- deos oligoméricos que não são polipeptídeos tetraméricos.

[00129] Em algumas modalidades, uma composição compreende um polipeptídeo recombinante monomérico, onde a composição é es- sencialmente livre de polipeptídeos oligoméricos. Uma composição pode precisar de polipeptídeos oligoméricos. Ill. Ácidos Nucleicos, Células de Clonagem, e Células de Expressão

[00130] “Modalidades aqui descritas também incluem um ácido nu- cleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um domínio extracelular modificado (por exemplo, SEQ ID Nº: 1-9, ou 42) e/ou um polipeptídeo recombinante aqui descrito. O ácido nucleico po- de ser DNA ou RNA. DNA compreendendo uma sequência de nucleo- tídeos codificando um polipeptídeo recombinante aqui descrito com- preende um promotor que está operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos. O promotor é preferivelmente capaz de dirigir expressão constitutiva ou induzível da sequência de nucleotídeos em uma célula de expressão de interesse. A precisa sequência de nucleotídeos do ácido nucleico não é particularmente limitante tanto quanto a sequên-

cia de nucleotídeos codifica um polipeptídeo recombinante aqui des- crito. Códons podem ser selecionados, por exemplo, para ajustar o viés de códon de uma célula de expressão de interesse (por exemplo, uma célula mamífera tal como uma célula humana) e/ou por conveni- ência durante clonagem. DNA pode ser um plasmídeo, por exemplo, que pode compreender uma origem de replicação (por exemplo, para replicação do plasmídeo em uma célula procariótica).

[00131] Vários aspectos das modalidades referem-se a uma célula compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio extracelular modificado e/ou um polipeptídeo recombinante aqui descrito. A célula pode ser uma célula de expressão ou uma célula de clonagem. Ácidos nucleicos são tipi- camente clonados em E. coli, embora outras células de clonagem pos- sam ser usadas. Se a célula é uma célula de expressão, o ácido nu- cleico é opcionalmente um ácido nucleico de um cromossomo, isto é, onde a sequência de nucleotídeos está integrada no cromossomo, embora então ácido nucleico possa estar presente em uma célula de expressão, por exemplo, como DNA extracromossômico.

[00132] Vários aspectos das modalidades referem-se a uma célula compreendendo um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligo- mérico (por exemplo, polipeptídeo dimérico, trimérico ou tetramérico) como aqui descrito. Vários aspectos das modalidades referem-se a uma composição compreendendo células, meios de cultura de células, e um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico como aqui descrito, onde as células compreendem um ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo recombinante ou as subunidades do polipeptídeo oligomérico e os meios de cultura de células compreendem o polipep- tídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico (por exemplo, porque as células secretaram o polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico nos meios de cultura de células). A célula é tipicamente uma célula de expressão. A natureza da célula de expressão não é particularmente limitante. Células de expressão mamiíferas podem permitir dobra favorável, modificações pós-traducionais, e/ou secreção de um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico, embora outras células eucarióticas ou células procarióticas possam ser usadas como células de expressão. Células de expressão exemplares incluem células CHO, HEK, BHK, NSO0, Sp2/0, COS, C127, HT-1080, PER.C6, HeLa e Jurkat.

IV. "Composições e Métodos Relacionados a Ensaios

[00133] Vários aspectos da invenção referem-se a composições compreendendo um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligo- mérico como aqui descrito, onde o polipeptídeo recombinante ou poli- peptídeo oligomérico está direta ou indiretamente ligado a um suporte sólido. O termo ligação "direta", como aqui usado, refere-se à conjuga- ção direta de uma molécula a um suporte sólido, por exemplo, uma interação ouro — tiol que liga uma cisteína tiol de um polipeptídeo re- combinante a uma superfície de ouro. O termo ligação "indireta", como aqui usado, inclui a específica ligação de um polipeptídeo recombinan- te a uma outra molécula que está diretamente ligada a um suporte só- lido, por exemplo, um polipeptídeo recombinante pode ligar um anti- corpo que está diretamente ligado a um suporte sólido pelo que ligan- do indiretamente o polipeptídeo recombinante ao suporte sólido (ver, por exemplo, Figura 4A). O termo ligação "indireta" é independente do número de moléculas entre o polipeptídeo recombinante e o suporte sólido tanto quanto (a) cada interação entre a cadeia margarida (daisy) de moléculas é específica ou interação covalente e (b) uma molécula terminal da cadeia margarida (daisy) está diretamente ligada ao supor- te sólido (ver, por exemplo, Figura 4º na qual peroxidase de raiz forte (HRP), um anticorpo anti-vWF, vWF e um polipeptídeo recombinante ("GPlba") estão, cada, indiretamente ligados a um suporte sólido atra-

vés de ligação direta de um anticorpo anti-CD42b ao suporte sólido).

