WO2022230254A1 - 共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法 - Google Patents

共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022230254A1
WO2022230254A1 PCT/JP2022/001369 JP2022001369W WO2022230254A1 WO 2022230254 A1 WO2022230254 A1 WO 2022230254A1 JP 2022001369 W JP2022001369 W JP 2022001369W WO 2022230254 A1 WO2022230254 A1 WO 2022230254A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
control
light
signal
unit
drive
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/001369
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
俊毅 山田
隆 三保家
Original Assignee
浜松ホトニクス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 浜松ホトニクス株式会社 filed Critical 浜松ホトニクス株式会社
Priority to US18/281,649 priority Critical patent/US20240151956A1/en
Priority to CN202280030939.5A priority patent/CN117203564A/zh
Priority to EP22795177.9A priority patent/EP4296748A1/en
Priority to JP2023517043A priority patent/JPWO2022230254A1/ja
Publication of WO2022230254A1 publication Critical patent/WO2022230254A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/082—Condensers for incident illumination only
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G02B21/0048—Scanning details, e.g. scanning stages scanning mirrors, e.g. rotating or galvanomirrors, MEMS mirrors
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0064—Optical details of the image generation multi-spectral or wavelength-selective arrangements, e.g. wavelength fan-out, chromatic profiling
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control

