CN116057176A

CN116057176A - Ace2和补体途径的双特异性和三特异性功能分子及其用途

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Publication number: CN116057176A
Application number: CN202180004030.8A
Authority: CN
Inventors: 余波; J·拉瑞克
Original assignee: LARIX BIOSCIENCE LLC
Current assignee: LARIX BIOSCIENCE LLC
Priority date: 2020-03-21
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2023-05-02
Also published as: JP2023517403A; EP3946612A1; WO2021194909A1; US20210292384A1

Abstract

本文公开了可用于阻断细胞被SARS‑CoV‑2感染的ACE2融合蛋白。所述融合蛋白可具有额外功能，如抑制补体。所述融合蛋白还可以包括增加ACE2融合蛋白的血清或血液半衰期的多肽或部分。

Description

ACE2和补体途径的双特异性和三特异性功能分子及其用途

序列表、表格或计算机程序的引用

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背景技术

本技术领域是用于治疗血管紧张素转换酶2(ACE2)和补体相关人类疾病的生物分子。更具体地说，描述了编码功能性ACE2活性和补体途径的特异性和强效抑制剂的核酸和结合功能性ACE2活性和补体途径的特异性和强效抑制剂的多肽，可用于治疗病毒感染、心脏、肺和肾脏疾病、高血压和炎症。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)通过维持血压和电解质平衡的稳态，在控制心血管和肾脏功能方面发挥核心作用。RAAS的异常激活与如高血压、心肌梗塞和心力衰竭等心血管和肾脏疾病的发病机制有关(Jai,2016)。蛋白酶肾素将血管紧张素原裂解成无活性的十聚肽血管紧张素I(Ang I)。然后，血管紧张素转换酶(ACE)将Ang 1裂解为活性八聚体血管紧张素II(Ang II)，其促进血管平滑肌血管收缩和肾小管钠重吸收。血管紧张素转换酶2(ACE2)是一种膜羧肽酶，主要在肺、肾脏、心脏和内皮细胞中表达，可裂解各种肽底物。ACE2水解Ang I生成Ang 1-9，水解Ang II生成Ang 1-7。Ang 1-7表现出血管扩张作用，并拮抗许多Ang II介导的作用。总体而言，ACE2通过降低局部Ang II浓度发挥RAAS反调节酶的作用(Imai,2010)。

ACE2已被证实在数种急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型以及肺纤维化和肺动脉高压模型中具有保护作用。重组人ACE2(rhACE2)已在一项针对急性肺损伤(ALI)的试点II期临床试验中进行了研究。大范围剂量的rhACE2的施用是安全的，没有引起显著的血流动力学变化。每天两次的输注使血浆Ang II水平迅速下降，Ang 1-7和Ang 1-5水平上升，以及血浆IL-6浓度呈下降趋势(Khan,2017)。此外，在HF鼠模型中，rhACE2对Ang II诱导的射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)和压力超负荷诱导的射血分数降低的HF提供有益的影响(Patel,2016)。尽管rhACE2在肺部和心血管疾病中表现出潜在的治疗应用，但其相对较短的半衰期限制了其临床开发。

ACE2受体也被证明是一些冠状病毒的人类受体，包括SARS-CoV(Kuba,2005)和SARS-CoV-2(Hoffmann,2020)。SARS-CoV的病毒进入是由病毒体表面表达的刺突糖蛋白(S蛋白)介导的，这有利于受体识别和膜融合(Gallagher,2001；Belouzard,2012)。在病毒感染期间，三聚体S蛋白被裂解为S1和S2亚基，S1亚基在向融合后构象的过渡中被释放(Song,2018)。S1含有受体结合域(RBD)，其直接与ACE2的肽酶域(PD)结合，而S2负责膜融合。当S1与宿主受体ACE2结合时，S2上的另一个裂解位点被暴露并被宿主蛋白酶裂解，这一过程对病毒感染至关重要(Li,2016)。可溶性ACE2已被证明能与S1亚基结合并阻止病毒进入人类细胞。许多研究已确定，这一病毒进入点与SARS-CoV-2相同，SARS-CoV-2是导致COVID-19的病毒，是一种新出现的全球人类健康威胁，其病例死亡率超过2％(Zhang,2020a；Zhou,2020；Zhu,2020)。此外，SARS-CoV刺突蛋白的结合下调了ACE2在肺部的表达，导致Ang II升高，加剧了ARDS症状(Kuba,2005)。重组ACE2(rACE2)蛋白可以通过与刺突蛋白结合阻止病毒进入细胞，并通过裂解Ang II减轻ARDS症状。因此，rACE2可能在保护ARDS患者方面具有重要地位，也是管理新出现的肺部疾病(如SARS、甲型禽流感感染、Covid-19等)的一种潜在治疗方法(Zou,2014)。

补体系统是宿主防御许多细菌、病毒和真菌感染的关键部分。它与模式识别受体(PRR)一起工作，在激活适应性免疫反应之前刺激宿主防御系统。补体的激活导致一系列蛋白酶激活级联，触发细胞因子的释放和激活级联的放大。对于补体系统，必须在防御病原体和避免过度炎症之间实现微妙的平衡。许多炎症性、自身免疫性、神经退行性和感染性疾病已被证明与过度的补体活性有关。

补体系统可以通过三种不同的途径被激活：经典途径、旁路途径和凝集素途径(Wagner,2010)。所有三种途径都汇聚于分别裂解补体成分C3和C5的C3转化酶和C5转化酶的关键蛋白酶复合物。补体系统的激活导致了细胞杀伤性膜攻击复合物(MAC)的形成、由过敏毒素C3a和C5a引起的炎症以及病原体的调理作用。MAC对于消除入侵的病原体和受损、坏死和凋亡的细胞是必要的。

经典途径是由C1q与抗体IgM或IgG的结合启动的，导致C1复合物的激活，该复合物裂解补体成分C2和C4，形成经典途径的C3转化酶，然后是C5转化酶。

凝集素途径是由甘露糖结合凝集素(MBL)与病原体表面的甘露糖残基结合启动的，这导致形成与经典途径相同的C3转化酶和C5转化酶。

与经典途径和凝集素途径需要抗原的特异性免疫反应不同，旁路途径是一种非特异性免疫反应，在低水平下持续活跃。C3的自发水解导致形成旁路途径的C3转化酶，然后形成旁路途径的C5转化酶。所有三种途径的C5转化酶都可以将C5裂解为C5a和C5b，从而募集和组装C6、C7、C7、C8和多个C9分子以组装MAC。这会在膜上形成洞或孔，可以杀死或破坏病原体或细胞。

补体系统受到衰变加速活性(DAA)和辅因子活性(CA)的严格调节。DAA是指促进C3转化酶或C5转化酶解离的能力。CA是指促进因子I使C3转化酶或C5转化酶失活的能力。有许多补体调节剂对经典或旁路途径表现出DAA或CA。衰变加速因子(DAF)加速经典和旁路C3转化酶的解离。膜辅因子蛋白(MCP)是因子I介导的C3b裂解为iC3b的辅因子。因子H和C4结合蛋白(C4BP)分别对旁路和经典途径的C3转化酶具有DAA，对C3b和C4b的裂解具有CA。人类补体受体1型(CR1)是唯一对经典和旁路C3转化酶和C5转化酶都具有DAA以及对C3b和C4b具有CA的补体调节剂。除了DAA和CA的调节剂外，其他补体调节剂是补体相关蛋白酶抑制剂C1-INH，其抑制C4的裂解和经典C3转化酶的形成；和保护素(CD59)，其直接抑制MAC并防止细胞裂解。

人类CR1是一种大的糖蛋白(～200kD)，由30个重复的同源一致重复短序列(shortconsensus repeats)(SCR，60-70aa)组成，后面是跨膜域和细胞质域。大多数DAA而非CA活性定位至前3个SCR(SCR1-3)(Krych-Goldberg,1999)。其他补体调节蛋白DAF、MCP、因子H和C4BP也含有许多SCR，其中补体抑制的活性位点已通过缺失分析定位至几个SCR(Makrides,1998)。DAF中的SCR2-4结合C3b和C4b，并对C3转化酶具有DAA。MCP中的SCR2-4结合C3b和C4b，并对C3b和C4b具有CA。因子H中的SCR1-4结合C3b，并对C3b具有CA，对旁路C3转化酶具有DAA。C4BPα亚基中的SCR1-3结合C4b，并对C4b具有CA，对经典C3转化酶具有DAA。

人类补体受体1型(CR1)已经引起了治疗应用的兴趣(Krych-Goldberg,2001)。可溶性CR1胞外域被证明体内抑制补体系统(Mollnes,2006)，并在人类临床试验(Perry,1998)、成人呼吸窘迫综合症(Zimmerman,2000)和肺移植(Zamora,1999)中安全且有效地减少心肌梗塞的组织损伤。许多其他补体调节蛋白，例如MCP、DAF和保护素，在体外和各种动物模型中有效地抑制补体(Wagner,2010)。已经用补体调节剂构建数种工程化融合蛋白，以提高功效。MCP与DAF融合生成补体活性阻断剂2(CAB2)。因子H与补体受体2型(CR2)的C3片段结合域融合生成TT30。针对因子B的人源化抗体片段与CR2的C3d结合域融合生成TA106。

针对补体蛋白的单克隆抗体也被用作治疗剂(Ehrnthaller,2011)。抗C5依库珠单抗于2007年被批准用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。针对C5a(TNX-558)、因子D(TNX-234)、因子P和C3b的抗体、人C5的适体抑制剂(ARC1905)和针对C3的13个氨基酸的环肽(康帕他汀)已经被开发出来，并在各种疾病模型和人体临床试验中进行评估(Ricklin,2016；Mastellos,2017；Ricklin,2017；Zipfel,2019)。

