CN112285091B - 一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法 - Google Patents

一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法，飞秒激光脉冲振荡器产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器、超陡长通滤波片、分束镜和物镜后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品上，分束镜的一侧设置有第一光谱仪；散射信号经待测样品的透射部分经聚光透镜收集，然后经第二分束镜分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片、透镜和第二光谱仪，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片、第二超陡短通滤波片、光电倍增管和锁相放大器后用于锁相放大成像。装置简单、廉价、易操作，信噪比高，平均入射光功率低。

Description

一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法
技术领域
本发明属于振动模式和细胞结构检测技术领域，具体涉及一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法。
背景技术
拉曼散射显微技术作为检测振动模式和分子结构最有用的光学技术之一，已经得到了广泛应用。然而自发拉曼散射(SPRS)由于自身信号强度的问题，SPRS在生物医学的快速成像方面有很大的局限。相比之下，荧光显微技术的发展如日中天。荧光显微镜能够得到广泛的应用主要得力于两点：第一，由于高灵敏度，荧光显微镜可以实现单分子荧光成像，通过多焦点成像，荧光显微镜的分辨率得到大幅度提升。第二，多种可选用的荧光探针，使得荧光显微技术的功能更加多样化，可以应用于各种生命体的观测。然而荧光显微镜有着其不可避免的内在局限。首先，荧光标记虽然对于大分子物质有着良好的靶向作用，但其对于小分子的生命物质很难做到有效的标记，因此特异性较差。其次，作为外源标记物的荧光探针对生命体细胞的活性有着一定的损伤，甚至引起细胞组织的光致漂白等问题。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的信号强度相比SPRS要高5，6个数量级，在生物医学领域，尤其是在活细胞成像方面有着广泛应用。CARS是一个由泵浦光，斯托克斯光，反斯托克斯光以及样品分子相互作用的一个四波混频(four wave mixing，FWM)的光学过程，属于三阶非线性光学过程。频率为ωp的泵浦光将样品分子激发到一个虚能级，频率为ωS的斯托克斯光再将样品分子激发到一个振动能级，该过程需要满足相位匹配即样品分子的固有振动频率Ω＝ωp-ωS。此时，样品分子的能量升高，再用频率为ωpr的探测光(probe)将样品分子激发到一个能量更高的虚能级，样品分子的能量不稳定回到基态，释放出频率为ωaS的反斯托克斯光子，该过程同样满足一定的条件Ω＝ωaS-ωpr。因此，相比荧光显微镜，CARS显微镜具有良好的特异性功能。CARS一般使用多光束或多光源方案(以满足泵浦光子，斯托克斯光子以及探测光子的频率成分要求)来实现，要求所有激发光束必须在空间上重合。
为简化CARS系统，使用陷波滤波片可以实现更简单的单光束CARS方法。通过在激光光谱上创建陷波特征(ωpr)，并在CARS谱上产生类似(尽管略微较弱)的特征(ωaS)。由于陷波滤波片的小巧、简单，容易安装于振镜扫描仪上对激光进行高频调制(高达几个kHz)。由于共振信号位置只与陷波频率位置pr有关，因此，可以利用自外差方法将非共振信号作为本地振荡器，除去非共振信号的同时放大较弱的共振信号。重要的是，这种方法可以用于所有基于光纤组件实现的CARS方案。这种方法还可以很容易地扩展到实现低频CARS光谱和显微镜，这对于研究大生物分子的低频振动模式很重要。
相比普通的多光束CARS和基于脉冲整形器实现的单光束CARS方案而言，上述基于陷波滤波片实现的单光束CARS方案要简单、紧凑的多。然而，陷波滤波片的引入，使得该系统仍然比较昂贵，相对复杂。人们利用超陡滤波片人们可以将陷波滤波片移出单光束CARS系统外，而且证明这种CARS光谱性价比更高，系统更加简单、易操作；然而，这种装置只限于测量拉曼光谱还不能实现振动成像，而且灵敏度有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法，利用荧光增强的方法进一步提高单光束CARS系统的灵敏度，并且将超陡长通滤波片安装于振镜扫描仪上以实现振动成像，以简化振动成像装置。
