CN110231332B - 利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置及方法 - Google Patents

利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置及方法，包括依次沿激光脉冲方向设置的棱镜对、超陡长通滤波片、分束镜、物镜、聚光透镜、第一超陡短通滤波片、第二超陡短通滤波片、透镜以及第二光谱仪，分束镜的正下方设置有用于根据分束镜反射光束检测超陡长通滤波片产生的超陡边沿波长的第一光谱仪，待测样品设置在物镜和聚光透镜之间。本发明利用超陡滤波片产生的超陡边沿，实现探测光子频率位置的标记，将陷波滤波片移出系统外，进一步简化单光束CARS系统。

Description

利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置及 方法
技术领域
本发明涉及振动模式和分子结构检测领域，具体涉及一种利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置及方法。
背景技术
作为检测振动模式和分子结构最有用的光学技术之一，自发拉曼散射(SPR)光谱已经得到了的广泛应用。然而由于其自身信号强度弱的问题，SPR很难用于生物医学的快速成像。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的信号强度相比SPR要高5，6个数量级，在生物医学研究中得到广泛应用，尤其是在活细胞成像方面。CARS是一种三阶非线性光学过程，其中频率为ωP的泵浦光子和频率为ωS的斯托克斯光子在频率Ω＝ωP-ωS处相干地激发分子振动。随后使用频率为ωPR的探测光子探测激发的振动，在频率为ωaS＝ωPR+Ω处生成蓝移的反斯托克斯光子。尤其是，在人们利用两束重合的飞秒激光脉冲实现了活细胞的三维成像以后，CARS显微成像技术引起了人们极大的兴趣。CARS通常通过使用多光束或多光源方案(以满足泵浦光子，斯托克斯光子以及探测光子的频率成分要求)来执行，要求所有激发光束必须在空间上重叠。
尽管如此，作为三阶非线性效应的CARS过程，由于其固有的非共振信号往往比所需要的共振信号强两个数量级以上，而且，所测CARS光谱是非共振信号和共振新的干涉，这大大限制了CARS技术的发展。为了克服这一局限性，人们证明了偏振CARS显微技术,大大地抑制了非共振信号，但所需要的共振信号强度也不可避免地减弱大约一个数量级。
为简化CARS的复杂系统，且降低非共振信号的贡献，人们已经使用脉冲整形器成功演示了单光束CARS光谱。与替代方案相比，单波束CARS由于其自身的简单、紧凑性尤其具有吸引力。在单光束CARS中，所有必需的泵浦光子，斯托克斯光子和探测光子同时由单个宽带飞秒激光器提供。利用单光束CARS提取物质的振动谱或拉曼谱时，通常利用两种方法。一种是通过扫描泵浦光子与探测光子之间的时间差来分辨，即当该时间差等于分子振动周期的整数倍时，该振动得到了选择激发。另一种方法是通过标定探测光子的频率位置(ωPR)，测量蓝移反斯托克斯光子的光谱(ωaS)，拉曼光谱可以通过公式Ω＝ωaS-ωPR提取。
利用相位整形将一束宽带宽飞秒脉冲变为脉冲链，通过扫描脉冲链的子脉冲之间的固定时差可以选择激发分子的振动。由于非共振信号对于相位非常敏感，但共振信号却不敏感，因而相位整形还有助于提高信噪比，实现高光谱分辨率的单光束CARS。然而，这种方案由于整形技术的复杂性以及较低的探测灵敏度使其很难得到广泛的应用。
为了进一步简化CARS系统，使用陷波滤波器可以实现更简单的单波束CARS方法，无需脉冲整形器。通过在激光光谱上创建陷波特征(ωPR)，并在CARS谱上产生类似(尽管略微较弱)的特征(ωaS)。由于陷波滤波片的小巧、简单，容易安装于振镜扫描仪上对激光进行高频调制(高达几个kHz)。由于共振信号位置只与陷波频率位置ωPR有关，因此，可以利用自外差方法将非共振信号作为本地振荡器，除去非共振信号的同时放大较弱的共振信号。重要的是，这种方法可以用于所有基于光纤组件实现的CARS方案。这种方法还可以很容易地扩展到实现低频CARS光谱和显微镜，这对于研究大生物分子的低频振动模式很重要。
