CN103487146A - 一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，该系统是：由超短脉冲激光器产生的超短脉冲激光，经分光镜分为两束，一束为斯托克斯光，依次通过一带有旋钮的可调的回射镜系统和一光强调制器；另一束通过光子晶体光纤产生超连续谱，经过带通滤波器选取超连续谱部分波段作为泵浦光，两束光通过一二向色镜共线后，通过回射镜系统快速调节两脉冲的时间延迟，使斯托克斯光与泵浦光中的不同波长成分重叠，依次通过扫描单元、物镜、滤光片、光电探测器，经锁相放大器处理，在计算机上成像，最终实现连续可调的超宽带受激拉曼生物显微光谱成像，具体可以实现一段在生命科学领域中很有研究价值的超宽带光谱成分的连续可调受激拉曼光谱检测成像。

Description

一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统

技术领域

本发明涉及光学显微技术、光纤技术及生物检测技术领域，具体涉及一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统。

背景技术

在光学生物成像系统中，借助探针标记的荧光显微镜，尤其是基于荧光单分子过程的共聚焦荧光显微镜，由于其高分辨率、高灵敏度和高放大率等优点，已经得到了广泛的应用。然而，由于存在有一些生物分子没有明显的光致发光特性或者标记探针容易造成生物损伤，因此，需要新的无标记的高特异性、高对比度生物成像方式，如受激拉曼散射成像、相干反斯托克斯拉曼散射成像、受激荧光成像等。

其中，受激拉曼散射显微成像是采用两束有特定频率差的光束进行照射，通过测量受激拉曼过程中其中一束光的能量变化进行成像。这一技术具有如下优点：1、无非共振背景光干扰，信噪比高，灵敏度高；2、光谱与自发拉曼光谱一致；3、信号强度与样品浓度线性相关，可以进行化学定量分析等，目前已得到了广泛的关注。

过去的大量研究中，受激拉曼显微系统都是采用两台钛蓝宝石激光器或者一台钛蓝宝石激光器和一台光参量振荡器分别作为两束光的光源，这种双光源系统价格昂贵，体积庞大，系统复杂，脉冲的调谐和同步比较麻烦，而且很难实现样品在不同拉曼光谱范围的连续可调超宽带光谱成像，即使已经有科研人员可以利用一些方法做到在某些拉曼光谱范围的连续成像，但其成像光谱范围也是十分有限。然而生物学中需要研究的对象的拉曼光谱，从常用的非极性溶剂二甲基亚砜（DMSO）中富含的S=O键的约670cm^-1，到核酸中富含的O-P-O对称键的约1095cm^-1，从蛋白质中富含的C-H₃键的约2950cm^-1，到水中富含的O-H键的约3250cm^-1，需要探测的光谱范围十分广泛，如果能有一种简便的大范围超宽带光谱成像检测方法，对于生命科学、医学的检测将提供很大的便利。

利用单个脉冲在光子晶体光纤的各种非线性效应对其展开产生的超连续谱是一种新型的光源，它具有高的输出功率、平坦的宽带光谱、高度的空间相干等特性，能极大提高信噪比、加宽光谱测量范围，在生物成像、光纤衰减测量、干涉测量仪、光相干摄影术、光学频率梳等方面有广泛的应用。超连续谱具有啁啾特性，对于单个脉冲的不同波长光具有前后时间差，因此，如果能将脉冲激光与宽带超连续谱中的不同成分分别在空间、时间上同步，就有望实现快速可调的超宽带受激拉曼连续光谱成像，特别是针对于生物检测领域十分有意义的超宽带拉曼光谱段的连续测量。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，该系统通过转动一个简便的旋钮结构即能够连续调节两束脉冲的时间延迟，从而对一段在生物应用中很有研究价值的超宽带拉曼光谱成分进行受激拉曼光谱信号连续检测成像，具有操作简单、系统成本低等优点。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，包括一超短脉冲激光器、偏振分束镜、带有旋钮的回射镜系统、光强调制器、光子晶体光纤、带通滤波器、二向色镜，超短脉冲激光器产生超短脉冲激光，该激光经偏振分束镜分为两束，一束反射脉冲为斯托克斯光，沿该激光束前进方向依次放置有一个带有旋钮的光程可调的回射镜系统和一个光强调制器，用于完成对斯托克斯光的频率调制，另一束透射脉冲为泵浦光，沿该激光前进方向依次放置一个光子晶体光纤和一个带通滤波器，光子晶体光纤用于使脉冲在激光的非线性效应下展宽产生超连续谱，带通滤波器用于选取一段波长范围的超连续谱作为超宽带光谱成像所用的泵浦光；两束光经过一个二向色镜后共线，通过调节回射镜系统上的旋钮调节两脉冲的时间延迟，使斯托克斯光与泵浦光中的不同波长成分重叠，然后光束进入扫描单元。本发明只需要通过简单调节光程大小精密可调的回射镜系统，改变斯托克斯光相对于超连续谱泵浦光的光延迟时间使斯托克斯光与泵浦光超连续谱中的不同波长成分依次重叠，利用选取好的脉冲光的波长和超连续谱的波段范围，即可实现连续可调的超宽带受激拉曼生物显微光谱成像。