具有已知或疑似补体参与的病症涵盖范围异常广泛，包括炎症、自身免疫、年龄相关、生物材料诱导和神经退行性范围的组织特异性、全身性、急性和慢性病症。大量的激活触发因素，如败血症情况下的模式相关分子模式(PAMP)或创伤中的损伤相关分子模式(DAMP)，可导致全身性炎症反应综合征(SIRS)，其中补体和其他防御途径的严重和突然反应导致稳态失衡、超急性炎症和组织损伤，可导致器官功能障碍和死亡。在补体参与的情况下，过多的保护性反应可导致不良后果。在移植诱导和生物材料诱导的炎症中，补体识别暴露于血液或组织液中的非自身表面，并引发适当但不需要的反应。随后的不良反应可能对患者的生活质量和外来成分的寿命和功能产生负面影响，在极端情况下可能导致材料、细胞或器官的排斥。

除了急性发炎性病况，补体还驱动数种慢性病症，如PNH、非典型溶血尿毒综合征(aHUS)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。这些病症中的大多数至少部分是由补体基因和蛋白质的改变(包括突变、多态性、缺失和缺陷)导致的补体激活不平衡而介导的。多态性可导致补体激活剂的功能获得性改变或补体调节剂的功能丧失性改变，并可能损害可溶性补体调节剂(如因子H)的自我识别能力。个体中补体改变的独特组合，有时被称为补体单倍型，往往决定了他或她的补体系统的适应性和他或她对某些疾病的易感性。

补体旨在清除免疫复合物、凋亡细胞和碎片的通常有益行动，当碎片或斑块不能再被清除时可能导致不良反应，从而导致补体持续激活，促成炎症性微环境的形成。这一原理的突出实例是与年龄有关的病症，如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和AMD。此外，由于早期补体成分的缺陷，对凋亡细胞和/或免疫复合物的清除不足，被认为是导致全身性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的关键因素。

肾脏对补体介导的损伤的明显易感性主要归因于其独特的解剖和功能特征，这些特征似乎有利于补体激活。与眼睛类似，眼睛也特别容易受到补体激活不平衡所导致的疾病的影响，肾脏由突出的隔室分隔膜表证，即肾小球基底膜，其缺乏补体调节剂，可能在覆盖细胞层受损时容易受到攻击。补体激活导致了许多肾脏疾病，其中包括：aHUS；C3肾小球病，包括致密物沉积病和C3肾小球肾炎；血液透析和肾移植的并发症；糖尿病肾病；IgA肾病；狼疮肾炎和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎(AAV)。

阻断补体系统已被证明可以减弱SARS-CoV(Gralinski,2018)和MERS-CoV(Jiang,2018)的发病机制。在感染了SARS-CoV MA15的C57BL/6J小鼠的肺部，通过C3裂解测量的补体激活明显升高。缺乏C3(C3-/-)的小鼠免受SARS-CoV诱导的体重减轻，并表现出较少的病理变化，呼吸功能改善，肺部和周围的炎性细胞因子/趋化因子水平降低。C3-/-和野生型小鼠的病毒复制的动力学和幅度是相同的，表明补体在控制病毒复制方面不起作用。SARS-CoV感染小鼠肺部的补体沉积表明，补体激活会导致免疫介导的肺部损伤。此外，血清激活表明，补体介导的全身性炎症可能驱动SARS-CoV感染的致病反应。此外，补体系统在其他肺部疾病中也有明确的作用(Sarma,2006)，特别是在流感病毒和呼吸道合胞病毒感染后(Chang,2010；Thielens,2002；Bera,2011)。重要的是，在用C3a受体(C3aR)拮抗剂或C5a抗体处理的小鼠中，MERS-CoV和H5N1流感病毒引起的急性肺损伤和肺部炎症会减少(Jiang,2018；Sun,2013)。总之，这些结果表明补体在SARS-CoV的发病机制中的关键作用，并表明抑制补体途径可以有效增强冠状病毒介导的疾病的抗病毒治疗。

COVID-19患者的初步病理研究显示，弥漫性肺泡损伤伴有水肿、透明膜和炎症，随后出现II型肺细胞增生，表征典型ARDS的特征(Xu,2020；Zhang,2020b)。COVID-19患者的促炎性细胞因子和趋化因子，包括TNFα、IL-1β、IL-6、G-CSF、IP-10、MCP-1和MIP-1-α都显著升高(Huang,2020；Liu,2020)。重症COVID-19患者的临床观察包括LDH、d-二聚体和胆红素升高；血小板减少；轻度贫血；肾脏和心脏损伤；以及据报道，弥漫性血栓性微血管病(TMA)，与异常凝血和过度补体激活一致(Zhou,2020b)。严重的COVID-19可能定义了一种由补体途径的激活和相关的促凝状态介导的灾难性微血管损伤综合征(Campbell,2020；Magro,2020)。

发现SARS-CoV-1、MERS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白与补体激活的凝集素途径(LP)中的关键丝氨酸蛋白酶MASP-2结合，导致补体激活异常，加重肺部炎症损伤(Gao,2020)。在COVID-19患者中识别到了补体LP途径过度激活的临床证据。在COVID-19患者中还观察到血清C5a水平显著升高，特别是在重症病例中。这些结果共同表明，补体途径在COVID-19患者的肺部被积极激活，这可能归因于SARS-CoV-2N蛋白和MASP-2之间的丰富相互作用(Gao,2020)。补体抑制可能代表了对这些高致病性冠状病毒引起的肺炎的一种有吸引力的常见治疗方法。

由于刺突蛋白对于SARS-CoV-2病毒进入至关重要，因此它已成为疫苗开发和治疗性抗体干预的目标。目前的一套抗体治疗剂和疫苗是用基于2020年大流行早期阶段流行的毒株的刺突蛋白来设计的。最近，在英国(B.1.1.7)、南非(B.1.351)、巴西(B.1.1.248)和其他地方出现了具有增强传播性的变体，其刺突蛋白具有多个替换。几项研究表明，一些抗体和免疫血清对表达刺突基因突变的变体的中和作用减弱(Chen,2021；Wang,2021)。基于可溶性ACE2的诱饵受体有望保持对新出现的SARS-CoV-2变体的中和活性，只要它们继续利用ACE2作为感染的细胞受体。

发明内容

本公开描述了一系列含有人ACE2和补体途径的特异性抑制剂的融合蛋白。这些融合蛋白含有人类蛋白的域并且具有人类序列，因此预期免疫原性低或无免疫原性，可作为人类治疗剂用于治疗ACE2和补体相关疾病。此外，所述融合蛋白由有利于延长血清半衰期的域组成。

本公开还描述了对SARS-CoV-2刺突蛋白具有增强亲和力的人ACE2变体。人ACE2变体包括表1中描述的那些。表1中的变体可用于SEQ ID NO:2、4、6或8的多肽。增强亲和力的ACE2变体可用于治疗患有SARS-CoV-2的受试者。施用这些增强亲和力的ACE2变体可以竞争性地与受试者体内的ACE2结合，从而阻断SARS-CoV-2感染受试者的细胞。

本文所述的多肽可以改善导致许多疾病发病机制的两种主要途径的激活；补体和肾素-血管紧张素-醛固酮系统。本文所述的多肽可以减少这些途径的激活。本文所述的多肽可用于治疗罹患各种慢性纤维化疾病的患者，其中包括特发性肺纤维化、肺动脉高压、充血性心力衰竭、肝脏纤维化疾病和NASH、不同来源的慢性肾脏疾病和进行性系统性硬化症。本文所述的多肽还可用于治疗罹患伴随严重冠状病毒感染的急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的患者，以及患有不同病因(例如败血症、多器官衰竭、肺栓塞等)的ARDS的患者。

编码本文所述多肽的核酸可用于在体外或体内制造这些多肽。

附图说明

图1是融合蛋白的示意图。域ACE2和ACE2V是人ACE2及其肽酶无活性变体(R273K或N374N378)的可溶性胞外域。CID是补体抑制剂。HSA是人白蛋白。Fc是人IgG4 Fc区。TrD是三聚体形成域。

图2是其他融合蛋白的示意图。

图3是纯化的ACE2融合蛋白的SDS-PAGE的描绘。

图4的A和B图显示了ACE2融合蛋白与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。

图5的A-E图显示了ACE2变体融合蛋白与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。

图6A显示了ACE2融合蛋白对经典补体途径的抑制。图6B显示了ACE2融合蛋白对旁路补体途径的抑制。

图7的A-C图显示了ACE2融合蛋白对假型SARS-CoV-2的体外阻断。

具体实施方式

在描述各种实施例之前，应理解，本公开的教导不限于所描述的特定实施例，因此当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求限制。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于本教导的实践或测试，但现在描述一些示例性方法和材料。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指代物。还应注意，权利要求书可以被撰写为排除任何可选的要素。因此，此陈述旨在作为使用如“仅(solely)”、“仅(only)”等与权利要求要素的叙述有关的排他性术语或使用“否定”限制的前题基础。除非上下文另外明确规定，否则关于物质的浓度或水平给出的数值限制是近似的。因此，当浓度表示为(例如)10μg时，意在将所述浓度理解为至少大约或约10μg。

如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见，本文描述和说明的每个单独的实施例都具有分立的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分开或组合，而不偏离本教导的范围或精神。任何叙述的方法都可以按照叙述的事件顺序或逻辑上可行的任何其他顺序进行。

定义

关于本公开，除非另外具体定义，否则本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，以下术语旨在具有以下含义。

如本文所用，术语“氨基酸取代”或“氨基酸差异”被定义为指多肽序列中某一位置处的氨基酸残基相对于参考序列中相应位置处的氨基酸残基的变化。氨基酸差异的位置在本文中一般被称为“Xn”，其中n是指残基差异所依据的参考序列中的相应位置。在本文的大多数情况下，某一位置处的特定氨基酸取代或氨基酸残基差异被表示为“XnY”，其中“Xn”指定如上所述的相应位置，并且“Y”是工程化多肽中发现的氨基酸的单字母标识符(即与参考多肽中不同的残基)。一个以上的氨基酸可以出现在指定的残基位置，替代氨基酸可以XnY/Z的形式列出，其中Y和Z代表替代氨基酸残基。在一些情况下，本公开还提供了由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A是参考序列中残基的单字母标识符，“n”是参考序列中残基位置的编号，B是工程化多肽序列中残基取代的单字母标识符。此外，在一些情况下，本公开的多肽可以包括相对于参考序列的一个或多个氨基酸残基差异，这由相对于参考序列进行改变的指定位置的列表指示。

