CN110058393B - 一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法，所述装置包括照明模块、光束调制模块和微分干涉成像模块。其中，照明模块包括光源和第一望远镜单元；光束调制模块包括偏振片、光束数字调制单元以及第二望远镜单元，光束数字调制单元用于产生具有不同角度和相位的条纹结构光；微分干涉成像模块包括第三望远镜单元和成像单元。由光源发射的光依次经过第一望远镜单元、偏振片、光束数字调制单元、第二望远镜单元和第三望远镜单元后，由成像单元接收。本发明通过数字化光束调制单元产生条纹结构的照明光，能够获得待测样品两个正交方向上的相位梯度分布，实现对被测样品相位分布的定量测量。

Description

一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法。

背景技术

传统的光学显微成像只能获取样品的强度信息，无法对相位进行直接成像或测量，而相位分布往往能反映物体三维形貌、内部结构与折射率分布等信息，因而能够对样品的相位分布进行可视化或定量测量的成像技术具有重要意义。

1985年，中科院上海光学精密机械研究所徐毓光等人在专利CN85105355中提出利用半透半反镜把成像物光分成两束，并进行微分干涉的相衬显微装置。2012年，华中科技大学曾邵群等人在专利CN102998789中提出一种基于结构照明的超分辨微分干涉相衬显微成像方法，该方法中，微分干涉由传统的微分干涉相衬成像模块来实现的，结构照明仅仅是用来提高微分干涉相衬成像分辨率。上述两种装置均是通过折射分光形成一个方向上的微分干涉，虽然能提高透明样品的成像对比度，但是无法定量重构出样品的相位分布。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

本发明的一个方面提供了一种基于结构光照明的相位显微成像装置，包括照明模块、光束调制模块和微分干涉成像模块，其中，

所述照明模块包括光源和第一望远镜单元；

所述光束调制模块包括偏振片、光束数字调制单元以及第二望远镜单元，所述光束数字调制单元用于产生具有不同角度和相移的条纹结构光；

所述微分干涉成像模块包括第三望远镜单元和成像单元；

由所述光源发射的光依次经过所述第一望远镜单元、所述偏振片、所述光束数字调制单元、所述第二望远镜单元和所述第三望远镜单元后，由所述成像单元接收；

所述成像单元与待测样品经所述第三望远镜单元成像后的像面之间存在预定间距。

在本发明的一个实施例中，所述第一望远镜单元包括靠近所述光源的第一透镜和靠近所述偏振片的第二透镜；

所述第二望远镜单元包括靠近所述光束数字调制单元的第三透镜和靠近所述第三望远镜单元的第一物镜；

所述第三望远镜单元包括靠近所述第一物镜的第二物镜和靠近所述成像单元的第四透镜。

在本发明的一个实施例中，所述成像单元与待测样品经所述第三望远镜单元成像后的像面之间的间距为5～50mm。

在本发明的一个实施例中，所述光源为激光器或LED光源。

在本发明的一个实施例中，所述光束数字调制单元为透射式空间光调制器，用于加载周期P为50μm～300μm，相位阶为π的二进制光栅。

在本发明的一个实施例中，所述光束数字调制单元包括反射式空间光调制器和分光棱镜，其中，

所述反射式空间光调制器用于加载周期P为50μm～300μm，相位阶为π的二进制相位光栅或灰度值为0和1的二进制振幅光栅，所述反射式空间光调制器的反射面垂直于光线入射方向，且所述分光棱镜的反射面与所述反射式空间光调制器的反射面呈45°。

本发明的另一方面提供了一种基于结构光照明的相位显微成像方法，所述方法采用上述实施例中任一项所述的相位显微成像装置进行成像，所述方法包括：

获取两个不同方向的微分干涉条纹；

分别获取待测样品在所述两个不同方向的微分干涉条纹下的相位梯度；

根据所述相位梯度获得所述待测样品的相位图像的频谱分布，并对所述频谱分布进行傅里叶变换获得所述待测样品的相位分布。

在本发明的一个实施例中，获取两个不同方向的微分干涉条纹，包括：

利用光束数字调制单元分别加载方向正交的两组条纹光栅组，每组条纹光栅组均包括沿其法线方向移动8次，每次移动1/8个周期的条纹光栅；

通过光源分别照射每组条纹光栅组中的每个条纹光栅，获得条纹照明光，其中，所述条纹照明光在像面上的强度分布为：

I_illum(x,y)＝I₀+ΔIcos[2π(cosθ_m·x+sinθ_m·y)/P+nπ/4]，

其中，x，y为二维空间坐标，I₀和ΔI分别为所述照明条纹光的直透光幅度和条纹调制度，P为光栅条纹的周期，θ_m表示干涉条纹的角度，θ_m＝0°表示x方向上的条纹，θ_m＝90°表示y方向上的条纹，n表示条纹光栅移动次数，n＝1,2,3…8。

在本发明的一个实施例中，分别获取待测样品在所述两个不同方向的微分干涉条纹下的相位梯度，包括：

将所述待测样品在x轴方向条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1x、O_0x和O_+1x，所述光束O_-1x、O_0x、O_+1x分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

获得在x轴方向条纹照明光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1x、O_0x和O_+1x在所述成像单元上的干涉光强度：

其中，O为所述待测样品对于平面照明光的透过率，φ_x为x轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

将所述待测样品在y轴条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y，所述三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

获得在y轴方向条纹照明光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1y，O_0y，O_+1y在所述成像单元上的干涉光强度：

其中，φ_y为y轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

分别根据x轴方向和y轴方向的所述干涉光强度获取所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y。

在本发明的一个实施例中，根据所述相位梯度获得所述待测样品的相位图像的频谱分布，并对所述频谱分布进行傅里叶变换获得所述待测样品的相位分布，包括：

根据所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y，利用基于傅里叶变换的梯度积分方法，获得所述待测样品的频谱分布：

其中，υ_x和υ_y分别为空间频率域内x和y方向上的坐标，FT表示傅里叶变换；

通过对所述频谱分布进行傅里叶变换，获得所述待测样品的相位分布φ(x,y)。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的相位显微成像装置通过数字化光调制器产生条纹结构照明光，再通过离焦使得不同衍射级之间产生错位干涉，依次获得两个正交方向上的相位梯度分布，实现对被测样品相位分布的定量测量。

2、本发明的相位显微成像装置利用数字化器件(空间光调制器或数字微镜阵列)产生条纹结构光对样品进行照明，通过移动所加载的条纹结构光在不同衍射级之间产生相移，实现不同衍射级的分离，解决了不同衍射级之间的串扰，提高了相位成像的信噪比。

3、本发明所涉及的通过移动光栅实现相移的方法具有消色差特性，每次移动光栅1/8个周期，0级和±1级衍射光之间可得到π/4的相移，±1级衍射光之间可得到π/2的相移，该相移操作对波长不具有依赖性，因此放宽了照明光源的要求。

4、本发明的相位显微成像装置和方法所提出的微分干涉光路中，发生干涉的±1衍射光经过相同的光学元件到达成像器件并发生干涉，该物参共路的结构降低了装置对光源相干性的要求，也使得干涉成像不受环境扰动的影响，因此，相对于其它光路如数字全息显微，本专利所提出的光路更加稳定，并对光源单色性要求较低。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于结构光照明的相位显微成像装置的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的另一种基于结构光照明的相位显微成像装置的结构示意图；

图3是本发明实施例提供的基于条纹光照明的微分干涉示意图；

图4是本发明实施例提供的一种基于结构光照明的相位显微成像方法的流程图；

图5是本发明实施例提供的空间光调制器上加载的x轴方向上二进制光栅的示意图；

图6是在图5光栅形成的x轴方向结构光的照明下产生的样品干涉图样；

图7是应用本发明实施例的相位显微成像方法获得的猴子肾脏切片在x轴方向上的相位梯度图；

图8是应用本发明实施例的相位显微成像方法获得的猴子肾脏切片在y轴方向上的相位梯度图；

图9是应用本发明实施例的相位显微成像方法获得的猴子肾脏切片的相位图。

附图说明如下：

1-光源；2-第一望远镜单元；21-第一透镜；22-第二透镜；3-偏振片；4-光束数字调制单元；41-分光棱镜；5-第二望远镜单元；51-第三透镜；52-第一物镜；6-第三望远镜单元；61-第二物镜；62-第四透镜；7-成像单元；8-待测样品；9-物面。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于结构光照明的相位显微成像装置和方法进行详细说明。

有关本发明的前述及其它技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。

应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例一

请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于结构光照明的相位显微成像装置的结构示意图。本实施例的相位显微成像装置包括照明模块、光束调制模块和微分干涉成像模块，其中，所述照明模块包括光源1和第一望远镜单元2。光源1可以为激光器或LED光源。在本实施例中，光源1为激光器，进一步地为氦氖激光器。光源1产生的光线波长在可见光范围，输出激光功率稳定，用于照明待测样品。第一望远镜单元2用于将光源1产生的光束扩束准直成平行光。

所述光束调制模块包括偏振片3、光束数字调制单元4以及第二望远镜单元5，光束数字调制单元用于产生具有不同角度和相移的条纹结构光。偏振片3用于使光源1发射的光束转化为线偏振光以提高数字调制单元的调制效率。

所述微分干涉成像模块包括第三望远镜单元6和成像单元7；由光源1发射的光依次经过第一望远镜单元2、偏振片3、光束数字调制单元4、第二望远镜单元5和第三望远镜单元6后，由成像单元7接收。

进一步地，第一望远镜单元2包括靠近光源1的第一透镜21和靠近偏振片3的第二透镜22；第二望远镜单元5包括靠近光束数字调制单元4的第三透镜51和靠近第三望远镜单元6的第一物镜52；第三望远镜单元6包括靠近第一物镜52的第二物镜61和靠近成像单元7的第四透镜62。在本实施例中，第一透镜21、第二透镜22、第三透镜51、第四透镜62为消色差透镜，以减小相位畸变，提高成像质量。

此外，成像单元7与第三望远镜单元6的后焦面，即待测样品被第三望远镜系统成像的像平面9之间存在一定的间距，以形成离焦现象，使得不同衍射级之间能够产生错位干涉。

待测样品8放置在第一物镜52与第二物镜61之间。通过由第二望远镜系统5的滤波作用，光束数字调制单元4上加载的二进制条纹被成像到待测样品8上时变成了强度呈正弦分布的条纹光场。进一步地，待测样品8的像面9上的照明条纹周期P₁满足以下关系：P₁＝P×(M₂/M₁)，其中，M₁和M₂分别为第三望远镜系统6和第二望远镜系统5的放大倍率。

在本实施例中，光束数字调制单元4为相位型空间光调制器，能够加载相位阶为π的二进制相位光栅。相位型空间光调制器用于对光的相位进行调节，通过第二望远镜系统5滤波后在待测样品上产生明暗交替分布的条纹结构光场。所述相位型空间光调制器用于分别加载方向正交(例如沿x轴和沿y轴)的两组条纹光栅组，每组条纹光栅组均包括沿其法线方向移动8次，每次移动P/8的条纹光栅，相邻衍射级之间的相位差为π/8。在其它实施例中，光束数字调制单元4还可以是振幅型空间光调制器或数字微镜器件，所加载的光栅为灰度阶为0和1的二进制振幅光栅或渐变型正弦光栅。振幅型空间光调制器用于对光的振幅进行调节，同样能够产生明暗交替分布的条纹结构光场。

更进一步地，如图1所示，光束数字调制单元4为透射式空间光调制器，加载周期P为50μm～300μm，相位阶为π的二进制光栅。在该装置中，光束整体上呈轴向直线传播。

请参见图2，图2是本发明实施例提供的另一种基于结构光照明的相位显微成像装置的结构示意图。在其他实施例中，光束数字调制单元4包括反射式空间光调制器和分光棱镜41，其中，所述反射式空间光调制器用于加载周期P为50μm～300μm(即，8-64个空间调制器像素或数字微镜器件像素)，相位阶为π的二进制光栅，所述反射式空间光调制器的反射面垂直于光线入射方向，且分光棱镜41的反射面与反射式空间光调制器的反射面呈45°。分光棱镜41的引入是为了能是入射光被调制后仍然能沿光轴方向传播。在该装置中，由于反射式空间光调制器和分光棱镜41的反射作用，光束的传播方向发生变化。

优选地，所述反射式空间光调制器的加载周期P为50μm，即8个空间调制器像素或数字微镜器件像素。

需要说明的是，为了提高光强利用率，振幅型空间光调制器或数字微镜器件上所加载的条纹为正弦振幅条纹。相位空间光调制器上所加载的条纹为二进制条纹(相位阶为π的Ronchi光栅，即占空比为1:1的黑白平行线)，对应相位值为0和π，对应线宽约为8～24个像素。

事实上，对于二进制明暗条纹，可以看成不同周期的一系列正弦条纹的叠加，这些正弦条纹的空间频率分别为1/P、2/P、4/P、8/P…。当这些正弦条纹经过由第三透镜51和第一物镜52组成的缩束系统时，空间频率大于1/P的部分将被截至掉频率，因此在样品上的照明光仍然为基频正弦条纹。

在本实施例中，成像单元7为CCD相机，具体地为可见光CCD相机或红外CCD相机，具有合适的灰度阶、像素尺寸和像素数量。成像单元7与第四透镜62的样品像面9之间的间距优选地为5-50mm，从而保证了在CCD面上发生干涉的两光束具有0.05～0.5mm的横向错位。

具体地，在使用过程中，光源1发出的激光被由第一透镜21和第二透镜22组成的第一望远镜系统2扩束准直成平行光；偏振片3放置在该光束上，使其变为线偏振光；该线偏振照明光经过一透射式空间光调制器或反射式空间光调制器，变成明暗交替的条纹分布；该条纹照明光被由第三透镜51和第一物镜52组成的缩束系统成像到待测样品8上，待测样品8通常放置在第一物镜52和第二物镜61的公共焦平面上。在条纹结构光照明下，待测样品8被第二物镜61和第四透镜62组成的第三望远镜系统6成像到CCD相机前的样品像面9上。

在本实施例中，光束数字调制单元4用于产生具有不同角度和相位的条纹结构光。为了得到x和y方向上的正交微分干涉，光束数字调制单元4上将分别加载两组方向正交的条纹，即在x轴上形成一组相位阶为π的条纹，在y轴上形成一组相位阶为π的条纹，每组条纹沿着其法线方向移动8次，移动1/8个周期，用于再现样品的相位梯度。

具体地，若照明条纹在第四透镜物面9即像面上的周期为P，则所述条纹照明光在像面上的强度分布为：：

I_illum(x,y)＝I₀+ΔIcos[2π(cosθ_m·x+sinθ_m·y)/P+nπ/4] (i)

其中，x，y为二维空间坐标，I₀和ΔI分别为所述照明条纹光的直透光幅度和条纹调制度，P为光栅条纹的周期，θ_m表示干涉条纹的角度，θ_m＝0°表示x方向上的条纹，θ_m＝90°表示y方向上的条纹，n表示条纹光栅移动次数，n＝1，2，3…8。

待测样品8在该条纹的照明下，物光被分成了三束(O_-1，O₀，O₁)，分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至CCD面上，其强度被CCD所接受。请参见图3，图3是本发明实施例提供的基于条纹光照明的微分干涉示意图。像面9与CCD之间的距离记为d。在本实施例中，像面9与CCD之间的距离为5-50mm，从而保证了在CCD面上发生干涉的两光束具有0.05-0.5mm的横向错位，其中，沿±1级衍射光传播的物光相对于0级光的横向错位(剪切量)为d·tan[arcsin(λ/P)]，±1级衍射光之间的横向错位为2d·tan[arcsin(λ/P)]。在x轴条纹光的照明下产生的O_-1x，O_0x，O_1x这三束光，在CCD面上发生干涉，其干涉光强度分布可以表示为：

其中，O为所述待测样品对平面照明光的透过率，φ_x为x轴方向的相位梯度，P为光栅周期，n表示条纹光栅移动次数，n＝1，2，3…8。

具体地，公式(ii)中O_0x＝I₀·O(x，y)，O_+1x＝ΔI·O(x+Δx，y)·exp(i2πx/P+inπ/4)，O_1x＝ΔI·O(x-Δx,y)·exp(-i2πx/P-inπ/4)。由于Δx＝P/8为一微小量，这里O(x+Δx,y)和O(x-Δx,y)可近似为：O(x+Δx,y)＝O(x,y)·exp(iφ_x)，O(x-Δx，y)＝O(x,y)·exp(-iφ_x)。这是因为对于一相位物体，其振幅分布对于Δx引起的变化可以忽略。在公式(ii)中，前两项为O_-1x，O_0x，O_+1x的直透光量，与样品的相位分布无关，第三项为0级光和±1级衍射光之间的干涉项，第四项为+1级衍射光与-1级衍射光之间的干涉项。从公式(ii)中可以看出：通过在光束数字调制单元上沿着光栅矢量方向移动光栅可以在不同衍射项之间引入不同的相移量。具体地，当条纹移动1/8个光栅周期(即P/8)时，前两项不会出现相位差，第三项会出现π/4的相位差，而第四项会出现π/2的相位差。利用这一特性，通过将光栅沿光栅矢量方向移动光栅8次(每次移动1/8个周期)，可以实现不同干涉项的分离，消除了不同干涉像之间的串扰。

接着，利用相移再现方法，可以从Ι_1,x，Ι_2,x，…Ι_8,x中再现出：

由于Ι₀，ΔΙ，P均为已知量，只与加载的光栅有关，利用公式(v)和公式(iv)可以求解出被测样品在x方向上的相位梯度φ_x。以此类推，通过采用y方向上的照明条纹，可以获得在y轴条纹光的照明下产生的O_-1y，O_0y，O_+1y三束光在CCD面上发生干涉的强度分布，从而再现出被测样品在y方向的相位梯度φ_y。然后，利用基于傅里叶变换的梯度积分方法，可以得到被测相位φ(x，y)的频谱分布：

其中，υ_x和υ_y为x和y方向上空间频率坐标，，FT表示傅里叶变换；随后，通过将公式(vi)进行傅里叶变换，可以得到被测的相位分布。

本实施例的相位显微成像装置通过数字化光调制器产生条纹结构照明光，依次获得两个正交方向上的相位梯度分布，实现对被测样品相位分布的定量测量。本实施例的相位显微成像装置利用数字化器件(空间光调制器或数字微镜阵列)产生条纹结构光对样品进行照明，再通过离焦使得不同衍射级之间产生错位干涉，通过移动所加载的条纹结构光在不同衍射级之间产生相移，实现不同衍射级的分离，解决了不同衍射级之间的串扰，提高了相位成像的信噪比。

实施例二

在上述实施例的基础上，本实施例提出了一种基于结构光照明的相位显微成像方法。所述方法采用实施例一所述的相位显微成像装置进行成像。请参见图4，图4是本发明实施例提供的一种基于结构光照明的相位显微成像方法的流程图。该方法包括：

S1：获取两个不同方向的微分干涉条纹；

S2：分别获取待测样品在所述两个不同方向的微分干涉条纹下的相位梯度；

S3：根据所述相位梯度获得所述待测样品的相位图像的频谱分布，并对所述频谱分布进行傅里叶变换获得所述待测样品的相位分布。

进一步地，步骤S1包括：

S11：利用光束数字调制器分别加载方向正交的两组条纹光栅组，每组条纹光栅组均包括沿其法线方向移动8次，每次移动1/8个周期的条纹光栅；

S12：通过光源分别照射每组条纹光栅组中的每个条纹光栅，获得条纹照明光。

具体地，为了得到x和y方向上的正交微分干涉，空间光调制器上将分别加载两组方向正交的条纹，即在x轴上形成一组相位阶为π的条纹，在y轴上形成一组相位阶为π的条纹。每组条纹沿着其法线方向移动8次，移动1/8个周期，用于再现样品的相位梯度。

若照明条纹在第四透镜物面9即像面上的周期为P，则此处照明光的强度分布可表示为：

I_illum(x,y)＝I₀+ΔIcos[2π(cosθ_m·x+sinθ_m·y)/P+nπ/4] (1)

其中，x，y为二维空间坐标，I₀和ΔI分别为所述照明条纹光的直透光幅度和条纹调制度，P为光栅条纹的周期，θ_m表示干涉条纹的角度，θ_m＝0°表示x方向上的条纹，θ_m＝90°表示y方向上的条纹，n表示条纹光栅移动次数，n＝1，2，3…8。

进一步地，步骤S2包括：

S21：将所述待测样品在x轴方向条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1x、O_0x和O_+1x，所述光束O_-1x、O_0x、O_+1x分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

S22：获得在x轴方向条纹照明光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1x、O_0x和O_+1x在所述成像单元上的干涉光强度：

其中，O为所述待测样品对平面照明光的的透过率，φ_x为x轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

具体地，O_0x＝I₀·O(x，y)，O_+1x＝ΔI·O(x+Δx,y)·exp(i2πx/P+inπ/4)，O_1x＝ΔI·O(x-Δx,y)·exp(-i2πx/P-inπ/4)。由于Δx＝P/8为一微小量，这里O(x+Δx,y)和O(x-Δx,y)可近似为：O(x+Δx,y)＝O(x,y)·exp(iφ_x)，O(x-Δx，y)＝O(x,y)·exp(-iφ_x)。这是因为对于一相位物体，其振幅分布对于Δx引起的变化可以忽略。在公式(2)中，前两项为O_-1，O₀，O₁的直透光量，与样品的相位分布无关，第三项为0级光和±1级衍射光之间的干涉项，第四项为+1级衍射光与-1级衍射光之间的干涉项。从公式(2)中可以看出：通过在光束数字调制单元上沿着光栅矢量方向移动光栅可以在不同衍射项之间引入不同的相移量。具体地，当条纹移动1/8个光栅周期(即P/8)时，前两项不会出现相位差，第三项会出现π/4的相位差，而第四项会出现π/2的相位差。利用这一特性，通过将光栅沿光栅矢量方向移动光栅8次(每次移动1/8个周期)，可以实现不同干涉项的分离，消除了不同干涉像之间的串扰。

S23：将所述待测样品在y轴条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y，所述三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

S24：获得在y轴方向条纹光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1y，O_0y，O_+1y在所述成像单元上的干涉光强度：

其中，O为待测样品对平面照明光的的透过率，φ_y为y轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

S25：分别根据x轴方向和y轴方向的所述干涉光强度获取所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y。

具体地，如上所述，

将上述公式进行下述推导：

利用相移再现方法，可以从Ι_1,x，Ι_2,x,…Ι_8,x中再现出：

由于Ι₀，ΔΙ，P均为已知量，与加载的光栅有关，利用公式(6)和公式(7)可以求解出被测样品在x方向上的相位梯度φ_x。类似地，通过采用y方向上的照明条纹，可以获得在y轴条纹光的照明下产生的O_-1y，O_0y，O_+1y三束光在CCD面上发生干涉的强度分布，从而再现出被测样品在y方向的相位梯度φ_y，即：

利用公式(8)和公式(9)可以求解出被测样品在y方向上的相位梯度φ_y。

进一步地，步骤S3包括：

根据所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y，利用基于傅里叶变换的梯度积分方法，获得所述待测样品的频谱分布，计算公式为：

其中，υ_x和υ_y分别为空间频率域内x和y方向上的坐标，FT表示傅里叶变换；

通过对公式(10)进行傅里叶变换，获得所述待测样品的相位分布φ(x,y)。

接着，以一小鼠的肾脏切片作为被测样品来研究本实施例的相位显微成像方法的成像效果。将肾脏切片被测样品放置在第一物镜52与第二物镜61的公共焦平面上。所使用的激光器为He-Ne激光(波长633nm)，第一望远镜单元2的放大倍率为40X，第一物镜52和第二物镜61的放大倍率均为10X，数值孔径为NA＝0.25，第三透镜51和第一物镜52组成的第二望远镜单元5以及第二物镜61和第四透镜62组成的第三望远镜系统的综合放大率为50X。空间光调制器(Holoeye LCR-2500，1024x768pixels，pixel size 19μm)上依次加载了法线分别沿x和y方向的二进制光栅(由16个像素来描述，明暗各占8个像素)。每个方向下的光栅将沿着光栅法线方向移动8次，每次1/8个光栅周期，请参见图5，图5是本发明实施例提供的空间光调制器上加载的x轴二进制光栅的示意图。与空间光调制器加载的图像一一对应，CCD相机上记录下每一次结构光照明下对应的干涉图样，如图6所示。

利用公式(6)和(7)，可以从这8个涉图样中求解出被测样品在x方向上的相位梯度分布φ_x，如图7所示。同理，通过加载y方向的照明结构光，并利用公式(8)和(9)可以得到样品在y方向上的相位梯度φ_y，如图8所示。最后，利用公式(10)对φ_x和φ_y进行积分，可以得到被测样品(猴子肾脏切片)的相位分布，如图9所示。从图中可以清晰看到呈环状分布的肾脏细胞，同时还可以定量分析每个细胞相对于周围液体引起的相位延迟。

本实施例所涉及的通过移动光栅实现相移的方法具有消色差特性，每次移动光栅1/8个周期，0级和±1级衍射光之间可得到π/4的相移，±1级衍射光之间可得到π/2的相移，该相移操作对波长不具有依赖性，因此放宽了照明光源的要求。本实施例的相位显微成像装置和方法所提出的微分干涉光路中，发生干涉的±1衍射光经过相同的光学元件到达成像器件并发生干涉，该物参共路的结构降低了装置对光源相干性的要求，也使得干涉成像不受环境扰动的影像，因此，相对于其它光路如数字全息显微，本实施例所提出的光路更加稳定，并对光源单色性要求较低。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，包括照明模块、光束调制模块和微分干涉成像模块，其中，

所述照明模块包括光源(1)和第一望远镜单元(2)；

所述光束调制模块包括偏振片(3)、光束数字调制单元(4)以及第二望远镜单元(5)，所述光束数字调制单元用于产生具有不同角度和相移的条纹结构光；

所述微分干涉成像模块包括第三望远镜单元(6)和成像单元(7)；

由所述光源(1)发射的光依次经过所述第一望远镜单元(2)、所述偏振片(3)、所述光束数字调制单元(4)、所述第二望远镜单元(5)和所述第三望远镜单元(6)后，由所述成像单元(7)接收；

所述成像单元(7)与待测样品(8)经所述第三望远镜单元(6)成像后的像面(9)之间存在预定间距；

其中，所述光束数字调制单元(4)具体用于：

分别加载方向正交的两组条纹光栅组，每组条纹光栅组均包括沿其法线方向移动8次，每次移动1/8个周期的条纹光栅；

通过所述光源(1)分别照射每组条纹光栅组中的每个条纹光栅，获得条纹照明光。

2.根据权利要求1所述的基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，所述第一望远镜单元(2)包括靠近所述光源(1)的第一透镜(21)和靠近所述偏振片(3)的第二透镜(22)；

所述第二望远镜单元(5)包括靠近所述光束数字调制单元(4)的第三透镜(51)和靠近所述第三望远镜单元(6)的第一物镜(52)；

所述第三望远镜单元(6)包括靠近所述第一物镜(52)的第二物镜(61)和靠近所述成像单元(7)的第四透镜(62)。

3.根据权利要求2所述的基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，所述成像单元(7)与待测样品(8)经所述第三望远镜单元(6)成像后的像面(9)之间的间距为5-50mm。

4.根据权利要求1所述的基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，所述光源(1)为激光器或LED光源。

5.根据权利要求1所述的基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，所述光束数字调制单元(4)为透射式空间光调制器，用于加载周期为50μm～300μm，相位阶为π的二进制光栅。

6.根据权利要求1所述的基于结构光照明的相位显微成像装置，其特征在于，所述光束数字调制单元(4)包括反射式空间光调制器和分光棱镜(41)，其中，

所述反射式空间光调制器用于加载周期为50μm～300μm，相位阶为π的二进制相位光栅或灰度值为0和1的二进制振幅光栅，所述反射式空间光调制器的反射面垂直于光线入射方向，且所述分光棱镜(41)的反射面与所述反射式空间光调制器的反射面呈45°。

7.一种基于结构光照明的相位显微成像方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至6中任一项所述的相位显微成像装置进行成像，所述方法包括：

获取两个不同方向的微分干涉条纹；

分别获取待测样品在所述两个不同方向的微分干涉条纹下的相位梯度；

根据所述相位梯度获得所述待测样品的相位图像的频谱分布，并对所述频谱分布进行傅里叶变换获得所述待测样品的相位分布。

8.根据权利要求7所述的基于结构光照明的相位显微成像方法，其特征在于，获取两个不同方向的微分干涉条纹，包括：

利用光束数字调制单元分别加载方向正交的两组条纹光栅组，每组条纹光栅组均包括沿其法线方向移动8次，每次移动1/8个周期的条纹光栅；

通过光源分别照射每组条纹光栅组中的每个条纹光栅，获得条纹照明光，其中，所述条纹照明光在像面上的强度分布为：

I_illum(x,y)＝I₀+ΔIcos[2π(cosθ_m·x+sinθ_m·y)/P+nπ/4]，

其中，x，y为二维空间坐标，I₀和ΔI分别为所述照明条纹光的直透光幅度和条纹调制度，P为光栅条纹的周期，θ_m表示干涉条纹的角度，θ_m＝0°表示x方向上的条纹，θ_m＝90°表示y方向上的条纹，n表示条纹光栅移动次数，n＝1,2,3…8。

9.根据权利要求8所述的基于结构光照明的相位显微成像方法，其特征在于，分别获取待测样品在所述两个不同方向的微分干涉条纹下的相位梯度，包括：

将所述待测样品在x轴方向条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1x、O_0x和O_+1x，所述光束O_-1x、O_0x、O_+1x分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

获得在x轴方向条纹照明光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1x、O_0x和O_+1x在所述成像单元上的干涉光强度：

I_n,x＝|O_0x+O_+1x+O_-1x|²

＝|I₀O|²+2|ΔI·O|²+4I₀ΔI|O|²cos(φ_x+2πx/P+nπ/4)，

+2ΔI²|O|²cos(2φ_x+4πx/P+nπ/2)

其中，O为所述待测样品对于平面照明光的透过率；φ_x为x轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

将所述待测样品在y轴方向条纹照明光的照明下形成的物光分成三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y，所述三束横向错位的光束O_-1y，O_0y，O_+1y分别沿照明条纹的0级、±1级衍射方向传播至所述成像单元；

获得在y轴方向条纹照明光的照明且不同光栅相位下，所述光束O_-1y，O_0y，O_+1y在所述成像单元上的干涉光强度：

I_n,y＝|O_0y+O_+1y+O_-1y|²

＝|I₀O|²+2|ΔI·O|²+4I₀ΔI|O|²cos(φ_y+2πy/P+nπ/4),

+2ΔI²|O|²cos(2φ_y+4πy/P+nπ/2)

其中，φ_y为y轴方向的相位梯度，P为光栅周期；

分别根据x轴方向和y轴方向的干涉图样获取所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y。

10.根据权利要求9所述的基于结构光照明的相位显微成像方法，其特征在于，根据所述相位梯度获得所述待测样品的相位图像的频谱分布，并对所述频谱分布进行傅里叶变换获得所述待测样品的相位分布，包括：

根据所述待测样品在x轴上的相位梯度φ_x和y轴上的相位梯度φ_y，利用基于傅里叶变换的梯度积分方法，获得所述待测样品的频谱分布：

其中，υ_x和υ_y分别为空间频率域内x和y方向上的坐标，FT表示傅里叶变换；

通过对所述频谱分布进行傅里叶变换，获得所述待测样品的相位分布φ(x,y)。

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