作为一种优选方式，所述光谱显微成像系统还包括依次放置的扫描单元、物镜、聚光镜、滤光片、光电探测器、锁相放大器，两束光共线后依次进入扫描单元、物镜，然后照射在物镜焦点处的样本上，经一聚光镜收集后平行照射在滤光片上，滤光片滤掉斯托克斯光透过泵浦光使泵浦光被光电探测器接收，再经由与光强调制器同频率的锁相放大器处理后成像在电脑上。

作为另一种优选方式，所述光谱显微成像系统还包括扫描单元、第二分束镜、光电探测器、第一物镜、第二物镜、滤光片、平衡探测器、锁相放大器、第一分束镜，一方面，两束光共线后通过扫描单元和第二分束镜，然后先进入光电探测器进行泵浦光和斯托克斯光的同步重合，同时使用KDP（磷酸二氢钾）和频晶体进行两束光的时间同步，然后通过第一物镜照射在物镜焦点处的样本上，经过第二物镜收集后平行照射在滤光片上，滤光片滤掉斯托克斯光透过泵浦光使泵浦光被平衡探测器接收，另一方面，所述带通滤波器后设有第一分束镜，所述超宽带光谱成像所用的泵浦光经过第一分束镜后分为两束，一束进入平衡探测器作为参考光，另一束进入二向色镜；平衡探测器根据参考光对经过滤光片后的光束进行信号处理，然后经由与光强调制器同频率的锁相放大器处理后成像在电脑上。

具体的，所述光强调制器为斩波器。

具体的，所述超短脉冲激光器为钛蓝宝石激光器。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明在系统中设置了一个带有旋钮的回射镜系统，通过旋转回射镜系统上的旋钮，可以完成斯托克斯光对泵浦光超连续谱不同波长成分的快速波长扫描，同时在系统中还设置了带通滤波器，可以选取一段波长范围的超连续谱作为超宽带光谱成像所用的泵浦光，通过上述两个结构可以调节斯托克斯光和泵浦光的时间延迟，进而很方便的进行连续可调的超宽带受激拉曼光谱成像，这将大大方便生命科学、医学中生物分子的光谱连续检测。

2、本发明显微成像系统只需要使用单个钛蓝宝石激光器和一个光子晶体光纤作为激发光源，大大降低了系统的搭建成本，减小了系统的体积，同时只需要简单的转动回射镜系统上的旋钮即可快速地调节两束光的时间延迟，使得操作更加便捷。

3、本发明通过优选超连续谱中的一段600nm至790nm的一段作为泵浦光，结合800nm斯托克斯光可以快速连续测量一段从160cm^-1到4167cm^-1的超宽带拉曼光谱，实现对生物检测领域十分有意义的拉曼光谱段的快速连续超宽带测量。

附图说明

图1为通过连续可调时间延迟实现超宽带受激拉曼光谱成像的原理图。

图2为实施例1所述系统的结构示意图。

图3为本实施例2中选取的泵浦光625-680纳米波段和斯托克斯光800纳米波段。

图4为本实施例2用于产生可用于生命科学中超宽带受激拉曼连续光谱成像系统示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

利用单个脉冲在光子晶体光纤的各种非线性效应对其展开产生的超连续谱是一种新型的光源，它具有高的输出功率、平坦的宽带光谱、高度的空间相干等特性，能极大提高信噪比、加宽光谱测量范围，在生物成像、光纤衰减测量、干涉测量仪、光相干摄影术、光学频率梳等方面有广泛的应用。超连续谱具有啁啾特性，对于单个脉冲的不同波长光具有前后时间差，因此，如果能将脉冲激光与宽带超连续谱中的不同成分分别在空间、时间上同步，就有望实现方便可调的超宽带受激拉曼连续光谱成像，例如，如果取超连续谱中相对普遍的一段600纳米到790纳米作为泵浦光，而使用800纳米脉冲光作为斯托克斯光的话，可以快速连续测量一段从160cm^-1到4167cm^-1的超宽带拉曼光谱，实现对生物检测领域十分有意义的拉曼光谱段的连续测量。

