JP2002228934A - 走査型顕微鏡 - Google Patents
走査型顕微鏡Info
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Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 調整可能な光学的手段を介し、ST
ED-顕微鏡のために必要な（極めて小さい）分解能を得
ることができる走査型顕微鏡を提供すること。 【解決手段】 照明光路と、顕微鏡光学系と、第
一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少
なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内
において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦さ
れかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦され
ており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域に
おいて光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域
で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及び第二
合焦領域が少なくとも部分的に重畳している走査型顕微
鏡は、前記照明光路（４１）に配される部材の光学的性
質が、前記２つの合焦領域が走査運動に依存することな
く互いに位置不変に留まるよう光学的収差が補正される
ように、互いに調整されることを特徴とする。
ED-顕微鏡のために必要な（極めて小さい）分解能を得
ることができる走査型顕微鏡を提供すること。 【解決手段】 照明光路と、顕微鏡光学系と、第
一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少
なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内
において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦さ
れかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦され
ており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域に
おいて光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域
で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及び第二
合焦領域が少なくとも部分的に重畳している走査型顕微
鏡は、前記照明光路（４１）に配される部材の光学的性
質が、前記２つの合焦領域が走査運動に依存することな
く互いに位置不変に留まるよう光学的収差が補正される
ように、互いに調整されることを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は走査型顕微鏡に関す
る。本発明は、特に、照明光線と、顕微鏡光学系と、第
一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少
なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内
において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦さ
れかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦され
ており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域に
おいて光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域
で誘導される放出（誘導放出）を惹き起こし、かつ、該
第一及び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳してい
る走査型顕微鏡に関する。
る。本発明は、特に、照明光線と、顕微鏡光学系と、第
一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少
なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内
において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦さ
れかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦され
ており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域に
おいて光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域
で誘導される放出（誘導放出）を惹き起こし、かつ、該
第一及び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳してい
る走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】走査型顕微鏡では、試料（ないし被検
物）から放出される反射光又は蛍光を観察するために、
試料は光線で照明される。照明光線の合焦スポットは、
調節可能な光線偏向装置によって、一般的には２つのミ
ラーの傾動によって、物体（被検物）面内で移動させら
れるが、偏向軸（複数）は、一方のミラーがＸ方向に、
