WO2020196782A1 - 走査型顕微鏡ユニット - Google Patents

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WO2020196782A1
WO2020196782A1 PCT/JP2020/013798 JP2020013798W WO2020196782A1 WO 2020196782 A1 WO2020196782 A1 WO 2020196782A1 JP 2020013798 W JP2020013798 W JP 2020013798W WO 2020196782 A1 WO2020196782 A1 WO 2020196782A1
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microscope
scan
mirror
scanning microscope
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PCT/JP2020/013798
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慈郎 山下
康行 田邊
俊輔 松田
寺田　浩敏
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浜松ホトニクス株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a scanning microscope unit constituting a scanning microscope.
  • a microscope device capable of obtaining an image of a specimen to be observed has been known.
  • a microscope connection port connected to a microscope a stimulation unit that irradiates a sample with light, an observation unit that detects light emitted from the sample, a microscope, a stimulation unit, and an observation unit are described.
  • a microscope connection unit including an optical path synthesizer that synthesizes optical paths that are optically connected is disclosed.
  • imaging of the sample is realized by irradiating the sample with excitation light and detecting the fluorescence generated accordingly.
  • the conventional microscope connection unit as described above is used to scan the optical axis of the lens in the microscope and the excitation light in the microscope connection unit when connected to and used with microscopes of various types or manufacturers. In some cases, the positional relationship with the mirror was not stable. Therefore, the signal strength and resolution of the observed image tend to decrease.
  • the embodiment has been made in view of such a problem, and an object of the present invention is to provide a scanning microscope unit capable of realizing imaging in which signal strength and resolution are maintained.
  • One embodiment of the present disclosure is a scanning microscope unit that constitutes a scanning microscope by being attached to a connection port of a microscope having a microscope optical system, and is a light source that outputs irradiation light toward a sample to be observed.
  • the light detector that detects the observation light generated from the sample according to the irradiation light and the irradiation light output from the light source are scanned on the sample, and the observation light generated from the sample is directed to the light detector according to the irradiation light.
  • the scan lens is fixed, and the scan lens that guides the irradiation light scanned by the scan mirror to the microscope optical system and guides the observation light imaged by the microscope optical system to the scan mirror. It includes a housing, an attachment portion for attaching the housing to the connection port, and a movable portion that supports the housing so that the angle of the housing with respect to the attachment portion can be changed.
  • the irradiation light emitted from the light source is scanned onto the sample via a scan mirror, a scan lens, and an external microscope, and the observation generated from the sample accordingly.
  • Light is detected by a photodetector via an external microscope, scan lens, and scan mirror.
  • a housing to which a scanning lens is fixed is attached to a microscope connection port by an attachment portion, and the angle of the housing with respect to the attachment portion can be changed.
  • the optical axis of the scan lens can be aligned with the direction of the optical axis of the optical system of the microscope corresponding to the attached microscope. As a result, it is possible to realize imaging in which signal strength and resolution are maintained.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a confocal microscope A, which is a type of scanning microscope according to the embodiment.
  • the confocal microscope A shown in FIG. 1 constitutes a confocal microscope that acquires an image that enables the construction of an optical tomographic image of the sample M to be observed, and is a scanning microscope unit according to the embodiment. 1 is connected to a connection port P1 for connecting an external unit of the microscope 50.
  • the confocal microscope unit 1 irradiates a sample M arranged on a stage of the microscope 50 or the like with excitation light via a microscope optical system such as an imaging lens 51 and an objective lens 52 in the microscope 50.
  • This is an apparatus that receives (detects) fluorescence generated from sample M in response to excitation light via the microscope optical system of the microscope 50 to generate and output an optical tomographic image.
  • the confocal microscope unit 1 constitutes a main housing 2, a part of the main housing 2, and a lens barrel (housing) 3 that is detachably connected to the connection port P1 of the microscope 50.
  • the scan mirror 4 fixed in the main housing 2, the fixed mirror 5, the first to fourth subunits 6a to 6d, and the scan lens 7 fixed in the lens barrel 3 are included.
  • each component of the confocal microscope unit 1 will be described in detail.