Definitions

  • the present disclosure relates to a confocal microscope unit and a confocal microscope that constitute a confocal microscope.
  • an optical image of the sample is acquired by scanning the sample with excitation light.
  • one aspect of the embodiments is to provide a confocal microscope unit and a confocal microscope capable of uniformizing the irradiation energy of the excitation light to the sample with high accuracy. Make it an issue.
  • a confocal microscope unit is a confocal microscope unit that configures a confocal microscope by being attached to a connection port of a microscope having a microscope optical system, and includes a light source that outputs excitation light, a light source A photodetector that detects the excitation light output from and outputs a detection signal, a drive unit that supplies drive current to the light source, and a drive current for the drive unit that is controlled in accordance with a control signal that indicates the target light intensity.
  • a light source unit having a control unit that outputs a drive signal, a scan mirror that scans the sample with the excitation light output from the light source unit, and a connection port that can be attached to the scan mirror and the light source unit are fixed.
  • the control unit has two types of functions, a setting mode and an operation mode.
  • a data table showing the correspondence between the drive current and the amount of the excitation light is generated and stored, and in the operation mode, the control signal as a drive signal, reads out the data table, executes the second control using the control signal corresponding to the drive current corresponding to the target light amount based on the data table, and detects Control is executed to stop the drive current when the amount of light indicated by the signal exceeds a predetermined value.
  • a confocal microscope includes the confocal microscope unit of the one aspect described above and a microscope having a connection port to which the microscope optical system and the confocal microscope unit are attached.
  • a confocal microscope unit control method is a confocal microscope unit that constitutes a confocal microscope by being attached to a connection port of a microscope having a microscope optical system, A light source that outputs excitation light, a photodetector that detects the excitation light output from the light source and outputs a detection signal, a drive unit that supplies drive current to the light source, and a control signal that indicates the target light intensity.
  • a light source unit having a control unit that outputs a drive signal for controlling the drive current to the unit; a scan mirror that scans the sample with the excitation light output from the light source unit;
  • a control method using a confocal microscope unit including a mirror and a housing to which a light source unit is fixed, the first control adjusting and outputting a drive signal based on a control signal and a detection signal and executing the first control while changing the value of the control signal to generate and store a data table showing the correspondence between the drive current and the amount of excitation light; , the data table is read, and based on the data table, the second control is performed using the control signal corresponding to the drive current corresponding to the target light amount, and the detection signal indicates and executing control to stop the drive current when the amount of light exceeds a predetermined value.
  • the excitation light output from the light source in the light source unit is scanned onto the sample by the scan mirror, and the corresponding image of the sample is produced by the microscope.
  • a data table indicating the correspondence relationship between the driving current supplied to the light source and the amount of excitation light is generated and stored in advance by the setting mode function of the control section, and the operation mode function of the control section Based on the data table, a control signal corresponding to the drive current corresponding to the target light amount is output as a drive signal to the drive section that supplies the drive current to the light source.
  • the driving current is stopped when the light intensity of the excitation light exceeds a predetermined value.
  • the target light intensity is set so that the light intensity of the excitation light is changed accordingly when the scanning speed of the excitation light on the sample changes, the light intensity of the excitation light is changed accordingly.
  • the light source can be driven at high speed and with high accuracy.
  • the confocal microscope unit can be used safely by performing control to stop the excitation light when the light intensity of the excitation light exceeds a predetermined value. As a result, the irradiation energy of the excitation light to the sample can be made uniform with high accuracy, and confocal imaging with high safety can be realized.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a confocal microscope A according to an embodiment
  • FIG. 2 is a block diagram showing a schematic configuration of a light source device 10a of FIG. 1
  • FIG. 2 is a diagram showing a detailed circuit configuration of the light source device 10a of FIG. 1
  • FIG. 4 is a circuit diagram showing a switching state of the light source device 10a during operation in a setting mode
  • FIG. 4 is a circuit diagram showing a switching state of the light source device 10a during operation of the operation mode
  • FIG. 4 is a flow chart showing the operation procedure of the setting mode function of the light source device 10a.
  • 4 is a flow chart showing operation procedures of functions of operation modes of the light source device 10a.
  • FIG. 4 is a plan view showing an example of the form of scanning of the first excitation light on the sample M using the confocal microscope A;
  • FIG. 9 is a graph showing temporal changes in the amount of laser light output from the light source device 10a corresponding to the scanning mode shown in FIG. 8.
  • FIG. FIG. 10 is a graph showing the time change of the amount of light in FIG. 9 in correspondence with the sweep waveform of the scan mirror 4;
  • FIG. It is a figure which shows the circuit structure of the light source device 110a concerning a modification.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a confocal microscope A according to an embodiment.
  • the confocal microscope A shown in FIG. 1 constitutes a confocal microscope that acquires an image that enables construction of an optical tomographic image of a sample M to be observed. It is configured to be connected to the connection port P1.
  • This confocal microscope unit 1 irradiates excitation light onto a sample M placed on a stage of a microscope 50 or the like via a microscope optical system such as an imaging lens 51 and an objective lens 52 in the microscope 50, and It is an apparatus for receiving (detecting) fluorescence generated from a sample M in response to excitation light via a microscope optical system of a microscope 50, generating and outputting an optical tomographic image.
  • the confocal microscope unit 1 includes a main housing 2, a lens barrel 3 that constitutes a part of the main housing 2 and is detachably connected to a connection port P1 of a microscope 50, and a main housing 2. It comprises a scan mirror 4 fixed inside, a fixed mirror 5, first to fourth subunits 6a to 6d, and a scan lens 7 fixed inside the lens barrel 3. As shown in FIG. Each component of the confocal microscope unit 1 will be described in detail below.
  • the scan lens 7 in the lens barrel 3 is an optical element that has the function of relaying the reflecting surface of the scan mirror 4 to the pupil position of the objective lens 52 and at the same time forming a spot on the primary imaging plane of the microscope optical system of the microscope 50 .
  • the scan lens 7 guides the excitation light scanned by the scan mirror 4 to the microscope optical system to irradiate the sample M, and accordingly guides the fluorescence generated from the sample M to the scan mirror 4 .
  • the scan mirror 4 in the main housing 2 is, for example, an optical scanning element such as a MEMS (Micro Electro Mechanical System) mirror whose reflecting plate can be tilted on two axes.
  • the scan mirror 4 scans the sample M with the excitation light output from the first to fourth subunits 6a to 6d by continuously changing the reflection angle, and emits fluorescence corresponding to the excitation light. , the role of guiding towards the first to fourth subunits 6a-6d.
  • the fixed mirror 5 is a light reflecting element fixed in the main housing 2, and reflects the excitation light output from the first to fourth subunits 6a to 6d toward the scan mirror 4. reflect the fluorescence toward the first to fourth subunits 6a to 6d coaxially with the excitation light.
  • the first subunit 6a includes a base plate 8a, a dichroic mirror (first beam splitter) 9a arranged on the base plate 8a, a light source device (light source unit) 10a, a dichroic mirror 11a, and a pinhole plate (first beam splitter) 9a. diaphragm member) 12a and a photodetector (first photodetector) 13a.
  • the dichroic mirror 9a is fixed in the fluorescence reflecting direction of the fixed mirror 5, and emits the first excitation light of the wavelength ⁇ 1 emitted by the first subunit 6a and the first excitation light of the wavelength range ⁇ 1 generated from the sample M accordingly.
  • the beam splitter has a property of reflecting the fluorescence of the first excitation light and transmitting light having a wavelength longer than that of the first excitation light and the first fluorescence.
  • the dichroic mirror 11a is provided in the reflection direction of the first fluorescence of the dichroic mirror 9a, transmits the first fluorescence in the wavelength range ⁇ 1, and reflects the first excitation light in the wavelength ⁇ 1 shorter than the wavelength range ⁇ 1. It is a beam splitter that has the property of
  • the light source device 10a is a device that incorporates a light emitting element (for example, a laser diode) that outputs first excitation light (for example, laser light) having a wavelength ⁇ 1.
  • the pinhole plate 12a is arranged so as to be coaxial with the fluorescence of the light and reflected toward the dichroic mirror 9a.
  • the pinhole plate 12a is arranged so that the pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the first excitation light on the sample M, and is a diaphragm member that limits the light flux of the first fluorescence. constitutes a confocal optical system.
  • the pinhole plate 12a has a pinhole diameter that can be adjusted from the outside so that the resolution of the image detected by the photodetector 13a and the signal intensity of the image can be changed.
  • the photodetector 13a has its detection surface facing the pinhole plate 12a, and receives and detects the first fluorescence that has passed through the pinhole plate 12a.
  • the photodetector 13a is a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), HPD (Hybrid Photo Detector), area image sensor, or the like.
  • the second to fourth subunits 6b to 6d also have the same configuration as the first subunit 6a.
  • the second subunit 6b includes a base plate 8b, a dichroic mirror (second beam splitter) 9b, a light source device 10b, a dichroic mirror 11b, a pinhole plate (second aperture member) 12b, a photodetector ( a second photodetector) 13b.
  • the dichroic mirror 9b reflects the second excitation light with a wavelength ⁇ 2 (> ⁇ 1 ) emitted by the second subunit 6b and the corresponding second fluorescent light with a wavelength range ⁇ 2 generated from the sample M, It has a property of transmitting light having a longer wavelength than the excitation light of 2 and the fluorescence of the second.
  • the dichroic mirror 11b has the property of transmitting the second fluorescence in the wavelength range ⁇ 2 and reflecting the second excitation light in the wavelength ⁇ 2 shorter than the wavelength range ⁇ 2.
  • the light source device 10b is a device incorporating a light-emitting element that outputs the second excitation light of wavelength ⁇ 2.
  • the pinhole plate 12b is arranged so that its pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the second excitation light on the sample M, and is a diaphragm member that restricts the light flux of the second fluorescence.
  • the photodetector 13b has its detection surface facing the pinhole plate 12b, and receives and detects the second fluorescence that has passed through the pinhole plate 12b.
  • the photodetector 13b is a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), HPD (Hybrid Photo Detector), area image sensor, or the like.
  • the third subunit 6c includes a base plate 8c, a dichroic mirror (third beam splitter) 9c, a light source device 10c, a dichroic mirror 11c, a pinhole plate (third aperture member) 12c, and a photodetector (third photodetector) 13c.
  • the dichroic mirror 9c reflects the third excitation light with a wavelength ⁇ 3 (> ⁇ 2 ) emitted by the third subunit 6c and the corresponding third fluorescent light with a wavelength range ⁇ 3 generated from the sample M, It has a property of transmitting light having a longer wavelength than the excitation light of 3 and the fluorescence of the third.
  • the dichroic mirror 11c has a property of transmitting the third fluorescent light in the wavelength range ⁇ 3 and reflecting the third excitation light of wavelength ⁇ 3 shorter than the wavelength range ⁇ 3.
  • the light source device 10c is a device containing a light-emitting element that outputs third excitation light with a wavelength of ⁇ 3.
  • the pinhole plate 12c is arranged so that the pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the third excitation light on the sample M, and is a diaphragm member that restricts the light flux of the third fluorescence.
  • the photodetector 13c has its detection surface facing the pinhole plate 12c, and receives and detects the third fluorescence that has passed through the pinhole plate 12c.
  • the photodetector 13c is a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), HPD (Hybrid Photo Detector), area image sensor, or the like.