他方のミラーがＹ方向に偏向を行うように、大抵互いに
直角に配されている。ミラーの傾動（運動）は、例え
ば、ガルバノメータ位置調節素子によって行われる。被
検物から生じる光のパワーは、走査光線の位置に依存し
て測定される。実際のミラー位置を求めるために、通
常、位置調節素子にはセンサ（複数）が設けられてい
る。
物）から放出される反射光又は蛍光を観察するために、
試料は光線で照明される。照明光線の合焦スポットは、
調節可能な光線偏向装置によって、一般的には２つのミ
ラーの傾動によって、物体（被検物）面内で移動させら
れるが、偏向軸（複数）は、一方のミラーがＸ方向に、
他方のミラーがＹ方向に偏向を行うように、大抵互いに
直角に配されている。ミラーの傾動（運動）は、例え
ば、ガルバノメータ位置調節素子によって行われる。被
検物から生じる光のパワーは、走査光線の位置に依存し
て測定される。実際のミラー位置を求めるために、通
常、位置調節素子にはセンサ（複数）が設けられてい
る。
【０００３】特に共焦点走査型顕微鏡においては、被検
物は、光線の合焦スポットにより三次元で走査される。
物は、光線の合焦スポットにより三次元で走査される。
【０００４】共焦点走査型顕微鏡は、一般に、光源と、
光源の光をピンホール遮光器−所謂励起遮光器（絞り）
−で合焦させる合焦光学系と、ビームスプリッタと、光
線制御用の光線偏向装置と、顕微鏡光学系と、検出用遮
光器（絞り）と、検出光ないし蛍光を検出するための検
出器（複数）を有する。照明光線は、ビームスプリッタ
によって入射結合される。被検物から発する蛍光又は反
射光は、逆戻りして光線偏向装置を介してビームスプリ
ッタに到達し、これを通過し、そして検出用遮光器（こ
の後方に検出器（複数）がある）で合焦される。合焦部
位に直接的には由来しない検出光は、上記と異なる光線
を辿り、従って検出用遮光器を通過しないので、被検物
を連続的ないし順次的に走査することにより三次元像を
形成する点情報が得られる。三次元像は、大抵、層状の
画像データを取得することにより得られる。照明光線を
光線偏向装置によって被検物上へないし被検物を通過す
るように案内する代わりに、照明光線を空間的に固定し
て被検物を移動させる構成もありうる。この２つの走査
方法、即ち光線走査と物体走査は、既知でありかつ普及
している。
光源の光をピンホール遮光器−所謂励起遮光器（絞り）
−で合焦させる合焦光学系と、ビームスプリッタと、光
線制御用の光線偏向装置と、顕微鏡光学系と、検出用遮
光器（絞り）と、検出光ないし蛍光を検出するための検
出器（複数）を有する。照明光線は、ビームスプリッタ
によって入射結合される。被検物から発する蛍光又は反
射光は、逆戻りして光線偏向装置を介してビームスプリ
ッタに到達し、これを通過し、そして検出用遮光器（こ
の後方に検出器（複数）がある）で合焦される。合焦部
位に直接的には由来しない検出光は、上記と異なる光線
を辿り、従って検出用遮光器を通過しないので、被検物
を連続的ないし順次的に走査することにより三次元像を
形成する点情報が得られる。三次元像は、大抵、層状の
画像データを取得することにより得られる。照明光線を
光線偏向装置によって被検物上へないし被検物を通過す
るように案内する代わりに、照明光線を空間的に固定し
て被検物を移動させる構成もありうる。この２つの走査
方法、即ち光線走査と物体走査は、既知でありかつ普及
している。
【０００５】被検物から発する光のパワーは、走査過程
中一定の時間間隔で測定され、走査スポット毎に走査
（ないし測定）される。測定データから画像を生成する
ことができるように、その測定値は、それに属する走査
位置に対し一義的に配属させられなければならない。そ
のために、光線偏向装置の調節素子の状態データを絶え
ず一緒に測定するか、或いは、多少正確さに欠けるもの
の、光線偏向装置の制御目標データを直接利用すること
が目的に適う。
中一定の時間間隔で測定され、走査スポット毎に走査
（ないし測定）される。測定データから画像を生成する
ことができるように、その測定値は、それに属する走査
位置に対し一義的に配属させられなければならない。そ
のために、光線偏向装置の調節素子の状態データを絶え
ず一緒に測定するか、或いは、多少正確さに欠けるもの
の、光線偏向装置の制御目標データを直接利用すること
が目的に適う。
【０００６】透過光構成では、例えば、蛍光又は励起光
の透過をコンデンサ側で検出することも可能である。こ
の場合、検出光線は、走査ミラーを介さずに検出器へ到
達する（非走査ミラー−検出器構成：Non descan Anord
nung）。蛍光を検出するために、この透過光構成では、
上述の走査ミラー−検出器構成（Descan-Anordnung）の
場合のように、三次元の分解能を得るために、コンデン
サ側に検出用遮光器が必要でもあろう。しかしながら、
二光子励起の場合では、コンデンサ側の検出用遮光器は
省略することができる。というのは、励起確率が光子密
度（これは必然的に合焦スポットにおいて、その周辺領
域においてより遥かに大きい）の２乗に依存している
（〜強さ２）からである。検出されるべき蛍光は、それ
故大きな確率でその殆んど全てが合焦部位に由来するの
で、遮光器を配置することにより合焦部位からの蛍光光
子をその周辺領域からの蛍光光子から更に区別すること
は不必要になる。
の透過をコンデンサ側で検出することも可能である。こ
の場合、検出光線は、走査ミラーを介さずに検出器へ到
達する（非走査ミラー−検出器構成：Non descan Anord
nung）。蛍光を検出するために、この透過光構成では、
上述の走査ミラー−検出器構成（Descan-Anordnung）の
場合のように、三次元の分解能を得るために、コンデン
サ側に検出用遮光器が必要でもあろう。しかしながら、
二光子励起の場合では、コンデンサ側の検出用遮光器は
省略することができる。というのは、励起確率が光子密