  • the scan lens 7 in the lens barrel 3 relays the reflective surface of the scan mirror 4 to the pupil position of the objective lens 52, and at the same time, concentrates the excitation light (irradiation light) on the primary imaging surface of the microscope optical system of the microscope 50. It is an optical element for making the lens.
  • the scan lens 7 irradiates the sample M by guiding the excitation light (irradiation light) scanned by the scan mirror 4 to the microscope optical system, and the fluorescence (observation light) generated from the sample M is emitted from the scan mirror accordingly.
  • Guide to 4 the scan lens 7 is configured to image the pupil of the objective lens 52 on the scan mirror 4, and guides the fluorescence imaged by the objective lens 52 and the imaging lens 51 of the microscope 50 to the scan mirror 4. .
  • the scan mirror 4 in the main housing 2 is, for example, an optical scanning element such as a MEMS (Micro Electro Mechanical System) mirror configured so that the reflector can be tilted in two axes.
  • the scan mirror 4 scans the excitation light (irradiation light) output from the first to fourth subunits 6a to 6d on the sample M by continuously changing the reflection angle, and responds to the excitation light. It has a role of guiding the resulting fluorescence (observation light) toward the first to fourth subunits 6a to 6d.
  • the fixed mirror 5 is a light reflecting element fixed in the main housing 2, and reflects the excitation light output from the first to fourth subsystems 6a to 6d toward the scan mirror 4 to reflect the excitation light toward the scan mirror 4.
  • the fluorescence reflected by is reflected toward the first to fourth subsystems 6a to 6d coaxially with the excitation light.
  • the first subsystem 6a includes a base plate 8a, a dichroic mirror (first beam splitter) 9a arranged on the base plate 8a, a light source 10a, a dichroic mirror 11a, and a pinhole plate (first diaphragm member) 12a. , A photodetector (first photodetector) 13a.
  • the dichroic mirror 9a is fixed in the fluorescence reflection direction of the fixed mirror 5, and the first excitation light of the wavelength ⁇ 1 irradiated by the first subsystem 6a and the first excitation light of the wavelength range ⁇ 1 generated from the sample M accordingly.
  • the dichroic mirror 11a is arranged in the reflection direction of the first fluorescent dichroic mirrors 9a, it passes through the first fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 1, reflects the first excitation light of a shorter wavelength lambda 1 than the wavelength range [Delta] [lambda] 1 It is a beam splitter that has the property of causing.
  • the light source 10a is a light emitting element (for example, a laser diode) that outputs a first excitation light (for example, laser light) having a wavelength ⁇ 1 , and the first excitation light is coaxial with the first fluorescence by the dichroic mirror 11a. It is arranged so as to be reflected toward the dichroic mirror 9a.
  • the pinhole plate 12a is a diaphragm member whose pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the first excitation light of the sample M and limits the light flux of the first fluorescence, and together with the light source 10a and the like. It constitutes a cofocal optical system.
  • the pinhole plate 12a has a pinhole diameter that can be adjusted from the outside, and the resolution of the image detected by the photodetector 13a and the signal intensity of the image can be changed.
  • the photodetector 13a is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12a, and receives and detects the first fluorescence that has passed through the pinhole plate 12a.
  • the photodetector 13a is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the second to fourth subunits 6b to 6d also have the same configuration as the first subunit 6a.
  • the second subsystem 6b includes a base plate 8b, a dichroic mirror (second beam splitter) 9b, a light source 10b, a dichroic mirror 11b, a pinhole plate (second diaphragm member) 12b, and a photodetector (second beam splitter). 2 Photodetector) 13b.
  • the dichroic mirror 9b reflects the second excitation light of the wavelength ⁇ 2 (> ⁇ 1 ) irradiated by the second subunit 6b and the second fluorescence of the wavelength range ⁇ 2 generated from the sample M accordingly, and the second It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the second excitation light and the second fluorescence.
  • the dichroic mirror 11b passes through a second fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 2, has a property of reflecting the second excitation light of a shorter wavelength lambda 2 from the wavelength range [Delta] [lambda] 2.