本发明采用以下技术方案：
一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，包括飞秒激光脉冲振荡器，飞秒激光脉冲振荡器产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器、超陡长通滤波片、分束镜和物镜后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品上，分束镜的一侧设置有第一光谱仪；散射信号经待测样品的透射部分经聚光透镜收集，然后经第二分束镜分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片、透镜和第二光谱仪，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片、第二超陡短通滤波片、光电倍增管和锁相放大器后用于锁相放大成像。
具体的，超短脉冲的中心波长为793～808nm，带宽为40～70nm，重复频率为80MHz，脉宽为5～20fs。
具体的，透镜的焦距为30m～100mm。
本发明的另一个技术方案是，一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，利用所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法具体步骤如下：
S1、启动飞秒激光脉冲，粗调物镜的焦点使激光聚焦于样品上，直至从第二光谱仪或光电倍增管看到原始CARS信号，同时调节反射镜和聚光透镜的位置，使第二光谱仪测量的CARS光谱强度最大；
S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被补偿，直到原始CARS信号不能增大为止；
S3、观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节分束镜使得激光与物镜至所观测的原始CARS信号不再增大为止；
S4、调节光谱仪的光纤角度使第二光谱仪所观测的原始CARS信号不再增大为止，使光耦合效率达到最高值。
具体的，步骤S1中，通过调节二维支架调节物镜的焦点位置、激光的俯仰角度以及准直度。
具体的，步骤S2中，调节一维精密平移台改变棱镜位置，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不再增大。
具体的，步骤S3中，观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节固定分束镜支架使得所观测的原始CARS信号不再增大为止，此时激光与物镜匹配到最佳位置。
具体的，步骤S4具体为：
S401、调节超陡长通滤波片的角度，利用第一光谱仪观测超陡长通滤波片截断边沿的波长，当边沿波长为780nm时，利用第二光谱仪记录原始CARS光谱数据I1；
S402、调节超陡长通滤波片的角度，当截断边沿波长为780.3～781nm时，利用第二光谱仪记录第二组原始CARS光谱数据I2；
S403、将所得两组原始CARS光谱进行微分便得到待测样品的拉曼光谱，以横轴为振动频率，纵轴为CARS光谱强度，利用Matlab画图得到不同振动频率的强度变化。
更进一步的，步骤S403中，待测样品的拉曼光谱IRaman如下：
其中，
本发明的另一个技术方案是，一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，利用所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法具体步骤如下：
S5、准备经过IR783染色的细胞，并将染色细胞放置于载玻片上；
S6、利用陷波滤波片选择感兴趣的IR783的振动模式；选择方法是陷波滤波片13所反射的波长通过计算应该在779.6nm处，同时移动光电倍增管的位置，使得所测信号电压/电流最大；
S7、通过改变振镜扫描仪的参数，观察锁相放大器输出信号的幅度和相位变化，记录光电倍增管的信号，并将待测样品上任意一点的电压/电流值，转化为数字信号，得到的模拟信号通过PCI卡转换为数字信号，然后利用Labview软件进行记录并用Matlab进行数据处理。