[00134] Vários aspectos da invenção referem-se a uma composição compreendendo um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligo- mérico como aqui descrito, onde o polipeptídeo recombinante ou poli- peptídeo oligomérico está covalentemente ou não covalentemente |i- gado a um suporte sólido. O termo "ligado não covalentemente", como aqui usado, refere-se a específica ligação tal como entre um anticorpo e seu antígeno, um ligante e seu receptor, ou uma enzima e seu subs- trato, exemplificada, por exemplo, pela interação entre proteína de |li- gação de estreptavidina e estreptavidina ou um anticorpo e seu antí- geno (ver, por exemplo, Figura 4A). Ligação específica refere-se ge- ralmente a interações com uma constante de dissociação (Kd) de me- nos que cerca de 10 UM, tal como menos que cerca de 1 uM, menos que cerca de 100 nM, ou menos que cerca de 10 nM.

[00135] Um suporte sólido pode compreender uma partícula, uma pérola, uma superfície, um chip de polipeptídeo, uma placa de microti- tulação, ou a fase sólida de uma coluna de cromatografia. Por exem- plo, o suporte sólido pode ser uma pérola de látex.

[00136] Uma composição pode compreender uma pluralidade de pérolas ou partículas, onde cada pérola ou partícula da pluralidade de pérolas ou partículas está direta ou indiretamente ligada a pelo menos um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oligomérico como aqui descrito. Una composição pode compreender uma pluralidade de pé- rolas ou partículas, onde cada pérola ou partícula da pluralidade de pérolas ou partículas está covalentemente ou não covalentemente |i- gada a pelo menos um polipeptídeo recombinante ou polipeptídeo oli- gomérico como aqui descrito.

[00137] Uma composição pode compreender Fator von Willebrand. Uma composição pode compreender vWWF humano, por exemplo, em uma solução ou suspensão aquosa tal como sangue integral ou uma sua fração tal como plasma de sangue. Uma composição pode com- preender um suporte sólido onde o suporte sólido compreende uma pluralidade de pérolas ou partículas, e o vWF reticula as partículas ou pérolas da pluralidade de partículas ou pérolas.

[00138] Uma composição pode compreender plasma de sangue humano. Uma composição pode compreender plaquetas humanas. Uma composição pode compreender plasma de sangue humano e plaquetas humanas.

[00139] Uma composição pode compreender um anticorpo, por exemplo, onde o anticorpo não é um anticorpo humano. O anticorpo pode ser, por exemplo, um camundongo, coelho, rato, hamster, porqui- nho da Índia, cabra, carneiro, cavalo, galinha, ou uma quimera das espé- cies anteriores, embora as espécies de anticorpos não sejam particular- mente limitantes. Una composição pode compreender um anticorpo anti-vWF, preferivelmente um anticorpo vWF anti-humano. Uma com- posição pode compreender um anticorpo marcado fluorescentemente. Em algumas modalidades o anticorpo vWF anti-humano está direta ou indiretamente ligado a um corante, fluoróforo ou, enzima.

[00140] Uma composição pode compreender um tampão de pH tal como tampão HEPES ou fosfato. Uma composição pode compreender polivinil pirrolidona (PVP), Tween (por exemplo, Tween 20), ou Dex- tran-500.

[00141] Uma composição ainda pode compreender ristocetina. Uma vantagem dos polipeptídeos recombinantes aqui mostrados é o de- senvolvimento de ensaios que não requerem ristocetina. Em algumas modalidades, as composições aqui mostradas carecem de ristocetina.

[00142] Vários aspectos das modalidades referem-se a um Kit com- preendendo uma composição como aqui descrita e instruções para uso. Exemplificação Exemplo 1. Expressão e purificação de polipeptídeos recombinan-

tes

[00143] O domínio de ligação de Fator von Willebrand (vWF) de Iba de glicoproteína (GPIba) consistindo em 290 aminoácidos (SEQ ID Nº: 19) foi clonado com um peptídeo líder terminal-N de ativador plasmi- nogênio de tecido humano (SEQ ID Nº: 20) e uma etiqueta poli histidi- na terminal-C (SEQ ID Nº: 15, 16, 17, 18, 43, 44 ou 46). Mutações de aminoácidos selecionadas foram introduzidas no domínio de ligação de vWF de GPlba. Domínios de oligomerização e domínios de reticu- lação foram clonados em construções selecionadas. As construções foram transientemente ou estavelmente expressas em células de rim embriônicas humanas (HEK) ou células de ovário de hamster Chinês (CHO). Polipeptídeo recombinante foi purificado a partir de sobrena- dante de cultura de células através de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) usando uma fase móvel salina tamponada com fosfato (PBS) compreendendo azida sódica 0,02%. Pureza de po- lipeptídeo recombinante foi avaliada através de eletroforese de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) sob condições re- dutoras em géis de poliacrilamida TGX 4-15% (Bio-Rad, California). Imagens de géis contendo polipeptídeo recombinante selecionado são mostradas na Figura 1.