  • the light source 10b is a light emitting element that outputs a second excitation light having a wavelength of ⁇ 2 .
  • the pinhole plate 12b is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the second excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the second fluorescence.
  • the photodetector 13b has its detection surface opposed to the pinhole plate 12b and receives and detects the second fluorescence that has passed through the pinhole plate 12b.
  • the photodetector 13b is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the third subsystem 6c includes a base plate 8c, a dichroic mirror (third beam splitter) 9c, a light source 10c, a dichroic mirror 11c, a pinhole plate (third diaphragm member) 12c, and a photodetector (third diaphragm member). It has a photodetector) 13c.
  • the dichroic mirror 9c reflects the third excitation light of the wavelength ⁇ 3 (> ⁇ 2 ) irradiated by the third subsystem 6c and the third fluorescence of the wavelength range ⁇ 3 generated from the sample M accordingly. It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the excitation light of No. 3 and the third fluorescence.
  • the dichroic mirror 11c is transmitted through the third fluorescence having a wavelength range [Delta] [lambda] 3, has the property of reflecting the third pumping light having a wavelength shorter lambda 3 than the wavelength range [Delta] [lambda] 3.
  • the light source 10c is a light emitting element that outputs a third excitation light having a wavelength of ⁇ 3 .
  • the pinhole plate 12c is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the third excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the third fluorescence.
  • the photodetector 13c is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12c, and receives and detects the third fluorescence that has passed through the pinhole plate 12c.
  • the photodetector 13c is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the fourth subsystem 6d includes a base plate 8d, a total reflection mirror 9d, a light source 10d, a dichroic mirror 11d, a pinhole plate (fourth aperture member) 12d, and a photodetector (fourth photodetector) 13d.
  • the total reflection mirror 9c reflects the fourth excitation light of the wavelength ⁇ 4 (> ⁇ 3 ) irradiated by the fourth subunit 6d and the fourth fluorescence of the wavelength range ⁇ 4 generated from the sample M accordingly.
  • the dichroic mirror 11d is transmitted through the fourth fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 4, have the property of reflecting the fourth pumping light wavelength shorter lambda 4 than the wavelength range [Delta] [lambda] 4.
  • the light source 10d is a light emitting element that outputs a fourth excitation light having a wavelength of ⁇ 4 .
  • the pinhole plate 12d is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the fourth excitation light spot of the sample M and limits the luminous flux of the fourth fluorescence.
  • the photodetector 13d is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12d, and receives and detects the fourth fluorescence that has passed through the pinhole plate 12d.
  • the photodetector 13d is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the first to fourth subsystems 6a to 6d are arranged in this order in the direction away from the fixed mirror 5 along the light guide direction of the first to fourth fluorescence by the scan mirror 4 and the fixed mirror 5. Moreover, the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d are fixed in the main housing 2 so as to be located on the first to fourth fluorescent optical paths. Specifically, the second to fourth subunits 6b to 6d are based on the center positions of the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d with respect to the first to third subunits 6a to 6c, respectively. Therefore, they are arranged so as to shift by a predetermined distance d in a direction perpendicular to the light guide direction of the second to fourth fluorescence.
  • This predetermined distance d is set to be substantially equal to the shift amount ⁇ in the direction perpendicular to the optical path caused by the refraction of fluorescence in each of the dichroic mirrors 9a to 9c in the optical path of fluorescence transmitted by the dichroic mirrors 9a to 9c. ..
  • the thicknesses of the mirror members constituting the dichroic mirrors 9a to 9c are set to be the same, the shift amounts generated by the dichroic mirrors 9a to 9c are substantially the same, and accordingly, the first to fourth The shift distance d between two adjacent subunits among the subunits 6a to 6d of the above is also set to be the same.