相比普通的多光束CARS和基于脉冲整形器实现的单光束CARS方案而言，上述基于陷波滤波片实现的单光束CARS方案要简单、紧凑的多。然而，陷波滤波片的引入，使得该系统仍然比较昂贵，相对复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法，以解决基于陷波整形实现的单光束CARS复杂、昂贵的问题，本发明利用超陡滤波片产生的超陡边沿，实现探测光子频率位置的标记，将陷波滤波片移出系统外，进一步简化单光束CARS系统。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置，包括依次沿激光脉冲方向设置的棱镜对、超陡长通滤波片、分束镜、物镜、聚光透镜、第一超陡短通滤波片、第二超陡短通滤波片、透镜以及第二光谱仪，分束镜的正下方设置有用于根据分束镜反射光束检测超陡长通滤波片产生的激发光谱超陡边沿波长的第一光谱仪，待测样品放置在物镜和聚光透镜之间。
进一步地，所述棱镜对用于对激光脉冲进行色散补偿，且棱镜对设置在一维精密平移台上。
进一步地，所述物镜置于第一三维精密平移台上；所述待测样品放置在石英玻璃管中，所述石英玻璃管置于第二三维精密平移台的样品槽上；所述聚光透镜置于第三三维精密平移台上。
利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法，包括以下步骤：
步骤一：启动激光脉冲，待激光脉冲稳定后，将激光脉冲依次经过棱镜对、超陡长通滤波片、分束镜和物镜后导入待测样品，调节物镜和聚光透镜的位置使得第二光谱仪测量的CARS光谱强度最大；
步骤二：利用第一光谱仪记录超陡长通滤波片产生的激发光谱超陡边沿的波长为λULPF1，同时记录这时的第二光谱仪测量的第一原始CARS光谱I1；然后旋转超陡长通滤波片使超陡边沿波长变化小于0.5nm，这时记录超陡长通滤波片产生的激发光谱超陡边沿波长为λULPF2时第二光谱仪测量的第二原始CARS光谱I2；
步骤三：将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别进行光滑处理，得到处理后的光谱的二次根，分别为
Figure GDA0002156005250000041
和
Figure GDA0002156005250000042
然后将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别归一化，并将归一化的结果差分，即得待测样品的拉曼光谱，公式如下：
Figure GDA0002156005250000043
进一步地，步骤一中激光脉冲在待测样品上的入射功率为10mW。
进一步地，步骤一中通过调节第一超陡短通滤波片和第二超陡短通滤波片的相对角度，以保证放入待测样品后第二光谱仪探测到的全部是CARS信号，而没有泄漏的入射激光。
进一步地，步骤一中通过调整物镜的位置使通过物镜的激光的焦斑位于待测样品的中部。
进一步地，步骤三中利用Matlab软件的smooth函数将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别光滑处理50次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明充分利用超陡长通滤波片具有的多功能特性，即它不仅具有普通长通滤波片除去入射激光波长较短的部分谱，而且它具有类似于陷波滤波的特性，即在入射激光光谱上产生锐利的超陡边沿作为标记，同时可以产生延时探测的功能(类似于谐振腔的效果)。假定这个超陡边沿的频率为ωSE，那么，频率为ωaS的原始CARS光谱可以直接利用第二光谱仪测量，而超陡边沿的频率ωSE由第一光谱仪测量。因此，拉曼谱就可以根据公式Ω＝ωaS-ωSE提取出来。这里，超陡长通滤波片的陡度决定了CARS光谱分辨率。该陡度越陡，则CARS光谱分辨率越高。这样，将陷波滤波片移出基于陷波整形的单光束CARS系统，CARS光谱仍然具有较高的分辨率，更重要的是，大大地简化了单光束CARS光谱系统，使其更加紧凑、灵巧，易操作，同时大大地降低了CARS成本，为商业化应用铺平了道路。另外，由于超陡长通滤波片和超陡短通滤波片无限接近，这种基于超陡滤波片简化的单光束CARS方法更加适合于探测频率更低的振动模式，即太赫兹振动谱。早期理论预言，生物大分子(如蛋白和DNA)在太赫兹波段具有大振幅的振动模式，而且这些振动模式对于研究生物大分子的相应生物功能具有重要的科学意义。因此，开发这种新的、更加简单灵巧的CARS装置和方法对于太赫兹波段生物研究具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为利用超陡滤波片简化CARS光谱的实验装置图；
其中，1、激光脉冲；2、棱镜对；3、超陡长通滤波片；4、分束镜；5、第一光谱仪；6、物镜；7、待测样品；8、聚光透镜；9、第一超陡短通滤波片；10、第二超陡短通滤波片；11、透镜；12、第二光谱仪。
图2为利用超陡滤波片简化CARS光谱的示意图；