Exemplo 2. Medição de afinidade de ligação (Kd) entre uWF e po- lipeptídeo recombinante

[00144] As constantes de dissociação (Kd) entre vuWF e seleciona- dos polipeptídeos diméricos ou um controle polipeptídeo monomérico (G233V, M239V — noFc (SEQ ID Nº: 35)) foram avaliadas através de anisotropia de fluorescência. Cada polipeptídeo dimérico incluiu duas subunidades polipeptídeo cada uma compreendendo um domínio de dimerização Fc murino e um domínio extracelular modificado de GPlba. Os polipeptídeos diméricos avaliados correspondem a SEQ ID Nº: 38 (A(229-240)); SEQ ID Nº: 37 (WT); SEQ ID Nº: 36 (A238V);

SEQ ID Nº: 34 (G233V, M239V); SEQ ID Nº: 32 (G233V); SEQ |D Nº: 33 (G233T, M239T); SEQ ID Nº: 21 (G233T); SEQ ID Nº: 30 (D235V); SEQ ID Nº: 31 (K237V). O domínio A1 de vWF (aminoácidos 1277- 1453 de vWF humano), que especificamente ligam o domínio de liga- ção de vWF GPlba, foi conjugado ao rótulo de fluorescência AlexaFlu- or 488 (Molecular Probes, Oregon) usando química cisteína — tiol — maleimida. Polipeptídeos recombinantes foram conjugados a partícu- las de lento revolver. Uma diluição serial de 2x de cada polipeptídeo recombinante a partir de 5 uM a 9,75 nM foi incubada com 150 nM das espécies vWF A1l — AlexaFluor em temperatura ambiente, e então anisotropia de fluorescência foi medida. Resultados são mostrados na Figura 2. Polipeptídeo recombinante que não inclui uma mutação mos- trou uma Kd de cerca de 1,25 uM. Polipeptídeos recombinantes que incluíram uma das mutações G233T, D235V, ou K237V cada um mos- trou Kds de menos que 500 nM (isto é, -67 nM, -250 nM, e -300 nM, respectivamente, para mutantes simples). A afinidade de ligação rela- tiva dos mutantes G233T, D235V, ou K237V foi confirmada por ELISA (ver Figura 4D, 4B e 4C, respectivamente, e Exemplo 3, infra).

[00145] Resultados de anisotropia de fluorescência foram confirma- dos por ressonância plásmon de superfície usando Biacore (Biacore, Sweden) (Figura 3). O domínio A1 de vWF foi conjugado a chip CM5 Biacore. As taxas ligado- e desligado- de um polipeptídeo compreen- dendo a mutação G233T ao domínio extracelular de GPlba, um do míií- nio Fc murino terminal-C, e uma etiqueta 8-His terminal-C (SEQ ID Nº: 21) foram medidas, e a constante de dissociação foi calculada como —58 nM, que é consistente com a medição -67 nM obtida por anisotro- pia de fluorescência. Exemplo 3. Polipeptídeo recombinante é capaz de detectar defei- tos qualitativos em ligação de vWF através de ELISA

[00146] Ensaios imunossorventes de enzima (ELISA) foram usados para determinar que polipeptídeos recombinantes compreendendo as mutações G2333T (SEQ ID Nº: 21), D235V (SEQ ID Nº: 30), e K237V (SEQ ID Nº: 31) são capazes de detectar diferenças qualitativas em afinidade de ligação de vWF. A Figura 4A mostra um desenho do en- saio ELISA. Em resumo, as cavidades de uma placa de múltiplas cavi- dades foram revestidas com um anticorpo anti-CD42b, que liga especi- ficamente o domínio extracelular modificado de GPlba dos polipeptí- deos recombinantes e foi usado para reticular indiretamente os poli- peptídeos recombinantes à placa de múltiplas cavidades (isto é, o su- porte sólido). Várias amostras controles, padrões, e suas diluições se- riais foram adicionados a diferentes cavidades da placa de múltiplas cavidades incluindo amostras de plasma associadas com Doença von Willebrand tipo 1, tipo 2B, e tipo 3, amostras controles de plasma de sangue humano reunido, amostras controles de plasma de sangue humano conhecidas não terem Doença de von Willebrand, uma dilui- ção serial de 2x de um padrão de referência de plasma humano reuni- do a partir de nenhuma diluição para diluição de 16-vezes, e soro de sangue de cabra como um controle negativo. Após incubação, as ca- vidades foram lavadas e então contactadas com um anticorpo vWF anti-humano coelho policlonal, que foi conjugado a peroxidase de raiz forte. vWF ligado foi quantificado através de monitoramento de con- versão de um substrato peroxidase de raiz forte em produto através de espectroscopia de absorção em 450 nm.