如图1所示，为通过连续可调时间延迟实现宽带受激拉曼光谱成像的原理图，通过调节斯托克斯光的光程实现斯托克斯光与泵浦光的不同成分的时间延迟，具体为时刻6时的斯托克斯光3与超连续谱4中的泵浦光频率2同步，而在时刻7时的斯托克斯光5与超连续谱4中的泵浦光频率1同步，从而可以实现斯托克斯光与泵浦光超连续谱中不同波长成分的快速连续同步，若能选取合适的波长即可实现快速连续的超宽带受激拉曼光谱成像。

为此，本实施例给出如图2所示的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，包括超短脉冲激光器和光子晶体光纤这一光源部分、带有旋钮的光程精细可调的回射镜系统部分、物镜及探测系统所构成的显微镜光学成像系统。具体是包括：一超短脉冲激光器、偏振分束镜9、带有旋钮的回射镜系统10、光强调制器12、光子晶体光纤14、带通滤波器16、二向色镜17，以及依次放置的扫描单元18、物镜19、聚光镜21、滤光片22、光电探测器23、锁相放大器。

工作过程是：由超短脉冲激光器产生的飞秒脉冲激光束8，通过45度放置的偏振分束镜9可以分为两束，一束反射脉冲为斯托克斯光，该脉冲进入可精密调节光程大小的回射镜系统10后由与光轴成45度放置的反射镜11反射继续进入光强调制器12完成对斯托克斯光的一个重复率调制，然后经过另一与光轴成45度放置的反射镜13后进入二向色镜17；另一束透射脉冲为泵浦光，该脉冲经过一个光子晶体光纤14后由于高强度激光的非线性效应会展宽产生超连续谱15，接着通过一个带通滤波器16选取一段波长范围的超连续谱作为超宽带光谱成像所用的泵浦光，该光束作为泵浦光与斯托克斯光一起经过一个与光轴成45度放置的二向色镜17后共线，两束光通过扫描单元18进入物镜19照射在焦点处的样本20上，经过一聚光镜21收集后平行照射在滤光片22上，滤光片22滤掉斯托克斯光透过泵浦光使其被光电探测器23接收，再经由与光强调制器同频率的锁相放大器处理后成像在电脑上。

通过调节精密可调光程大小的回射镜系统10可改变斯托克斯光相对于泵浦光超连续谱的光延迟时间，使斯托克斯光与泵浦光中的不同波长成分依次重叠（如图1所示），从而实现快速、连续可调的超宽带受激拉曼生物显微光谱成像过程。

实施例2

本实施例除下述特征外其他结构同实施例1：

如图4所示，本实施例超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，包括一超短脉冲激光器（本实施例为钛蓝宝石激光器）、偏振分束镜9、回射镜系统10、光强调制器12（本实施例为斩波器）、光子晶体光纤14、带通滤波器16、二向色镜17，还包括扫描单元18、第二分束镜218、光电探测器220、第一物镜221，第二物镜223、滤光片224、平衡探测器225、锁相放大器226、第一分束镜219，另外，图4中标号11、213、214、215、216、217均为反射镜。