  • the fourth subunit 6d includes a base plate 8d, a total reflection mirror 9d, a light source device 10d, a dichroic mirror 11d, a pinhole plate (fourth aperture member) 12d, and a photodetector (fourth photodetector) 13d. and
  • the total reflection mirror 9d reflects the fourth excitation light of wavelength ⁇ 4 (> ⁇ 3 ) emitted by the fourth subunit 6d and the fourth fluorescent light of wavelength range ⁇ 4 emanating from the sample M correspondingly.
  • the dichroic mirror 11d has the property of transmitting the fourth fluorescence in the wavelength range ⁇ 4 and reflecting the fourth excitation light in the wavelength ⁇ 4 shorter than the wavelength range ⁇ 4.
  • the light source device 10d is a device containing a light-emitting element that outputs fourth excitation light with a wavelength of ⁇ 4.
  • the pinhole plate 12d is a diaphragm member arranged so that its pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the fourth excitation light on the sample M, and restricts the light flux of the fourth fluorescence.
  • the photodetector 13d has its detection surface facing the pinhole plate 12d, and receives and detects the fourth fluorescence that has passed through the pinhole plate 12d.
  • the photodetector 13d is a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), HPD (Hybrid Photo Detector), area image sensor, or the like.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a schematic configuration of the light source device 10a.
  • the light source device 10a includes a light emitting element (light source) 21 that outputs laser light, which is first excitation light with a wavelength ⁇ 1, and a photodetector that detects the laser light output from the light emitting element 21 and outputs a detection signal. 22, a drive unit 23 that supplies a drive current to the light emitting element 21, and a control unit 24 that outputs a drive signal for controlling the drive current to the drive unit 23 according to a target light amount.
  • the light emitting element 21 is, for example, a laser diode (hereinafter simply referred to as "LD"). However, the light emitting element 21 may be another light emitting element such as a light emitting diode (LED).
  • the photodetector 22 is a photomultiplier tube, photodiode, avalanche photodiode, MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), HPD (Hybrid Photo Detector), area image sensor, or the like.
  • the drive unit 23 is a voltage-controlled current source including a transistor that generates a drive current according to a drive signal that is a voltage signal.
  • the control unit 24 built into the light source device 10a includes a CPU (Central Processing Unit) that is a processor, a RAM (Random Access Memory) or ROM (Read Only Memory) that is a recording medium, a communication module, an input/output module, and the like. including a microcomputer.
  • the control unit 24 causes the hardware such as the CPU and RAM to read the program, thereby operating the communication module, the input/output module, etc. under the control of the CPU, and reading and writing data in the RAM. By doing so, the functions described later are realized.
  • the CPU may be a single piece of hardware, or may be implemented in a programmable logic such as an FPGA like a soft processor.
  • the RAM and ROM may be stand-alone hardware, or may be built in programmable logic such as FPGA.
  • Various data necessary for executing this computer program and various data generated by executing this computer program are all stored in built-in memories such as ROM and RAM, or storage media such as hard disk drives.
  • the light source devices 10b, 10c, and 10d have the same configuration as the light source device 10a, and differ only in the wavelength of the laser light output from the light emitting element 21. Only the detailed configuration of the light source device 10a will be described below.
  • FIG. 3 is a diagram showing a detailed circuit configuration of the light source device 10a.
  • the control unit 24 constituting the light source device 10a includes a microcomputer 25, a DA converter (hereinafter referred to as "DAC") 26, AD converters (hereinafter referred to as "ADC") 27 and 28, a subtractor 29, and An amplifier 30 is included.
  • the light source device 10a is further provided with two switches SW1 and SW2 for switching the signal transmission path.
  • the DAC 26 receives a control value indicating a target light amount of laser light output from the microcomputer 25 , converts the control value into a control signal that is a voltage signal, and outputs the control signal to the subtractor 29 .
  • Subtractor 29 outputs different types of signals depending on the mode.
  • the subtractor 29 receives the control signal and the detection signal output from the photodetector 22 via the switch SW2, generates a difference signal indicating the difference between the control signal and the detection signal, The difference signal is output to amplifier 30 .
  • the control signal output from the DAC 26 is output to the amplifier 30 as it is.
  • the amplifier 30 also has different functions depending on the mode.
  • the drive signal is adjusted and output so that the difference signal output from the subtractor 29 is minimized.
  • the operation mode it outputs a driving signal obtained by amplifying the control signal output from the subtractor 29 by a predetermined amplification factor.
  • the driving signal output from the amplifier 30 is converted by the driving section 23 into a driving current supplied to the light emitting element 21 . That is, by controlling the drive signal, the drive current output from the drive section 23 to the light emitting element 21 can be controlled, and the light intensity of the laser light output from the light emitting element 21 can be controlled.
  • the switch SW2 switches the output destination of the detection signal generated by the photodetector 22 between the subtractor 29 and the ADC 28.
  • the ADC 28 converts the amount of laser light indicated by the detection signal into a digital value and inputs it to the microcomputer 25 .
  • SW1 is provided on a signal transmission path between the output of the amplifier 30 and the input of the ADC 27, and turns on/off the input of the driving signal from the amplifier 30 to the ADC 27.
  • the ADC 27 converts the drive value indicated by the drive signal into a digital value and inputs it to the microcomputer 25 .
  • the light source device 10a configured as described above is configured to operate by switching between two types of functions, a setting mode and an operation mode, under the control of the microcomputer 25.
  • FIG. FIG. 4 is a circuit diagram showing the switching state of the light source device 10a during operation in the setting mode
  • FIG. 5 is a circuit diagram showing the switching state of the light source device 10a during operation in the operation mode.
  • the setting mode functions operate as follows. That is, as shown in FIG. 4, the switch SW1 is turned on, and the switch SW2 is switched to set the transmission path of the detection signal to the subtractor 29 side. Thereby, the detection signal from the photodetector 22 is fed back to the control signal output from the DAC 26 , and the driving signal output from the amplifier 30 is input to the ADC 27 .
  • the control unit 24 corrects (adjusts) the drive signal so that the difference between the detection signal and the control signal becomes small.
  • APC control (automatic power control, first control) that decreases the drive signal when the light intensity is greater than that indicated by the detection signal and increases the drive signal when the light intensity indicated by the detection signal is smaller than the light intensity indicated by the control signal. and adjusts and outputs the drive signal based on the control signal and the detection signal.
  • the control unit 24 performs APC control while changing the voltage value of the control signal within the range of the amount of laser light that can be assumed to be used in the confocal microscope unit 1, and controls the drive value corresponding to the drive signal. and the amount of laser light indicated by the voltage value of the control signal are generated, and the generated LUTs are stored in internal memory such as RAM in the microcomputer 25.
  • the drive value corresponding to the drive current set in the LUTs is a value obtained by converting the value of the drive current into a value before being amplified by the amplifier 30 . Also, the voltage value of the control signal is changed, for example, by setting the voltage value corresponding to the maximum amount of light to 100% and changing the voltage value from 1% to 100% in increments of 0.5%.
  • the function of the operation mode When the function of the operation mode operates, it operates as follows. That is, as shown in FIG. 5, the switch SW1 is turned off, and the switch SW2 is switched to set the transmission path of the detection signal to the ADC 28 side. Thereby, the detection signal from the photodetector 22 is input to the ADC 28 .
  • the control unit 24 inputs the control signal as it is to the amplifier 30, and outputs the control signal amplified by the amplifier 30 as a drive signal. : automatic current control, second control).
  • the control unit 24 when controlling the light intensity of the laser beam to the target light intensity, the control unit 24 reads the LUTs from the built-in memory such as RAM in the microcomputer 25 and specifies the drive value corresponding to the target light intensity. Then, the control unit 24 executes the above ACC control using the control signal having the specified drive value. In addition, the control unit 24 also monitors the light intensity of the laser light indicated by the detection signal when operating the functions of the operation mode, and when the light intensity exceeds a predetermined reference value (for example, 1.5 mW), the driving Control is performed so that the generation of the drive current by the unit 23 is stopped.
  • a predetermined reference value for example, 1.5 mW
  • the confocal microscope unit 1 can be used safely even if
  • FIG. 6 is a flowchart showing operation procedures of the setting mode functions of the light source device 10a
  • FIG. 7 is a flowchart showing operation procedures of the operation mode functions of the light source device 10a.
  • the control unit 24 sets the voltage value of the control signal to an initial value within a predetermined range. (step S1). Then, APC control using the set control signal is executed by the control unit 24 (step S2). Accordingly, the control unit 24 specifies a drive value corresponding to the drive signal output from the control unit 24 (step S3). Next, the control unit 24 records in LUTs the correspondence relationship between the identified drive value and the light amount indicated by the voltage value of the control signal at that time (step S4).
  • the control unit 24 determines whether or not the next value exists within a predetermined range for the voltage value of the control signal (step S5). As a result of determination, if the next voltage value exists (step S5; Yes), the voltage value of the control signal is set to the next value and the processing of steps S1 to S4 is repeated. As a result of the determination, if the next voltage value does not exist (step S5; No), the controller 24 stores the LUTs in which the correspondence relationships have been recorded in the processing up to that point in the microcomputer 25 (step S6 ). By the above processing, the operation of the setting mode is completed.
  • the control unit 24 sets the target light amount of the laser beam to be output (step S101). .
  • the controller 24 reads out the LUTs from the microcomputer 25 (step S102). Then, the LUTs are referenced by the control unit 24, and the driving value corresponding to the set target light amount is specified (step S103). Furthermore, the control unit 24 executes ACC control using a control signal having the specified drive value (step S104). In addition, the controller 24 identifies the amount of laser light based on the detection signal output from the photodetector 22 (step S105).
  • step S106 it is determined by the control unit 24 whether or not the specified amount of light is equal to or less than a predetermined reference value. As a result of the determination, when it is determined that the amount of light exceeds the reference value (step S106; No), the process proceeds to step S108. On the other hand, when it is determined that the amount of light is equal to or less than the reference value as a result of the determination (step S106; Yes), the control unit 24 determines whether or not to end the output of the laser light corresponding to the scanning of the sample M. is determined (step S107). As a result of the determination, if the output of the laser light is to be continued (step S107; No), the target value of the light amount is changed to the next value according to the scan, and the processing of steps S101 to S106 is repeated.
  • step S106 determines that the amount of light exceeds the reference value as a result of the determination in step S106 (step S106; No), or if the output of the laser light is stopped as a result of the determination in step S107 (step S107; Yes ), the generation of the drive current by the drive unit 23 is stopped by the control unit 24 (step S108).
  • the first excitation light output from the first subunit 6a is reflected by the dichroic mirror 9a, passes through the scan mirror 4 and the scan lens 7, and reaches the sample M.
  • the first fluorescent light scanned upward and correspondingly generated from above the sample M passes through the scan lens 7 and the scan mirror 4 and is reflected by the dichroic mirror 9a to enter the first subunit 6a,
  • the image is formed on the pinhole plate 12a in the first subunit 6a and detected by the photodetector 13a.
  • the second excitation light output from the second subunit 6b is transmitted through the dichroic mirror 9a in the first subunit 6a after being reflected by the dichroic mirror 9b in the second subunit 6b.