  • the shift distance d is appropriately set according to the thickness and the refractive index of the mirror members constituting the dichroic mirrors 9a to 9c. Specifically, when the mirror member has a thickness t and a refractive index n, the incident angle of the fluorescence incident on the mirror member is ⁇ , and the refraction angle inside the mirror member is ⁇ , the shift amount ⁇ of the fluorescence by the mirror member is , As shown in FIG. At this time, since the shift amount ⁇ can be obtained by the following equation (1), the shift distance (predetermined distance) d may be set according to the shift amount ⁇ . There is a relationship of the following equation (2) between the incident angle ⁇ and the refraction angle ⁇ .
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing the attachment structure of the confocal microscope unit 1 to the microscope 50.
  • a scan lens 7 composed of a plurality of lenses is fixed inside the lens barrel 3, and an attachment portion 21 and a movable portion 22 are integrated inside the tip of the lens barrel 3.
  • a modified fan adjustment mechanism 23 is provided.
  • the attachment portion 21 has a ring-shaped shape protruding from the tip of the lens barrel 3, and has a structure that can be attached to the connection port P1 for connecting the camera of the microscope 50 on the tip side thereof (for example, a structure corresponding to a C mount).
  • the movable portion 22 is continuously formed on the base end side of the attachment portion 21, has a substantially ring-shaped shape, and has a sliding surface whose outer surface is formed in a spherical shape.
  • the inner surface of the tip of the lens barrel 3 is formed with a spherical sliding surface 24 corresponding to the outer surface shape of the movable portion 22.
  • the outer surface of the movable portion 22 and the inner surface of the lens barrel 3 have their shapes in a state where the movable portion 22 is fitted into the lens barrel 3 and the attachment portion 21 is connected to the connection port P1 of the microscope 50.
  • the center C1 of the including spherical surface is shaped so as to be located on the image plane S1 of the microscope optical system of the microscope 50.
  • the movable portion 22 is attached to the sliding surface 24 of the lens barrel 3 in the state of being mounted on the microscope 50.
  • the lens barrel 3 can be supported so that the angle of the lens barrel 3 with respect to the attachment portion 21 can be changed.
  • the lens barrel 3 is made rotatable with respect to the attachment portion 21, and the lens barrel 3 with respect to the central axis of the attachment portion 21 The angle of the central axis can be adjusted two-dimensionally.
  • the fanning adjustment mechanism 23 is configured to be able to change the angle of the lens barrel 3 with respect to the attachment portion 21 so that the optical axis of the microscope optical system of the microscope 50 and the optical axis of the scan lens 7 are parallel to each other.
  • the excitation light (irradiation light) emitted from the light sources 10a to 10d of each of the subsystems 6a to 6d passes through the scan mirror 4, the scan lens 7, and the external microscope 50. Then, it is scanned onto the sample M, and the fluorescence (observation light) generated from the sample M correspondingly is the light of each subsystem 6a to 6d via the external microscope 50, the scan lens 7, and the scan mirror 4. It is detected by the detectors 13a to 13d.
  • the lens barrel 3 to which the scan lens 7 is fixed is attached to the connection port P1 of the microscope 50 by the attachment portion 21, and the angle of the lens barrel 3 with respect to the attachment portion 21 can be changed.
  • the optical axis of the scan lens 7 can be aligned with the direction of the optical axis of the microscope optical system of the microscope 50, corresponding to the microscope 50 to be attached. As a result, it is possible to realize imaging in which signal strength and resolution are maintained.
  • FIG. 4 is a graph showing the wavelength distribution characteristics of excitation light and fluorescence handled by the first to fourth subunits 6a to 6d.
  • Wavelength range [Delta] [lambda] 1 of fluorescence generated in response to the excitation light having a wavelength lambda 1 emitted from the first sub-unit 6a is generally a range of wavelength longer than the wavelength lambda 1 and in the vicinity of the wavelength lambda 1 Become.
  • the wavelength ⁇ 2 of the excitation light emitted from the second subunit 6b and the wavelength range ⁇ 2 of the fluorescence generated thereby are in a wavelength range longer than the wavelength ⁇ 1 and the wavelength range ⁇ 1. ..