度（これは必然的に合焦スポットにおいて、その周辺領
域においてより遥かに大きい）の２乗に依存している
（〜強さ２）からである。検出されるべき蛍光は、それ
故大きな確率でその殆んど全てが合焦部位に由来するの
で、遮光器を配置することにより合焦部位からの蛍光光
子をその周辺領域からの蛍光光子から更に区別すること
は不必要になる。
【０００７】走査型顕微鏡の分解能は、とりわけ照明光
線の合焦領域の強度分布及び空間的広がりによって与え
られる。蛍光を利用する場合の分解能を高めるための構
成は、PCT/DE/95/00124から既知である。この構成は、
第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する
光源（この場合、試料（ないし被検物）中において、励
起光線は第一合焦領域で合焦し、放出光線は第一合焦領
域と部分的に重畳する第二合焦領域で合焦する）を有す
る。励起光線は、試料を第一合焦領域で光学的に励起
し、他方放出光線は、第二合焦領域で誘導放出を惹き起
こす。そして第一合焦領域の誘導放出が惹き起こされな
かった部分から自然発生的に放出される光のみが検出さ
れ、そのため全体として分解能の改善が達成される。こ
の方法には、STED（Stimulated Emission Depletion：
誘導放出欠乏）という名称が与えられた。
線の合焦領域の強度分布及び空間的広がりによって与え
られる。蛍光を利用する場合の分解能を高めるための構
成は、PCT/DE/95/00124から既知である。この構成は、
第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成する
光源（この場合、試料（ないし被検物）中において、励
起光線は第一合焦領域で合焦し、放出光線は第一合焦領
域と部分的に重畳する第二合焦領域で合焦する）を有す
る。励起光線は、試料を第一合焦領域で光学的に励起
し、他方放出光線は、第二合焦領域で誘導放出を惹き起
こす。そして第一合焦領域の誘導放出が惹き起こされな
かった部分から自然発生的に放出される光のみが検出さ
れ、そのため全体として分解能の改善が達成される。こ
の方法には、STED（Stimulated Emission Depletion：
誘導放出欠乏）という名称が与えられた。
【０００８】これまでに、STED技術は更に発展し、放出
光線の合焦領域が、その内部（領域）において消失した
強度分布を有することにより、横方向にも軸方向にも分
解能を高めることができるようになった。この合焦領域
には、内部に言わば中空がはっきりと現れている。その
ような強度分布は、例えば、放出光線の合焦領域に関す
るフーリエ面（Fourierebene）に配されたλ／２プレー
ト（その直径は光線の直径より短く、従って（上から）
覆われるように照明される）によって得ることができ
る。放出光線の合焦領域は、励起光線の合焦領域と一致
していなければならない。そして、そのような構成にお
いては、放出光線の合焦領域の強度分布が消失している
部分から自然発生的に放出される光しか最早検出されな
い。理論的には、そのような構成によって、１００ｎｍ
より遥かに高い分解能（１００ｎｍ未満）が得られる。
光線の合焦領域が、その内部（領域）において消失した
強度分布を有することにより、横方向にも軸方向にも分
解能を高めることができるようになった。この合焦領域
には、内部に言わば中空がはっきりと現れている。その
ような強度分布は、例えば、放出光線の合焦領域に関す
るフーリエ面（Fourierebene）に配されたλ／２プレー
ト（その直径は光線の直径より短く、従って（上から）
覆われるように照明される）によって得ることができ
る。放出光線の合焦領域は、励起光線の合焦領域と一致
していなければならない。そして、そのような構成にお
いては、放出光線の合焦領域の強度分布が消失している
部分から自然発生的に放出される光しか最早検出されな
い。理論的には、そのような構成によって、１００ｎｍ
より遥かに高い分解能（１００ｎｍ未満）が得られる。
【０００９】決定的に重要なことは、放出光線の合焦領
域と励起光線の合焦領域が適切に重畳されるということ
である。更に、この重畳は、試料を走査する場合にも維
持されたままでいなければならない。この重畳は、この
２つの光線相互の、走査過程によって変動されない空間
的関係である。
域と励起光線の合焦領域が適切に重畳されるということ
である。更に、この重畳は、試料を走査する場合にも維
持されたままでいなければならない。この重畳は、この
２つの光線相互の、走査過程によって変動されない空間
的関係である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】しかし、高度に補正さ
れたハイエンド光学素子でさえ残留収差（Restaberrati
onen）がある。この残留収差は、伝統的な顕微鏡では大
抵問題にならないが、ここで問題となっている分解能領
域では、大いに影響を及ぼす。とりわけ励起光線と放出
光線の波長が互いに異なるので、残留色収差により、極
めて重大な誤差が生じる。例えば、ハイエンド顕微鏡対
物レンズ系の色縦誤差（Farblaengsfehler）だけで既に
凡そ１５０ｎｍに達し、これは理論的にSTEDによって達
成可能な分解能を越えている。光線走査システムでは、
軸方向の収差の他に更に横方向の収差も加わり、そのた
め走査運動の間、重畳領域は、縦方向にも、横方向にも
変化してしまう。
れたハイエンド光学素子でさえ残留収差（Restaberrati
onen）がある。この残留収差は、伝統的な顕微鏡では大
抵問題にならないが、ここで問題となっている分解能領
域では、大いに影響を及ぼす。とりわけ励起光線と放出
光線の波長が互いに異なるので、残留色収差により、極
めて重大な誤差が生じる。例えば、ハイエンド顕微鏡対