工作过程是：由钛蓝宝石激光器产生的800纳米脉宽约200飞秒脉冲激光束8，通过与光轴成45度放置的偏振分束镜9分为两束脉冲，一束反射脉冲做为斯托克斯光(如图3中标号2所示)，该脉冲经过一个与光轴成45度放置的反射镜213反射进入可精密调节光程大小的回射镜10后继续经过一个与光轴成45度放置的反射镜11反射后进入斩波器12完成对斯托克斯光的一个重复率调制；另一束透射脉冲为泵浦光，该脉冲经过光子晶体光纤14后会产生超连续谱15，接着通过一个带通滤波器16选取一段625-680纳米波长范围内的超连续谱作为成像所用的泵浦光(如图3中标号1所示)，该光束经过一个与光轴成45度放置的第一分束镜219后又分为两束，透过的光束经两个与光轴成45度放置的反射镜216、217反射后进入平衡探测器225作为参考光。另一束反射光经过一个与光轴成45度放置的反射镜215反射后作为泵浦光与斯托克斯光一起经过一个与光轴成45度放置的二向色镜17（700纳米以上波长光透过，700纳米以下波长光反射）后共线，经过与光轴成45度放置的反射镜214反射，两束光通过扫描单元18和一个与光轴成45度放置的第二分束镜218，先进入光电探测器220进行泵浦光和斯托克斯光的空间同步重合，同时使用KDP和频晶体进行两束光的时间同步，在这里规定800纳米波长光和650纳米波长光产生的和频358纳米光时，两个脉冲的时间延时为零。同步完成后进入第一物镜221照射在焦点处的样本222上，经过第二物镜223收集后平行照射在滤光片224上，滤光片224滤掉斯托克斯光透过泵浦光使泵浦光被平衡探测器225接收，平衡探测器225通过接收一开始的参考泵浦光进行信号处理，可以避免一些其他因素对于实验的干扰，再经由与斩波器12同频率的锁相放大器226处理后成像在电脑227上。

通过调节精密可调光程大小的回射镜10改变斯托克斯光相对于泵浦光超连续谱的光延迟时间，使斯托克斯光与泵浦光中的不同波长成分依次重叠（如图1所示），从而实现连续可调的超宽带受激拉曼生物显微光谱成像过程，本实例中具体可以实现2200-3500cm^-1这一在生命科学中很有研究价值的超宽带光谱成分的连续可调受激拉曼信号检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，其特征在于，包括一超短脉冲激光器、偏振分束镜、带有旋钮结构的回射镜系统、光强调制器、光子晶体光纤、带通滤波器、二向色镜，超短脉冲激光器产生超短脉冲激光束，与光轴方向成45度放置的偏振分束镜将光束分为两束，一束反射脉冲为斯托克斯光，沿该激光束前进方向依次放置有一个带有旋钮的光程可调的回射镜系统和一个光强调制器，用于完成对斯托克斯光的快速波长扫描，另一束透射脉冲为泵浦光，沿该激光前进方向依次放置一个光子晶体光纤和一个带通滤波器，光子晶体光纤用于使脉冲在激光的非线性效应下展宽产生超连续谱，带通滤波器用于选取一段波长范围的超连续谱作为超宽带光谱成像所用的泵浦光；两束光经过一个二向色镜后共线，通过转动回射镜系统上的旋钮快速调节两脉冲间的时间延迟，使斯托克斯光与泵浦光中的不同波长成分重叠，实现斯托克斯光对于泵浦光不同波长成分的快速波长扫描，然后光束进入扫描单元。

2.根据权利要求1所述的简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，其特征在于，所述光谱显微成像系统还包括依次放置的扫描单元、物镜、聚光镜、滤光片、光电探测器、锁相放大器，两束光共线后依次进入扫描单元、物镜，然后照射在物镜焦点处的样本上，经一聚光镜收集后平行照射在滤光片上，滤光片滤掉斯托克斯光透过泵浦光使泵浦光被光电探测器接收，再经由与光强调制器同频率的锁相放大器处理后成像在电脑上。

3.根据权利要求1所述的简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，其特征在于，所述光谱显微成像系统还包括扫描单元、第二分束镜、光电探测器、第一物镜、第二物镜、滤光片、平衡探测器、锁相放大器、第一分束镜，一方面，两束光共线后通过扫描单元和第二分束镜，然后先进入光电探测器进行泵浦光和斯托克斯光的同步重合，同时使用KDP和频晶体进行两束光的时间同步，然后通过第一物镜照射在物镜焦点处的样本上，经过第二物镜收集后平行照射在滤光片上，滤光片滤掉斯托克斯光透过泵浦光使泵浦光被平衡探测器接收，另一方面，所述带通滤波器后设有第一分束镜，所述超宽带光谱成像所用的泵浦光经过第一分束镜后分为两束，一束进入平衡探测器作为参考光，另一束进入二向色镜；平衡探测器根据参考光对经过滤光片后的光束进行信号处理，然后经由与光强调制器同频率的锁相放大器处理后成像在电脑上。

4.根据权利要求2或3所述的简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，其特征在于，所述光强调制器为斩波器。

5.根据权利要求2或3所述的简便的超宽带受激拉曼光谱显微成像系统，其特征在于，所述超短脉冲激光器为钛蓝宝石激光器。

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