如本文所用，“抗体”被定义为一种蛋白质，其在功能上定义为配体结合蛋白且在结构上定义为包含被技术人员识别为来源于免疫球蛋白的可变区的氨基酸序列。抗体可以由基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因片段、杂交免疫球蛋白基因(通过结合来自不同动物的遗传信息制成)或合成免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成。公认的原生免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因和多个D区段和J区段。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其又分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体以完整的免疫球蛋白、通过用各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段或通过重组DNA技术制成的各种片段形式存在。抗体可以来源于许多不同的物种(例如兔子、绵羊、骆驼、人类或啮齿动物，如小鼠或大鼠)，或者可以是合成的。抗体可以是嵌合的、人源化的或人源工程化的。抗体可以是单克隆或多克隆、多链或单链、片段或完整免疫球蛋白。

如本文所用，“抗体片段”被定义为完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且指抗原结合域，例如完整抗体的抗原决定可变区，足以赋予抗体片段对目标如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH域以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”被定义为包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。除非说明，否则如本文所用，scFv可以具有按任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

如本文所用，术语“密码子优化”被定义为指将编码蛋白质的多核苷酸的密码子改变为在特定生物体中优先使用的密码子，从而使编码的蛋白质在感兴趣的生物体中有效表达。尽管遗传密码是简并的，因为大多数氨基酸由几个密码子表示，称为“同义(synonyms/synonymous)”密码子，但众所周知，特定生物体的密码子使用是非随机的并偏向于特定的密码子三联体。关于给定基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高表达的蛋白质与低拷贝数的蛋白质以及生物体基因组的聚集蛋白质编码区，这种密码子使用的偏向性可能更高。编码本文所述多肽的多核苷酸可以进行密码子优化，以便从选择表达的宿主生物体中获得最佳产量。

如本文所用，术语“共有序列(consensus sequence)”和“典型序列(canonicalsequence)”被定义为指与特定蛋白质或感兴趣序列的所有变体进行比较的原型氨基酸序列。所述术语还指列出最常存在于感兴趣的DNA序列中的核苷酸的序列。对于基因的每个位置，共有序列给出了在多序列比对(MSA)中该位置处最丰富的氨基酸。

如本文所用，术语“保守氨基酸取代”或“保守氨基酸差异”被定义为指某一残基位置处的氨基酸改变为具有类似侧链的不同残基，因此通常涉及多肽中的氨基酸用相同或类似定义的氨基酸类别中的氨基酸取代。通过举例而非限制，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一种脂肪族氨基酸取代，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸取代，例如丝氨酸和苏氨酸；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸取代，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸取代，例如赖氨酸和精氨酸；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸取代，例如天冬氨酸或谷氨酸；以及疏水或亲水氨基酸分别被另一种疏水或亲水氨基酸取代。下表1中提供了示例性的保守取代。

表1

如本文所用，术语“控制序列”被定义为包括对于本公开的多核苷酸和/或多肽的表达是必要的或有利的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是原生的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录终止信号和适当时的翻译终止信号。控制序列可以具备接头，以便引入特定的限制性位点，促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”可互换使用，并定义为如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物有效实现特定生物学结果的量。

如本文所用，“异源”被定义为指核酸和/或多肽与宿主细胞不同源。或者，“异源”是指核酸或多肽的各部分接合在一起形成组合，其中各部分来自不同的物种，并且所述组合在自然界中未发现。

如本文所用，术语“同源基因”被定义为指彼此对应且彼此相同或相似的一对基因。所述术语涵盖因物种形成(即新物种的发展)而分离的基因(例如直系同源基因)，以及因基因复制而分离的基因(例如旁系同源基因)。

如本文所用，术语“分离的多肽”被定义为指基本上与天然伴随的其他污染物(例如蛋白质、脂质和多核苷酸)分离的多肽。所述术语涵盖已从其天然存在的环境或表达系统(例如宿主细胞或体外合成)中去除或纯化的多肽。

如本文所用，术语“非保守取代”或“非保守氨基酸差异”被定义为指将某一残基位置处的氨基酸改变为具有显著不同侧链特性的不同残基。非保守取代可以使用定义的组别之间而非定义的组别内的氨基酸，并影响(a)取代区域的肽主链结构(例如脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)大部分(the bulk of)的侧链。通过举例而非限制，示例性的非保守取代可以是酸性氨基酸被碱性或脂肪族氨基酸取代；芳香族氨基酸被小氨基酸取代；以及亲水氨基酸被疏水氨基酸取代。

如本文所用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括初级转化细胞和由此产生的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。具有与最初的转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代也包括在内。

如本文所用，术语“可操作地连接”被定义为指一种构型，其中控制序列被适当地放置在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处(即处于一种功能关系)，以便控制序列指导或调控感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。

如本文所用，术语“直系同源物”和“直系同源基因”被定义为指不同物种中的基因，它们通过物种形成从共同的祖先基因(即同源基因)进化而来。通常，直系同源物在进化过程中保留相同的功能。在新测序的基因组中，直系同源物的鉴定可用于对基因功能的可靠预测。

如本文所用，术语“旁系同源物”和“旁系同源基因”被定义为指在基因组内通过复制而相关的基因。一般，旁系同源物往往会演变成新的功能，即使一些功能通常与原始功能有关。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，并且被定义为指共价连接在一起的两个或更多个核苷。多核苷酸可以完全由核糖核苷(即RNA)构成，完全由2'脱氧核糖核苷(即DNA)构成或是核糖核苷和2'脱氧核糖核苷的混合物。虽然核苷通常通过标准磷酸二酯键连接在一起，但多核苷酸可以包括一个或多个非标准键。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以包括单链区域和双链区域。此外，虽然多核苷酸通常由天然存在的编码核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)构成，但它可以包括一个或多个修饰和/或合成的核碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等。优选地，此类修饰或合成的核碱基将是编码核碱基。

如本文所用，术语“启动子序列”被定义为指被宿主细胞识别的核酸序列，用于表达感兴趣的多核苷酸，如编码序列或基因。启动子序列含有转录控制序列，其介导感兴趣的多核苷酸的表达。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂交启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。

如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用，并且被定义为指通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而无关于长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂化、肉豆蔻化、泛素化等)。这一定义中包括D-和L-氨基酸，以及D-和L-氨基酸的混合物。标准的单字母或三字母缩写可用于基因编码的氨基酸(参见例如IUPAC-IUB生物化学命名法联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)，“Nomenclatureand Symbolism for Amino Acids and Peptides,”Eur.J.Biochem.138:9-37,1984)。

如本文所用，术语“重组”或“工程化”或“非天然存在”可互换使用，并且被定义为指修饰的多肽或核酸，所述多肽或核酸以自然界中不存在的方式被修饰，或从合成材料和/或通过使用重组技术的操作而产生或衍生。非限制性实例尤其包括表达在原生(非重组)形式的细胞中未发现的基因或表达以不同水平表达的原生基因的重组细胞。

如本文所用，术语“严格的杂交条件”被定义为指在42℃的温度下在含50％甲酰胺的5XSSC中杂交，并在60℃下在0.2XSSC中洗涤过滤器。(1XSSC是0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠。)严格的杂交条件还涵盖低离子强度和高温洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；用变性剂如甲酰胺进行杂交，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，在42℃下；或50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X邓哈特溶液(Denhardt's solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50pg/ml)、0.1％ SDS和10％硫酸葡聚糖在42℃下,在42℃下在0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)并在55℃下在50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃下用含有EDTA的0.1XSSC组成的高严格度洗涤液洗涤。

如本文所用，术语“基本上纯的多肽”被定义为指其中多肽物种是存在的主要物种的组合物(即以摩尔或重量计，它比组合物中任何其他单独的大分子物种更丰富)，并且当目标物种以摩尔或重量百分比计占存在的大分子物种的至少约50％时，通常是基本上纯的组合物。一般来说，以摩尔或重量百分比计，基本上纯的组合物将包含约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多以及约98％或更多的存在于组合物中的所有大分子物种。目标物种可以被纯化至基本同质(即，通过常规检测方法无法在组合物中检测到污染物物种)，其中组合物基本上由单一大分子物种组成。溶剂物种、小分子(<500道尔顿)和元素离子物种不被视为大分子物种。分离的工程化多肽可以是基本上纯的多肽组合物。

如本文所用，术语“野生型”被定义为指主要在自然界中发现的形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列是主要存在于生物体中的序列，其可以从自然界中的来源分离并且未被人为操作有意地修饰。

ACE2分子

重组ACE2在许多感染疾病、心血管、肾脏和肺部疾病中提供了治疗益处，在这些疾病中，对补体系统的抑制往往是保护性的。本文描述了一系列人ACE2域和补体抑制剂的融合蛋白，其利用两者功能部分在相关疾病中提供最大的治疗益处。特别是在冠状病毒SARS-CoV和SARS-CoV-2感染的情况下，ACE2被病毒刺突蛋白用作细胞表面受体以进入细胞。因此，可溶性ACE2融合蛋白可用作病毒刺突蛋白的诱饵，以阻止细胞进入。

ACE2域可以是全长ACE2胞外域(SEQ ID NO:1-2)或缺失变体(SEQ ID NO:3-4)。它可以保持肽酶活性或无酶活性(SEQ ID NO:5-8)。它可以被工程改造以增强肽酶活性或与冠状病毒刺突蛋白的结合亲和力。它可以是具有不同活性的任何变体。