物レンズ系の色縦誤差（Farblaengsfehler）だけで既に
凡そ１５０ｎｍに達し、これは理論的にSTEDによって達
成可能な分解能を越えている。光線走査システムでは、
軸方向の収差の他に更に横方向の収差も加わり、そのた
め走査運動の間、重畳領域は、縦方向にも、横方向にも
変化してしまう。
【００１１】それ故、本発明の課題は、STED-顕微鏡の
ために必要な分解能を得ることができるように調整され
る光学的手段を有する走査型顕微鏡を創出することであ
る。
ために必要な分解能を得ることができるように調整され
る光学的手段を有する走査型顕微鏡を創出することであ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この課題の解決のため、
本発明の一視点によれば、照明光線と、顕微鏡光学系
と、第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成
する少なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検
物）内において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で
合焦されかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合
焦されており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦
領域において光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合
焦領域で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及
び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳している走査
型顕微鏡が提供される。この走査型顕微鏡は、照明光路
に配される部材の光学的性質が、２つの合焦領域（第一
及び第二合焦領域）が走査運動に依存することなく互い
に位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるよう
に、互いに調整されることを特徴とする。
本発明の一視点によれば、照明光線と、顕微鏡光学系
と、第一波長の励起光線及び第二波長の放出光線を生成
する少なくとも１つの光源を有すると共に、試料（被検
物）内において該励起光線が第一面内の第一合焦領域で
合焦されかつ該放出光線が第二面内の第二合焦領域で合
焦されており、かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦
領域において光学的に励起しかつ該放出光線が該第二合
焦領域で誘導される放出を惹き起こし、かつ、該第一及
び第二合焦領域が少なくとも部分的に重畳している走査
型顕微鏡が提供される。この走査型顕微鏡は、照明光路
に配される部材の光学的性質が、２つの合焦領域（第一
及び第二合焦領域）が走査運動に依存することなく互い
に位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるよう
に、互いに調整されることを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明の好ましい実施の形
態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。走査
型顕微鏡は、更に、励起光線に対してのみ作用する光学
的補正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕
微鏡は、更に、放出光線に対してのみ作用する光学的補
正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕微鏡
は、更に、励起光線及び放出光線に対して作用する光学
的補正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕
微鏡は、更に、光学的補正手段が、レンズ、ドリフトレ
ンジ（Driftstrecke）及び適応制御光学系（補償光学
系：adaptive Optik）のうち少なくとも１つを含むこと
が好ましい。
態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。走査
型顕微鏡は、更に、励起光線に対してのみ作用する光学
的補正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕
微鏡は、更に、放出光線に対してのみ作用する光学的補
正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕微鏡
は、更に、励起光線及び放出光線に対して作用する光学
的補正手段が設けられていることが好ましい。走査型顕
微鏡は、更に、光学的補正手段が、レンズ、ドリフトレ
ンジ（Driftstrecke）及び適応制御光学系（補償光学
系：adaptive Optik）のうち少なくとも１つを含むこと
が好ましい。
【００１４】本発明は、STED-技術の理論的分解能が、
物体（被検物）走査システムにおいても、光線走査シス
テムにおいても達成されるという長所を有する。
物体（被検物）走査システムにおいても、光線走査シス
テムにおいても達成されるという長所を有する。
【００１５】本発明によれば、とりわけ色収差（例え
ば、色縦誤差、色倍率誤差、色横誤差（Farbquerfehle
r））が補正される。そのような補正は、とりわけ有利
な方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過
する、照明光路の分割（分岐）光路（Teilstrahlengaen
ge）中に配した付加的光学系によって達成される。これ