  • the second fluorescence generated from the sample M accordingly passes through the dichroic mirror 9a via the scan lens 7 and the scan mirror 4. After that, it is reflected by the dichroic mirror 9b and enters the second subunit 6b, and its image is formed on the pinhole plate 12b in the second subunit 6b and detected by the photodetector 13b.
  • the excitation light emitted from the own unit and the fluorescence generated accordingly are reflected by the dichroic mirror of the own unit and transmitted through the dichroic mirrors of the other units. Fluorescence generated in response to two wavelengths of excitation light can be detected independently.
  • LUTs indicating the correspondence between the drive current supplied to the light emitting element 21 and the amount of excitation light are generated and stored in advance by the function of the setting mode of the control unit 24.
  • the operation mode function of the control unit 24 Based on the LUTs, the operation mode function of the control unit 24 outputs a control signal corresponding to the driving current corresponding to the target light amount to the driving unit 23 that supplies the driving current to the light emitting element 21 as a driving signal. be done.
  • the driving current is stopped when the light intensity of the excitation light exceeds a predetermined value.
  • the target light amount is set so that the light amount of the excitation light is changed accordingly when the scanning speed of the excitation light on the sample M changes, the light amount of the excitation light is changed accordingly.
  • the light emitting element 21 can be driven at high speed and with high accuracy.
  • the confocal microscope unit 1 can be used safely by performing control to stop the excitation light when the light amount of the excitation light exceeds a predetermined value. As a result, the irradiation energy of the excitation light to the sample M can be made uniform with high accuracy, and confocal imaging with high safety can be realized.
  • FIG. 8 is a plan view showing an example of the scanning form of the first excitation light on the sample M using the confocal microscope unit 1.
  • an effective visual field range AR2 is set inside the scanning range AR1 by the scan mirror 4.
  • FIG. within the scanning range AR1 the entire scanning range AR1 is scanned by repeating two round trip linear scans along one direction while shifting the scanning position in the direction perpendicular to the one direction.
  • the light source device 10a operates so as to irradiate the first excitation light only during scanning within the effective visual field range AR2 inside the scanning range AR1. do.
  • FIG. 9 shows temporal changes in the amount of laser light output from the light source device 10a corresponding to the scanning mode shown in FIG. 8, and FIG. , corresponding to the sweep waveform of .
  • the lower part of FIG. 10 shows the time change of the amount of light
  • the upper part of FIG. 10 shows the corresponding sweep waveform W1 of the drive signal for the scan mirror 4 and the time change of the scanning speed V1 of the laser light.
  • a sine wave is used as the sweep waveform W1 of the drive signal for tilting the reflection angle of the scan mirror 4 in one direction.
  • the light source device 10a modulates the intensity of the LD light quantity in accordance with the scanning speed of the scan mirror 4, thereby realizing uniform irradiation energy within the effective visual field range AR2.
  • the light source device 10a operates to output a laser beam in one direction (forward) scanning of the round trip (forward and backward) scanning within the effective visual field range AR2 of the sample M,
  • the amount of laser light irradiated to the area is maximized, and the amount of laser light during scanning is set so that the amount of laser light irradiated gradually decreases from the center to the edge of the effective visual field range AR2.
  • the light source device 10a sets the voltage value of the control signal set during operation in the operation mode so as to vary according to the waveform of the scanning speed V1, which is the differentiated waveform of the sweep waveform W1.
  • V1 the waveform of the scanning speed
  • W1 the differentiated waveform of the sweep waveform W1
  • the maximum value of the light intensity of the laser light is set according to the input value to the microcomputer 25. It is possible.
  • the modulation degree of the light intensity of the laser light is constant, and the maximum value of the light intensity can be set within the range of 1% to 100%. In this case, if the degree of modulation is doubled, the amount of laser light can be changed in a dynamic range of 100 times (200 times including modulation).
  • the light source devices 10a to 10d feed back the detection signal from the photodetector 22 to the output of the control signal in the control section 24 in the setting mode, and input it to the control section 24 in the operation mode.
  • a switch SW2 With such a configuration, the detection signal from the photodetector 22 can be appropriately output when the function of the setting mode is activated and when the function of the operation mode is activated. As a result, it is possible to achieve both uniformity of irradiation energy of excitation light and improvement of safety.
  • control unit 24 executes APC control to increase or decrease the drive signal so that the difference between the detection signal and the control signal is reduced in the setting mode, and controls the drive signal based on the control signal in the operation mode. It functions to execute ACC control that outputs With such a configuration, it is possible to accurately store the correspondence relationship between the drive current and the amount of excitation light when the function of the setting mode is operated, and to drive the light emitting element at high speed when the function of the operation mode is operated. can be In particular, highly accurate control of the amount of excitation light is possible even if there are individual differences in the light emission characteristics of the light emitting elements 21, changes over time, changes in environmental temperature, and the like. As a result, the irradiation energy of the excitation light to the sample M can be made uniform with higher accuracy.
  • the drive section 23 is configured by a voltage-controlled current source that generates a drive current based on the drive signal.
  • the configuration of the light source devices 10a to 10d can be simplified.
  • the control unit 24 generates and stores LUTs indicating the correspondence relationship between the drive value corresponding to the drive current and the amount of light indicated by the control signal in the setting mode, and based on the LUTs in the operation mode. First, it operates to execute ACC control using a control signal having a drive value corresponding to the target light amount. According to such a configuration, by the function of the setting mode of the control unit 24, LUTs indicating the correspondence relationship between the driving value for driving the light emitting element 21 and the light amount indicated by the control signal are generated and stored in advance.
  • the control signal corresponding to the drive value corresponding to the target light amount is output as a drive signal to the drive unit 23 that supplies the drive current to the light emitting element 21 by the function of the operation mode.
  • the irradiation energy of the excitation light to the sample M can be made uniform with high accuracy.
  • the controllers 24 of the light source devices 10a to 10d may have the following functions. That is, in the setting mode, the control unit 24 generates and stores LUTs indicating the correspondence relationship between the drive value corresponding to the drive signal and the amount of light indicated by the detection signal output from the photodetector 22, and in the operation mode, the ACC control may be performed based on LUTs. According to such a modified example as well, the irradiation energy of the excitation light to the sample M can be made uniform with high accuracy.
  • FIG. 11 shows the circuit configuration of a light source device 110a according to a modification.
  • the light source device 110a does not have the switches SW1 and SW2 of the light source device 10a, and the detection signal output from the photodetector 22 is input to the microcomputer via the ADC 28 as a digital value of the light intensity.
  • the microcomputer 25 of the light source device 110a sets a control value so that the detection signal output from the photodetector 22 becomes a desired value (desired amount of light) on its firmware (FW) when the function of the setting mode is operated. and output to the DAC 26.
  • the DAC 26 receives the adjusted control value output from the microcomputer 25 , converts the control value into a control signal that is a voltage signal, and outputs the control signal to the amplifier 30 . Then, the amplifier 30 generates a driving signal based on the input control signal and outputs it to the driving section 23 .
  • the drive unit 23 generates a drive current to be supplied to the light emitting element 21 based on the drive signal and supplies the light emitting element 21 with the drive current.
  • the photodetector 22 detects the emitted light again, and the detection signal output from the photodetector 22 is again input to the microcomputer via the ADC 28 as a digital value of the amount of light.
  • the microcomputer 25 executes APC control by repeating this until the detection signal reaches a desired value, and records the control value and the corresponding light amount in the LUTs when the desired value is obtained. Further, the microcomputer 25 executes ACC control using LUTs when the functions of the operation mode are operated, and outputs control values generated as a result of the control to the DAC 26 . At the same time, the microcomputer 25 controls the stop of the drive current based on the digital value of the amount of light input from the ADC 28 when the function of the operation mode is activated. According to such a modified example, it is possible to uniformize the irradiation energy of the excitation light to the sample M with high accuracy, and to realize confocal imaging with high safety.
  • the light source unit preferably has a switch that feeds back the detection signal from the photodetector to the output of the control signal in the control section in the setting mode and inputs it to the control section in the operation mode. be.
  • the detection signal from the photodetector can be appropriately output when the function of the setting mode is activated and when the function of the operation mode is activated. As a result, it is possible to achieve both uniformity of irradiation energy of excitation light and improvement of safety.
  • the control unit executes automatic light amount control that increases or decreases the drive signal so that the difference between the detection signal and the control signal is reduced in the setting mode, and controls the drive signal based on the control signal in the operation mode. It is also preferable to perform automatic current control that outputs.
  • the correspondence relationship between the drive current and the amount of excitation light can be memorized accurately when the function of the setting mode is operated, and the light source can be driven at high speed when the function of the operation mode is operated. As a result, the irradiation energy of the excitation light to the sample can be made uniform with higher accuracy.
  • the drive section has a voltage-controlled current source that generates a drive current based on the drive signal.
  • the configuration of the light source unit can be simplified.
  • control unit generates and stores a data table indicating the correspondence relationship between the drive value corresponding to the drive current and the amount of light indicated by the control signal in the setting mode, and stores the data table in the operation mode. It is also preferable to execute the second control using a control signal having a drive value corresponding to the target light amount.
  • the setting mode function of the control unit pre-generates and stores a data table showing the correspondence between the driving value for driving the light source and the light amount indicated by the control signal, and the operation mode of the control unit is set.
  • a control signal corresponding to a drive value corresponding to a target light amount is output as a drive signal to a drive unit that supplies a drive current to the light source.
  • the control unit generates and stores a data table indicating the correspondence relationship between the drive value corresponding to the drive signal and the light amount indicated by the detection signal in the setting mode, and stores the data table in the operation mode. It is also preferable to execute the second control using a control signal having a drive value corresponding to the target light amount.
  • a data table indicating the correspondence relationship between the driving value for driving the light source and the light amount indicated by the detection signal of the excitation light is generated and stored in advance by the setting mode function of the control unit.
  • a control signal corresponding to the driving value corresponding to the target light amount is output as the driving signal to the driving section that supplies the driving current to the light source.
  • the irradiation energy of the excitation light to the sample can be made uniform with high accuracy.
  • the embodiments are intended for use as a confocal microscope unit, a confocal microscope, and a control method for the confocal microscope unit, and are capable of uniformizing the irradiation energy of the excitation light to the sample with high accuracy.
  • SYMBOLS 1 Confocal microscope unit 4
  • Scan mirror 10a, 10b, 10c, 10d, 110a Light source device (light source unit) 21... Light emitting element (light source) 22... Photodetector 23... Driving section 24... Control unit 50... Microscope A... Confocal microscope P1... Connection port SW1, SW2... Switch M... Sample.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