本发明所述的补体抑制剂可以是任何抑制补体激活的蛋白质或蛋白质片段，如人CR1、DAF、MCP、因子H、C4BP、保护素、C1-INH及其在其他灵长类动物中的对应物的域。特别地，它们可以是人CR1 SCR1-3(SEQ ID NO:9-10)、其变体含有N29K/S37Y/G79D/D109N突变(SEQ ID NO:11-12)、DAF SCR2-4(SEQ ID NO:13-14)、MCP SCR2-4(SEQ ID NO:15-16)、因子H SCR1-4(SEQ ID NO:17-18)或C4BPA SCR1-3(SEQ ID NO:19-20)。其中，因子H SCR1-4是唯一专门针对旁路途径而非经典途径的CID。这些补体抑制剂可以被诱变以增强抑制活性，所有这些改进都属于本发明的范围。补体抑制剂也可以是针对因子B、因子D、因子P、C3或C5的任何肽抑制剂或寡核苷酸抑制剂。它们也可以是任何全长抗体或抗体片段，或抗体可变区(VH或VK)，或由针对因子B、因子D、因子P、C3或C5的抗体衍生的scFv抗体。

此外，ACE2和补体抑制剂的这些融合蛋白与第三部分缀合，以延长体内半衰期。第三部分可以是单体的人血清白蛋白(HSA)、二聚体的免疫球蛋白IgG4Fc或其稳定化和FcγR非结合变体、人胶原蛋白COL18A1三聚体域或任何其他延长体内半衰期的域。Fc域可以来自任何免疫球蛋白同种型、亚类和同种异型。这些融合蛋白也可以聚乙二醇化或与聚合物缀合以增加体内半衰期；或与抗体、抗体片段、Fc区、HSA或其他人类蛋白化学交联以增加体内半衰期；或以任何长期持续释放的形式(例如脂质纳米颗粒等)配制以延长体内ACE2和抗补体活性。

ACE2多肽包括对SARS-CoV-2的刺突蛋白具有增强亲和力的ACE2变体。这些ACE2变体的实例见表1，其中的氨基酸变化可以置于SEQ ID NO:2、4、6和/或8的ACE2多肽中。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:2、4、6和/或8：K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和/或K353H。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个双重氨基酸取代的SEQ ID NO:2、4、6和/或8：K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和/或Q42E/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个三重氨基酸取代的SEQ IDNO:2、4、6和/或8：K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y和/或D30E/Q42K/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个四重氨基酸取代的SEQ ID NO:2、4、6和/或8：K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或K31F/N33D/H34S/E35Q。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个五重氨基酸取代的SEQ ID NO:2、4、6和/或8：K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下七重氨基酸取代的SEQ ID NO:2、4、6和/或8：D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。

ACE2变体可以包括具有以下一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:2：K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和/或K353H。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个双重氨基酸取代的SEQ ID NO:2：K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和/或Q42E/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个三重氨基酸取代的SEQ ID NO:2：K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y和/或D30E/Q42K/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个四重氨基酸取代的SEQ ID NO:2：K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或K31F/N33D/H34S/E35Q。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个五重氨基酸取代的SEQID NO:2：K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下七重氨基酸取代的SEQ ID NO:2：D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:4：K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和/或K353H。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个双重氨基酸取代的SEQ IDNO:4：K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和/或Q42E/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个三重氨基酸取代的SEQ IDNO:4：K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y和/或D30E/Q42K/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个四重氨基酸取代的SEQ ID NO:4：K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或K31F/N33D/H34S/E35Q。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个五重氨基酸取代的SEQ ID NO:4：K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下七重氨基酸取代的SEQ ID NO:4：D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:6：K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和/或K353H。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个双重氨基酸取代的SEQID NO:6：K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和/或Q42E/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个三重氨基酸取代的SEQ ID NO:6：K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y和/或D30E/Q42K/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个四重氨基酸取代的SEQ ID NO:6：K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或K31F/N33D/H34S/E35Q。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个五重氨基酸取代的SEQ ID NO:6：K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下七重氨基酸取代的SEQ ID NO:6：D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:8：K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和/或K353H。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个双重氨基酸取代的SEQ ID NO:8：K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和/或Q42E/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个三重氨基酸取代的SEQ ID NO:8：K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y和/或D30E/Q42K/L79W。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个四重氨基酸取代的SEQ ID NO:8：K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或K31F/N33D/H34S/E35Q。ACE2变体可以包括具有以下一个或多个五重氨基酸取代的SEQ ID NO:8：K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y和/或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。ACE2变体可以包括具有以下七重氨基酸取代的SEQ ID NO:8：D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。

这些ACE2变体可用于治疗感染SARS-CoV-2的受试者。这些ACE2变体还可用于预防性使用，以保护受试者免受SARS-CoV-2感染。这些变体可以与受试者细胞上的ACE2竞争结合于SARS-CoV-2刺突蛋白，因此，ACE2变体可以阻断SARS-CoV-2感染受试者的细胞。

实例1描述了ACE2融合蛋白的构建和表达。人ACE2胞外域的序列示于SEQ ID NO:1-4中，而无酶活性ACE2变体的序列示于SEQ ID NO:5-8中。实例2描述了ACE2和补体抑制剂融合蛋白的构建和表达。人CR1SCR1-3_N29K/S37Y/G79D/D109N的序列示于SEQ ID NO:11-12中。它与实例1中所述的ACE2融合蛋白的C端融合。在实例3所述的直接ELISA结合实验中，测定融合蛋白与SARS-COV2刺突蛋白S1的结合活性。

经典补体途径的抑制活性在实例4中进行了表征，而旁路补体途径的抑制活性在实例5中进行了表征。在实例6利用荧光肽底物评估了融合蛋白的肽酶活性。在实例7中评估了融合蛋白对病毒进入的阻断。

在实例8中确定了融合蛋白的体内药代动力学特征。在实例9-11中对融合蛋白在体内的保护活性进行了表征。

多核苷酸和表达载体

在另一个方面，多核苷酸可以编码本文所述的任何工程化的ACE2分子。示例性ACE2核苷酸见于SEQ ID NO:1、3、5和7(ACE2的相应氨基酸序列见于SEQ ID NO:2、4、6和8)。SEQ ID NO:1编码人野生型ACE2胞外域。SEQ ID NO:3、5和7编码人变异型ACE2胞外域。ACE2核苷酸可以与编码可抑制补体途径的多肽和/或延长融合蛋白在血液和/或血清中的半衰期的多肽的核苷酸接合在一起。这些接合的多核苷酸将编码具有ACE2部分和编码补体抑制蛋白的部分和/或延长血液和/或血清半衰期的多肽部分的融合蛋白。可用于与ACE2部分融合的补体抑制剂包括例如CR1 SCR1-3(SEQ ID NO:9-10)、CR1 SCR1-3N29K/S37Y/G79N/D109N(SEQ ID NO:11-12)、DAF SCR2-4(SEQ ID NO:13-14)、MCP SCR2-4(SEQ ID NO:15-16)、因子H SCR1-4(SEQ ID NO:17-18)和C4BPA SCR1-3(SEQ ID NO:19-20)。可以提高血清和/或血液半衰期的多肽包括例如白蛋白、IgG4 Fc或COL18A1三聚体域。

多核苷酸可以与一个或多个控制基因表达的控制序列可操作地连接，以创建能够表达多肽的重组多核苷酸。含有编码工程化ACE2分子的异源多核苷酸的表达构建体可被引入适当的宿主细胞，以表达相应的ACE2分子。

多核苷酸可以编码工程化ACE2分子，并且可以与选自SEQ ID NO:1、3、5和7的参考序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。多核苷酸可以编码工程化ACE2分子，并且可以在严格的杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、3、5和7之一的序列或其互补序列的核酸杂交。编码ACE2分子融合伴侣的多核苷酸可以与选自SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23或25的参考序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。多核苷酸可以编码工程化ACE2分子，并且可以在严格的杂交条件下与具有SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23或25之一的序列或其互补序列的核酸杂交。

多核苷酸可以进行密码子优化，以匹配生产蛋白质的宿主细胞。例如，用于细菌的优选密码子用于在细菌中表达基因；用于酵母的优选密码子用于在酵母中表达；用于哺乳动物的优选密码子用于在哺乳动物细胞中表达。

控制序列可以尤其包括启动子、增强子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。其他控制序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

可以基于所使用的宿主细胞来选择合适的启动子。对于细菌宿主细胞，用于引导本公开的核酸构建体转录的合适启动子包括从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因以及原核生物β-内酰胺酶基因获得的启动子、tac启动子或T7启动子。

丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的启动子(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂交)及其突变、截短和杂交启动子。示例性酵母细胞启动子可以来自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。

昆虫细胞的示例性启动子尤其包括基于多角体、PCNA、OplE2、OplE1、果蝇金属硫蛋白和果蝇肌动蛋白5C的启动子。在一些实施例中，昆虫细胞启动子可以与杆状病毒载体一起使用。

植物细胞的示例性启动子尤其包括基于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S、多聚泛素基因(PvUbi1和PvUbi2)的启动子、水稻(Oryza sativa)肌动蛋白1(OsAct1)和肌动蛋白2(OsAct2)启动子、玉米泛素1(ZmUbi1)启动子和多个水稻泛素(RUBQ1、RUBQ2、rubi3)启动子。

哺乳动物细胞的示例性启动子尤其包括CMV IE启动子、延伸因子1α亚基启动子、泛素C启动子、猿猴病毒40启动子和磷酸甘油酸激酶1启动子。

控制序列也可以是合适的前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5'端可操作地连接。可以使用在所选宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

控制序列也可以是多腺苷酸化序列，所述序列与核酸序列的3'端可操作地连接，并且当转录时，被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷酸残基的信号。在所选宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列都可以在本文中使用。

控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，并引导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列的编码序列的5'端可以固有地含有信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区区段在翻译阅读框中天然连接。或者，编码序列的5'端可以含有对编码序列来说是外来的信号肽编码区。任何引导所表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本公开。

控制序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽被称为前酶或前多肽(或在一些情况下为酶原)。前多肽可以通过催化或自催化裂解来自前多肽的前肽而转化为成熟的活性多肽。当信号肽区和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区位于多肽的氨基末端旁边，而信号肽区位于前肽区的氨基末端旁边。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别为终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3'端可操作地连接。可以使用在所选宿主细胞中具有功能的任何终止子。

还可能需要添加调控序列，其允许相对于宿主细胞的生长调控多肽的表达。调控系统的实例是那些使基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而打开或关闭的系统。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中，合适的调控系统包括例如ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调控序列包括TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。