らの分割光路では、特に軸方向及び横断方向の光線の性
質が影響を与えられうる。そして残りの色縦誤差は、例
えば、励起光線と放出光線の合焦面−光源間において双
方の光の経路の長さを異なるようにすることによって補
正することができる。
ば、色縦誤差、色倍率誤差、色横誤差（Farbquerfehle
r））が補正される。そのような補正は、とりわけ有利
な方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過
する、照明光路の分割（分岐）光路（Teilstrahlengaen
ge）中に配した付加的光学系によって達成される。これ
らの分割光路では、特に軸方向及び横断方向の光線の性
質が影響を与えられうる。そして残りの色縦誤差は、例
えば、励起光線と放出光線の合焦面−光源間において双
方の光の経路の長さを異なるようにすることによって補
正することができる。
【００１６】球面収差、コマ収差、非点収差、像面弯
曲、歪曲収差のような単色光の収差も、とりわけ有利な
方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過す
る、照明光路の分割光路中の付加的光学系によって補正
することができる。しかし、励起光線と放出光線が共通
に通過する、照明光路の部分中に配した補正部材もまた
有利である。補正部材には、レンズ、ドリフトレンジ
（光が光学素子によって影響を受けずに伝搬する光路範
囲）が含まれるが、適応制御光学系（補償光学系）又は
活性光学系も含まれる。考えられるものとしては、例え
ば、変形可能ミラー、箔片（フォイル帯）式ミラー（Fo
lienspiegel）、マイクロミラーアレイがあるが、これ
らは、走査運動中、その湾曲（ないし曲率）又は位置が
変化するものである。適応制御光学系としては、照明光
線中に、LCD-素子も、好ましくは合焦面に関するフーリ
エ面に設けることができる。LCD-素子は、励起光線若し
くは放出光線の位相又は励起光線若しくは放出光線の
（複数の）部分（一部）を変化させる。
曲、歪曲収差のような単色光の収差も、とりわけ有利な
方法によれば、励起光線のみ又は放出光線のみが通過す
る、照明光路の分割光路中の付加的光学系によって補正
することができる。しかし、励起光線と放出光線が共通
に通過する、照明光路の部分中に配した補正部材もまた
有利である。補正部材には、レンズ、ドリフトレンジ
（光が光学素子によって影響を受けずに伝搬する光路範
囲）が含まれるが、適応制御光学系（補償光学系）又は
活性光学系も含まれる。考えられるものとしては、例え
ば、変形可能ミラー、箔片（フォイル帯）式ミラー（Fo
lienspiegel）、マイクロミラーアレイがあるが、これ
らは、走査運動中、その湾曲（ないし曲率）又は位置が
変化するものである。適応制御光学系としては、照明光
線中に、LCD-素子も、好ましくは合焦面に関するフーリ
エ面に設けることができる。LCD-素子は、励起光線若し
くは放出光線の位相又は励起光線若しくは放出光線の
（複数の）部分（一部）を変化させる。
【００１７】
【実施例】本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明
する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は、
発明の理解の容易化のためであり、本発明を図示の態様
に限定することを意図しない。また、以下の実施例も、
発明の理解の容易化のためであり、本発明の技術的思想
を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な修正
・変更を含むことも言うまでもない。
する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は、
発明の理解の容易化のためであり、本発明を図示の態様
に限定することを意図しない。また、以下の実施例も、
発明の理解の容易化のためであり、本発明の技術的思想
を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な修正
・変更を含むことも言うまでもない。
【００１８】図１は、従来の光線走査システムにおける
励起光線１と放出光線３の合焦領域の軌跡の推移を示す
模式図である。励起光線１と放出光線３は、顕微鏡光学
系５によって合焦する。励起光線１の合焦領域７は、実
線で描かれている。この合焦領域７は、走査運動を実行
するとき、ライン１１を辿る。放出光線３の合焦領域９
は、破線で描かれている。この合焦領域９は、走査運動
を実行するとき、ライン１３を辿る。重畳領域１５は、
走査運動の実行時に、変化する。光軸の領域においてさ
え、合焦領域７及び９は、色縦誤差のため一致しない。
光軸から外れたところでは、この軸方向の収差に加え
て、更に色横誤差、並びに歪曲収差及び像面弯曲が加わ
り、そのため合焦領域７及び９は、横方向にも、縦方向
にも互いに位置がずらされてしまう。
励起光線１と放出光線３の合焦領域の軌跡の推移を示す
模式図である。励起光線１と放出光線３は、顕微鏡光学
系５によって合焦する。励起光線１の合焦領域７は、実
線で描かれている。この合焦領域７は、走査運動を実行
するとき、ライン１１を辿る。放出光線３の合焦領域９
は、破線で描かれている。この合焦領域９は、走査運動
を実行するとき、ライン１３を辿る。重畳領域１５は、
走査運動の実行時に、変化する。光軸の領域においてさ
え、合焦領域７及び９は、色縦誤差のため一致しない。
光軸から外れたところでは、この軸方向の収差に加え
て、更に色横誤差、並びに歪曲収差及び像面弯曲が加わ
り、そのため合焦領域７及び９は、横方向にも、縦方向
にも互いに位置がずらされてしまう。
【００１９】図２には、共焦点走査型顕微鏡として構成
されている本発明の走査型顕微鏡が示されている。パル