共焦点顕微鏡ユニット１は、発光素子２１、光検出器２２、駆動部２３、及び制御部２４を有する光源装置１０ａと、光源装置１０ａから出力された励起光を走査させるスキャンミラー４とを備え、制御部２４は、設定モードでは、光検出器２２からの検出信号及び制御信号を基に駆動部２３を駆動する駆動信号を調整して出力する第１の制御を実行し、制御信号の値を変更しながら第１の制御を実行することにより、駆動電流と励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルを生成および記憶し、動作モードでは、制御信号を駆動信号として出力する第２の制御を実行し、データテーブルを読み出し、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動電流に対応する制御信号を用いて第２の制御を実行し、検出信号の示す光量が所定値を超えた場合に駆動電流を停止する制御を実行する。

Description

共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法
　本開示は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡に関する。
　従来から、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットが知られている（例えば、下記特許文献１～３参照。）。このような共焦点顕微鏡ユニットによれば、顕微鏡を利用した共焦点イメージングを容易に実現することができる。
国際公開２０２０／１９６７８３号公報 国際公開２０２０／１９６７８２号公報 国際公開２０２０／１９６７８４号公報
　上述したような従来の共焦点顕微鏡ユニットにおいては、試料に対して励起光をスキャンすることにより、試料の光学的な像を取得している。ここで、試料に対して励起光を２次元的にスキャンする際には試料上におけるスキャン速度を変化させる必要がある。そのような場合においても、試料における単位面積（単位長さ）当たりの励起光の照射エネルギーを均一にすることが望ましい。
　そこで、実施形態の一側面は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することが可能な共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。
　実施形態の一側面に係る共焦点顕微鏡ユニットは、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、励起光を出力する光源、光源から出力される励起光を検出して検出信号を出力する光検出器、光源に駆動電流を供給する駆動部、及び、目標の光量を示す制御信号に応じて駆動部に対し駆動電流を制御する駆動信号を出力する制御部を有する光源ユニットと、光源ユニットから出力された励起光を、試料上で走査させるスキャンミラーと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、及び、光源ユニットが固定された筐体と、を備え、制御部は、設定モードと動作モードの２種類の機能を有し、設定モードでは、制御信号及び検出信号を基に駆動信号を調整して出力する第１の制御を実行し、制御信号の値を変更しながら第１の制御を実行することにより、駆動電流と励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルを生成および記憶し、動作モードでは、制御信号を駆動信号として出力する第２の制御を実行し、データテーブルを読み出し、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動電流に対応する制御信号を用いて第２の制御を実行し、検出信号の示す光量が所定値を超えた場合に駆動電流を停止する制御を実行する。
　あるいは、実施形態の他の側面に係る共焦点顕微鏡は、上記一側面の共焦点顕微鏡ユニットと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡と、を備える。
　あるいは、実施形態の別の他の側面に係る共焦点顕微鏡ユニットの制御方法は、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、励起光を出力する光源、光源から出力される励起光を検出して検出信号を出力する光検出器、光源に駆動電流を供給する駆動部、及び、目標の光量を示す制御信号に応じて駆動部に対し駆動電流を制御する駆動信号を出力する制御部を有する光源ユニットと、光源ユニットから出力された励起光を、試料上で走査させるスキャンミラーと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、及び、光源ユニットが固定された筐体と、を備えた共焦点顕微鏡ユニットを用いた制御方法であって、制御信号及び検出信号を基に駆動信号を調整して出力する第１の制御を実行し、制御信号の値を変更しながら第１の制御を実行することにより、駆動電流と励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルを生成および記憶するステップと、制御信号を駆動信号として出力する第２の制御を実行し、データテーブルを読み出し、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動電流に対応する制御信号を用いて第２の制御を実行し、検出信号の示す光量が所定値を超えた場合に駆動電流を停止する制御を実行するステップと、を備える。
　上記一側面、他の側面、あるいは別の他の側面のいずれかによれば、光源ユニット内の光源から出力された励起光がスキャンミラーによって試料上に走査され、それに応じた試料の像が顕微鏡を介して観察可能とされる。上記光源ユニットにおいては、制御部の設定モードの機能により、光源に供給する駆動電流と励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルが予め生成および記憶され、制御部の動作モードの機能により、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動電流に対応する制御信号が、光源に駆動電流を供給する駆動部に対して、駆動信号として出力される。加えて、動作モードの機能により、励起光の光量が所定値を超えた場合には駆動電流が停止される。これにより、試料上の励起光のスキャン速度が変化する際にそれに応じて励起光の光量を変化させるように目標の光量を設定した際に、励起光の光量をそれに追随して変化させるように、光源を高速かつ高精度に駆動することができる。さらに、励起光の光量が所定値を超えた場合には励起光が停止される制御が行われることにより、共焦点顕微鏡ユニットを安全に使用することができる。その結果、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができるとともに、安全性の高い共焦点イメージングを実現することができる。
　本開示の一側面によれば、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができる。
実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。 図１の光源装置１０ａの概略構成を示すブロック図である。 図１の光源装置１０ａの詳細な回路構成を示す図である。 設定モードの動作時の光源装置１０ａの切り替え状態を示す回路図である。 動作モードの動作時の光源装置１０ａの切り替え状態を示す回路図である。 光源装置１０ａの設定モードの機能の動作手順を示すフローチャートである。 光源装置１０ａの動作モードの機能の動作手順を示すフローチャートである。 共焦点顕微鏡Ａを用いた試料Ｍ上の第１の励起光のスキャンの形態の一例を示す平面図である。 図８に示すスキャン形態に対応して光源装置１０ａから出力されるレーザ光の光量の時間変化を示すグラフである。 図９の光量の時間変化をスキャンミラー４の掃引波形に対応して示すグラフである。 変形例にかかる光源装置１１０ａの回路構成を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
　図１は、実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡Ａは、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、共焦点顕微鏡ユニット１が顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。この共焦点顕微鏡ユニット１は、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。
　詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１は、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１の各構成要素について詳細に説明する。
　鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面にスポットを結ぶ機能を有する光学素子である。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光をスキャンミラー４に導光する。
　メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光を、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて導く役割を有する。
　固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて反射する。
　第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１のビームスプリッタ）９ａ、光源装置（光源ユニット）１０ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ１より短い波長λ１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源装置１０ａは、波長λ１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）を内蔵する装置であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源装置１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄも、第１のサブユニット６ａと同様な構成を有する。
　すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２のビームスプリッタ）９ｂ、光源装置１０ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ２（＞λ１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ２より短い波長λ２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源装置１０ｂは、波長λ２の第２の励起光を出力する発光素子を内蔵する装置である。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３のビームスプリッタ）９ｃ、光源装置１０ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ３（＞λ２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ３より短い波長λ３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源装置１０ｃは、波長λ３の第３の励起光を出力する発光素子を内蔵する装置である。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー９ｄ、光源装置１０ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。全反射ミラー９ｄは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ４（＞λ３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ４より短い波長λ４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源装置１０ｄは、波長λ４の第４の励起光を出力する発光素子を内蔵する装置である。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　次に、光源装置１０ａの構成について詳細に説明する。図２は、光源装置１０ａの概略構成を示すブロック図である。