在另一个方面，本公开还涉及一种重组表达载体，其包含编码本文所述多肽的多核苷酸和一个或多个表达调控区，如启动子和终止子、复制起点等，这取决于它们将被引入的宿主类型。

表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何保证自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时，被整合到基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，它们共同含有要引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。表达载体可以在宿主细胞中以单个拷贝存在，或保持较高的拷贝数，例如低拷贝数可达4，高拷贝数可达50或更多。

在一些实施例中，表达载体含有一个或多个可选标记，其允许选择转化细胞。可选标记是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养等。细菌可选标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素(实例1)或四环素抗性的标记。适用于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等效物。用于曲霉细胞的实施例包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。

宿主细胞

宿主细胞可以是例如细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。示例性原核宿主细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科，如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公开可用的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌纲(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如地衣芽孢杆菌41P)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是说明性的而非限制性的。菌株W3110是一种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组多核苷酸产物发酵的常见宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以对菌株W3110进行修饰以在编码宿主内源性多肽的基因中实现基因突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT kan'；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvG kan'；大肠杆菌W3110菌株40B4，其为具有非卡那霉素抗性的degP缺失突变的菌株37D6；以及具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反应也是合适的。

真核微生物可用于表达。真核微生物如丝状真菌或酵母是多肽编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母是一种常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、华尔迪克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养型酵母在本文中是合适的并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，所述酵母选自汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。酵母属是优选的酵母宿主，其中合适的载体视需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。通常的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

除了微生物，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和生产如本文所述的多肽，并且在一些情况下是优选的(参见Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。对于一些实施例，真核细胞可能是优选的，因为在本领域已经开发了许多能够分泌异源多肽(例如完整免疫球蛋白)的合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选地，骨髓瘤细胞系，或转化的B细胞或杂交瘤。哺乳动物宿主细胞可以是CHO细胞。

其他有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚胎肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12系)；小鼠支持细胞；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。

药物组合物

本发明的药物组合物可包含如本文所述的ACE2分子，结合一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。

药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由临床试验确定。

合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员所熟知的。药学上可接受的赋形剂的实例包括磷酸盐缓冲盐水(例如0.01M磷酸盐、0.138M NaCl、0.0027M KC1，pH 7.4)、含有如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐等无机酸盐的水溶液、盐水、乙二醇或乙醇的溶液以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。还可以使用辅助剂/佐剂，如润湿剂或乳化剂，以及pH缓冲剂。可以适当地使用在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)(其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中描述的药学上可接受的赋形剂。组合物可被配制成适合肠胃外施用的已知形式，例如注射或输注。组合物可包含制剂添加剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及用于延长储存期间有效期限的保鲜剂。

受试者组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、鼻内、动脉内、瘤内、进入传入淋巴管、静脉内(i.v.)注射或腹腔内施用于患者。在一个方面，ACE2分子组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一个方面，ACE2分子组合物是通过静脉内注射施用。

从下面的实验细节将更好地理解本文公开的发明。不过，本领域技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对所附权利要求书更全面描述的本发明的说明。除非另有说明，本公开不限于特定的程序、材料等，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的。

实例

实例1ACE2融合(AF)蛋白的表达

合成人ACE2胞外域的cDNA并与HSA、人免疫球蛋白Fc域或人胶原蛋白三聚体域(AF-1、AF-3或AF-5，图1)融合。ACE2可能是无酶活性的变体ACE2V(AF-2、AF-4或AF-6，图1)。融合蛋白在hEF1α启动子的控制下被克隆到哺乳动物表达载体中。可以在域之间插入接头。载体含有用于哺乳动物细胞选择的嘌呤霉素抗性基因和用于大肠杆菌繁殖的氨苄青霉素抗性基因。所有融合蛋白在N端都含有信号肽，用于从细胞中分泌出来。表达载体质粒用于瞬时转染100ml的293细胞。72小时后收获培养基并纯化融合蛋白。

多种人ACE2胞外域(ECD)已被生产为Fc融合蛋白。LB701含有全长ACE2 ECD(SEQID NO 2)；LB664含有具有缺失的ACE2 ECD(SEQ ID NO 4)；LB666含有无酶活性的ACE2(H374N/H378N)(SEQ ID NO 8)。它们在293细胞中瞬时转染或在CHO细胞中稳定转染后通过蛋白A色谱法纯化。纯化的LB664和LB664显示在图3中。

从公布的晶体结构(Lan 2020,Shang 2020,Yan 2020)中识别对ACE2和SARS-CoV-2刺突蛋白的结合很重要的氨基酸残基。在LB664中引入了预测会增强刺突蛋白结合的点突变，以制备LB697载体，其将ACE2变体表达为Fc融合蛋白。在表征单个突变的结合特性后，在ACE2-Fc中产生了多个突变(表2)。LB801、LB802、LB803、LB804、LB805和LB806分别含有全长ACE2 ECD(SEQ ID NO 2)和D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、K31F_N33D_H34S_E35Q、D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y和D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y突变。

表2产生和表征的ACE2-Fc变体

实例2ACE2和补体抑制剂融合(ACF)蛋白的表达

合成人CR1 SCR1-3 N29K/S37Y/G79D/D109N的cDNA，并在AF-1-6的C端融合以制备ACF-1-6(图2)。可以在CR1域之前插入接头。载体含有用于哺乳动物细胞选择的嘌呤霉素抗性基因和用于大肠杆菌繁殖的氨苄青霉素抗性基因。所有融合蛋白在N端都含有信号肽，用于从细胞中分泌出来。表达载体质粒用于瞬时转染100ml的293细胞。72小时后收获培养基并纯化融合蛋白。

已经生产了多种ACF融合蛋白。LB669含有具有缺失的功能性ACE2ECD(SEQ ID NO4)；LB683含有无酶活性的ACE2(H374N/H378N)(SEQ ID NO8)；LB684含有无酶活性的ACE2(R514Q)(SEQ ID NO 6)。CIDv9域也在LB664中的ACE2-Fc的N端处融合以制备LB685。LB771和LB772分别含有具有缺失的功能性ACE2 ECD(SEQ ID NO 4)以及亲和力增强的D30E/L79W/N330Y和D30E/Q42K/L79W/N330Y突变；LB833、LB834和LB835分别含有全长ACE2 ECD(SEQ ID NO 2)以及T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y和D30E/Q42K/L79W/N330Y突变。它们在293细胞中瞬时转染或在CHO细胞中稳定转染后通过蛋白A色谱法纯化。纯化的LB669、LB683和LB685显示在图3中。

实例3ACE2融合蛋白与SARS-COV-2刺突蛋白的体外结合

可溶性ACE2融合蛋白AF和ACF与SARS-COV-2刺突蛋白的S1域结合的能力是在功能性ELISA中确定的。简而言之，将刺突蛋白S1域(Sino Biological)以2.5μg/mL涂布于标准ELISA板上，然后在4℃下培育过夜。各孔在室温下阻断一小时。将ACE2融合蛋白的稀释液加入板中，并在37℃下培育一小时。洗涤各孔，使用多克隆山羊抗ACE2 IgG(R&D Systems)检测结合的ACE2融合蛋白，并用HRP标记的驴抗山羊IgG报告。洗涤后，加入TMB试剂(Sigma)并在读板器中测量450nm处的OD吸收。

将SARS-CoV2刺突蛋白(2μg/ml)涂布于ELISA板。用1％ BSA阻断后，在ELISA板中加入从20μg/ml开始的3倍稀释系列的LB664、LB666、LB669和LB683。洗涤后，用抗人Fc HRP检测结合的ACE2融合蛋白。所有4种ACE2融合蛋白都对刺突蛋白表现出相似的结合亲和力(图4A)。在单独的ELISA测定中，LB669和LB685表现出相似的结合活性(图4B)。对ACE2变体(表2)的结合活性进行了类似的表征，并与LB664进行比较。K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、Q42K、L79W、G352Y、N330Q和N330Y的单个突变增强了与SARS-CoV2刺突蛋白的结合(图5A-D)。包括K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W和Q42K/L79W在内的一些双重突变也增强了结合活性(图5E)。多个ACE2变体与SARS-CoV2刺突蛋白的RBD域的结合动力学在Octet上进行了表征(表3)。具有四重突变D30E/Q42K/L79W/N330Y的ACE2-Fc表现出最高的亲和力，为0.91nM。在全长ACE2 ECD中含有D30E/Q42K/L79W/N330Y突变(SEQ ID NO 2)的LB801对SARS-CoV2刺突蛋白的结合亲和力高于LB697-D30E/Q42K/L79W/N330Y，其含有ACE2ECD的C端缺失(SEQ ID NO 4)(图5F)。LB802-805也表现出强大的结合亲和力(图5F)。

表3 工程化ACE2-Fc变体的结合动力学

	KD(nM)	Kon(1/Ms)	Koff(1/s)
				LB664	31.8	3.85E+05	1.22E-02
LB697-L79W	8.52	7.21E+05	6.14E-03
				LB697-D30E/L79W	4.91	7.27E+05	3.57E-03
LB697-D30E/L79W/N330Y	1.49	8.08E+05	1.20E-03
				LB697-D30E/Q42K/L79W/N330Y	0.91	8.10E+05	7.40E-04

实例4 ACF对经典补体途径的抑制

经典途径活性CH50测定(Kabat,1961)测量样品溶解50％涂有抗红细胞抗体(EA，抗体致敏的绵羊红细胞，Complement Technology)的绵羊红细胞标准悬浮液的能力。首先确定在37℃下培育1小时后溶解90％1×10E7 EA/mL的正常人血清(ComplementTechnology)的稀释度。所述测定在含有0.15mM CaCl₂和0.5mM MgCl₂的GVB⁺⁺缓冲液(0.1％明胶、5mM Veronal、145mM NaCl、0.025％NaN₃，pH 7.3)中进行。通过在37℃下将应溶解90％ EA的正常人血清稀释液与0-500nM的测试蛋白混合1小时来激活经典补体途径的抑制。然后在血清和EA培育1小时后，通过测量541nm处的OD来测定EA的溶血。LB669表现出对经典补体途径的有效抑制，EC50为～0.1μg/ml(图6A)。

