CN108956575B - 一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统，通过创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

Description

一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统

技术领域

本发明涉及超分辨显微成像技术领域，特别涉及一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统。

背景技术

在生命科学技术飞速发展的今天，为了进一步了解和研究生命体之间的相互作用、疾病的产生机理，人们迫切需要获得更加精确的细胞内部的结构信息。但是，由于光学衍射极限的存在，常规的光学显微镜的分辨率只能达到200nm左右，难以满足现代生物医学的需要。近年来，单分子定位超分辨荧光显微技术的出现，如光敏定位显微术(PLM)、随机光学重建显微术(STORM)、荧光光敏定位显微技术(FPLM)等，它们克服了衍射极限，达到20nm的横向分辨率和100nm的轴向分辨率，有力地推动了生命科学的发展，广泛应用于生物医学的各个领域。虽然单分子定位超分辨成像系统能够实现超分辨成像,但是较低的轴向分辨率仍有待改善。为了克服这一问题，有研究人员在光路中加入柱面镜，将单分子定位显微的景深扩展到600nm；或者在探测光路中引入特殊相位，将点扩散函数变为双螺旋的形式，实现荧光分子在轴向±2μm范围内的三维定位；或者将探测光路分光并引入光程差，通过计算两路光的光程差来获得荧光分子的轴向位置，使成像景深达到1μm。虽然这些方法显著地提升了单分子定位超分辨成像系统的成像景深，但对于厚度约10μm的完整细胞而言，现有的方法还不能满足多分子追踪时的大景深要求。

为了获取整个细胞的信息，传统方法是对同一细胞的不同轴向位置的层面进行一系列扫描探测，再由相关算法将所有层面信息按照轴向位置排序合成，还原出整个细胞内的分子信息。但是，在三维扫描的过程中，不同层面的信息会相互影响，产生背景噪声和荧光漂白，降低分辨率。一些研究者提出使用变形光栅对样品进行多层面探测，但由于变形光栅的能量主要分布在衍射的0级与±1级，故该方法最多只能对细胞内九个不同层面同时成像，因此，在实现大的轴向探测范围的同时无法保持较高的轴向分辨率。

因而现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统，可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种单分子定位显微成像方法，其包括如下步骤：

创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；

多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块的步骤包括：

对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅；

将双螺旋点扩散函数相位引入所述变形多值纯相位光栅中，获得具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述双螺旋点扩散函数相位为光瞳平面沿直径方向上的涡旋光的叠加：

其中i²＝-1；(x,y)为相位片的光瞳坐标；(x_k,y_k)为第k个螺旋光的相位奇点的坐标；R_dh为光瞳半径；N_dh为螺旋光的数目,当N_dh增加时，光强更加集中在两个旁瓣上；M为(N_dh-1)/2；d为相邻的涡旋奇点的距离。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述变形多值纯相位光栅的透过率函数为：

其中，(x,y)为变形多值纯相位光栅入瞳面的坐标；Λ为x方向上光瞳孔径中心的光栅周期；

R为变形多值纯相位光栅的光瞳半径，n₀是聚焦区域的折射率，K为常数，W₂₀为离焦系数，m为衍射级，C_m为对应的衍射系数。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述衍射系数C_m为：

其中N是一个周期内被划分的块数；

是第n块的相位分布值。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅的步骤包括：

根据公式

计算得到

并生成一个二值相位光栅，在一个归一化的周期内，其光栅条纹的每个离散的相位所占宽度为

引入与公式

中相同的离焦相位ψ_w，其透过率表达式为

其中M₀为傅里叶级数截断级，其m级的衍射系数A_m为

取T_grating(x,y)的实数部分，并将数值大于0的部分赋值为1，数值小于0的部分赋值为-1，得到黑白相间的光栅相位分布；

将

的值依序赋值到黑和白的相位区域内，将二值相位转换为多值相位的形式。

所述的单分子定位显微成像方法中，所述光学模块的相位函数为：

其中，

为双螺旋相位片的相位，

为变形多值纯相位光栅的相位。

一种用于单分子定位显微成像的光学组件，其包括沿光路传输方向依次设置的：

第一透镜，用于将待测分子发出的荧光进行准直；

光学模块，具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束；

第二透镜，用于将所述成像光束输出以用于成像。

一种单分子定位显微成像系统，其包括沿光路传输方向依次设置的：

探测物镜，用于接收含有待测分子发出的荧光的光束；

滤光片，用于对所述光束进行滤波并输出所述荧光；

双色镜，用于对所述荧光进行反射；

管镜，用于将反射的荧光聚焦并向成像组件输出；

成像组件，采用如上所述的光学组件，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束；

探测器，用于接收所述成像光束并进行双螺旋及多阶成像。

所述的单分子定位显微成像系统中，还包括：

偏振片，位于所述双色镜和管镜之间，用于将所述荧光转换为适用于空间光调制器的线偏振光。

相较于现有技术，本发明提供的单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统中，所述单分子定位显微成像方法通过创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