　光源装置１０ａは、波長λ１の第１の励起光であるレーザ光を出力する発光素子（光源）２１と、発光素子２１から出力されるレーザ光を検出して検出信号を出力する光検出器２２、発光素子２１に駆動電流を供給する駆動部２３、及び、目標の光量に応じて駆動部２３に対し駆動電流を制御する駆動信号を出力する制御部２４とを備える。発光素子２１は、例えば、レーザダイオード（以下、単に「ＬＤ」という。）である。ただし、発光素子２１は、発光ダイオード（ＬＥＤ）など他の発光素子でもよい。光検出器２２は、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。駆動部２３は、電圧信号である駆動信号に応じて駆動電流を生成するトランジスタを含む電圧制御電流源である。
　光源装置１０ａに内蔵される制御部２４は、プロセッサであるＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、記録媒体であるＲＡＭ（Random　Access　Memory）又はＲＯＭ（Read　Only　Memory）、通信モジュール、及び入出力モジュール等を含んだマイクロコンピュータを含む。制御部２４は、ＣＰＵ及びＲＡＭ等のハードウェア上にプログラムを読み込ませることにより、ＣＰＵの制御のもとで、通信モジュール、及び入出力モジュール等を動作させるとともに、ＲＡＭにおけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで、後述する機能を実現させる。なお、ＣＰＵは、単体のハードウェアでもよく、ソフトプロセッサのようにＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に実装されたものでもよい。ＲＡＭやＲＯＭについても単体のハードウェアでもよく、ＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に内蔵されたものでもよい。このコンピュータプログラムの実行に必要な各種データ、及び、このコンピュータプログラムの実行によって生成された各種データは、全て、ＲＯＭ、ＲＡＭ等の内蔵メモリ、又は、ハードディスクドライブなどの記憶媒体に格納される。
　光源装置１０ｂ，１０ｃ，１０ｄは、光源装置１０ａと同様な構成を有し、発光素子２１の出力するレーザ光の波長のみが異なっている。以下、光源装置１０ａの詳細な構成のみを説明する。
　図３は、光源装置１０ａの詳細な回路構成を示す図である。光源装置１０ａを構成する制御部２４は、マイクロコンピュータ２５、ＤＡ変換器（以下、「ＤＡＣ」という。）２６、ＡＤ変換器（以下、「ＡＤＣ」という。）２７，２８、減算器２９、及びアンプ３０を含む。光源装置１０ａには、信号の伝達経路を切り替える２つのスイッチＳＷ１，ＳＷ２もさらに設けられている。
　ＤＡＣ２６は、マイクロコンピュータ２５から出力されるレーザ光の目標の光量を示す制御値を受けて、その制御値を電圧信号である制御信号に変換して減算器２９に出力する。減算器２９は、モードに応じて異なる種類の信号を出力する。まず、設定モードにおいて、減算器２９は、その制御信号と光検出器２２からスイッチＳＷ２を介して出力された検出信号とを受け、制御信号と検出信号との差分を示す差信号を生成し、差信号をアンプ３０に出力する。一方、動作モードにおいては、ＤＡＣ２６から出力された制御信号をそののままアンプ３０に出力する。また、アンプ３０もモードに応じて異なる機能を有する。まず、設定モードにおいては、減算器２９から出力される差信号が最小となるように駆動信号を調整して出力する。一方、動作モードにおいては、減算器２９から出力される制御信号を所定の増幅率で増幅した駆動信号を出力する。アンプ３０から出力された駆動信号は、駆動部２３にて、発光素子２１に供給される駆動電流に変換される。つまり、駆動信号を制御することで駆動部２３から発光素子２１へ出力される駆動電流を制御でき、発光素子２１から出力されるレーザ光の光量を制御することができる。
　スイッチＳＷ２は、光検出器２２によって生成される検出信号の出力先を、減算器２９とＡＤＣ２８との間で切り替える。ＡＤＣ２８は、検出信号の示すレーザ光の光量をデジタル値に変換してマイクロコンピュータ２５に入力する。ＳＷ１は、アンプ３０の出力とＡＤＣ２７の入力との間の信号伝達経路上に設けられ、アンプ３０からＡＤＣ２７に対する駆動信号の入力をオン／オフする。ＡＤＣ２７は、駆動信号の示す駆動値をデジタル値に変換してマイクロコンピュータ２５に入力する。
　上記構成の光源装置１０ａは、マイクロコンピュータ２５の制御に応じて、設定モードと動作モードの２種類の機能を切り替えて動作するように構成されている。図４は、設定モードの動作時の光源装置１０ａの切り替え状態を示す回路図、図５は、動作モードの動作時の光源装置１０ａの切り替え状態を示す回路図である。
　設定モードの機能の動作時には、次のように動作する。すなわち、図４に示されるように、スイッチＳＷ１がオンされ、スイッチＳＷ２が検出信号の伝達経路を減算器２９側に設定するように切り替えられる。これにより、光検出器２２からの検出信号がＤＡＣ２６の出力する制御信号にフィードバックされ、アンプ３０の出力する駆動信号がＡＤＣ２７に入力される。このような接続構成により、設定モードの機能の動作時には、制御部２４は、検出信号と制御信号の差が小さくなるような駆動信号の補正（調整）、すなわち、検出信号の示す光量が制御信号の示す光量より大きい場合は駆動信号を減少させ、検出信号の示す光量が制御信号の示す光量より小さい場合は駆動信号を増加させるＡＰＣ制御（Auto　Power　Control：自動光量制御、第１の制御）を実行し、制御信号及び検出信号を基に駆動信号を調整し出力する。このとき、制御部２４は、制御信号の電圧値を、共焦点顕微鏡ユニット１での使用を想定しうるレーザ光の光量の範囲で変更しながらＡＰＣ制御を実行し、駆動信号に対応する駆動値と制御信号の電圧値の示すレーザ光の光量との対応関係を示すデータテーブルであるＬＵＴｓ（Look　Up　Tables）を生成し、生成したＬＵＴｓをマイクロコンピュータ２５内のＲＡＭ等の内蔵メモリに記憶する。なお、ＬＵＴｓに設定される駆動電流に対応する駆動値は、駆動電流の値をアンプ３０による増幅前の値に変換した値である。また、制御信号の電圧値の変更は、例えば、最大光量に対応する電圧値を１００％として１％から１００％までを０．５％刻みで変更することにより行われる。
　動作モードの機能の動作時には、次のように動作する。すなわち、図５に示されるように、スイッチＳＷ１がオフされ、スイッチＳＷ２が検出信号の伝達経路をＡＤＣ２８側に設定するように切り替えられる。これにより、光検出器２２からの検出信号がＡＤＣ２８に入力される。このような接続構成により、動作モードの機能の動作時には、制御部２４は、制御信号をそのままアンプ３０に入力し、アンプ３０によって増幅された制御信号を駆動信号として出力するＡＣＣ制御（Auto　Current　Control：自動電流制御、第２の制御）を実行する。このとき、制御部２４は、レーザ光の光量を目標の光量に制御する際には、マイクロコンピュータ２５内のＲＡＭ等の内蔵メモリからＬＵＴｓを読み出し、目標の光量に対応する駆動値を特定する。そして、制御部２４は、特定した駆動値を有する制御信号を用いて上記のＡＣＣ制御を実行する。加えて、制御部２４は、動作モードの機能の動作時には、検出信号の示すレーザ光の光量のモニタリングも行い、光量が所定の基準値（例えば、１．５ｍＷ）を超えた場合には、駆動部２３による駆動電流の生成を停止するように制御する。これにより、４つの光源装置１０ａ～１０ｄを合わせても所定の基準値の４倍（例えば、１．５ｍＷ×４＝４．５ｍＷ）以下のレーザ出力に抑えることができ、レーザ管理区域外であっても安全に共焦点顕微鏡ユニット１を使用することができる。
　次に、本実施形態の光源装置１０ａの機能の動作手順、すなわち、本実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニットの制御方法について説明する。図６は、光源装置１０ａの設定モードの機能の動作手順を示すフローチャート、図７は、光源装置１０ａの動作モードの機能の動作手順を示すフローチャートである。
　まず、図６を参照して、光源装置１０ａにおける設定モードの動作が、マイクロコンピュータ２５に対する指示入力等により開始されると、制御部２４により、制御信号の電圧値が所定範囲における初期値に設定される（ステップＳ１）。そして、制御部２４により、設定された制御信号を用いたＡＰＣ制御が実行される（ステップＳ２）。それに応じて、制御部２４により、制御部２４の出力する駆動信号に対応する駆動値が特定される（ステップＳ３）。次に、制御部２４により、特定した駆動値と、そのときの制御信号の電圧値が示す光量との対応関係が、ＬＵＴｓに記録される（ステップＳ４）。
　その後、制御部２４により、制御信号の電圧値に関して所定範囲内に次の値が存在するか否かが判定される（ステップＳ５）。判定の結果、次の電圧値が存在する場合には（ステップＳ５；Ｙｅｓ）、制御信号の電圧値が次の値に設定されてステップＳ１～Ｓ４の処理が繰り返される。判定の結果、次の電圧値が存在しない場合には（ステップＳ５；Ｎｏ）、制御部２４により、それまでの処理で対応関係が記録されたＬＵＴｓがマイクロコンピュータ２５内に記憶される（ステップＳ６）。以上の処理により、設定モードの動作が完了する。
　図７に移って、光源装置１０ａにおける動作モードの動作が、マイクロコンピュータ２５に対する指示入力等により開始されると、制御部２４により、出力するレーザ光の目標の光量が設定される（ステップＳ１０１）。次に、制御部２４により、マイクロコンピュータ２５内からＬＵＴｓが読み出される（ステップＳ１０２）。そして、制御部２４によりＬＵＴｓが参照され、設定した目標の光量に対応する駆動値が特定される（ステップＳ１０３）。さらに、制御部２４により、特定した駆動値を有する制御信号を用いたＡＣＣ制御が実行される（ステップＳ１０４）。それに加えて、制御部２４により、光検出器２２から出力された検出信号を基にレーザ光の光量が特定される（ステップＳ１０５）。
　そして、制御部２４により、特定した光量が所定の基準値以下であるか否かが判定される（ステップＳ１０６）。判定の結果、光量が基準値を超えたと判定された場合には（ステップＳ１０６；Ｎｏ）、処理がステップＳ１０８に移行される。一方で、判定の結果、光量が基準値以下と判定された場合には（ステップＳ１０６；Ｙｅｓ）、制御部２４により、試料Ｍへのスキャンに応じたレーザ光の出力を終了するか否かが判定される（ステップＳ１０７）。判定の結果、レーザ光の出力を継続する場合には（ステップＳ１０７；Ｎｏ）、光量の目標値がスキャンに応じた次の値に変更されてステップＳ１０１～ステップＳ１０６の処理が繰り返される。
　一方で、ステップＳ１０６の判定の結果、光量が基準値を超えたと判定された場合（ステップＳ１０６；Ｎｏ）、あるいは、ステップＳ１０７の判定の結果、レーザ光の出力を停止する場合（ステップＳ１０７；Ｙｅｓ）には、制御部２４により、駆動部２３による駆動電流の生成が停止される（ステップＳ１０８）。以上の処理により、動作モードの動作が完了する。
　以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１によれば、第１のサブユニット６ａから出力された第１の励起光が、ダイクロイックミラー９ａを反射してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第１の蛍光がスキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してからダイクロイックミラー９ａを反射することにより第１のサブユニット６ａ内に入射し、第１のサブユニット６ａ内のピンホール板１２ａにその像が結ばれて光検出器１３ａで検出される。加えて、第２のサブユニット６ｂから出力された第２の励起光が、第２のサブユニット６ｂ内のダイクロイックミラー９ｂを反射した後に第１のサブユニット６ａ内のダイクロイックミラー９ａを透過してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してダイクロイックミラー９ａを透過した後にダイクロイックミラー９ｂを反射して第２のサブユニット６ｂ内に入射し、第２のサブユニット６ｂ内のピンホール板１２ｂにその像が結ばれて光検出器１３ｂで検出される。同様に、他の第２及び第３のサブユニット６ｃ，６ｄに関しても、自ユニットから照射された励起光及びそれに応じて生じた蛍光が自ユニットのダイクロイックミラーを反射し他ユニットのダイクロイックミラーを透過するように構成されることで、２つの波長の励起光に応じて生じた蛍光の検出が独立に可能となる。