实例5ACF对旁路补体途径的抑制

与经典补体途径相反，旁路补体途径的激活仅需要镁离子而不需要钙离子。因此，上述测定被修改为含有5mM Mg²⁺和5mM EGTA，后者优先螯合钙离子。对于该测定，在37℃下培育30分钟后，首先确定溶解90％1.25×10E7兔红细胞/毫升(Er,ComplementTechnology)的正常人血清(Complement Technology)的稀释度。所述测定在含有5mMMgCl₂和5mM EGTA的GVB⁰缓冲液(0.1％明胶、5mM Veronal、145mM NaCl、0.025％ NaN₃，pH7.3)中进行。通过在37℃下将应溶解90％ Er的正常人血清稀释液与0-500nM的测试蛋白混合1小时来启动旁路补体途径的抑制。然后在血清和Er培育30分钟后，通过测量412nm处的OD来测定Er的溶血。LB669表现出对旁路补体途径的强大抑制，EC50为～13.1μg/ml(图6B)。

实例6 ACE2融合蛋白的肽酶活性的表征

ACE2融合蛋白的肽酶活性通过使用合成ACE2底物Mca-APK(Dnp)(Enzo LifeSciences)的荧光测定来评估。所述测定在室温下进行，并通过测量底物水解时荧光的增加(激发1/4 340nm，发射1/4 430nm)在读板器中进行连续监测。初始速度由0-60分钟时间内荧光增加的线性速率来确定。反应产物通过使用Mca的标准溶液进行量化。

LB664、LB666、LB669和LB683的肽酶活性是以重组ACE2(R&Dsystem)作为阳性对照来评估的。LB664和LB669表现出与阳性对照相似的活性，而LB666和LB683则如预期的那样无酶活性(表4)。所有亲和力增强的ACE2变体对SARS-CoV2刺突蛋白的酶活性也得到了证实。

表4ACE2融合蛋白的肽酶活性

实例7抑制假型病毒进入模型中的病毒感染

使用假型SARS-CoV-2S病毒粒子和VeroE6细胞评估ACF阻断病毒进入的能力，已知所述细胞表达ACE2并支持SARS-CoV和SARS-CoV-2复制。

基于MLV的SARS-CoV-2S假型是按照Millet和Whittaker,2016年的描述制备的。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)与S编码质粒、MLV Gag-Pol包装构建体和编码荧光素酶报告基因的MLV转移载体共转染HEK293T细胞。细胞在37℃下用转染培养基培育5小时。然后将细胞用DMEM洗涤两次，接着加入含有10％ FBS的DMEM并培育60小时。然后收获上清液并通过0.45um的膜过滤，使用30kDa的截止膜在3,000rpm下离心10分钟来浓缩，然后在-80℃下冷冻。

VeroE6细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和1％ PenStrep的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)中培养。将VeroE6细胞以0.3×10E6的密度接种到12孔板中，并在37℃下培养16小时。在用DMEM洗涤三次后，将20uL浓缩的假病毒加入孔中。在一些实验中，在与假病毒一起培育之前或期间加入ACF。2-3小时后，向细胞中加入含有20％ FBS和2％PenStrep的DMEM，然后培养48小时。在48小时感染后，向细胞中加入One-Glo-EX(Promega)，在黑暗中培育10分钟，然后在EnVision MultiLabel Reader(Perkin Elmer)上读取发光。结果表明，病毒进入受到各种ACF的抑制。

假型SARS-CoV2是用表达荧光素酶报告基因的慢病毒表达载体LB686和表达SARS-CoV2刺突蛋白的LB733构建的。将LB686、LB733和慢病毒包装载体共转染于HEK293细胞中。4天后收获慢病毒，并用于感染表达人ACE2的HEK293细胞。2天后通过测定细胞裂解物中的荧光素酶活性来表征感染活性。为了测试ACE2融合蛋白对病毒感染的阻断活性，在感染前将它们与病毒预混合。LB664以中等活性抑制假型SARS-CoV2感染，EC50为5-10μg/ml。ACE2融合体LB697-EW(D30E/L79W)、LB697-KW(Q42K/L79W)、LB697-EKWY(D30E/Q42K/L79W/N330Y)的高亲和力变体表现出更高的阻断活性，EC50分别为～1、3、0.3μg/ml(图7A)。具有全长ECD的ACE2变体表现出更好的病毒感染阻断活性(图7B)。

用慢病毒表达系统类似地产生具有南非变体501Y.v2的刺突蛋白的假型SARS-CoV2。将刺突蛋白克隆到表达载体LB798中。将LB686、LB798和慢病毒包装载体共转染于HEK293细胞中。4天后收获慢病毒，并用于感染表达人ACE2的HEK293细胞。ACE2融合蛋白表现出有效的病毒感染阻断活性(图7C)。

实例8ACF在小鼠中的药代动力学评估

10mg/kg的ACF通过静脉内注射施用于小鼠。在注射后的不同时间点采集血清样本，直至15天。血清样本中融合蛋白的浓度用夹心ELISA测定法测定。

实例9在酸诱导的ALI模型中表征ACF的保护活性

小鼠吸酸，模拟人类急性肺损伤/ARDS，导致肺功能迅速受损，通过肺弹性(衡量每单位体积变化所达到的压力变化，代表肺的硬度)增加，血氧合减少和肺水肿发展来评估。在酸诱导的ALI模型中评估ACF的保护活性。

3月龄小鼠用氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)腹膜内麻醉，切开气管并用容量控制恒流呼吸机(Voltek Enterprises)通气。进行容量补充操作(volumerecruitment manoeuvre)(VRM)(25cmH₂O，3秒)以标准化容量历史，并将测量结果作为基线。在酸滴注前30分钟，给小鼠施用各种ACF。在气管内滴注HC1(pH＝1.5；2ml/kg)后，接着进行VRM(35cmH₂O，3秒)，给动物通气3小时(F_IO₂ 1.0)。盐水处理组充当对照。

在通气期间，每隔30分钟分别在呼气和吸气阻塞结束时测量总PEEP(PEEPt)和平线区压力(Pplat)，并将弹性计算为Pplat-PEEPt)/V_T。在通气结束时，对左肺进行取样以测量肺湿/干质量比或在液氮中快速冷冻以进行后续生化分析，而右肺固定在10％缓冲福尔马林中进行组织学检查。

在实验结束时，从左心室获得血液样本并测量PaO₂(Ciba-Corning 248型)以评估动脉血氧合作为呼吸衰竭的指标。为了评估肺水肿，计算肺湿/干重量比。简而言之，从切除的肺排出血液后，测量肺湿重。然后将肺在重力对流烘箱中加热至65℃持续24小时，并进行称重以确定基线肺干质量水平。通过测量伊文思蓝(Evans Blue)的肺外渗来评估肺血管渗透性。在3小时通气期结束时，将伊文思蓝(20mg/g)注射至颈静脉。注射伊文思蓝十分钟后，处死动物。接着用冰冷的PBS灌注肺，然后将肺组织用于测定伊文思蓝的含量。

实例10在SARS-CoV感染模型中表征ACF的保护活性

C57BL/6J(Jackson Laboratories)小鼠(10至11周龄)用氯胺酮-甲苯噻嗪的混合物麻醉，鼻内接种50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)或10E5 PFU的在PBS中稀释的SARS-CoV。监测小鼠的疾病迹象并每隔24小时称重一次。在感染后3、12、24、48和72小时处死小鼠，以评估病毒复制、肺病理和补体激活。在病毒接种前、接种时和/或接种后的不同时间给予ACF(例如0.5-50mg/kg的范围)。

对于每只小鼠，将肺样品称重并在五体积的PBS中均质化，得到20％的溶液。将溶液在气溶胶密封下在台式离心机中以13,000rpm离心5分钟。将澄清的上清液在PBS中连续稀释，并将200uL各稀释液应用于六孔板中的单层Vero E6细胞。在37℃下培育1小时后，用含有0.8％琼脂糖的培养基覆盖细胞。两天后，用中性红对板进行染色，并对斑块进行计数。

从尸检中获得的多个组织在10％的缓冲福尔马林中固定72小时，转移到70％的乙醇中，然后进行石蜡包埋。对经常规苏木精和伊红染色的脱蜡切片进行组织病理学评估。组织学显示，当向小鼠给予ACF时，病毒感染后肺和其他组织的损伤减少。

使用比色间接免疫碱性磷酸酶方法和兔抗SARS-CoV核衣壳蛋白抗体(Imgenex)对SARS-CoV进行免疫组织化学(IHC)测试。结果表明，SARS-CoV核衣壳蛋白的水平较低，表明在感染前或感染后用ACF处理的小鼠的病毒复制较低。

对SARS-CoV或模拟感染小鼠的肺切片进行染色，看是否存在C3。在感染10E5 PFU病毒后1、2、4和7天，对20周龄小鼠的肺样本进行测试。使用山羊抗小鼠C3初级抗体(MPBiomedicals)进行染色。在用ACF处理的小鼠中，补体激活被减弱。

实例11在鼠冠状病毒感染模型中表征ACF的保护活性

通过标准方法产生在CAG启动子控制下表达人ACE2(huACE2)的转基因小鼠。麻醉的huACE2转基因小鼠及其非转基因同窝小鼠在8至20周龄时，通过鼻内(i.n.，50uL生理盐水)途径接种1X10E3至5X10E5 TCID50的SARS-CoV在Vero细胞中的第2代Urbani株。在感染时或感染后的不同时间给予各种剂量的ACF(例如0.5-50mg/kg的范围)。每天对动物进行称重并观察疾病和死亡的迹象。受感染小鼠在接种后的不同时间间隔被处死。

将肺组织称重并使用TissueLyser(Qiagen)在含有10％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质化。所得的10％组织悬浮液通过离心澄清，并使用Vero E6细胞通过标准感染性测定进行病毒滴定。各样本的病毒滴度表达为TCID50每g样本。结果表明，用ACF处理的小鼠的病毒复制减弱。