  • the boundary wavelength ⁇ d1 of the optical division of the dichroic mirror 9a of the first subunit 6a is longer than the wavelength ⁇ 1 and the wavelength range ⁇ 1 , and is longer than the wavelength ⁇ 2 and the wavelength range ⁇ 2. It is set to a value that is a short wavelength. This enables confocal measurement in the wavelength ⁇ 1 and wavelength range ⁇ 1 using the first subunit 6a, and the wavelength ⁇ 2 and wavelength range ⁇ using the second subunit 6b of the same device. Confocal measurement in the range of 2 is possible.
  • the boundary wavelength ⁇ d2 of the optical division of the dichroic mirror 9b of the second subsystem 6b is longer than the wavelength ⁇ 2 and the wavelength range ⁇ 2 , and is longer than the wavelength ⁇ 3 and the wavelength range ⁇ 3. It is set to a value that is a short wavelength, and the boundary wavelength ⁇ d3 of the optical division of the dichroic mirror 9c of the third subsystem 6c is a longer wavelength than the wavelength ⁇ 3 and the wavelength range ⁇ 3 , and the wavelength ⁇ It is set to a value that is shorter than 4 and the wavelength range ⁇ 4 .
  • the movable portion 22 of the fanning adjustment mechanism 23 is configured so that the angle of the lens barrel 3 can be changed so that the optical axis of the scan lens 7 and the optical axis of the microscope optical system of the microscope 50 are parallel to each other.
  • the pupil positions of the scan mirror 4 and the objective lens 52 can be arranged at the conjugate position, and the NA of the objective lens 52 is used to the maximum. This makes it possible to reliably improve the signal strength and resolution of the signals detected by the photodetectors 13a to 13d.
  • the movable portion 22 is configured to be rotatable with respect to the attachment portion 21.
  • the direction of the scan lens 7 and the optical axis of the microscope optical system can be two-dimensionally aligned, and the signal strength and resolution of the signals detected by the photodetectors 13a to 13d can be reliably improved. Can be done.
  • the rotation center C1 of the movable portion 22 is configured to be included in the image plane S1 of the microscope optical system. In this way, the adjustment can be made without affecting the visual field, so that it is not necessary to repeat the visual field adjustment and the angle adjustment alternately.
  • FIG. 5 shows an image of an excitation light or a fluorescent light guide when the direction of the optical axis of the scan lens 7 and the direction of the optical axis of the microscope optical system do not match in the confocal microscope unit 1.
  • FIG. The image of the light guide of excitation light or fluorescence when the direction of the optical axis of the scan lens 7 and the direction of the optical axis of the microscope optical system in the confocal microscope unit 1 coincide with each other is shown.
  • the microscope optical system and the scan lens 7 are adjusted in advance so that the objective lens pupil of the microscope 50 is imaged on the scan mirror 4.
  • changing the angle by driving the scan mirror 4 is equivalent to swinging the angle of the excitation light or the fluorescent light beam with the pupil of the objective lens 52, reducing the loss of the light ray and sufficiently improving the performance of the objective lens 52.
  • the size of the pupil of the objective lens differs depending on the objective lens 52, and the beam diameter of the excitation light or fluorescence needs to be equal to or larger than the pupil size.
  • the scan mirror 4 composed of a MEMS mirror or the like has a scan mirror 4. Since the diameter is small and the swing angle is large, the objective lens pupil may not fit on the scan mirror 4 when the low magnification / low NA objective lens 52 having a large pupil is used.
  • the optical axis of the microscope may be tilted with respect to the connection port P1 (FIG. 1) due to an assembly error.
  • This inclination becomes a problem when capturing and detecting the observation light, and particularly when it is used as a scanning microscope.
  • the optical axis A2 of the scan lens 7 is at an angle ⁇ (> 0) with respect to the optical axis A1 of the microscope optical system. It may tilt as much as possible.
  • the direction of the optical axis A2 of the scan lens 7 is aligned with the optical axis A1 of the microscope optical system.
  • the positions of the light rays B1 and B2 are set to the aperture position of the objective lens. Can be matched. As a result, it is possible to prevent the excitation light from being eclipsed, and it is possible to increase the signal amount and resolution in the image generated by using the subunits 6a to 6d.