附图说明

图1为本发明提供的单分子定位显微成像方法的流程图。

图2为双螺旋点扩散函数相位片和双螺旋点扩散函数在不同轴向位置的光强分布。

图3为双螺旋点扩散函数两个旁瓣旋转角度与z轴位置的关系曲线。

图4为变形多值纯相位光栅的设计示意图。

图5中的(a)图为一维变形多值纯相位光栅成像原理图。

图5中的(b)图为二维变形多值纯相位光栅成像原理。

图6为二维变形多值纯光栅的相位分布图。

图7中的(a)图为点光源位于前焦点处的成像结果。

图7中的(b)图为点光源位于z＝0.5Δz位置的成像结果。

图7中的(c)图为点光源位于z＝-12Δz位置的成像结果。

图8为探测面上不同衍射级光强分布。

图9为本发明提供的用于单分子定位显微成像的光学组件的示意图。

图10为本发明提供的单分子定位显微成像系统第一优选实施例的示意图。

图11为本发明提供的单分子定位显微成像系统第二优选实施例的示意图。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统，可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，本发明提供的单分子定位显微成像方法包括如下步骤：

S100、创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；

S200、多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；

S300、根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；

S400、根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。

通过双螺旋点扩散函数(DH-PSF)实现单分子定位是基于一种被称为自成像的现象。DH-PSF是一种特殊的点扩散函数，在其传播横截面上，光强分布呈现为两个相对的旁瓣，随着物体在轴向离焦距离的变化，原本水平方向上的两个旁瓣会发生旋转和缩放，如图2所示。而且旋转的角度与离焦距离成正比关系，如图3所示。基于这一特性，DH-PSF可以用来对三维空间中的稀疏粒子进行横向和轴向的高精度定位。本发明通过创建综合了双螺旋点扩散函数及变形多值纯相位光栅多阶成像双重效应的光学模块，多阶成像的景深较大，双螺旋成像的分辨率较高且具有一定的景深，多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过上述光学模块成像时，可以将细胞样品中不同层面的分子信息以双螺旋点扩散函数的形式成像在同一像平面的不同位置，并且相互之间的光强相近，一方面通过多阶成像和双螺旋成像大幅度扩大了景深，另一方面通过双螺旋成像显著的提高了分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

具体地，所述步骤S100包括：

S101、对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅；

S102、将双螺旋点扩散函数相位引入所述变形多值纯相位光栅中，获得具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块。

本实施例中，通过多值相位编码技术对传统的变形光栅进行相位编码，获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅(以下简称为DMVPPG)，其与传统的变形光栅一样，具备菲涅耳波带片的透镜作用，在不同衍射级具有不同焦距的透镜效应；另一方面，对于传统的变形光栅，入射光能主要分布在低衍射级上，高衍射级上的信号难以被探测，而DMVPPG在需要的几个衍射级上的光强分布趋于一致，从而能够探测到更高衍射级的信息，并且本发明设计的DMVPPG具有纯相位结构，相比振幅光栅，其效率大大提高，并且在活动了变形多值纯相位光栅后，通过波前编码将双螺旋点扩散函数相位引入所述变形多值纯相位光栅中，获得具有复合功能的全息相位片，即具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块。波前编码是用于使用一个或多个专门设计的相位掩模来创建诸如透镜之类光学模块的光学传递函数的方法，其为现有技术，此处不作详述。

具体实施时，传统方法获得DH-PSF的过程较为复杂，需要寻找位于拉盖尔高斯(Laguerre-Gauss,LG)模式平面上特定直线上的LG模式，将这些模式进行线性叠加得到DH-PSF，并对其相位分布进行迭代优化，来获得高效率的相位模板，本实施例中使用一种简单方法设计DH-PSF，基于涡旋的传播性质和螺旋光的基础理论，把DH-PSF解析为光瞳平面沿直径方向上的涡旋光的叠加，其数学表达式如下：