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen Sciences)在感染后的不同时间间隔从受感染小鼠的组织中分离总RNA。用DNase I去除污染的基因组DNA。通过定量实时RT-PCR(qRT-PCR)分析扩增RNA，以评估SARS-CoV特异性亚基因组mRNA 1和mRNA 5的表达。使用以下引物和检测探针：对于mRNA 5，正向，5'-AGGTTTCCTATTCCTAGCCTGGATT，反向，5'-AGAGCCAGAGGAAAACAAGCTTTAT，其中5'-ACCTGTTCCGATTAGAATAG作为检测探针；对于mRNA 1，正向，5'-TCTGCGGATGCATCAACGT，反向，5'-TGTAAGACGGGCTGCACTT，其中5'-CCGCAAACCCGTTTAAA作为检测探针。选定的引物组和18S rRNA的Taq-Man探针(AppliedBiosystems)用作内源性对照。为了进行扩增反应，将每个采样时间点的80ng RNA转移到不同的试管中，通过使用TaqMan一步式RT-PCR预混试剂盒(Applied Biosystems)，分别对目标基因和内源性对照(18S rRNA)进行扩增。循环参数如下：在48℃下逆转录30分钟，在95℃下AmpliTaq激活10分钟，在95℃下变性15秒，在60℃下退火/延伸1分钟。在ABI PRISM 7700实时热循环仪(Applied Biosystems)上按照制造商的说明进行总共40个循环。C0值随着感染后时间的增加而降低，表明病毒滴度增加。用ACF治疗小鼠会减少病毒在小鼠宿主体内的复制，这反映在感染后更高的C0值上。

从尸检中获得的多个组织在10％的缓冲福尔马林中固定72小时，转移到70％的乙醇中，然后进行石蜡包埋。对经常规苏木精和伊红染色的去石蜡切片进行组织病理学评估。组织学显示，当向小鼠给予ACF时，病毒感染后肺和其他组织的损伤减少。

使用比色间接免疫碱性磷酸酶方法和兔抗SARS-CoV核衣壳蛋白抗体(Imgenex)对SARS-CoV进行免疫组织化学(IHC)测试。结果表明，SARS-CoV核衣壳蛋白的水平较低，表明在感染前或感染后用ACF治疗的小鼠的病毒复制较低。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等同物。这些等同物旨在被所附权利要求所涵盖。

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本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请都以其全文形式被援引加入本文。应当理解，所公开的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明仅受所附权利要求的限制。