スレーザとして構成されている第一光源１７は、励起光
線１９を生成する。同様にパルスレーザとして構成され
ている第二光源２１は、放出光線２３を生成する。励起
光線１９と放出光線２３は、ダイクロイック光線結合器
２５によって結合され、ダイクロイックビームスプリッ
タ２７を介して、カルダン懸架式走査ミラー３１を有す
る走査モジュール２９に達し、走査ミラー３１によっ
て、励起光線１９と放出光線２３は、走査光学系３３、
光学系３５を介し、顕微鏡光学系３７を通過して、試料
（被検物）３９上に案内されるか又は試料３９を通過さ
せられる。試料３９は、Ｚ方向、即ち励起光線１９の
（進行）方向での走査（位置調節）を可能にする顕微鏡
ステージ（不図示）に配されている。試料３９の種々の
(異なった)合焦面が励起光線１９と放出光線２３により
順次走査される。励起光線１９と放出光線２３は、実線
で描かれている照明光路４１を形成する。試料３９から
射出する光（射出光）４３は、顕微鏡光学系３７を通過
し、走査モジュール２９を介し、ビームスプリッタ２７
に至りこれを通過し、光電子増倍管として構成されてい
る検出器４５に入射する。射出光４３は、破線で描かれ
ている。検出器４５では、射出光４３のパワーに比例す
る電気的検出信号が生成し、この信号は、処理ユニット
（不図示）へ送信される。検出器４５には、放出光線２
３の波長を有する光を遮光する帯域（通過）フィルタ４
９が前置されている。共焦点走査型顕微鏡において通常
設けられている照明用ピンホール（遮光器）５１と、検
出用ピンホール（遮光器）４７は、完全を期するために
模式的に描かれている。これに対し、光線案内及び形成
用の幾つかの光学素子は、図を見やすくするために省略
されている。これらの素子は、当業者には周知である。
走査運動の実行中であっても励起光線１９と放出光線２
３の合焦領域を互いに位置不変に留めておくことを実現
するために、第一光源１７とダイクロイック光線結合器
２５との間に、合焦光学系が設けられている。第一光源
１７及び第二光源２１からダイクロイック光線結合器２
５までの光の経路の長さの差違と共に、照明光路４１の
残りの全ての光学系の色縦誤差の補正が行われる。横方
向の収差を補償するために、第二光源２１とダイクロイ
ックビームスプリッタとの間に、ＬＣＤ素子として構成
されている適応制御光学系（補償光学系）５３が設けら
れている。これは、光線偏向装置（走査モジュール）２
９内の走査ミラー３１の位置に依存して制御される。
されている本発明の走査型顕微鏡が示されている。パル
スレーザとして構成されている第一光源１７は、励起光
線１９を生成する。同様にパルスレーザとして構成され
ている第二光源２１は、放出光線２３を生成する。励起
光線１９と放出光線２３は、ダイクロイック光線結合器
２５によって結合され、ダイクロイックビームスプリッ
タ２７を介して、カルダン懸架式走査ミラー３１を有す
る走査モジュール２９に達し、走査ミラー３１によっ
て、励起光線１９と放出光線２３は、走査光学系３３、
光学系３５を介し、顕微鏡光学系３７を通過して、試料
（被検物）３９上に案内されるか又は試料３９を通過さ
せられる。試料３９は、Ｚ方向、即ち励起光線１９の
（進行）方向での走査（位置調節）を可能にする顕微鏡
ステージ（不図示）に配されている。試料３９の種々の
(異なった)合焦面が励起光線１９と放出光線２３により
順次走査される。励起光線１９と放出光線２３は、実線
で描かれている照明光路４１を形成する。試料３９から
射出する光（射出光）４３は、顕微鏡光学系３７を通過
し、走査モジュール２９を介し、ビームスプリッタ２７
に至りこれを通過し、光電子増倍管として構成されてい
る検出器４５に入射する。射出光４３は、破線で描かれ
ている。検出器４５では、射出光４３のパワーに比例す
る電気的検出信号が生成し、この信号は、処理ユニット
（不図示）へ送信される。検出器４５には、放出光線２
３の波長を有する光を遮光する帯域（通過）フィルタ４
９が前置されている。共焦点走査型顕微鏡において通常
設けられている照明用ピンホール（遮光器）５１と、検
出用ピンホール（遮光器）４７は、完全を期するために
模式的に描かれている。これに対し、光線案内及び形成
用の幾つかの光学素子は、図を見やすくするために省略
されている。これらの素子は、当業者には周知である。
走査運動の実行中であっても励起光線１９と放出光線２
３の合焦領域を互いに位置不変に留めておくことを実現
するために、第一光源１７とダイクロイック光線結合器
２５との間に、合焦光学系が設けられている。第一光源
１７及び第二光源２１からダイクロイック光線結合器２
５までの光の経路の長さの差違と共に、照明光路４１の
残りの全ての光学系の色縦誤差の補正が行われる。横方
向の収差を補償するために、第二光源２１とダイクロイ
ックビームスプリッタとの間に、ＬＣＤ素子として構成
されている適応制御光学系（補償光学系）５３が設けら
れている。これは、光線偏向装置（走査モジュール）２
９内の走査ミラー３１の位置に依存して制御される。
【００２０】図３には、多光子励起を伴う非DESCAN構成
による本発明の走査型顕微鏡が示されている。この実施
例では、検出はコンデンサ側で行われる。この構成で
は、照明用ピンホール（遮光器）と検出用ピンホール
（遮光器）を排除することができる。試料３９から射出
する光（射出光）７１は、コンデンサ光学系５５によっ
て合焦され、ミラー７３を介し、光電子増倍管として構
成されている検出器４５へ導かれる。検出器４５には、
励起光線の波長を有する光と放出光線の波長を有する光
を遮光するフィルタ７５が前置されている。励起光線６
３は、チタンサファイア−パルスレーザとして構成され
ている第一光源によって生成される。放出光線６９は、
光パラメトリック発信器を含む第二光源６７によって生
成される。ダイクロイック光線結合器５９による結合
後、試料の照明（照射）は、図２について記載された照