S8、当物镜与待测样品的相对距离不变时，以待测样品所在水平面为坐标平面建立xoy坐标系，确定光斑在样品上位置的坐标；当光斑所在样品位置坐标的y值为恒定值时，增加施加给待测样品所在精密平移台x轴方向的电压值，光斑的x值以步长为1微米平移，同时记录130个不同x值时光电倍增管的信号；
y＝y+1微米时，再次同时记录130个不同x值时的光电倍增管15的信号；到y＝y+130微米时，再次同时记录130个不同x值时光电倍增管15的信号，扫描130微米x130微米的区域，并将这个130x130二维矩阵格点上所有的值记录了下来。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，利用超陡滤波片简化现有单光束CARS显微成像的方案，并利用电子共振效应实现高灵敏度的太赫兹波段CARS显微成像。
进一步的，利用近红外波段入射激光与样品发生电子共振的效应，超短脉冲参数设置中心波长选择在800nm第二个目的是该波段激光与所选超陡滤波片的有效波段接近，带宽设置为60nm的目的是宽带宽的入射激光对于CARS激发所需光子的组合选择多，信号灵敏度高，脉冲重复频率选择80MHz和10fs的目的是利用超陡脉冲的高峰值功率实现低平均功率的CARS激发，对生物样品的光毒性小。
进一步的，透镜的焦距为50mm，与连接第二光谱仪的光纤耦合效率高。
一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，能够逐渐、有序地将所产生的CARS信号强度增大，并优化CARS光谱探测各个元件的位置。
进一步的，步骤S1使得激光焦点位于待测样品上，并使得探测元件与收集到的CARS信号耦合效率高。
进一步的，通过步骤S2补偿激光由于经过物镜产生的群速度色散。
进一步的，通过步骤S3使得入射激光尽可能透过物镜。
进一步的，步骤S4通过改变超陡滤波片的位置，测量两组原始CARS光谱并进行数据处理，以获得待测样品的拉曼光谱。
进一步的，步骤S403设置的目的是通过微分和归一化处理，除去背景噪声的影响，同时放大所要提取的共振拉曼信号。
一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，能够逐步、有序地实现小白鼠N9细胞的CARS光谱与显微成像。
综上所述，本发明装置简单、廉价，操作容易，同时信噪比高。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明装置图；
图2为入射激光光谱与IR783溶液吸收谱的实验测量结果图；
图3为有机染料IR783溶液的全电子共振CARS光谱图，其中，(a)为超陡长通滤波片产生的超陡边沿分别在780.0nm(虚线)和780.3nm(实线)的对应的有机染料IR783原始测量CARS光谱图，(b)为通过SPRS(虚线)和CARS(实线)获得的IR783拉曼光谱图；
图4为利用有机染料IR783溶液将细胞进行染色后的全电子共振CARS显微成像图。
其中：1.飞秒激光脉冲振荡器；2.脉冲压缩器；3.超陡长通滤波片；4.分束镜；5.第一光谱仪；6.物镜；7.待测样品；8.聚光透镜；9.第二分束镜；10.第一超陡短通滤波片；11.透镜；12.第二光谱仪；13.陷波滤波片；14.第二超陡短通滤波片；15.光电倍增管；16.锁相放大器。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“一侧”、“一端”、“一边”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在附图中示出了根据本发明公开实施例的各种结构示意图。这些图并非是按比例绘制的，其中为了清楚表达的目的，放大了某些细节，并且可能省略了某些细节。图中所示出的各种区域、层的形状及它们之间的相对大小、位置关系仅是示例性的，实际中可能由于制造公差或技术限制而有所偏差，并且本领域技术人员根据实际所需可以另外设计具有不同形状、大小、相对位置的区域/层。
请参阅图1，本发明提供了一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，依次包括飞秒激光脉冲振荡器1、脉冲压缩器2、超陡长通滤波片3、分束镜4、第一光谱仪5、物镜6、待测样品7、聚光透镜8、第二分束镜9、第一超陡短通滤波片10、透镜11、第二光谱仪12、陷波滤波片13、第二超陡短通滤波片14、光电倍增管15和锁相放大器16。