图3为利用超陡滤波片简化的CARS光谱提取样品拉曼谱的实验案例图，其中(a)为激光脉冲通过超陡长通滤波片产生的超陡边沿分别在780nm和780.3nm的光谱图，(b)为超陡边沿分别在780nm和780.3nm时对应的四溴乙烷液体的两组原始测量CARS光谱图，(c)为经过将相应两组原始CARS光谱利用Matlab函数smooth光滑处理后的结果图，(d)为利用步骤三中公式提取出四溴乙烷液体的拉曼谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
参见图1和图2，一束脉冲宽度约为8fs激光脉冲(Thorlabs,OCTAVIUS-85M-HP)，中心波长为800nm，带宽约为60nm，经过一对放置于一维精密平移台(Thorlabs,PT1B)上的棱镜对2(Thorlabs,AFS-SF10)进行色散补偿后，通过一个超陡长通滤波片3(Semrock LP02-785RE)产生延时探测脉冲(频率为ωULPF)，然后经过一个分束镜4被分为两束，反射的第一束经过第一光谱仪5(CCS175)用于检测超陡长通滤波片3产生的超陡边沿的波长，透射的第二束光被置于第一三维精密平移台(Thorlabs，RB13M/M)上的物镜6(Newport,
Figure GDA0002156005250000061
0.4NA)聚焦于待测样品7上，待测样品7是放置在一个小石英玻璃管(Sigma,Z800015-1EA)内，然后置于第二三维精密平移台(Mad City Labs,Inc.Nano-Bios)的样品槽上。透射信号通过置于第三三维精密平移台(Mad City Labs,Inc.Nano-Bios)上的聚光透镜8(Edmund Optics，0.5NA)汇聚，再通过2个超陡短通滤波片(Semrock SP01-785RU)将入射激光滤掉，然后经过50mm的透镜11(Thorlabs,AC254-030-AB)导入连接第二光谱仪12(Jobin Yvon Triax 320)的光纤中，用于测量原始的CARS光谱。由于所产生的CARS信号中的共振CARS只与超陡边沿有关，非共振CARS与超陡边沿无关。通过微量地调节超陡长通滤波片的角度，测量两组原始的CARS光谱，将二者微分并归一化就可以得到低频振动谱或拉曼谱，包括亚太赫兹波段振动谱。本发明利用超陡长通滤波片的超陡边沿作为探测标记，将陷波滤波片移出系统，大大地简化了单光束CARS方案，如图1所示。这种方案中，超陡长通滤波片既具有长通的功能，而且具有类似于陷波滤波的特性，超陡边沿不仅起到长通的效果，而且具有延时探测的功能(类似于谐振腔中多次反射延迟的效果)。这个方案中，超陡长通波滤波片实现了较高的光谱分辨率(大约20cm-1)，其分辨率取决于超陡长通滤波片的陡度(在透射边沿，透射强度变化的最大斜率约为100％/(10cm-1))。超陡长通滤波片和超陡低通滤波片保证了入射激光无限地接近所探测的CARS信号，因而可以实现太赫兹振动谱的探测，如图2所示。
利用超陡滤波片简化的CARS光谱提取拉曼光谱的方法，包括以下步骤：
(1)启动激光，待激光稳定后，将约10mW的激光脉冲1导入待测样品7；调节棱镜对2(置于脉冲压缩器中)之间的相对距离优化第二光谱仪12测量的CARS光谱，这时色散得到补偿；调节物镜6的第一三维精密平移台和聚光透镜8的第二三维精密平移台使得CARS光谱强度最大；
(2)利用第一光谱仪5记录超陡长通滤波片3产生的超陡边沿的波长λULPF1，同时记录这时的第二光谱仪12测量的第一原始CARS光谱I1；微小地旋转超陡长通滤波片的波长变化小于0.5nm，这时记录超陡长通滤波片产生的超陡边沿的波长λULPF2时第二光谱仪12测量的第二原始CARS光谱I2；
(3)利用Matlab软件的smooth函数将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别光滑处理50次，得到处理后的光谱的二次根(分别是
Figure GDA0002156005250000071
和
Figure GDA0002156005250000072
)，将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别归一化，并将归一化的结果差分就是所得的拉曼光谱。即利用以下公式提取样品的拉曼谱为：
Figure GDA0002156005250000073
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述：
本实施例给出一种超陡滤波片简化的单光束CARS光谱方法，利用超陡滤波片产生的超陡边沿作为探测脉冲的标记，在常温常压下通过测量两组蓝移的原始CARS光谱提取四溴乙烷液体的拉曼谱。
本发明一种超陡滤波片简化的单光束CARS光谱方法的工作过程如下所示：