式中i²＝-1；(x,y)为相位片的光瞳坐标；(x_k,y_k)为第k个螺旋光的相位奇点的坐标；R_dh为光瞳半径；N_dh为螺旋光的数目，当N_dh增加时，光强更加集中在两个旁瓣上；M为(N_dh-1)/2；d为相邻的涡旋奇点的距离，当d增大时，两个旁瓣的相对距离会随之增大。相比于传统方法，该方法大幅降低了DH-PSF相位片的设计难度，并且具有更高的定位精度和效率。

本实施例中，所述变形多值纯相位光栅的透过率函数为：

式中(x,y)为DMVPPG为入瞳面的坐标；Λ为x方向上光瞳孔径中心的光栅周期；

R为DMVPPG的光瞳半径，n₀是聚焦区域的折射率，K是常数，决定变形光栅不同衍射级的焦距大小,当光栅紧贴透镜时，K为聚焦透镜的数值孔径，W₂₀为光栅的离焦系数。m为衍射级，其对应的衍射系数C_m表示如下：

式中N是一个周期内被划分的块数；

是第n块的相位分布值，它的选取直接决定了衍射级之间光强分布。

因此，通过最优化算法，可以寻找合适的相位值来使得所需要的β个衍射级的光强分布相当，即|C_m|²＝|C₀|²。在实际光栅相位生成中，先根据(3)式计算得到

并生成一个二值相位光栅，在一个归一化的周期内，其光栅条纹的每个离散的相位所占宽度为

之后引入(2)式中相同的离焦相位ψ_w，其透过率表达式如下：

其中M₀为傅里叶级数截断级，其m级的衍射系数A_m为

取T_grating(x,y)的实数部分，并将数值大于0的部分赋值为1，数值小于0的部分赋值为-1，这样可以得到一个黑白相间的光栅相位分布；最后，将

的值依序赋值到黑和白的相位区域内，将原本的二值相位转换为多值相位的形式，如图4所示。当DMVPPG透过率函数中离焦系数W₂₀＝0时，光栅退化为多值纯相位光栅(MVPPG)，相位条纹产生弯曲，在不同衍射级上引入了不同焦距的透镜效应，其m衍射级对应的焦距

这一特性使得样品内不同轴向位置的信息(相邻的两个样品面的间隔为Δz)从左到右的成像在同一平面，其原理如图5(a)所示，当样品面位于轴上不同位置时，经3×3的DMVPPG和透镜成像在探测面，其成像位置与物方样品位置之间的关系如图5(b)所示。在纳米分辨多分子追踪系统中，相比于变形光栅，这种新型的复合功能全息相位片可以获得更高的清晰度和更多细胞层的信息，有效地提高单分子定位显微镜的成像深度。

以下结合具体应用实施例对本发明采用的单分子定位显微成像方法理论模拟结果进行说明：

首先，设计生成5×5的DMVPPG，如图6所示，像素数为600×600，像素尺寸为10μm；单个周期的划分块数N＝4，对应的相位值

分别为1.1165π，0.7761π，1.8472π和0.7761π；K＝0.4841；周期Λ＝200μm；x,y方向的离焦系数分别为W_20,x＝10λ，W_20,y＝50λ。接着根据(1)式生成双螺旋相位，其像素数和像素尺寸与DMVPPG相同，其中N_dh＝9,d＝0.7R_dh，旋转180°对应的轴向范围为1.125μm，最后根据波前编码技术将两者相位结合，生成新的全息相位片，即同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块。

在物方轴上的不同位置，依次模拟点光源作为细胞中的分子，两个相邻的点光源距离为0.5μm，经4f系统后成像在CCD的探测面上，根据光源的不同的轴向位置，在焦平面的对应区域形成双螺旋点扩散函数，如图8所示，其中虚线区域为对应双螺旋点扩散函数的放大图。当点光源位于4f系统透镜的前焦点处，探测面上形成清晰的双螺旋点，位于整个视场中心，如图7(a)所示，双螺旋的两个旁瓣保持水平。当点光源与前焦点的距离为0.5Δz时，其恰好位于物方相邻两个成像层面的中间位置，因此衍射零级和衍射+1级上会同时出现光强相等的双螺旋点，它们分别顺时针旋转40°和逆时针旋转40°。如图7(b)所示。当光源距离焦点距离-12Δz时，双螺旋点分别出现在视场的左上角，如图7(c)所示。通过上面的模拟实验结果，可以证明本申请中同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的全息相位片能够达到理论上的最大扩展深度，有效地将系统探测范围提升到±6μm。相比于传统的多焦面超分辨单分子定位荧光显微系统，大幅提高了样品的成像层数，将样品内相邻的两个探测面的间隔缩小到0.5μm，提高了轴向的分辨率。最后，将每个衍射级的强度进行统计，并进行归一化计算，如图8所示。可以看出多值相位编码有效地将光强均匀分布到所需要的25个衍射级上，提高了高衍射级的光强分布。

基于上述单分子定位显微成像方法，本发明相应提供一种用于单分子定位显微成像的光学组件，如图9所示，所述光学组件包括沿光路传输方向依次设置的第一透镜901、光学模块902和第二透镜903。其中，光学模块902具有上述的双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束，具体请参阅上述方法对应的实施例，此处不再赘述。通常，光学系统通过探测待测分子发出的荧光对分子进行定位追踪，该系统中，第一透镜901将待测分子发出的荧光进行准直并向光学模块902输出，光学模块902将准直后的荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束，然后由第二透镜903输出，将成像光束聚焦于探测器904的像平面上，在探测器上实现双螺旋及多阶成像，通过成像面上的双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置可以确定待测分子的横向位置，通过双螺旋旁瓣的中心及两旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。

在本实施例中，光学模块902具体可以是通过光刻的方法制作的相位版，也可以直接采用空间光调制器，该光学模块902的相位函数如上述方法实施例所述，此处不再赘述。

基于上述用于单分子定位显微成像的光学组件，本发明相应提供一种单分子定位显微成像系统，将本发明的成像方法与超分辨荧光显微成像方法(如PALM，STORM)相结合，实现超大景深单分子定位显微成像探测，如图10所示，所述单分子定位显微成像系统包括沿光路的传输方向依次设置的探测物镜1、滤光片2、双色镜3、管镜4、成像组件5及探测器6。其中，成像组件5采用如上所述的光学组件。作为一种实现方式，该光学组件5中的光学模块53具体可以是一相位片，用于将荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束。

在该系统中，探测物镜1位于待测物的出光侧，待测物被激发光激发后可发出荧光，含有激发光和荧光及其他杂散光的光束由探测物镜1接收，该光束经过滤光片2的滤光作用后滤除激发光及杂散光，透过荧光，荧光经双色镜3反射至管镜4，通过管镜4进行聚焦并传输至光学组件5的第一透镜51，荧光光束通过相位片后转变为双螺旋及多阶成像光束，最后通过第二透镜52聚焦于探测器6的成像面上，在成像面上形成双螺旋的像点。

作为另一种实现方式，如图11所示，光学模块53还可以采用空间光调制器来显示相位片的相位函数，实现相位片的功能。此时，该成像系统还包括位于双色镜3和管镜4之间的偏振片7，用于将荧光光束转换为线偏振光，以适用于空间光调制器。如上述方法实施例所述，该光学模块53是通过波前编码技术，将DMVPPG与DH-PSF结合产生的，其相位分布为：

其中，

为双螺旋相位片的相位，

为变形多值纯相位光栅的相位，即由双螺旋相位片的相位

与变形多值纯相位光栅的相位

线性叠加而成，这种全息相位片可以将不同样品面的分子信息以双螺旋点扩散函数的形式成像在同一探测面上不同位置，并且它们之间的光强趋于一致，可将其放入到图11的显微成像系统中，实现相位的调制功能。

上述成像系统通过本发明提供的光学组件并基于本发明提供的成像方法进行双螺旋及多阶成像，利用多阶成像的大景深效应及双螺旋成像的高精度轴向定位效应，同时实现了超大景深及高分辨率的单分子定位显微成像，成像景深可达十几微米，可实现任意深度亚细胞的动态范围成像，又可获得多个运动分子的动态功能图像，适用于完整细胞的三维纳米分辨成像。该单分子定位显微成像系统既可以单独用于细胞成像，也可内置于细胞成像以及其它成像设备中，因此，设有该成像系统的成像设备也在本发明的保护范围内。

综上所述，本发明提供的单分子定位显微成像方法、光学组件及成像系统中，所述单分子定位显微成像方法通过创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置。可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置，在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率，解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种单分子定位显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：

创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块；

多个样品面的待测分子发出的荧光光束通过所述光学模块后在同一探测面的不同位置成像得到各自的双螺旋图像；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中心在成像面上的位置确定待测分子的横向位置；