序列

SEQ ID NO:1(核酸)和SEQ ID NO:2(氨基酸)：人ACE2胞外域

SEQ ID NO:5(核酸)和SEQ ID NO:6(氨基酸)：人ACE2胞外变体

SEQ ID NO:7(核酸)和SEQ ID NO:8(氨基酸)：人ACE2胞外变体

SEQ ID NO:9(核酸)和SEQ ID NO:10(氨基酸)：人CR1 SCR1-3

SEQ ID NO:11(核酸)和SEQ ID NO:12(氨基酸)：人CR1

SCR1-3_N29K/S37Y/G79N/D109N

SEQ ID NO:13(核酸)和SEQ ID NO:14(氨基酸)：DAF SCR2-4

SEQ ID NO:15(核酸)和SEQ ID NO:16(氨基酸)：MCP SCR2-4

SEQ ID NO:17(核酸)和SEQ ID NO:18(氨基酸)：因子H SCR1-4

SEQ ID NO:19(核酸)和SEQ ID NO:20(氨基酸)：C4BPA SCR1-3

SEQUENCE LISTING （序列表）

<110> Larix Bioscience LLC

<120> Bispecific and Trispecific Functional Molecules of ACE2 and

Complement Pathways and Their Use （ACE2和补体途径的双特异性和三特异性功能分子及其用途）

<130> LRX.0012

<150> 62/992,910

<151> 2020-03-21

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2169

<212> DNA

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 1

cagtccacca ttgaggaaca ggccaagaca tttttggaca agtttaacca cgaagccgaa 60

gacctgttct atcaaagttc acttgcttct tggaattata acaccaatat tactgaagag 120

aatgtccaaa acatgaataa tgctggggac aaatggtctg cctttttaaa ggaacagtcc 180

acacttgccc aaatgtatcc actacaagaa attcagaatc tcacagtcaa gcttcagctg 240

caggctcttc agcaaaatgg gtcttcagtg ctctcagaag acaagagcaa acggttgaac 300

acaattctaa atacaatgag caccatctac agtactggaa aagtttgtaa cccagataat 360

ccacaagaat gcttattact tgaaccaggt ttgaatgaaa taatggcaaa cagtttagac 420

tacaatgaga ggctctgggc ttgggaaagc tggagatctg aggtcggcaa gcagctgagg 480

ccattatatg aagagtatgt ggtcttgaaa aatgagatgg caagagcaaa tcattatgag 540

gactatgggg attattggag aggagactat gaagtaaatg gggtagatgg ctatgactac 600

agccgcggcc agttgattga agatgtggaa catacctttg aagagattaa accattatat 660

gaacatcttc atgcctatgt gagggcaaag ttgatgaatg cctatccttc ctatatcagt 720

ccaattggat gcctccctgc tcatttgctt ggtgatatgt ggggtagatt ttggacaaat 780

ctgtactctt tgacagttcc ctttggacag aaaccaaaca tagatgttac tgatgcaatg 840

gtggaccagg cctgggatgc acagagaata ttcaaggagg ccgagaagtt ctttgtatct 900

gttggtcttc ctaatatgac tcaaggattc tgggaaaatt ccatgctaac ggacccagga 960

aatgttcaga aagcagtctg ccatcccaca gcttgggacc tggggaaggg cgacttcagg 1020

atccttatgt gcacaaaggt gacaatggac gacttcctga cagctcatca tgagatgggg 1080

catatccagt atgatatggc atatgctgca caaccttttc tgctaagaaa tggagctaat 1140

gaaggattcc atgaagctgt tggggaaatc atgtcacttt ctgcagccac acctaagcat 1200

ttaaaatcca ttggtcttct gtcacccgat tttcaagaag acaatgaaac agaaataaac 1260

ttcctgctca aacaagcact cacgattgtt gggactctgc catttactta catgttagag 1320

aagtggaggt ggatggtctt taaaggggaa attcccaaag accagtggat gaaaaagtgg 1380

tgggagatga agcgagagat agttggggtg gtggaacctg tgccccatga tgaaacatac 1440

tgtgaccccg catctctgtt ccatgtttct aatgattact cattcattcg atattacaca 1500

aggacccttt accaattcca gtttcaagaa gcactttgtc aagcagctaa acatgaaggc 1560

cctctgcaca aatgtgacat ctcaaactct acagaagctg gacagaaact gttcaatatg 1620

ctgaggcttg gaaaatcaga accctggacc ctagcattgg aaaatgttgt aggagcaaag 1680

aacatgaatg taaggccact gctcaactac tttgagccct tatttacctg gctgaaagac 1740

cagaacaaga attcttttgt gggatggagt accgactgga gtccatatgc agaccaaagc 1800

atcaaagtga ggataagcct aaaatcagct cttggagata aagcatatga atggaacgac 1860

aatgaaatgt acctgttccg atcatctgtt gcatatgcta tgaggcagta ctttttaaaa 1920

gtaaaaaatc agatgattct ttttggggag gaggatgtgc gagtggctaa tttgaaacca 1980

agaatctcct ttaatttctt tgtcactgca cctaaaaatg tgtctgatat cattcctaga 2040

actgaagttg aaaaggccat caggatgtcc cggagccgta tcaatgatgc tttccgtctg 2100

aatgacaaca gcctagagtt tctggggata cagccaacac ttggacctcc taaccagccc 2160

cctgtttcc 2169

<210> 2

<211> 723

<212> PRT

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 2

Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn

1 5 10 15

His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn

20 25 30

Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala

35 40 45

Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln

50 55 60

Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser

85 90 95

Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr

100 105 110

Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu

115 120 125

Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg

130 135 140

Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg

145 150 155 160

Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala

165 170 175

Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val

180 185 190

Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp

195 200 205

Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His

210 215 220

Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser

225 230 235 240

Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg

245 250 255

Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro

260 265 270

Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln

275 280 285

Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro

290 295 300

Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly

305 310 315 320

Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys

325 330 335

Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe

340 345 350

Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr

355 360 365

Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His

370 375 380

Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His

385 390 395 400

Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu

405 410 415

Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr

420 425 430

Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys

435 440 445

Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys

450 455 460

Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr

465 470 475 480

Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile

485 490 495

Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu

500 505 510

Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser

515 520 525

Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly

530 535 540

Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys

545 550 555 560

Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr

565 570 575

Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp

580 585 590

Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys

595 600 605

Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr

610 615 620

Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys

625 630 635 640

Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala

645 650 655

Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys

660 665 670

Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg

675 680 685

Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser

690 695 700

Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro

705 710 715 720

Pro Val Ser

<210> 3

<211> 1794

<212> DNA

<213> Artificial Sequence （人工序列）

<220>

<223> ACE2 Variant （ACE2变体）

<400> 3

cagtccacca ttgaggaaca ggccaagaca tttttggaca agtttaacca cgaagccgaa 60

gacctgttct atcaaagttc acttgcttct tggaattata acaccaatat tactgaagag 120

aatgtccaaa acatgaataa tgctggggac aaatggtctg cctttttaaa ggaacagtcc 180

acacttgccc aaatgtatcc actacaagaa attcagaatc tcacagtcaa gcttcagctg 240

caggctcttc agcaaaatgg gtcttcagtg ctctcagaag acaagagcaa acggttgaac 300

acaattctaa atacaatgag caccatctac agtactggaa aagtttgtaa cccagataat 360

ccacaagaat gcttattact tgaaccaggt ttgaatgaaa taatggcaaa cagtttagac 420

tacaatgaga ggctctgggc ttgggaaagc tggagatctg aggtcggcaa gcagctgagg 480

ccattatatg aagagtatgt ggtcttgaaa aatgagatgg caagagcaaa tcattatgag 540

gactatgggg attattggag aggagactat gaagtaaatg gggtagatgg ctatgactac 600

agccgcggcc agttgattga agatgtggaa catacctttg aagagattaa accattatat 660

gaacatcttc atgcctatgt gagggcaaag ttgatgaatg cctatccttc ctatatcagt 720

ccaattggat gcctccctgc tcatttgctt ggtgatatgt ggggtagatt ttggacaaat 780

ctgtactctt tgacagttcc ctttggacag aaaccaaaca tagatgttac tgatgcaatg 840

gtggaccagg cctgggatgc acagagaata ttcaaggagg ccgagaagtt ctttgtatct 900

gttggtcttc ctaatatgac tcaaggattc tgggaaaatt ccatgctaac ggacccagga 960

aatgttcaga aagcagtctg ccatcccaca gcttgggacc tggggaaggg cgacttcagg 1020

atccttatgt gcacaaaggt gacaatggac gacttcctga cagctcatca tgagatgggg 1080

catatccagt atgatatggc atatgctgca caaccttttc tgctaagaaa tggagctaat 1140

gaaggattcc atgaagctgt tggggaaatc atgtcacttt ctgcagccac acctaagcat 1200

ttaaaatcca ttggtcttct gtcacccgat tttcaagaag acaatgaaac agaaataaac 1260

ttcctgctca aacaagcact cacgattgtt gggactctgc catttactta catgttagag 1320

aagtggaggt ggatggtctt taaaggggaa attcccaaag accagtggat gaaaaagtgg 1380

tgggagatga agcgagagat agttggggtg gtggaacctg tgccccatga tgaaacatac 1440

tgtgaccccg catctctgtt ccatgtttct aatgattact cattcattcg atattacaca 1500

aggacccttt accaattcca gtttcaagaa gcactttgtc aagcagctaa acatgaaggc 1560

cctctgcaca aatgtgacat ctcaaactct acagaagctg gacagaaact gttcaatatg 1620

ctgaggcttg gaaaatcaga accctggacc ctagcattgg aaaatgttgt aggagcaaag 1680

aacatgaatg taaggccact gctcaactac tttgagccct tatttacctg gctgaaagac 1740

cagaacaaga attcttttgt gggatggagt accgactgga gtccatatgc agac 1794

<210> 4

<211> 598

<212> PRT

<213> Artificial Sequence （人工序列）

<220>

<223> ACE2 variant （ACE2变体）

<400> 4

Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn

1 5 10 15

His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn

20 25 30

Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala

35 40 45

Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln

50 55 60

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Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser

85 90 95

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100 105 110

Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu

115 120 125

Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg

130 135 140

Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg

145 150 155 160

Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala

165 170 175

Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val

180 185 190

Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp

195 200 205

Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His

210 215 220

Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser

225 230 235 240

Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg

245 250 255

Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro

260 265 270

Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln

275 280 285

Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro

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Arg Glu Thr Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val

1 5 10 15

Pro Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys

20 25 30

Asn Glu Gly Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu

35 40 45

Lys Gly Ser Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys

50 55 60

Val Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe

65 70 75 80

Ser Glu Val Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys

85 90 95

Asp Pro Ala Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr

100 105 110

Ile Tyr Cys Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys

115 120 125

Lys Val Val Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile

130 135 140

Ser Gly Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu

145 150 155 160

Cys Asp Lys Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp

165 170 175

Ser Asn Ser Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu

180 185

<210> 17

<211> 735

<212> DNA

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 17

gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 60

gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 120

cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 180

aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 240

acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 300

caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 360

cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 420

agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 480

aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 540

agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 600

tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 660

atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 720

ttgccttcat gtgaa 735

<210> 18

<211> 245

<212> PRT

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 18

Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr

20 25 30

Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys

35 40 45

Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu

65 70 75 80

Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp

100 105 110

Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys

115 120 125

Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met

130 135 140

Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys

145 150 155 160

Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp

165 170 175

Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys

180 185 190

Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile

195 200 205

Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu

210 215 220

Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro

225 230 235 240

Leu Pro Ser Cys Glu

245

<210> 19

<211> 561

<212> DNA

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 19

aattgtggtc ctccacccac tttatcattt gctgccccga tggatattac gttgactgag 60

acacgcttca aaactggaac tactctgaaa tacacctgcc tccctggcta cgtcagatcc 120

cattcaactc agacgcttac ctgtaattct gatggcgaat gggtgtataa caccttctgt 180

atctacaaac gatgcagaca cccaggagag ttacgtaatg ggcaagtaga gattaagaca 240

gatttatctt ttggatcaca aatagaattc agctgttcag aaggattttt cttaattggc 300

tcaaccacta gtcgttgtga agtccaagat agaggagttg gctggagtca tcctctccca 360

caatgtgaaa ttgtcaagtg taagcctcct ccagacatca ggaatggaag gcacagcggt 420

gaagaaaatt tctacgcata cggcttttct gtcacctaca gctgtgaccc ccgcttctca 480

ctcttgggcc atgcctccat ttcttgcact gtggagaatg aaacaatagg tgtttggaga 540

ccaagccctc ctacctgtga a 561

<210> 20

<211> 187

<212> PRT

<213> Homo sapiens （智人）

<400> 20

Asn Cys Gly Pro Pro Pro Thr Leu Ser Phe Ala Ala Pro Met Asp Ile

1 5 10 15

Thr Leu Thr Glu Thr Arg Phe Lys Thr Gly Thr Thr Leu Lys Tyr Thr

20 25 30

Cys Leu Pro Gly Tyr Val Arg Ser His Ser Thr Gln Thr Leu Thr Cys

35 40 45

Asn Ser Asp Gly Glu Trp Val Tyr Asn Thr Phe Cys Ile Tyr Lys Arg

50 55 60

Cys Arg His Pro Gly Glu Leu Arg Asn Gly Gln Val Glu Ile Lys Thr

65 70 75 80

Asp Leu Ser Phe Gly Ser Gln Ile Glu Phe Ser Cys Ser Glu Gly Phe

85 90 95

Phe Leu Ile Gly Ser Thr Thr Ser Arg Cys Glu Val Gln Asp Arg Gly

100 105 110

Val Gly Trp Ser His Pro Leu Pro Gln Cys Glu Ile Val Lys Cys Lys

115 120 125

Pro Pro Pro Asp Ile Arg Asn Gly Arg His Ser Gly Glu Glu Asn Phe

130 135 140

Tyr Ala Tyr Gly Phe Ser Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Arg Phe Ser

145 150 155 160

Leu Leu Gly His Ala Ser Ile Ser Cys Thr Val Glu Asn Glu Thr Ile

165 170 175

Gly Val Trp Arg Pro Ser Pro Pro Thr Cys Glu

180 185

Claims

1.一种融合蛋白，包括ACE2域和第二多肽域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中ACE2域是人ACE2的全长胞外域、人ACE2的缺失变体或对冠状病毒刺突蛋白具有更高亲和力的人ACE2变体，并且第二多肽域是补体抑制域。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中ACE2域含有肽酶活性或是无酶活性的变体。

4.根据权利要求2至3中任一项所述的融合蛋白，其中ACE2域是比野生型ACE2具有更高酶活性的变体，或对冠状病毒刺突蛋白具有更高亲和力的变体。

5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中ACE2域是SEQ ID NO:2、4、6或8。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的融合蛋白，其中补体抑制域是CR1、DAF、MCP、因子H或C4BP的一部分。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的融合蛋白，其中补体抑制域是SEQ ID NO:10、12、14、16、18或20。

8.根据权利要求2至5中任一项所述的融合蛋白，其中补体抑制域是针对因子B、因子D、因子P、C3或C5的抗体的抗体片段或scFv或可变区(VH或VK)。

9.根据权利要求2至5中任一项所述的融合蛋白，其中补体抑制域是因子B、因子D、因子P、C3或C5的肽抑制剂或寡核苷酸抑制剂。

10.一种治疗ACE2相关疾病的方法，包括以下步骤：施用根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。

11.一种治疗冠状病毒感染的方法，包括以下步骤：施用根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。

12.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，具有一个或多个氨基酸取代K26E、K26R、T27R、F28W、D30E、K31E、Y41N、Q42E、L45E、L79W、Y83F、G326E、N330K、N330Q、N330Y、G352Y和K353H。

13.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，具有一个或多个双重氨基酸取代K26R/L79W、T27R/L79W、F28W/L79W、D30E/L79W或Q42E/L79W。

14.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，具有一个或多个三重氨基酸取代K26R/D30E/L79W、D30E/L79W/N330Q、D30E/L79W/N330Y、D30E/Q42K/L79W。

15.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，具有一个或多个四重氨基酸取代K26R/F28W/D30E/L79W、D30E/Q42K/L79W/N330Q、D30E/Q42K/L79W/N330Y或K31F/N33D/H34S/E35Q。

16.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、7或8的氨基酸序列，具有一个或多个五重氨基酸取代K26R/T27R/F28W/D30E/L79W、T27R/D30E/Q42K/L79W/N330Y、T27Y/D30E/Q42K/L79W/N330Y或D30E/H34V/Q42K/L79W/N330Y。

17.一种ACE2变体，包括：SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，具有七重氨基酸取代D30E/K31F/H34I/E35Q/Q42K/L79W/N330Y。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的ACE2变体，还包括半衰期延长域。

19.根据权利要求18所述的ACE2变体，其中半衰期延长域是免疫球蛋白Fc区、人白蛋白、人胶原蛋白的一部分或水溶性聚合物。

20.根据权利要求2至9中任一项所述的ACE2变体，还包括半衰期延长域。

21.根据权利要求20所述的ACE2变体，其中半衰期延长域是免疫球蛋白Fc区、人白蛋白、人胶原蛋白的一部分或水溶性聚合物。

22.根据权利要求12至19中任一项所述的ACE2变体，还包括补体抑制域。

23.一种抑制SARS-CoV-2病毒感染细胞的方法，包括：将SARS-CoV-2病毒暴露于根据权利要求12至22中任一项所述的ACE2变体，其中ACE2变体与SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白结合并抑制SARS-CoV-2病毒感染细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中细胞在受试者体内，并且还包括向受试者施用ACE2变体的步骤。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中ACE2变体还包括补体抑制域。