明（照射）と同様にして行われる。走査運動の実行中で
あっても励起光線６３及び放出光線６９の合焦領域を互
いに位置不変に留めたままにしておくことを実現するた
めに、第一光源６１とダイクロイック光線結合器５９の
間に、ディフォーカス（脱焦）用レンズ６５が設けられ
ている。第一光源６１及び第二光源６７からダイクロイ
ック光線結合器５９へ至るまでの光線の経路の長さの相
違と共に、照明光線４１の残りの全ての光学系の色縦誤
差の補正が行われる。横方向の収差を補償するために、
励起光線６３と放出光線６９が共通に進行する照明光路
の部分に、適応制御光学系（補償光学系）５７が設けら
れている。これは、光線偏向装置２９内の走査ミラー３
１の位置に依存して制御される。
による本発明の走査型顕微鏡が示されている。この実施
例では、検出はコンデンサ側で行われる。この構成で
は、照明用ピンホール（遮光器）と検出用ピンホール
（遮光器）を排除することができる。試料３９から射出
する光（射出光）７１は、コンデンサ光学系５５によっ
て合焦され、ミラー７３を介し、光電子増倍管として構
成されている検出器４５へ導かれる。検出器４５には、
励起光線の波長を有する光と放出光線の波長を有する光
を遮光するフィルタ７５が前置されている。励起光線６
３は、チタンサファイア−パルスレーザとして構成され
ている第一光源によって生成される。放出光線６９は、
光パラメトリック発信器を含む第二光源６７によって生
成される。ダイクロイック光線結合器５９による結合
後、試料の照明（照射）は、図２について記載された照
明（照射）と同様にして行われる。走査運動の実行中で
あっても励起光線６３及び放出光線６９の合焦領域を互
いに位置不変に留めたままにしておくことを実現するた
めに、第一光源６１とダイクロイック光線結合器５９の
間に、ディフォーカス（脱焦）用レンズ６５が設けられ
ている。第一光源６１及び第二光源６７からダイクロイ
ック光線結合器５９へ至るまでの光線の経路の長さの相
違と共に、照明光線４１の残りの全ての光学系の色縦誤
差の補正が行われる。横方向の収差を補償するために、
励起光線６３と放出光線６９が共通に進行する照明光路
の部分に、適応制御光学系（補償光学系）５７が設けら
れている。これは、光線偏向装置２９内の走査ミラー３
１の位置に依存して制御される。
【００２１】
【発明の効果】本発明の独立請求項１により、所定の課
題として掲げた効果が達成される。即ち、本発明の走査
型顕微鏡により、調整可能な光学的手段を介し、STED-
顕微鏡のために必要な（極めて小さい）分解能を得るこ
とができる。各従属請求項により、更に付加的な効果
が、前述の通りそれぞれ達成される。
題として掲げた効果が達成される。即ち、本発明の走査
型顕微鏡により、調整可能な光学的手段を介し、STED-
顕微鏡のために必要な（極めて小さい）分解能を得るこ
とができる。各従属請求項により、更に付加的な効果
が、前述の通りそれぞれ達成される。
【図１】従来の（走査）システムの励起光線及び放出光
線の合焦領域の軌跡の模式図。
線の合焦領域の軌跡の模式図。
【図２】本発明の走査型顕微鏡の模式図。
【図３】多光子励起を伴う非DESCAN構成による本発明の
走査型顕微鏡の模式図。
走査型顕微鏡の模式図。
１ 励起光線 ３ 放出光線 ５ 顕微鏡光学系 ７ 励起光線の合焦領域 ９ 放出光線の合焦領域 １１ ライン １３ ライン １５ 重畳領域 １７ 第一光源 １９ 励起光線 ２１ 第二光源 ２３ 放出光線 ２５ ダイクロイック光線結合器 ２７ ダイクロイックビームスプリッタ ２９ 走査モジュール ３１ 走査ミラー ３３ 走査光学系 ３５ 光学系 ３７ 顕微鏡光学系 ３９ 試料（被検物） ４１ 照明光路 ４３ 射出光 ４５ 検出器 ４７ 検出用ピンホール（遮光器） ４９ 帯域（通過）フィルタ ５１ 照明用ピンホール（遮光器） ５３ 適応制御光学系（補償光学系） ５５ コンデンサ光学系 ５７ 適応制御光学系（補償光学系） ５９ ダイクロイック光線結合器 ６１ 第一光源 ６３ 励起光線 ６５ レンズ ６７ 第二光源 ６９ 放出光線 ７１ 射出光 ７３ ミラー ７５ フィルタ
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2H045 AB13 AB53 BA13 DA31 2H052 AA07 AC04 AC14 AC15 AC27 AC30 2H087 KA09 NA01
Claims (5)
- 【請求項１】照明光線と、顕微鏡光学系と、第一波長の
励起光線及び第二波長の放出光線を生成する少なくとも
１つの光源を有すると共に、試料（被検物）内において
該励起光線が第一面内の第一合焦領域で合焦されかつ該
放出光線が第二面内の第二合焦領域で合焦されており、
かつ、該励起光線が該試料を該第一合焦領域において光
学的に励起しかつ該放出光線が該第二合焦領域で誘導さ
れる放出を惹き起こし、かつ、該第一及び第二合焦領域
が少なくとも部分的に重畳している走査型顕微鏡におい
て、 前記照明光路（４１）に配される部材の光学的性質は、
前記２つの合焦領域が走査運動に依存することなく互い
に位置不変に留まるよう光学的収差が補正されるよう
に、互いに調整されることを特徴とする走査型顕微鏡。 - 【請求項２】前記励起光線（１９、６３）に対してのみ
作用する光学的補正手段が設けられていることを特徴と
する請求項１に記載の走査型顕微鏡。 - 【請求項３】前記放出光線（２３、６９）に対してのみ
作用する光学的補正手段が設けられていることを特徴と
する請求項１に記載の走査型顕微鏡。 - 【請求項４】前記励起光線（１９、６３）及び前記放出
光線（２３、６９）に対して作用する光学的補正手段が
設けられていることを特徴とする請求項１に記載の走査
型顕微鏡。 - 【請求項５】前記光学的補正手段は、レンズ（６５）、
ドリフトレンジ及び適応制御光学系（補償光学系）（５