根据所述双螺旋图像中双螺旋旁瓣的中点及两个旁瓣之间的连线的旋转角度确定待测分子的轴向位置；

所述创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块的步骤包括：

对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅；

所述变形多值纯相位光栅的透过率函数为：

其中i²＝-1，(x,y)为变形多值纯相位光栅入瞳面的坐标；Λ为x方向上光瞳孔径中心的光栅周期；离焦相位

R为变形多值纯相位光栅的光瞳半径，n₀是聚焦区域的折射率，K为常数，W₂₀为离焦系数，m为衍射级，C_m为对应的衍射系数，λ为光的波长；

所述衍射系数C_m为：

其中N是一个周期内被划分的块数；

是第n块的相位分布值；

在光栅相位生成中，生成一个二值相位光栅，将

的值依序赋值到二值相位光栅的相位区域内，将原本的二值相位转换为多值相位的形式。

2.根据权利要求1所述的单分子定位显微成像方法，其特征在于，所述创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块的步骤还包括：

将双螺旋点扩散函数相位引入所述变形多值纯相位光栅中，获得具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块。

3.根据权利要求2所述的单分子定位显微成像方法，其特征在于，所述双螺旋点扩散函数相位为光瞳平面沿直径方向上的涡旋光的叠加：

其中(x,y)为相位片的光瞳坐标；(x_k,y_k)为第k个螺旋光的相位奇点的坐标；R_dh为光瞳半径；N_dh为螺旋光的数目,当N_dh增加时，光强更加集中在两个旁瓣上；M为(N_dh-1)/2。

4.根据权利要求1所述的单分子定位显微成像方法，其特征在于，所述对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅的步骤包括：

根据公式

计算得到

并生成一个二值相位光栅，在一个归一化的周期内，其光栅条纹的每个离散的相位所占宽度为

引入与公式

中相同的离焦相位ψ_w，其透过率表达式为

其中M₀为傅里叶级数截断级，其m级的衍射系数A_m为

取T_grating(x,y)的实数部分，并将数值大于0的部分赋值为1，数值小于0的部分赋值为-1，得到黑白相间的光栅相位分布；

将

的值依序赋值到黑和白的相位区域内，将二值相位转换为多值相位的形式。

5.根据权利要求2所述的单分子定位显微成像方法，其特征在于，所述光学模块的相位函数为：

其中，

为双螺旋相位片的相位，

为变形多值纯相位光栅的相位。

6.一种用于单分子定位显微成像的光学组件，其特征在于，包括沿光路传输方向依次设置的：

第一透镜，用于将待测分子发出的荧光进行准直；

光学模块，具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束；

第二透镜，用于将所述成像光束输出以用于成像；

创建同时具有双螺旋点扩散函数和变形多值纯相位光栅多阶成像性质的光学模块的步骤包括：

对变形光栅进行相位编码获得多值相位形式的变形多值纯相位光栅；

所述变形多值纯相位光栅的透过率函数为：

其中i²＝-1，(x,y)为变形多值纯相位光栅入瞳面的坐标；Λ为x方向上光瞳孔径中心的光栅周期；离焦相位

R为变形多值纯相位光栅的光瞳半径，n₀是聚焦区域的折射率，K为常数，W₂₀为离焦系数，m为衍射级，C_m为对应的衍射系数，λ为光的波长；

所述衍射系数C_m为：

其中N是一个周期内被划分的块数；

是第n块的相位分布值；

在光栅相位生成中，生成一个二值相位光栅，将

的值依序赋值到二值相位光栅的相位区域内，将原本的二值相位转换为多值相位的形式。

7.一种单分子定位显微成像系统，其特征在于，包括沿光路传输方向依次设置的：

探测物镜，用于接收含有待测分子发出的荧光的光束；

滤光片，用于对所述光束进行滤波并输出所述荧光；

双色镜，用于对所述荧光进行反射；

管镜，用于将反射的荧光聚焦并向成像组件输出；

成像组件，采用如权利要求6所述的光学组件，用于将所述荧光转换为具有双螺旋及多阶成像性质的成像光束；

探测器，用于接收所述成像光束并进行双螺旋及多阶成像。

8.根据权利要求7所述的单分子定位显微成像系统，其特征在于，还包括：

偏振片，位于所述双色镜和管镜之间，用于将所述荧光转换为适用于空间光调制器的线偏振光。

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