  • FIG. 7 is a diagram showing a configuration of a jig used for adjusting the fanning of the confocal microscope unit 1.
  • a jig including a disk-shaped target member 31 and a mount portion 32 for attaching the target member 31 to the microscope 50 instead of the objective lens 52 can be adopted.
  • a circular marking 33 is provided at the center of the surface of the target member 31, and the position of the marking 33 coincides with the pupil position of the objective lens 52 when attached to the microscope 50 by the mount portion 32.
  • the spot SP1 of the excitation light irradiated to the target member 31 is observed using an external camera or the like while outputting the excitation light using the confocal microscope unit 1. Then, the spot SP1 of the excitation light is adjusted so as to coincide with the marking 33 on the target member 31, so that the direction of the optical axis of the scan lens 7 is aligned with the optical axis of the microscope optical system. It will be possible.
  • the scan mirror 4 may be a MEMS mirror. In this case, the device can be easily miniaturized.
  • each of the subsystems 6a to 6d is provided with pinhole plates 12a to 12d that limit the luminous flux of the observation light returned through the scan mirror 4, and the photodetectors 13a to 13d include pinhole plates 12a to 12d. It is configured to detect the passing observation light. In this case, it is possible to realize imaging in which signal strength and resolution are maintained in confocal observation.
  • the fanning adjustment mechanism 23 of the above embodiment is not limited to the configuration of the movable portion 22 having a spherical sliding surface, and the movable portion 22 may be configured by a rubber member or a bellows-shaped member.
  • the excitation light is irradiated by the subunits 6a to 6d, and the fluorescence generated in response to the excitation light can be detected.
  • the sample M depending on the irradiation of the irradiation light. It may be configured so that the reflected light generated can be detected.
  • the above embodiment is not limited to the case of being used as a confocal microscope, and may be used for a general fluorescence microscope, a reflection microscope, or the like as long as it is a scanning microscope using a scanning mirror.
  • the above embodiment is not limited to the application of a scanning microscope using a scan mirror, and when the optical unit having a lens is attached to the connection port P1 of the optical microscope, the optical axis of the microscope optical system of the microscope 50 and the optical unit It is also effective when tilting the housing of the optical unit so that it is parallel to the optical axis of the lens. In this case, the optical axis adjustment between the optical microscope and the optical unit becomes easy.
  • a pinhole plate is used as a diaphragm member to form a confocal optical system, but the diaphragm member may be an optical element that limits the luminous flux, for example, a color diaphragm or a fiber core. You may.
  • the position of the end face of the fiber core may be the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited).
  • a laser light source such as a solid-state laser or a diode laser can also be used.
  • the position of the beam waist of these laser light sources may be set to the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited), and the light source itself plays the role of a diaphragm member.
  • the movable portion may be capable of changing the angle of the housing so that the optical axis of the scan lens and the optical axis of the microscope optical system are parallel to each other. In this case, by aligning the direction of the scan lens with the optical axis of the microscope optical system, the signal strength and resolution of the signal detected by the photodetector can be reliably improved.
  • the movable portion may be configured to be rotatable with respect to the attachment portion.
  • the center of rotation of the movable part may be included in the image plane of the microscope optical system. In this way, the effect of increasing the amount of signals detected by the photodetector and improving the resolution can be obtained without affecting the field of view.
  • the scan mirror may be a MEMS mirror.
  • the device can be easily miniaturized.
  • the photodetector may detect the fluorescence generated by the irradiation of the irradiation light as the observation light, or may detect the reflected light generated by the irradiation of the irradiation light as the observation light. According to such a configuration, it is possible to realize imaging in which signal intensity and resolution are maintained in various types of observation light imaging.
  • a diaphragm member for limiting the luminous flux of the observation light returning through the scan mirror may be further provided, and the photodetector may detect the observation light passing through the diaphragm member.
  • an optical tomographic image can be acquired by confocal observation.
  • this diaphragm member may be a pinhole plate.
  • a scanning microscope unit constituting a scanning microscope is used, and imaging in which signal strength and resolution are maintained can be realized.