首先，启动激光，等激光稳定5分钟后，按锁模按钮，利用第一光谱仪5监视激光光谱的变化。当激光光谱变宽即表示激光已经得到了锁定。在放入待测样品之前，调节超陡长通滤波片3的位置使其处于780nm，如图3中(a)所示。利用第二光谱仪12检测微量入射光(约20微瓦)时是否有漏过去的激光，调节第一超陡短通滤波片9和第二超陡短通滤波片10的相对角度，直至完全没有漏过去激光为止，保证放入待测样品后探测到的全部是CARS信号。
其次，将四溴乙烷液体装进石英玻璃管并放入样品槽，调节物镜6的位置使激光的焦斑位于待测样品7中部。并调节脉冲压缩器中棱镜对2之间的距离，使得激光在待测样品7处的色散得到补偿。具体方法就是利用第二光谱仪12监视原始CARS光谱的强度，使其达到最大。同时，调节聚光透镜8的位置使得光谱仪光纤的耦合效率尽可能高。
再次，利用第二光谱仪12记录超陡长通滤波片3在780nm时原始CARS光谱I1。微小调节超陡长通滤波片的角度，使得超陡长通滤波片位于780.3nm，并记录此时的原始CARS光谱I2，如图3中(b)所示。利用Matlab中的smooth函数光滑地处理I1和I2得到处理后的
Figure GDA0002156005250000081
和
Figure GDA0002156005250000082
如图3中(c)所示。
最后，利用公式
Figure GDA0002156005250000083
提取出四溴乙烷的拉曼谱，如图3中(d)所示，从图中可以清楚地看到四溴乙烷液体的低频拉曼谱，如振动模式220,178,150,115,65cm-1。

Claims (2)

1.利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置，其特征在于，包括依次沿激光脉冲(1)方向设置的棱镜对(2)、超陡长通滤波片(3)、分束镜(4)、物镜(6)、聚光透镜(8)、第一超陡短通滤波片(9)、第二超陡短通滤波片(10)、透镜(11)以及第二光谱仪(12)，分束镜(4)的正下方设置有用于根据分束镜(4)反射光束检测超陡长通滤波片(3)产生的激发光谱超陡边沿波长的第一光谱仪(5)，待测样品(7)放置在物镜(6)和聚光透镜(8)之间；
所述棱镜对(2)用于对激光脉冲(1)进行色散补偿，且棱镜对(2)设置在一维精密平移台上；
所述物镜(6)置于第一三维精密平移台上；所述待测样品(7)放置在石英玻璃管中，所述石英玻璃管置于第二三维精密平移台的样品槽上；所述聚光透镜(8)置于第三三维精密平移台上。
2.利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱方法，采用权利要求1所述的利用超陡滤波片简化的相干反斯托克斯拉曼散射光谱装置，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：启动激光脉冲，待激光脉冲稳定后，将激光脉冲(1)依次经过棱镜对(2)、超陡长通滤波片(3)、分束镜(4)和物镜(6)后导入待测样品(7)，调节物镜(6)和聚光透镜(8)的位置使得第二光谱仪(12)测量的CARS光谱强度最大；
步骤二：利用第一光谱仪(5)记录超陡长通滤波片(3)产生的激发光谱超陡边沿的波长为λULPF1，同时记录这时的第二光谱仪(12)测量的第一原始CARS光谱I1；然后旋转超陡长通滤波片(3)使超陡边沿波长变化小于0.5nm，这时记录超陡长通滤波片(3)产生的激发光谱超陡边沿波长为λULPF2时第二光谱仪(12)测量的第二原始CARS光谱I2；
步骤三：将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别进行光滑处理，得到处理后的光谱的二次根，分别为
Figure FDA0003272372470000021
和
Figure FDA0003272372470000022
然后将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别归一化，并将归一化的结果差分，即得待测样品的拉曼光谱，公式如下：
Figure FDA0003272372470000023
其中，步骤一中激光脉冲(1)在待测样品上的入射功率为10mW；步骤一中通过调节第一超陡短通滤波片(9)和第二超陡短通滤波片(10)的相对角度，以保证放入待测样品后第二光谱仪(12)探测到的全部是CARS信号，而没有泄漏的入射激光；步骤一中通过调整物镜(6)的位置使通过物镜(6)的激光的焦斑位于待测样品的中部；步骤三中利用Matlab软件的smooth函数将第一原始CARS光谱I1和第二原始CARS光谱I2分别光滑处理50次。
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