　本実施形態では、光源装置１０ａ～１０ｄにおいては、制御部２４の設定モードの機能により、発光素子２１に供給する駆動電流と励起光の光量との対応関係を示すＬＵＴｓが予め生成および記憶され、制御部２４の動作モードの機能により、ＬＵＴｓを基に、目標の光量に対応する駆動電流に対応する制御信号が、発光素子２１に駆動電流を供給する駆動部２３に対して、駆動信号として出力される。加えて、動作モードの機能により、励起光の光量が所定値を超えた場合には駆動電流が停止される。これにより、試料Ｍ上の励起光のスキャン速度が変化する際にそれに応じて励起光の光量を変化させるように目標の光量を設定した際に、励起光の光量をそれに追随して変化させるように、発光素子２１を高速かつ高精度に駆動することができる。さらに、励起光の光量が所定値を超えた場合には励起光が停止される制御が行われることにより、共焦点顕微鏡ユニット１を安全に使用することができる。その結果、試料Ｍに対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができるとともに、安全性の高い共焦点イメージングを実現することができる。
　図８は、共焦点顕微鏡ユニット１を用いた試料Ｍ上の第１の励起光のスキャンの形態の一例を示す平面図である。このように、試料Ｍ上には、スキャンミラー４による走査範囲ＡＲ１の内側に有効視野範囲ＡＲ２が設定される。この走査範囲ＡＲ１内において、一方向に沿った往復の２回の直線状の走査が、一方向に垂直な方向に走査位置をずらしながら繰り返されることにより、走査範囲ＡＲ１の全体が走査される。この際、試料Ｍの励起光による退色を最小限の範囲にするために、走査範囲ＡＲ１の内側の有効視野範囲ＡＲ２内における走査においてのみ第１の励起光を照射するように光源装置１０ａが動作する。
　また、図９には、図８に示すスキャン形態に対応して光源装置１０ａから出力されるレーザ光の光量の時間変化を示し、図１０には、図９の光量の時間変化をスキャンミラー４の掃引波形に対応して示している。図１０の下側には、光量の時間変化を示し、図１０の上側には、それに対応した、スキャンミラー４の駆動信号の掃引波形Ｗ１、および、レーザ光の走査速度Ｖ１の時間変化を示している。本実施形態では、スキャンミラー４の反射角度を一方向に傾動させるための駆動信号の掃引波形Ｗ１として、正弦波が用いられている。そのため、光源装置１０ａが出力するレーザ光の光量を一定にしてしまうと、試料Ｍ上の有効視野範囲ＡＲ２内の単位面積当たりのレーザ光の照射エネルギーが不均一となってしまい、退色ムラが発生していまう。これを防止するために、光源装置１０ａは、スキャンミラー４による走査速度に合わせてＬＤ光量を強度変調させることで、有効視野範囲ＡＲ２内の照射エネルギーの均一化を実現する。すなわち、光源装置１０ａは、試料Ｍの有効視野範囲ＡＲ２内における往復（行きおよび帰り）の走査のうち一方向（行き）の走査においてレーザ光を出力するように動作し、有効視野範囲ＡＲ２の中央部に照射されるレーザ光の光量を最大とし、有効視野範囲ＡＲ２の中央部から縁部に向かうに従って照射されるレーザ光の光量が次第に小さくなるように走査時のレーザ光の光量を設定する。具体的には、光源装置１０ａは、動作モードでの動作時に設定する制御信号の電圧値を、掃引波形Ｗ１の微分波形である走査速度Ｖ１の波形に対応して変化させるように設定する。これにより、試料Ｍの有効視野範囲ＡＲ２内で均一なレーザ光の照射エネルギーを実現にするＬＤ光量の強度変調が可能とされる。
　加えて、本実施形態の光源装置１０ａにおいては、試料Ｍの観察に適したレーザ光の平均光量を設定するために、マイクロコンピュータ２５に対する入力値に応じて、レーザ光の光量の最大値を設定可能とされている。例えば、光源装置１０ａにおいては、レーザ光の光量の変調度は一定として、光量の最大値を１％から１００％の範囲で設定可能とされる。この場合、変調度を２倍とすると、レーザ光の光量が、１００倍（変調込みで２００倍）のダイナミックレンジで変更可能とされる。
　また、本実施形態においては、光源装置１０ａ～１０ｄは、光検出器２２からの検出信号を、設定モードでは制御部２４における制御信号の出力にフィートバックし、動作モードでは制御部２４に入力する、スイッチＳＷ２を有している。このような構成の場合、光検出器２２からの検出信号を、設定モードの機能の動作時と動作モードの機能の動作時において適切に出力させることできる。その結果、励起光の照射エネルギーの均一化と安全性の向上との両立が可能となる。
　また、本実施形態においては、制御部２４は、設定モードでは、検出信号と制御信号の差が小さくなるように駆動信号を増減させるＡＰＣ制御を実行し、動作モードでは制御信号を基に駆動信号を出力するＡＣＣ制御を実行するように機能している。このような構成の場合、設定モードの機能の動作時に、駆動電流と励起光の光量との対応関係を精度よく記憶することができるとともに、動作モードの機能の動作時の発光素子の駆動を高速化できる。特に、発光素子２１の発光特性の個体差あるいは経時変化、環境温度の変化等が生じても、励起光の光量の高精度な制御が可能とされる。その結果、試料Ｍに対する励起光の照射エネルギーをさらに高精度に均一化することができる。
　さらに、本実施形態においては、駆動部２３は、駆動信号を基に駆動電流を生成する電圧制御電流源によって構成されている。この場合、光源装置１０ａ～１０ｄの構成を簡略化することができる。
　さらに、本実施形態においては、制御部２４は、設定モードでは、駆動電流に対応する駆動値と制御信号の示す光量との対応関係を示すＬＵＴｓを生成及び記憶し、動作モードでは、ＬＵＴｓを基に、目標の光量に対応する駆動値を有する制御信号を用いてＡＣＣ制御を実行するように動作している。かかる構成によれば、制御部２４の設定モードの機能により、発光素子２１を駆動するための駆動値と制御信号の示す光量との対応関係を示すＬＵＴｓが予め生成および記憶され、制御部２４の動作モードの機能により、ＬＵＴｓを基に、目標の光量に対応する駆動値に対応する制御信号が、発光素子２１に駆動電流を供給する駆動部２３に対して、駆動信号として出力される。その結果、試料Ｍに対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができる。
　以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。
　上述した実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニット１においては、光源装置１０ａ～１０ｄの制御部２４は、次のような機能を有していてもよい。すなわち、制御部２４は、設定モードでは、駆動信号に対応する駆動値と光検出器２２から出力される検出信号の示す光量との対応関係を示すＬＵＴｓを生成及び記憶し、動作モードでは、そのＬＵＴｓを基にＡＣＣ制御を実行してもよい。このような変形例によっても、試料Ｍに対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができる。
　また、図１１には、変形例に係る光源装置１１０ａの回路構成を示す。光源装置１１０ａにおいては、光源装置１０ａにおけるスイッチＳＷ１，ＳＷ２が存在せず、光検出器２２から出力される検出信号は、ＡＤＣ２８を経由してマイクロコンピュータに光量のデジタル値として入力される。光源装置１１０ａのマイクロコンピュータ２５は、設定モードの機能の動作時には、そのファームウェア（ＦＷ）上で、光検出器２２から出力される検出信号が所望の値（所望の光量）となるように制御値に調整し、ＤＡＣ２６に出力する。ＤＡＣ２６は、マイクロコンピュータ２５から出力される調整された制御値を受けて、その制御値を電圧信号である制御信号に変換してアンプ３０に出力する。そして、アンプ３０は入力された制御信号を基に駆動信号を生成し、駆動部２３に出力する。駆動部２３では、駆動信号に基づいて発光素子２１に供給される駆動電流を生成し発光素子２１を供給する。光検出器２２は、再び当該発光を検出し、光検出器２２から出力される検出信号は、再びＡＤＣ２８を経由してマイクロコンピュータに光量のデジタル値として入力される。マイクロコンピュータ２５は、検出信号が所望の値になるまでこれを繰り返すことでＡＰＣ制御を実行し、所望の値になった際の制御値を対応する光量とともにＬＵＴｓに記録する。また、マイクロコンピュータ２５は、動作モードの機能の動作時には、ＬＵＴｓを用いたＡＣＣ制御を実行し、その制御の結果生成された制御値をＤＡＣ２６に対して出力する。それと同時に、マイクロコンピュータ２５は、動作モードの機能の動作時には、ＡＤＣ２８から入力された光量のデジタル値を基に駆動電流の停止の制御を実行する。このような変形例によっても、試料Ｍに対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができるとともに、安全性の高い共焦点イメージングを実現することができる。
　上記実施形態においては、光源ユニットは、光検出器からの検出信号を、設定モードでは制御部における制御信号の出力にフィートバックし、動作モードでは制御部に入力するスイッチを有する、ことが好適である。この場合、光検出器からの検出信号を、設定モードの機能の動作時と動作モードの機能の動作時において適切に出力させることできる。その結果、励起光の照射エネルギーの均一化と安全性の向上との両立が可能となる。
　また、上記実施形態においては、制御部は、設定モードでは、検出信号と制御信号の差が小さくなるように駆動信号を増減させる自動光量制御を実行し、動作モードでは制御信号を基に駆動信号を出力する自動電流制御を実行する、ことも好適である。この場合、設定モードの機能の動作時に、駆動電流と励起光の光量との対応関係を精度よく記憶することができるとともに、動作モードの機能の動作時の光源駆動を高速化できる。その結果、試料に対する励起光の照射エネルギーをさらに高精度に均一化することができる。
　さらに、上記実施形態においては、駆動部は、駆動信号を基に駆動電流を生成する電圧制御電流源を有する、ことが好適である。この場合、光源ユニットの構成を簡略化することができる。
　またさらに、上記実施形態においては、制御部は、設定モードでは、駆動電流に対応する駆動値と制御信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルを生成及び記憶し、動作モードでは、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動値を有する制御信号を用いて第２の制御を実行する、ことも好適である。かかる構成によれば、制御部の設定モードの機能により、光源を駆動するための駆動値と制御信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルが予め生成および記憶され、制御部の動作モードの機能により、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動値に対応する制御信号が、光源に駆動電流を供給する駆動部に対して、駆動信号として出力される。その結果、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができる。
　またさらに、上記実施形態においては、制御部は、設定モードでは、駆動信号に対応する駆動値と検出信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルを生成及び記憶し、動作モードでは、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動値を有する制御信号を用いて第２の制御を実行する、ことも好適である。かかる構成によれば、制御部の設定モードの機能により、光源を駆動するための駆動値と励起光の検出信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルが予め生成および記憶され、制御部の動作モードの機能により、データテーブルを基に、目標の光量に対応する駆動値に対応する制御信号が、光源に駆動電流を供給する駆動部に対して、駆動信号として出力される。その結果、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができる。
　実施形態は、共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法を使用用途とし、試料に対する励起光の照射エネルギーを精度よく均一化することができるものである。
　１…共焦点顕微鏡ユニット、４…スキャンミラー、１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ，１１０ａ…光源装置（光源ユニット）、２１…発光素子（光源）、２２…光検出器、２３…駆動部、２４…制御部、５０…顕微鏡、Ａ…共焦点顕微鏡、Ｐ１…接続ポート、ＳＷ１，ＳＷ２…スイッチ、Ｍ…試料。