[00147] Cada um dos polipeptídeos recombinantes compreendendo as mutações G233T, D235V, ou K237V foi capaz de detectar os defei- tos em amostras de plasma associadas com Doença von Willebrand tipo 1, tipo 2B, e tipo 3, por exemplo, em relação a amostras de plas- ma normais e amostras controles (FIGURAS 4B-4D). Cada um dos polipeptídeos recombinantes compreendendo as mutações G233T, D235V, e K237V também permitiu acurada correlação entre as cinco amostras da diluição serial e medição de absorbância. Estes resulta- dos demonstram que polipeptídeos recombinantes aqui descritos compreendendo pelo menos uma das mutações G233T, D235V, e K237V podem ser usados em ensaios para detecção de Doença von Willebrand e que tais ensaios podem permitir uma medição acurada de concentração de vWF e/ou afinidade de ligação em plasma sobre uma faixa dinâmica que espalha por mais que uma ordem de magnitude. Referências

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Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo recombinante que liga especificamente Fa- tor von Willebrand humano, caracterizado por compreender um domí- nio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta, onde: o polipeptídeo recombinante carece de um domínio trans- membrana; e o domínio extracelular modificado compreende pelo menos uma mutação selecionada de G233T, D235V, e K237V, em relação a SEQ ID Nº: 19.

2. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado por ter uma maior afinidade de ligação para o Fa- tor von Willebrand de uma amostra de sangue humano ou amostra de plasma de sangue humano que um polipeptídeo controle que não compreende a pelo menos uma mutação, mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombinante.

3. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizado por Kd do polipeptídeo recombinante e Fator von Willebrand humano ser menos que 1 uM, 750 nM, 500 nM, 250 NM, ou 100 nM.

4, Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por domínio extracelular modificado compreender: mutações C65S e G233T; mutações C65S e D235V; mutações C65S e K237V; ou mutações C65S, G233T, e M239T, em relação a SEQ ID Nº: 19.

5. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por domínio extracelular modificado ter pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com pelo menos cerca de 250 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; ou SEQ ID Nº: 5.

6. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 5, caracterizado por domínio extracelular modificado compreender a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 2; SEQ ID Nº: 3; SEQ ID Nº: 4; ou SEQ ID Nº: 5.

7. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ainda compreender um domínio de reticulação, onde o domínio de reticulação compreende um ou mais de uma cisteína terminal-C, um domínio terminal-C carre- gado negativamente, e proteína de ligação de estreptavidina.

8. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 7, caracterizado por sequência de aminoácidos do domínio de re- ticulação ser selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; ou SEQ ID Nº: 18.

9. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ainda compreender uma etiqueta de afinidade selecionada de etiqueta poli histidina, eti- queta Snap, etiqueta Clip, etiqueta Halo, etiqueta Snoop, etiqueta Spy, proteína de ligação de quitina, proteína de ligação de maltose, etiqueta Strep, glutationa-S-transferase, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi, etiqueta Calmodulina, po- liglutamato, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, etiqueta isopep, proteína carreadora de carboxila de biotina, etiqueta — proteína fluorescente verde, etiqueta Nus, etiqueta tiorredoxina e o domínio Fc de um anticorpo.

10. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizado por etiqueta de afinidade ser uma etiqueta poli- histidina compreendendo entre 6 e 8 resíduos histidina.

11. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma de reivindicações 9 ou 10, caracterizado por sequência de ami- noácidos da etiqueta de afinidade ser selecionada do grupo consistin- do em SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 15; SEQ ID Nº: 16; SEQ ID Nº: 17; SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 43; SEQ ID Nº: 44; SEQ ID Nº: 45; ou SEQ ID Nº: 46.

12. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ainda compre- ender um domínio de oligomerização, onde o domínio de oligomeriza- ção é capaz de formar um dímero, trímero, tetrâmero ou pentâmero.

13. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizado por domínio de oligomerização ser selecionado do grupo consistindo em p53, GCNA, clatrina, etiqueta pent, ou o do- mínio Fc de um anticorpo.

14. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por sequência de ami- noácidos do domínio de oligomerização ser selecionada do grupo con- sistindo em SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; SEQ ID Nº: 13; SEQ ID Nº: 14; ou SEQ ID Nº: 46.

15. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante ter pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID Nº: 25; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41.

16. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por sequência de aminoácidos do polipeptídeo recombinante ser selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 21; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 24; SEQ ID

Nº: 25; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 31; SEQ ID Nº: 33; SEQ ID Nº: 39; SEQ ID Nº: 40; ou SEQ ID Nº: 41.

17. Polipeptídeo recombinante que liga especificamente Fa- tor von Willebrand humano, caracterizado por compreender um domí- nio extracelular modificado de Iba de glicoproteína de plaqueta, onde: o domínio extracelular modificado compreende mutações C65A, G233V e M239V, em relação a SEQ ID Nº: 19.

18. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado por sequência de aminoácidos do domínio ex- tracelular modificado compreender a sequência de aminoácidos mos- trada em SEQ ID Nº: 42 ou onde a sequência de aminoácidos do poli- peptídeo recombinante é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 27; ou SEQ ID Nº: 28.

19. Polipeptídeo recombinante que liga especificamente Fa- tor von Willebrand humano, caracterizado por compreender um domí- nio extracelular modificado de l|ba de glicoproteína de plaqueta, onde: o domínio extracelular modificado compreende: a mutação A238V; ou a mutação A(229-240), em relação a SEQ ID Nº: 19; e o polipeptídeo recombinante tem uma menor afinidade para Fator von Wilebrand de uma amostra de sangue humano ou uma amostra de plasma de sangue humano que um polipeptídeo controle que não compreende a mutação A238V ou a mutação A(229-240) mas que é de outro modo idêntico ao polipeptídeo recombinante.

20. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizado por sequência de aminoácidos do domínio ex- tracelular modificado compreender a sequência de aminoácidos mos- trada em SEQ ID Nº: 6 ou SEQ ID Nº: 9, ou onde a sequência de ami- noácidos do polipeptídeo recombinante é SEQ ID Nº: 36 ou SEQ ID Nº: 38.

21. Polipeptídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ainda compre- ender um peptídeo líder.

22. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindica- ção 21, caracterizado por sequência de aminoácidos do peptídeo líder ser SEQ ID Nº: 20.

23. Polipeptídeo oligomérico, caracterizado por compreen- der pelo menos dois dos polipeptídeos recombinantes como definidos em qualquer uma de reivindicações 1 a 22.

24. Célula, caracterizada por compreender o polipeptídeo recombinante como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 22 ou o polipeptídeo oligomérico como definido na reivindicação 23.

25. Célula de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser uma célula CHO, HEK, BHK, NSO0, Sp2/0, COS, C127, HT- 1080, PER.C6, HeLa, ou Jurkat.

26. Ácido nucleico, caracterizado por compreender: uma sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo recombinante como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 22 ou o polipeptídeo oligomérico como definido na reivindicação 23; e um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleo- tídeos.

27. Célula, caracterizada por compreender o ácido nucleico como definido na reivindicação 26.

28. Composição, caracterizada por compreender o polipep- tídeo recombinante como definido em qualquer uma de reivindicações 1a 22 ou o polipeptídeo oligomérico como definido na reivindicação 23, e um suporte sólido, onde o polipeptídeo recombinante ou o poli- peptídeo oligomérico está covalentemente ou não covalentemente |i- gado ao suporte sólido.

29. Composição de acordo com a reivindicação 28, caracte-

rizada por suporte sólido compreender uma partícula, uma pérola, uma membrana, uma superfície, um chip de polipeptídeo, uma placa de mi- crotitulação, ou a fase sólida de uma coluna de cromatografia.

30. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracte- rizada por suporte sólido ser uma partícula de látex.

31. Composição de acordo com qualquer uma de reivindi- cações 28 a 30, caracterizada por ainda compreender Fator von Wille- brand.

32. Composição de acordo com a reivindicação 31, caracte- rizada por: suporte sólido compreender uma pluralidade de partículas ou pérolas; e Fator von Willebrand reticular as partículas ou pérolas da pluralidade de partículas ou pérolas.

33. Composição de acordo com qualquer uma de reivindi- cações 31 ou 32, caracterizada por ainda compreender plasma de sangue humano.

34. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracte- rizada por ainda compreender plaquetas humanas.