３、５７）のうち少なくとも１つを含むことを特徴とす
る請求項２〜４の一に記載の走査型顕微鏡。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10063276A DE10063276C2 (de) | 2000-12-19 | 2000-12-19 | Scanmikroskop |
| DE10063276.9 | 2000-12-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002228934A true JP2002228934A (ja) | 2002-08-14 |
| JP4312979B2 JP4312979B2 (ja) | 2009-08-12 |
Family
ID=7667776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001386020A Expired - Lifetime JP4312979B2 (ja) | 2000-12-19 | 2001-12-19 | 走査型顕微鏡 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6914236B2 (ja) |
| JP (1) | JP4312979B2 (ja) |
| DE (1) | DE10063276C2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2006519408A (ja) * | 2003-02-27 | 2006-08-24 | アイシス イノベイシヨン リミテツド | 光補正要素を有した顕微鏡画像処理システム |
| JP2007316662A (ja) * | 2007-07-23 | 2007-12-06 | Olympus Corp | 走査型光学顕微鏡 |
| JP2012533069A (ja) * | 2009-07-09 | 2012-12-20 | ホワルド フグヘス メドイクアル インストイトウテ | 適応光学系を有する顕微鏡検査法 |
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| DE10247249A1 (de) * | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Leica Microsystems Heidelberg Gmbh | Scanmikroskop mit einem Spiegel zur Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls |
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| DE102005020003B4 (de) * | 2005-04-27 | 2007-10-11 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Fluoreszenzmikroskop |
| CN101490533A (zh) * | 2006-07-20 | 2009-07-22 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多色生物传感器 |
| DE102006046369A1 (de) * | 2006-09-29 | 2008-04-03 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie |
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| JP2008261790A (ja) * | 2007-04-13 | 2008-10-30 | Hitachi High-Technologies Corp | 欠陥検査装置 |
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| US8934166B2 (en) | 2011-12-29 | 2015-01-13 | Elwha Llc | Customized user options for optical device |
| US9033497B2 (en) | 2011-12-29 | 2015-05-19 | Elwha Llc | Optical device with interchangeable corrective elements |
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| DE102019008304B8 (de) | 2019-11-29 | 2021-06-02 | Abberior Instruments Gmbh | Fluoreszenzmikroskop mit stabilisierter Justage und Verwendung einer Baugruppe zur Aufrüstung eines Fluoreszenzmikroskops |
| DE102020113998A1 (de) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | Abberior Instruments Gmbh | Verfahren, Computerprogramm und Vorrichtung zum Bestimmen von Positionen von Molekülen in einer Probe |
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2000
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