飞秒激光脉冲振荡器1产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器2、固定在振镜扫描仪上的超陡长通滤波片3、分束镜4和物镜6后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品7上，分束镜4的一侧设置有第一光谱仪5；用于将激光在待测样品7位置的色散补偿经超陡长通滤波片3截断，再通过分束镜4反射导入第一光谱仪5用于入射激光光谱测量，经过分束镜4的透射光被导入物镜6，然后聚焦于待测样品7上。
其中，超短脉冲的中心波长为793～808nm，800nm，带宽为40～70nm，优选60nm，重复频率为80MHz，脉宽为5～20fs，优选10fs。
待测样品7的后侧依次设置有聚光透镜8和第二分束镜9，第二分束镜9分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片10、透镜11和第二光谱仪12；另一路依次连接陷波滤波片13、第二超陡短通滤波片14、光电倍增管15和锁相放大器16。
散射信号中的透射部分经聚光透镜8收集，收集到的光经过第二分束镜9分为两路，透射部分先经过第一超陡短通滤波片10，再经过30m～100mm焦距的透镜11导入第二光谱仪12进行CARS光谱测量，透镜11的焦距优选50mm，被反射的部分经陷波滤波片13选择感兴趣的信号，所选择的信号经过第二超陡短通滤波片14，最后导入光电倍增管15，进一步利用锁相放大器16进行锁相放大成像。
第二光谱仪12所获得的光谱数据和锁相放大器16所获得的电压/电流信号通过一个数据采集卡(National Instruments DAQ-6024E)将模拟信号转换成数字信号，然后导入电脑并利用Matlab处理画图，得到样品的拉曼光谱图和CARS显微成像图。
本发明一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，请参阅图3，相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法包括以下步骤：
S1、启动飞秒激光脉冲1，待激光脉冲稳定后，将激光脉冲依次经过脉冲压缩器2、超陡长通滤波片3、分束镜4和物镜6后聚焦于待测样品7，粗调光路直至从第二光谱仪12或光电倍增管15看到原始CARS信号，调节物镜6和聚光透镜8的位置使得第二光谱仪12测量的CARS光谱强度最大；
激光脉冲在待测样品7上的入射功率为0.3mW，粗调光路指的是利用两个光阑，并通过调节反射镜、分光镜、物镜以及聚光透镜的支撑支架上的精密控制旋钮对激光光斑进行粗略准直。
S2、通过调节第一超陡短通滤波片3和第二超陡短通滤波片10的相对角度，以保证放入待测样品7后第二光谱仪12探测到的全部是CARS信号，而没有泄漏的入射激光；优化脉冲压缩器2中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被补偿，这时原始CARS信号逐渐增大，直到不能增大为止；
由于脉冲压缩器中其中之一棱镜被放置于一维精密可调的平移台上，调节平移台的控制旋钮，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不能被增大；通过调整物镜6的位置使通过物6镜的激光的焦斑位于待测样品7的中部。
S3、调节分束镜4使得激光与物镜6匹配到最佳，同时观测这时原始CARS信号的变化；该过程还需要辅助地调节聚光透镜8的位置使其达到最佳位置；
由于聚光透镜被固定在二维可调的支架上，辅助调节固聚光透镜支架上的精密控制旋钮，即可调节所收集信号的俯仰角度以及准直度，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不能被增大。
观察第一光谱仪，当激发光谱超陡边沿的波长为780.0nm时记录这时的第二光谱仪12测量的第一原始CARS光谱I1；然后微量旋转超陡长通滤波片3使超陡边沿波长变化为780.3nm，这时记录第二光谱仪12测量的第二原始CARS光谱I2；
S4、调节光谱仪的光纤角度使其光耦合效率达到最高值，即利用第二光谱仪所观测的原始CARS信号不能被增大为止。
S401、调节超陡长通滤波片3的角度，利用第一光谱仪5观测超陡长通滤波片3截断边沿的波长，当边沿波长为780nm时，利用第二光谱仪12记录原始CARS光谱数据；
S402、调节超陡长通滤波片3的角度，当截断边沿波长为780.3～781nm时，边沿波长之差不超过超陡滤波片的跨度波长，利用第二光谱仪12记录第二组原始CARS光谱数据；
S403、将所得两组原始CARS光谱进行微分便得到待测样品7的拉曼光谱，以横轴为振动频率，纵轴为CARS光谱强度，利用Matlab进行画图可得到不同振动频率的强度变化。
将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别进行光滑处理，得到处理后的光谱的二次根，分别为和/>然后将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2相减，并归一化处理，即得待测样品的拉曼光谱，公式如下：
其中，
利用Matlab软件的smooth函数将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别光滑处理50次。图3中的实线结果就是利用公式(1)处理得到的，其中，图(a)为超陡长通滤波片产生的超陡边沿分别在780.0nm(虚线)和780.3nm(实线)对应的有机染料IR783原始测量CARS光谱图，图(b)为分别通过SPRS(虚线)和CARS(实线)获得的IR783拉曼光谱图；SPRS和CARS实验所使用溶液浓度分别为10mg/mL和0.1mg/mL。
实验中，调节第一超陡短通滤波片10的角度使得原始CARS信号足够的靠近780nm，但不能漏过入射激光；这样所提取拉曼谱就是低频波段的拉曼光谱。
实验中，通过设置振镜扫描仪的参数，例如调节幅度为10毫伏，调节频率为1kHz；激光脉冲得到快速精密调制，由于共振CARS信号只与超陡长通滤波片所截断所得的边沿(延时探测光)有关，因此，共振CARS信号利用锁相放大器16进行解调而提取；
通过改变输入电压，精密控制二维平移台上待测样品7的移动；
对于每个扫描点，设置像素停留时间200微秒，空间分辨率为1微米；然后记录每个点的电压值并将其通过数值/模拟信号转换器导入电脑进行数据处理实现二维成像。
请参阅图4，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法，包括以下步骤：
S5、准备经过IR783染色的细胞，并将染色细胞放置于载玻片上；
S6、利用陷波滤波片13选择感兴趣的IR783的振动模式，如180cm-1；选择的方法是陷波滤波片13所反射的波长通过计算应该在779.6nm处，同时移动光电倍增管的位置，使得所测信号电压/电流最大。
S7、通过改变振镜扫描仪的参数，观察锁相放大器输出信号的幅度和相位变化。记7录光电倍增管15的信号，并将待测样品7上任意一点的电压/电流值，转化为数字信号。其中，得到的模拟信号通过PCI卡(National Instruments DAQ-6024E)转换为数字信号，然后利用Labview软件进行记录并用Matlab进行数据处理。
S8、当物镜6与待测样品7的相对距离不变时，并且以待测样品7所在水平面为坐标平面建立xoy坐标系，光斑在样品上位置的坐标就可以一一确定下来。当光斑所在样品7位置坐标的y值是某恒定值时，逐渐增加施加给待测样品6所在精密平移台x轴方向的电压值，光斑的x值以步长为1微米平移，同时记录130个不同x值时光电倍增管15的信号。
同样地，y＝y+1微米时，再次同时记录130个不同x值时的光电倍增管15的信号。一直到y＝y+130微米时，再次同时记录130个不同x值时光电倍增管15的信号。这样，扫描了130微米x130微米的区域，并将这个130x130二维矩阵格点上所有的值记录了下来。
过程中，设置每个格点的停留时间为1毫秒。利用数据采集卡将所有点的模拟信号转换为数字信号，并利用Matlab对数据进行处理得到如图4所示的图像，振动频率IR783在180cm-1的振动模式。像素停留时间为1ms，扫描面积为130微米x130微米。
其中，IR783溶液是将IR783粉末溶于水制备而成；利用有机染料IR783对细胞进行染色处理。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一束脉冲宽度约为10fs的激光脉冲(Thorlabs，OCTAVIUS-85M-HP)，中心波长为800nm，带宽约为60nm，经过一对放置于一维精密平移台(Thorlabs,PT1B)上的棱镜对2(Thorlabs，AFS-SF10)进行色散补偿后，通过一个(根据客户要求)安装于振镜扫描仪(www.nutfieldtech.com)上的超陡长通滤波片3(Semrock LP02-785RE)产生延时探测脉冲(频率为ωULPF)，然后经过一个分束镜4被分为两束，反射的第一束经过第一光谱仪5(CCS175)用于检测超陡长通滤波片3产生的超陡边沿的波长，如图2中的实线所示。透射的第二束光被置于第一三维精密平移台(Thorlabs，RB13M/M)上的物镜6(Newport，20x，0.4NA)聚焦于待测样品7上，待测样品7是置于一个二维精密平移台(Mad City Labs,Inc.Nano-Bios)的样品槽上。透射信号通过置于第二个三维精密平移台(Thorlabs，RB13M/M)上的聚光透镜8(Edmund Optics，0.5NA)汇聚，再通过第二分束镜9，透射部分经过第一超陡短通滤波片10(Semrock SP01-785RU)将入射激光滤掉，然后经过50mm的透镜11(Thorlabs，AC254-030-AB)导入连接第二光谱仪12(Jobin Yvon Triax 320)的光纤中，用于测量原始的CARS光谱。经过反射镜9的反射部分首先被一陷波滤波片(Unaxis Blazers)选择反射，然后通过第二超陡短通滤波片14(Semrock SP01-785RU)导入光电倍增管15，最后所转换的电信号经过锁相放大器16提取。
请参阅图2，启动吸收光谱仪，打开相应测量软件，首先测量放置IR783溶液的空透明玻璃瓶的吸收谱并将其作为背景，其次测量装有IR783溶液的同一透明玻璃瓶的吸收谱，经过处理得到图2所示(虚线)样品的吸收谱。由于入射激光光谱中的三个所需光子(泵浦，斯托克斯，探测光子)均与吸收谱中的其中一个峰重合，因此可以实现全电子共振CARS光谱与显微成像。
全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射光谱及显微成像实验装置利用单个光束中的三个光子(ωp，ωS，ωpr)全部与近红外吸收染料(样品)发生电子共振，因此，所实现的CARS信号得到了极大的增强，其灵敏度在原则上要超过所有现有CARS技术。这是由于所报道结果中虽然(ωp，ωpr)与吸收染料(样品)发生了电子共振，但斯托克斯光子ωS还没有与样品发生电子共振。而且，这里采用单光束激发CARS装置相比文献中采用两束激光实现的受激拉曼散射要简单，成本也相对低廉。
本发明将超陡长通滤波片固定于振镜扫描仪上，可以对入射激光进行高频调制，从而对CARS信号中的共振项进行高频调制。由于所产生的CARS信号中的共振CARS只与超陡边沿有关，非共振CARS与超陡边沿无关[4]。通过微量地调节超陡长通滤波片的角度，测量两组原始的CARS光谱，将二者微分并归一化就可以得到低频振动谱或拉曼谱，包括太赫兹波段振动谱。超陡长通滤波片和超陡短通滤波片保证了入射激光无限地接近所探测的CARS信号，因而可以实现太赫兹波段振动谱的探测。早期理论预言，生物大分子(如蛋白和DNA)在太赫兹波段具有大振幅的振动模式，而且这些振动模式对于研究生物大分子的相应生物功能具有重要的科学意义。本发明主要利用超陡滤波片和荧光染料增强效应，可实现对CARS系统的简化以及CARS信号的增强。
通过锁相放大除掉其中的非共振信号，提取CARS信号中较弱的共振信号。另外，通过实验发现，利用超陡长通滤波片和短通滤波片不同角度的组合可以将原有探测装置[5]中的第二个超陡短通滤波片去掉，这样进一步简化了实验装置。
应用荧光染料的增强效应，能够对细胞的太赫兹CARS信号进行有效的增强。在使用荧光染料IR783增强生物细胞的太赫兹波段的CARS信号的实验中，我们得到了相较于双光子荧光和四波混频更加清晰有效的细胞结构图像。通过加入有机染料IR783我们获得了明显增强的太赫兹波段的CARS信号，使用低浓度的染料有效地降低了荧光染料对细胞的伤害，使太赫兹成像能够应用于含水较多的生物细胞，扩展了太赫兹波段高分辨振动成像的适用范围。
综上所述，本发明一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置及方法，装置简单、廉价、易操作，信噪比高，平均入射光功率低。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，包括飞秒激光脉冲振荡器(1)，飞秒激光脉冲振荡器(1)产生的超短脉冲依次经脉冲压缩器(2)、超陡长通滤波片(3)、分束镜(4)和物镜(6)后照射在放置于二维精密可调平台上的待测样品(7)上，分束镜(4)的一侧设置有第一光谱仪(5)；散射信号经待测样品(7)的透射部分经聚光透镜(8)收集，然后经第二分束镜(9)分两路，一路依次连接第一超陡短通滤波片(10)、透镜(11)和第二光谱仪(12)，用于进行CARS光谱测量；另一路依次经陷波滤波片(13)、第二超陡短通滤波片(14)、光电倍增管(15)和锁相放大器(16)后用于锁相放大成像。
2.根据权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，超短脉冲的中心波长为793～808nm，带宽为40～70nm，重复频率为80MHz，脉宽为5～20fs。