 

Claims (8)

  1. 　顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
    　励起光を出力する光源、前記光源から出力される前記励起光を検出して検出信号を出力する光検出器、前記光源に駆動電流を供給する駆動部、及び、目標の光量を示す制御信号に応じて前記駆動部に対し前記駆動電流を制御する駆動信号を出力する制御部を有する光源ユニットと、
    　前記光源ユニットから出力された励起光を、試料上で走査させるスキャンミラーと、
    　前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、及び、前記光源ユニットが固定された筐体と、
    を備え、
    　前記制御部は、設定モードと動作モードの２種類の機能を有し、
    前記設定モードでは、前記制御信号及び前記検出信号を基に前記駆動信号を調整して出力する第１の制御を実行し、前記制御信号の値を変更しながら前記第１の制御を実行することにより、前記駆動電流と前記励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルを生成および記憶し、
    前記動作モードでは、前記制御信号を前記駆動信号として出力する第２の制御を実行し、前記データテーブルを読み出し、前記データテーブルを基に、目標の光量に対応する前記駆動電流に対応する前記制御信号を用いて前記第２の制御を実行し、前記検出信号の示す光量が所定値を超えた場合に前記駆動電流を停止する制御を実行する、
    共焦点顕微鏡ユニット。
  2. 　前記光源ユニットは、前記光検出器からの前記検出信号を、前記設定モードでは前記制御部における前記制御信号の出力にフィートバックし、前記動作モードでは前記制御部に入力するスイッチを有する、
    請求項１に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  3. 　前記制御部は、前記設定モードでは、前記検出信号と前記制御信号の差が小さくなるように前記駆動信号を増減させる自動光量制御を実行し、前記動作モードでは制御信号を基に前記駆動信号を出力する自動電流制御を実行する、
    請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  4. 　前記駆動部は、前記駆動信号を基に前記駆動電流を生成する電圧制御電流源を有する、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  5. 　前記制御部は、前記設定モードでは、前記駆動電流に対応する駆動値と前記制御信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルを生成及び記憶し、
    前記動作モードでは、前記データテーブルを基に、目標の光量に対応する前記駆動値を有する前記制御信号を用いて前記第２の制御を実行する、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  6. 　前記制御部は、前記設定モードでは、前記駆動信号に対応する駆動値と前記検出信号の示す光量との対応関係を示すデータテーブルを生成及び記憶し、
    前記動作モードでは、前記データテーブルを基に、目標の光量に対応する前記駆動値を有する前記制御信号を用いて前記第２の制御を実行する、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニットと、
    　前記顕微鏡光学系及び前記共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡と、
    を備える、共焦点顕微鏡。
  8. 　顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、励起光を出力する光源、前記光源から出力される前記励起光を検出して検出信号を出力する光検出器、前記光源に駆動電流を供給する駆動部、及び、目標の光量を示す制御信号に応じて前記駆動部に対し前記駆動電流を制御する駆動信号を出力する制御部を有する光源ユニットと、前記光源ユニットから出力された励起光を、試料上で走査させるスキャンミラーと、前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、及び、前記光源ユニットが固定された筐体と、を備えた共焦点顕微鏡ユニットを用いた制御方法であって、
    　前記制御信号及び前記検出信号を基に前記駆動信号を調整して出力する第１の制御を実行し、前記制御信号の値を変更しながら前記第１の制御を実行することにより、前記駆動電流と前記励起光の光量との対応関係を示すデータテーブルを生成および記憶するステップと、
    　前記制御信号を前記駆動信号として出力する第２の制御を実行し、前記データテーブルを読み出し、前記データテーブルを基に、目標の光量に対応する前記駆動電流に対応する前記制御信号を用いて前記第２の制御を実行し、前記検出信号の示す光量が所定値を超えた場合に前記駆動電流を停止する制御を実行するステップと、
    を備える共焦点顕微鏡ユニットの制御方法。

     
PCT/JP2022/001369 2021-04-26 2022-01-17 共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法 WO2022230254A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/281,649 US20240151956A1 (en) 2021-04-26 2022-01-17 Confocal microscope unit, confocal microscope, and control method for confocal microscope unit
CN202280030939.5A CN117203564A (zh) 2021-04-26 2022-01-17 共聚焦显微镜单元、共聚焦显微镜及共聚焦显微镜单元的控制方法
EP22795177.9A EP4296748A1 (en) 2021-04-26 2022-01-17 Confocal microscope unit, confocal microscope, and control method for confocal microscope unit
JP2023517043A JPWO2022230254A1 (ja) 2021-04-26 2022-01-17

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021073870 2021-04-26
JP2021-073870 2021-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022230254A1 true WO2022230254A1 (ja) 2022-11-03

Family

ID=83846855

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/001369 WO2022230254A1 (ja) 2021-04-26 2022-01-17 共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240151956A1 (ja)
EP (1) EP4296748A1 (ja)
JP (1) JPWO2022230254A1 (ja)
CN (1) CN117203564A (ja)
WO (1) WO2022230254A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009152545A (ja) * 2007-11-26 2009-07-09 Olympus Corp 光源装置およびレーザ走査型顕微鏡
WO2009104718A1 (ja) * 2008-02-22 2009-08-27 株式会社ニコン レーザ走査顕微鏡
WO2020196782A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 浜松ホトニクス株式会社 走査型顕微鏡ユニット
WO2020196784A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 浜松ホトニクス株式会社 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009152545A (ja) * 2007-11-26 2009-07-09 Olympus Corp 光源装置およびレーザ走査型顕微鏡
WO2009104718A1 (ja) * 2008-02-22 2009-08-27 株式会社ニコン レーザ走査顕微鏡
WO2020196782A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 浜松ホトニクス株式会社 走査型顕微鏡ユニット
WO2020196784A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 浜松ホトニクス株式会社 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡
WO2020196783A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 浜松ホトニクス株式会社 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡

Also Published As

Publication number Publication date
CN117203564A (zh) 2023-12-08
US20240151956A1 (en) 2024-05-09
EP4296748A1 (en) 2023-12-27
JPWO2022230254A1 (ja) 2022-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6943944B2 (en) Laser microscope and laser pulse width control method
US7180661B2 (en) Confocal scanning microscope
JP4685489B2 (ja) 多光子励起型観察装置
JP2012189792A (ja) 顕微鏡装置
EP1202102B1 (en) Laser microscope
WO2022230254A1 (ja) 共焦点顕微鏡ユニット、共焦点顕微鏡、及び共焦点顕微鏡ユニットの制御方法
JPH09237914A (ja) 光検出装置
JP5007462B2 (ja) 光学組立物および共焦点走査型顕微鏡に少なくとも１つの波長の光を結合するための装置
US20020000507A1 (en) Method, apparatus and scanning microscope with means for stabilizing the temperature of optical components
JP5231154B2 (ja) レーザ走査型顕微鏡
JP2010008082A (ja) 多光子励起測定装置
JP6389462B2 (ja) パルス化制御されるレーザ光源を有する共焦点レーザ走査顕微鏡
JP5153171B2 (ja) 顕微鏡装置とその制御方法
US8111455B2 (en) Light source apparatus and laser scanning microscope
JP6009837B2 (ja) レーザ顕微鏡および受光感度延命方法
JP2006099129A (ja) 共焦点顕微鏡
JP4493302B2 (ja) 走査型光学顕微鏡
US8830563B2 (en) Laser scanning microscope having a laser diode comprising a light modulation device
US20240161997A1 (en) Electron beam application device
WO2020246438A1 (ja) レーザー光源及び光電子顕微鏡
US20220291493A1 (en) Illumination device for a confocal microscope
JP2007132794A (ja) 多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置
JP6339926B2 (ja) 顕微鏡システム
JP2006171028A (ja) レーザ走査顕微鏡および光検出器の感度設定方法
WO2020054176A1 (ja) 光計測装置

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22795177

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023517043

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18281649

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022795177

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022795177

Country of ref document: EP

Effective date: 20230921

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280030939.5

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE