CN102812404A - 一种数字全息显微及成像技术用途及检测已标记细胞样本的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种数字全息显微及成像技术的用途及方法，所述数字全息显微及成像技术用于检测细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述细胞的分子或构造的方法，所述抗体直接附着在所述细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述细胞上。
Description
技术领域 本发明涉及一种数字全息显微及成像技术的用途及方法，所述数字全息显微及成像技术用于检测细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述细胞的分子或构造的方法，所述抗体直接附着在所述细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述细胞上。
背景技术
人们对生物研究对象信息的更丰富更精确的需求永远都不会停止，比如人体、动物体、植物体以及其它生物体中的细胞。细胞非常细小并且只有极少的部分构造可以通过光学显微镜轻易辨识。现在已经开发了很多可以将细胞及细胞构造看得更清楚的不同方法。这些方法中有很多都会包括将整个细胞或者部分细胞构造着色的着色步骤。所着的颜色可以是荧光的或者非荧光的。比如台盼蓝就是广为使用的对整个细胞着色的非荧光着色剂。台盼蓝只能用在死细胞上。由于不同的着色剂的属性不同，给细胞着色的具体方法也随之变化。比较新颖的一种标记方法是激发细胞自身产生荧光物质，比如产生绿色荧光蛋白（GFP）。这种标记可以是选择性的，只显示特定细胞构造，或者是非选择性的，显示整个细胞。另一种广泛使用的方法叫做免疫标记，该方法使用抗体来标记细胞。抗体是脊椎动物体液中的一种蛋白质。抗体会附着到某些物质或者分子上去，比如细菌或病毒，这些东西随后就被当做外来对象，抗体针对非常特殊的结构。这一特性对生物学或者医学研究是非常有用的，因为抗体可以用于辨识细胞或者细胞的部分结构中非常特别的微小构造。抗体非常难于检测，但是他们可以跟很多种不同的分子或者构造相缀合使他们清晰可见。不同的抗体缀合物适合不同的检测方法，比如光学显微、电子显微、光谱测定或者放射性测定。缀合后的抗体可以用于直接附着目标。如果需要更强的标记，则可以通过先用未标记抗体附着目标然后用第二波的缀合后的抗体附着第一波的未缀合的抗体来对标记做放大。第一波抗体叫做主抗体而第二波叫做二级抗体。进一步地，如果标记还需要更强的话还可以使用更多层次的抗体。
不同的着色剂、标记物以及抗体缀合物有不同的光学特性，比如对几种或者许多种不同波长的光的吸收能力，释放特定波长的光的能力，散射光或者偏振光的能力。这些不同的特性使得着色剂在使用光学显微镜、相差显微镜、荧光显微镜或流式细胞仪的时候显示出不同颜色或者有荧光效果。也可以使用譬如分光光度计或者荧光分析仪测量这些着色剂、标记物或缀合物。
可以提供不同吸光率的抗体缀合物有量子点、塑料球、玻璃珠以及半导体。可以散射光或偏振光的抗体缀合物有磁性微球、金颗粒、纳米晶体或磁珠。
数字全息显微使得对活细胞的研究不再需要标记。在WO2009/154558中描述了一个数字全息显微所使用的观测器皿以及使用所述器皿进行数字全息显微的方法，其中披露了数字全息显微技术使得对活细胞的研究不再需要标记或着色。事实是数字全息显微及成像提供了单色图像，这意味着直到现在人们还没有关注把这样的技术用于分析标记或着色的细胞样本。标记的使用越来越多，对这些标记的兴趣以及将这些标记运用到不同的样本分析中去的兴趣也不断增加。
WO2007/073345披露了一种使用数字全息显微技术研究细胞的方法，其中披露了分析细胞生长阶段的方法以及实现分析的设备。
如前所述，WO2009/154558披露了另外一种使用数字全息显微技术研究细胞的方法。
如前述所言，数字全息显微及成像技术提供的是单色光图像。这意味着就像发明WO2007/073345以及发明WO2009/154558定义的那样，该技术尚未在使用已标记以及已着色的细胞样本方面引起关注。
发明内容
本发明提供一种数字全息显微及成像技术检测至少一个细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述细胞的分子或构造的用途，所述抗体直接附着在所述细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述细胞上。
而且，本发明还提供一个检测该分子或构造的方法，所述方法对细胞样品进行数字全息显微并成像的步骤，包括：
a）生成至少一束物光以及至少一束参考光，并且所述至少一束物光以及所述至少一束参考光为相干光；
b）将所述细胞样本置于所述至少一束物光照射之下；
c）将穿过所述细胞样本的所述至少一束物光与所述至少一束参考光叠加从而生成干涉图；
d）检测所述干涉图，即全息图；
e）重建所述干涉图的物光波前的相位和/或振幅信息；
f）构建至少一个细胞分析图像来检测至少一个细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测所述至少一个细胞的已缀合抗体的分子或构造，所述抗体直接附着在所述至少一个细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述至少一个细胞上。
具体实施方式
在数字全息显微技术中，不需要依据不同的焦平面机械地调整显微镜就可以研究多个焦平面。只需要通过处理收集到的数据就可以对不同的焦平面进行研究了。所以，可以得到三维图像。尤其是该方法的不良干扰较少，噪音水平较低，细胞样本的相位以及振幅信息精准并且细胞样本的全息图像分辨率高。
在一个本发明的方法的实施例之中，相干的至少一束物光以及至少一束参考光是通过将来自一个相干光源的一束光分成两束得到的，比如使用分光器。来自相干光源的光束可以是激光束。所述激光束可以来自任何激光源，比如氦氖激光器或者二极管激光器。优选为使用二极管激光器。激光源可以线性偏振。
物光以及参考光是相干光，这意味着它们有共同的波长并且在时序中会表现出恒定的相位关系。
物光穿过细胞样本。由于参考光被导向不同于物光的路径，比如使用分光器、镜子和/或光纤，所以参考光不受细胞样本影响。
物光在穿过细胞样本之前有已知的波前。当物光通过该至少一个细胞样本的时候，该细胞样本实质上不会吸收任何光线，但是穿过细胞样本的光线较之穿过周围媒介其光程会不同。从细胞样本出来的波前，即物光波前，会发生相移。当然参考光也有已知的波前。用物理的或几何的厚度乘以折光率就是光程。
在本发明的方法的一个实施例中，穿过细胞样本的至少一束物光与至少一束参考光的叠加是通过将两束光集合在一起实现的，比如使用另一个分光器。这种叠加会生成干涉图样，它包括被所述至少一个细胞样本影响过的物光波前的信息。
在本发明的方法的一个实施例中，使用数字传感器检测所述干涉图样，比如CCD或CMOS。检测到的干涉图样叫做全息图。
为了将所述通过细胞样本的至少一束物光与至少一束参考光进行叠加并由此生成干涉图样并检测干涉图样，就要用到傅里叶法或菲涅耳法。优选为使用菲涅耳法。傅里叶法和菲涅尔法的差别在于光学构造，不同的光学构造意味着在满足某种条件的时候得到不同的近似值，例如一个菲涅尔近似值，用于重建算法。这个近似值简化了图像重建的过程。在菲涅尔法中，所述条件是指物体与传感器之间的距离比物体以及传感器的尺寸要大。该条件是通过使用一个显微镜物镜收集物体散射的光并以几乎平行的光束的形式将散射的光导给传感器来实现的。这样就生成了一个远离传感器的虚拟对象。
通过检测到的干涉图样，物光波前的相位和/或振幅信息得以重建。所述重建可以通过任何常见的数值重建进行，比如傅里叶变换重建或者积分重建。振幅信息可以用于设置想要的焦平面。重建的信息可以用于获得所研究的细胞样本的二维或三维图像。
作为生成一束物光和一束参考光的替代方案，还可以使用同轴数字全息技术。本技术领域人员显然很容易根据本说明书的描述知道如何修改本发明的方法从而使用同轴数字全息术。
取得的一个图像可以进一步用于计算机图形处理以认定所研究的对象的有用信息，比如形状、容量以及光密度。
取得的多个图像也可以进一步用于图形处理以认定所研究的对象的其它有用信息，比如形状、容量以及光密度的变化。
本发明的具体的实施例
在某些实施例中，分子或者构造或者抗体是附着在所述至少一个细胞的细胞表面的。这进一步改进了本发明的友好性，因为伤害细胞的风险降低了。
在使用本发明的数字全息显微以及成像系统的某些实施例中，分子或构造在特定波长范围内具有一个吸光峰值和/或偏移该数字全息显微及成像技术所用的光的偏振方向的能力。利用在特定波长范围内具有吸光峰值的特点的分子或构造就可以对这些分子或构造进行检测。利用在具有偏移光束的偏振方向的特点的分子或构造就可以对分子或构造进行检测。
根据本发明的数字全息显微及成像技术的应用的一个具体实施例，对至少一个细胞上的一处或多处的不止一种类型的分子或构造进行着色或标记，或者与同一类型的抗体相缀合，所述抗体可以是直接附着也可以间接通过另一抗体或一条链上的多个抗体附着到所述至少一个细胞上，并且其中至少一种分子或构造在特定波长范围内有吸光峰值且至少一种分子或构造会偏移该数字全息显微及成像技术中使用的光束的偏振方向。根据这一实施例，在特定波长范围有吸光峰值的分子或构造以及可以偏移偏振方向的分子或构造是一起使用的，即使用两种不同的分子或构造。通过将这些特性缀合起来，就有可能取得由不同波长的光所生成的图像以及由不同偏振方向所生成的图像这两种图像。
当同时取得这两种图像时，对细胞以及附着在其上的分子或构造的检测的可靠性就增加了。
根据本发明的数字全息显微及成像技术的应用的一些实施例，使用的具体分子或构造在特定波长范围内具有一个吸光峰值并且能偏移数字全息显微及成像技术所使用的光的偏振方向。在这些实施例中，分子或构造既可以在特定波长范围内高峰吸光也可以偏移偏振方向，也就是只使用一种分子或构造。如前所述，通过缀合这些特性，既可以取得由不同波长的光所生成的图像也可以取得由不同偏振方向所生成的图像。当同时取得这两种图像的时候，对分子或构造的检测就更可靠了，从而对这些分子或构造所附着的细胞的检测也更可靠了。
根据本发明的数字全息显微及成像技术的应用的一些实施例，用来照射所述分子或构造的数字全息显微以及成像技术所使用的光至少有两种彼此不相同的波长。通过用至少有两种不同波长的光来照射分子或构造，检测分子或构造的可靠性提高了。
根据本发明的数字全息显微及成像技术的应用的一些实施例，数字显微成像系统会偏移其使用的至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。通过偏移物光和/或参考光的偏振方向，检测分子或构造的可靠性提高了。
优选地，所述至少一束物光以及至少一束参考光的偏振方向偏移以后得到的偏振方向彼此垂直或大体上相互垂直。开始的时候所述至少一束参考光以及所述至少一束物光的偏振方向通常是一样的。然而，为了检测能够随机改变光束偏振方向的分子或构造，与所述至少一束参考光相关的所述至少一束物光的偏振方向应当偏移到使彼此垂直的方向。根据本发明的这一实施例，没有必要使所述至少一束参考光与所述至少一束物光之间的角度精确到90或270度才能用来检测能偏移光束偏振方向或能随机改变偏振方向的分子或构造。然而，随着所述至少一束物光的偏振方向与所述至少一束参考光的偏振方向的角度偏移成直角，要检测分子及构造会更容易。根据本发明，小于或大于90度的角也可以，比如75-89度的角或91-105度的角或者是255-269度或271-285度的角。但是，在角度为90度或270度的时候，可以检测的干涉图样只会来自于本身可以随机改变偏振方向的分子或构造。
根据本发明的一个具体实施例的有关方法，其中使用了两个或以上的波长的光，其中所使用的具体的分子或构造在一个波长范围内有一个吸光峰值，所述波长范围包含所使用的两个或以上的波长中的一个但不是全部，并且其中针对所使用的每个波长都进行了步骤a）到f）的操作，从而使得可以将在步骤f）中由不同波长生成的，一个所述细胞的图像以及另一相同所述细胞的图像进行比较。
通过使用两个或以上的波长光束，是可以提高本发明的方法的可靠性的。如果使用的分子或构造在特定波长范围内有吸光峰值，那就可以使用至少一个波长在该范围内的光束以及一个波长不在该范围内的光束。如此一来，对该分子或构造的实际检测就可以确定了。
此外，通过使用至少两个波长的光并各自产生一个图像，就可以将取得的图像进行对比。由于在特定波长范围具有吸光峰值的分子或构造的波长范围至少覆盖了所使用的波长中的一个而不覆盖另一个，所以所述分子或构造至少会影响图像中的一个而不影响另一个。通过比较被影响的图像和未被影响的图像就可以检测分子或构造了。
实施这种涉及两个或以上波长的方法的一种方式是针对所使用的波长之一进行步骤a）到步骤f）然后再针对所使用的另一波长进行步骤a）到f），如果使用的波长在两个以上，则对剩余的波长一一进行步骤a）到f）。
一种替代的方式是先对所使用的一个波长进行步骤a）到d）再对使用的另一波长进行步骤a）到d），如果使用了两个以上波长则对剩余的波长一一进行步骤a）到d）。之后可以对所有使用的波长同时进行步骤e）到f）。这一替代方式提高了实施该方法的速度减少了实施本方法的时间。
在本发明的方法的一些实施例中，使用的是两种波长，一种包含在所使用的具体的分子或构造的吸光峰值所在的波长范围内，另一种则不在该范围内，这样的实施例中会生成两个细胞分析图像来进行对比。
一般说来，实施该方法使用两种不同波长就足够了，因为可以得到一张被分子或构造影响的图以及一张未被分子或构造影响的图。这样，就能够比较两张不同的图并检测分子或构造。通过仅使用两个波长，本方法的效率较使用两个以上的波长也会提高。但是使用两个以上波长的话精确度会提高。
根据本发明的方法的另一具体实施方式，所使用的特定的分子或构造会偏移光束的偏振方向，并且该实施例中步骤a）到f）的进行的次数中，至少有一次在步骤a）中不会包括偏移物光和/或参考光的偏振方向的步骤，并且至少有一次在步骤a）中会包括偏移物光和/或参考光的偏振方向的步骤，从而能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在步骤f）中由不同偏振方向生成的图像中进行比较。
在这一实施例中，至少生成一个被所使用的分子或构造偏移了偏振方向的图。当物光或参考光的偏振方向被偏移以后，会随机偏移偏振方向的分子或构造就可以被看见了。对所述至少一个物光和/或至少一个参考光的其中之一进行偏移从而让它们彼此呈垂直或几乎垂直，并且不引入任何自身能够偏移偏振方向的分子或构造，这样就会得到一个不会显示任何东西的“零图样”。但是根据本发明的这一实施例，如果使用了分子或构造，则所述分子或构造会偏移偏振方向，则所述偏移会在图样中显示。这也是一种消除相关不确定性的方式——如果你实际上观察的是至少一个已标记或已着色细胞的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述至少一个细胞的分子或构造，并且所述抗体直接附着在所述至少一个细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述至少一个细胞上。
必须认识到的一点是“偏移所述至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向”并不包括同时偏移所述至少一束物光以及至少一束参考光，因为同时偏移生成的图像会与不偏移物光和/或参考光的彼此相对的偏振方向生成图像等效，即回到初始的位置或偏移到与进行偏移之前等效的位置。
根据本发明的方法的一个具体实施例，使用的具体分子或构造会偏移光束的偏振方向，并且其中步骤a）到f）实施的次数中至少一次包括且至少一次不包括在步骤a）中对物光和/或参考光的偏振方向进行偏移，所述偏移是使二者的偏振方向垂直或几乎垂直，由此使得可以将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在步骤f）中由不同偏振方向生成的图像中进行比较。让物光与相关的参考光的光束偏振方向垂直的益处之前已经做过进一步的描述。
这种涉及步骤a）到f）的执行并且在步骤a）中包括或不包括物光和/或参考光的偏移的方法的实施方式之一是在执行步骤a）到步骤f）的时候在步骤a）中不进行物光和/或参考光的偏移，然后再次执行步骤a）到f）的时候进行物光和/或参考光的偏移。
一个替代的方式是先执行a）到d）一次并且在步骤a）中不进行所述偏振，然后再执行a）到d）一次并且在步骤a）中进行所述偏振。然后，步骤e）到f）可以接着之前执行过的步骤继续执行。这一替代方式提高了该方法的执行速度，也就是降低了执行该方法的时间。
在根据本发明的某些实施例，使用了一种以上的分子或者构造，并且其中至少有一种分子或者构造在特定波长范围内有吸光峰值并且至少还有一种分子或构造会偏移所述至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。在这些实施例中，在特定波长范围内有吸光峰值的以及具有偏移所述物光和/或参考光的偏振方向能力的分子或构造是一起使用的，也就是说，有用到两种不同类型的分子或构造。通过缀合这些特性，就有可能同时取得不同波长的光生成的图像以及不同偏振方向的光生成的图像。当同时取得这两种图像的时候，对分子或构造所附着的细胞的检测的可靠性就提高了。
在本发明的方法的某些实施例中，所使用的具体的分子或构造在在特定波长范围内有吸光峰值并且能够偏移至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。在这些实施例中，使用了同时具有吸光峰值以及偏移能力的分子或构造，也就是使用了一种类型的分子或构造。如前所述，通过缀合这些特性，我们有可能同时取得不同吸光峰值以及不同偏振方向产生的图像，那么对分子或构造的检测的可靠性就增加了，所以对分子或构造所附着的细胞的检测的可靠性也提高了。
在本发明的方法的某些实施例中使用了两种以上的波长，并且其中所使用的分子或构造中至少有一种的吸光峰值的波长范围至少覆盖了一个所使用的所述波长，但是没有覆盖所使用的所有波长，其中针对所使用的每一个波长都进行一次步骤a）到步骤f）的操作，并且其中所使用的分子或构造中至少有一种类型能够偏移光线的偏振方向，其中步骤a）到步骤f）的过程中在步骤a）至少有一次会对至少一束物光和/或至少一束参考光进行偏移并且至少有一次不对至少一束物光和/或至少一束参考光进行偏移，从而可以对所述一个细胞及至少另一个相同细胞在不同波长以及不同偏振方向产生的图像中进行对比。在这些实施例中会取得由不同波长的光束所产生的图像以及由不同偏振方向所产生的图像。所以，能够同时分析这两种因素，从而使得对分子或构造的检测的可靠性以及对分子或构造所附着的细胞的检测的可靠性都提高了。该方法的这些实施例中至少产生三个图像。这些图像其中之一可以是使用第一波长并且在步骤a）中不做额外处理（偏移）得到的参考图。这些图像其中之一还可以是使用第二波长并且在步骤a）中不做额外处理（偏移）得到的图像。这些图像其中之一还可以是使用第一波长但是在步骤a）中作额外处理（偏移）的来的图形。但是，为了增加该方法的精确度，不同波长的光束得到的图像的数量以及不同偏振方向的光得到的图像的数量都可以增加。而且，同样在这一案子中，所述至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向可以进行偏移从而使得所述物光和参考光的偏振方向呈垂直或几乎垂直的状态。
Claims (17)
1.一种数字全息显微及成像技术的应用，用于检测至少一个细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述细胞的分子或构造，所述抗体直接附着在所述细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述细胞上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子或构造或抗体附着于所述至少一个细胞的表面。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述分子或构造在特定波长范围内具有吸光峰值和/或能够偏移所述数字全息显微及成像技术中所使用的光束的偏振方向。
4.根据权利要求1到3任意一项所述的应用，其特征在于，至少一个细胞上的同一位置或多个位置的至少两种以上类型的分子或构造进行了标记或者着色或者与同一种抗体进行了缀合，所述抗体直接附着到所述至少一个细胞或者间接通过另一个抗体或者一条链上的多个抗体附着到所述至少一个细胞上，并且其中至少一种分子或构造在特定波长范围内具有吸光峰值并且其中至少一种分子或构造会偏移所述数字全息显微及成像技术中所用的光束的偏振方向。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所使用的分子或构造在特定波长范围内具有吸光峰值并且能够偏移所述数字全息显微及成像技术中所使用的光束的偏振方向。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的应用，其特征在于，所述数字全息显微及成像技术使用具有两种波长彼此不同的光束照射所述分子或构造。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的应用，其特征在于，所述数字全息显微及成像技术用于偏移所述数字全息显微及成像技术中使用的至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的应用，其特征在于，所述数字全息显微及成像技术用于偏移所述数字全息显微及成像技术中使用的至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向，从而使得所述至少一束物光以及所述至少一束参考光彼此的偏振方向相互垂直或几乎垂直。
9.一种检测至少一个细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测已缀合抗体的所述细胞的分子或构造的方法，所述抗体直接附着在所述细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述细胞上，所述方法包括针对细胞样品执行数字全息显微和成像的步骤，执行执行数字全息显微和成像是通过下列步骤实现的：
a）生成至少一束物光以及至少一束参考光，并且所述至少一束物光以及所述至少一束参考光为相干光；
b）将所述细胞样本置于所述至少一束物光照射之下；
c）将穿过所述细胞样本的所述至少一束物光与所述至少一束参考光叠加从而生成干涉图；
d）检测所述干涉图，即全息图；
e）重建所述干涉图的物光波前的相位和/或振幅信息；
f）构建至少一个细胞分析图像来检测至少一个细胞的已标记或已着色的分子或构造，或者检测所述至少一个细胞的已缀合抗体的分子或构造，所述抗体直接附着在所述至少一个细胞上或者通过另外一个抗体或者另外一个链上的多个抗体附着在所述至少一个细胞上。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用两种以上的波长的光束，其中所使用的分子或构造在特定波长范围内具有吸光峰值，所述特定波长范围覆盖至少一种光束，但是不覆盖所有的所述的两种以上的波长的光束，并且其中针对所用的每一种波长都进行一次步骤a）到f），使得能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在步骤f）中由不同波长所生成的图像中进行比较。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，使用了两种波长的光束，其中一种处于所述分子或构造的吸光峰值所要求的特定波长范围内，另一种不处于所述特定波长范围内，并且其中构建两种细胞分析图像进行比较。
12.如权利要求9-11中任意一项所述的方法，其特征在于，所使用的分子或构造能够偏移光束的偏振方向，并且其中步骤a）到f）的执行中，在步骤a）中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，使得能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在步骤f）中由不同偏振方向所生成的图像中进行比较。
13.如权利要求9-12中任意一项所述的方法，其特征在于，所使用的分子或构造能够偏移光束的偏振方向，并且其中步骤a）到f）的执行中，在步骤a）中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，从而使得所述至少一束物光以及所述至少一束参考光彼此的偏振方向垂直或几乎垂直，使得能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在步骤f）中由不同偏振方向所生成的图像中进行比较。
14.如权利要求9-13中任意一项所述的方法，其特征在于，使用了不止一种分子或构造并且其中至少一种分子或构造在特定波长范围内有吸光峰值并且至少一种分子或构造能够偏移所述至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。
15.如权利要求9-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所使用的分子或构造在特定波长范围内具有吸光峰值并且能够偏移所述至少一束物光和/或至少一束参考光的偏振方向。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，使用了至少两种波长的光束，其中所使用的分子或构造中至少有一种在特定波长范围内有吸光峰值，所述波长范围覆盖至少一种所述波长的光束，但是不覆盖所用的全部两种以上所述波长的光束，其中步骤a）到f）针对每种所述波长的光束均执行一次，并且其中所用的分子或构造至少有一种能够偏移光束的偏振方向，其中步骤a）到f）的执行中，在步骤a）中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，使得能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在由不同波长及偏振方向生成的图像中进行比较。
17.如权利要求14-16中任意一项所述的方法，其特征在于，使用了至少两种波长的光束，其中所使用的分子或构造中至少有一种在特定波长范围内有吸光峰值，所述波长范围覆盖至少一种所述波长的光束，但是不覆盖所用的全部两种以上波长的光束，其中步骤a）到f）针对每种所述波长的光束均执行一次，并且其中所用的分子或构造至少有一种能够偏移光束的偏振方向，其中步骤a）到f）的执行中，在步骤a）中至少有一次包偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束参考光的偏振方向，使得所述至少一束物光和/或至少一束参考光彼此的偏振方向垂直或几乎垂直，从而能够将一个所述细胞以及另一相同所述细胞在由不同波长及偏振方向生成的图像中进行比较。
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