3.根据权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像装置，其特征在于，透镜(11)的焦距为30m～100mm。
4.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，其特征在于，利用权利要求1所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法具体步骤如下：
S1、启动飞秒激光脉冲，粗调物镜的焦点使激光聚焦于样品上，直至从第二光谱仪或光电倍增管看到原始CARS信号，同时调节反射镜和聚光透镜的位置，使第二光谱仪测量的CARS光谱强度最大；
S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被补偿，直到原始CARS信号不能增大为止；
S3、观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节分束镜使得激光与物镜至所观测的原始CARS信号不再增大为止；
S4、调节光谱仪的光纤角度使第二光谱仪所观测的原始CARS信号不再增大为止，使光耦合效率达到最高值。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，通过调节二维支架调节物镜的焦点位置、激光的俯仰角度以及准直度。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，调节一维精密平移台改变棱镜位置，同时利用第二光谱仪观测原始CARS光谱强度的变化，直至CARS光谱强度不再增大。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，观测第二光谱仪测量的CARS光谱强度，调节固定分束镜支架使得所观测的原始CARS信号不再增大为止，此时激光与物镜匹配到最佳位置。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S4具体为：
S401、调节超陡长通滤波片的角度，利用第一光谱仪观测超陡长通滤波片截断边沿的波长，当边沿波长为780nm时，利用第二光谱仪记录原始CARS光谱数据I1；
S402、调节超陡长通滤波片的角度，当截断边沿波长为780.3～781nm时，利用第二光谱仪记录第二组原始CARS光谱数据I2；
S403、将所得两组原始CARS光谱进行微分便得到待测样品的拉曼光谱，以横轴为振动频率，纵轴为CARS光谱强度，利用Matlab画图得到不同振动频率的强度变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S403中，待测样品的拉曼光谱IRaman如下：
其中，
10.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱与显微成像方法，其特征在于，利用权利要求1所述的成像装置，全电子共振的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法具体步骤如下：
S5、准备经过IR783染色的细胞，并将染色细胞放置于载玻片上；
S6、利用陷波滤波片选择感兴趣的IR783的振动模式；选择方法是陷波滤波片13所反射的波长通过计算应该在779.6nm处，同时移动光电倍增管的位置，使得所测信号电压/电流最大；
S7、通过改变振镜扫描仪的参数，观察锁相放大器输出信号的幅度和相位变化，记录光电倍增管的信号，并将待测样品上任意一点的电压/电流值，转化为数字信号，得到的模拟信号通过PCI卡转换为数字信号，然后利用Labview软件进行记录并用Matlab进行数据处理；
S8、当物镜与待测样品的相对距离不变时，以待测样品所在水平面为坐标平面建立xoy坐标系，确定光斑在样品上位置的坐标；当光斑所在样品位置坐标的y值为恒定值时，增加施加给待测样品所在精密平移台x轴方向的电压值，光斑的x值以步长为1微米平移，同时记录130个不同x值时光电倍增管的信号；
y＝y+1微米时，再次同时记录130个不同x值时的光电倍增管15的信号；到y＝y+130微米时，再次同时记录130个不同x值时光电倍增管15的信号，扫描130微米x130微米的区域，并将这个130x130二维矩阵格点上所有的值记录了下来。
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