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Abstract

実施形態は、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に取り付けられる共焦点顕微鏡ユニット１であって、観察対象の試料Ｍに向けて照射光を出力する光源１０ａ～１０ｄと、照射光に応じて試料から生じる観察光を検出する光検出器１３ａ～１３ｄと、照射光を試料Ｍ上で走査させ、試料Ｍから生じる観察光を光検出器１３ａ～１３ｄに向けて導くスキャンミラー４と、スキャンミラー４によって走査された照射光を顕微鏡光学系に導光し、顕微鏡光学系によって結像された観察光をスキャンミラー４に導光するスキャンレンズ７と、スキャンレンズ７が固定された鏡筒３と、鏡筒３を接続ポートＰ１に取り付けるためのアタッチメント部２１と、アタッチメント部２１に対する鏡筒３の角度を変更可能に鏡筒３を支持する可動部２２と、を備える。

Description

走査型顕微鏡ユニット
　本開示は、走査型顕微鏡を構成する走査型顕微鏡ユニットに関する。
　従来から、観察対象の標本のイメージを得ることが可能な顕微鏡装置が知られている。例えば、下記特許文献１には、顕微鏡に接続される顕微鏡接続ポートと、標本に光を照射する刺激ユニットと、標本から発せられる光を検出する観察ユニットと、顕微鏡と刺激ユニット及び観察ユニットとを光学的に接続する光路を合成する光路合成部とを備える顕微鏡接続ユニットが開示されている。このような構成の顕微鏡接続ユニットでは、例えば、励起光を標本に照射して用いてそれに応じて生じる蛍光を検出することにより、標本のイメージングが実現される。
特開２０１１－９０２４８号公報
　上述したような従来の顕微鏡接続ユニットでは、様々な種類、または、様々なメーカーの顕微鏡に接続して使用する際に、顕微鏡におけるレンズの光軸と顕微鏡接続ユニット内の励起光を走査するためのミラーとの位置関係とが安定しない場合があった。そのため、観察される画像における信号強度及び分解能が低下してしまう傾向にある。
　実施形態は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することが可能な走査型顕微鏡ユニットを提供することを課題とする。
　本開示の一形態は、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、走査型顕微鏡を構成する走査型顕微鏡ユニットであって、観察対象の試料に向けて照射光を出力する光源と、照射光に応じて試料から生じる観察光を検出する光検出器と、光源から出力された照射光を、試料上で走査させ、照射光に応じて試料から生じる観察光を光検出器に向けて導くスキャンミラーと、スキャンミラーによって走査された照射光を顕微鏡光学系に導光し、顕微鏡光学系によって結像された観察光をスキャンミラーに導光するスキャンレンズと、スキャンレンズが固定された筐体と、筐体を接続ポートに取り付けるためのアタッチメント部と、アタッチメント部に対する筐体の角度を変更可能に筐体を支持する可動部と、を備える。
　上記一形態の走査型顕微鏡ユニットによれば、光源から照射された照射光が、スキャンミラー、スキャンレンズ、及び外部の顕微鏡を経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた観察光が、外部の顕微鏡、スキャンレンズ、及びスキャンミラーを経由して光検出器で検出される。この走査型顕微鏡ユニットは、スキャンレンズが固定される筐体がアタッチメント部によって顕微鏡の接続ポートに取り付けられ、そのアタッチメント部に対する筐体の角度が変更可能とされている。このような構成により、取り付ける顕微鏡に対応してスキャンレンズの光軸を顕微鏡の光学系の光軸の方向に合わせることができる。その結果、信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができる。
　実施形態によれば、信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができる。
実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。 ダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおける蛍光の屈折状態を示す平面図である。 図１の共焦点顕微鏡ユニット１の顕微鏡５０への取り付け構造を示す断面図である。 図１の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。 共焦点顕微鏡ユニット１において励起光あるいは蛍光の導光のイメージを示す図である。 共焦点顕微鏡ユニット１において励起光あるいは蛍光の導光のイメージを示す図である。 共焦点顕微鏡ユニット１を対象にした煽り調整時に用いる冶具の構成を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
　図１は、実施形態にかかる走査型顕微鏡の一種である共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡Ａは、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、実施形態に係る走査型顕微鏡ユニットである共焦点顕微鏡ユニット１が顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。この共焦点顕微鏡ユニット１は、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。
　詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１は、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒（筐体）３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１の各構成要素について詳細に説明する。
　鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面に励起光（照射光）を集光させるための光学素子である。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光（照射光）を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光（観察光）をスキャンミラー４に導光する。詳細には、スキャンレンズ７は、対物レンズ５２の瞳をスキャンミラー４に結像するように構成され、顕微鏡５０の対物レンズ５２及び結像レンズ５１によって結像された蛍光をスキャンミラー４に導く。
　メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光（照射光）を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光（観察光）を、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて導く役割を有する。
　固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて反射する。
　第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１のビームスプリッタ）９ａ、光源１０ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ１より短い波長λ１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源１０ａは、波長λ１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄも、第１のサブユニット６ａと同様な構成を有する。
　すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２のビームスプリッタ）９ｂ、光源１０ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ２（＞λ１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ２より短い波長λ２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｂは、波長λ２の第２の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３のビームスプリッタ）９ｃ、光源１０ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ３（＞λ２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ３より短い波長λ３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｃは、波長λ３の第３の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー９ｄ、光源１０ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。全反射ミラー９ｃは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ４（＞λ３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ４より短い波長λ４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｄは、波長λ４の第４の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　上記構成の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置関係について説明する。
　第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１～第４の蛍光の導光方向に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１～第４の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄが位置するように、メイン筐体２内に固定されている。詳細には、第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄは、それぞれ、第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃに対して、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準にして、第２～第４の蛍光の導光方向に垂直な方向に所定距離ｄだけシフトするように、配置されている。
　この所定距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによって透過される蛍光の光路において、それぞれのダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおいて蛍光の屈折によって生じる、その光路に垂直な方向のシフト量δに略等しく設定される。本実施形態では、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さは同一に設定されているため、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃで生じるシフト量はほぼ同じとなり、それに応じて、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちの隣り合う２つのサブユニット間のシフト距離ｄも同じに設定される。このシフト距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さ及び屈折率に応じて適切に設定される。詳しくは、ミラー部材が厚さｔ、屈折率ｎであり、ミラー部材に入射する蛍光の入射角をθ、ミラー部材内部への屈折角をφとした場合、ミラー部材による蛍光のシフト量δは、図２のようになる。この時、シフト量δは、下記式（１）のように求めることができるため、このシフト量δに合わせてシフト距離（所定距離）ｄを設定すればよい。なお、入射角θと屈折角φの間には、下記式（２）の関係がある。
δ＝ｔ・sin（θ‐φ）／cosφ　　　　…（１）
φ＝arcsin(sinθ／ｎ)　　　　　　　　…（２）
なお、入射角θを４５度とした場合、ミラー部材の屈折率ｎが１．５であれば、ｄ＝δ＝０．３３ｔとなり、ミラー部材の屈折率ｎが１．４であれば、ｄ＝δ＝０．２９ｔとなる。
　次に、共焦点顕微鏡ユニット１における顕微鏡５０への取り付け構造の詳細について説明する。図３は、共焦点顕微鏡ユニット１の顕微鏡５０への取り付け構造を示す断面図である。
　図３に示すように、鏡筒３の内部に複数のレンズによって構成されるスキャンレンズ７が固定されており、その鏡筒３の先端の内側には、アタッチメント部２１と可動部２２とが一体化された煽り調整機構２３が設けられている。アタッチメント部２１は、鏡筒３の先端から突出するリング状の形状を有し、その先端側に顕微鏡５０のカメラ接続用の接続ポートＰ１に取り付け可能な構造（例えば、Ｃマウントに対応した構造）を有する。可動部２２は、アタッチメント部２１の基端側に連続して形成され、略リング状の形状を有し、その外面が球面状に形成された摺動面をなしている。また、鏡筒３の先端の内面は、可動部２２の外面形状に対応した球面状の摺動面２４が形成されている。ここで、可動部２２の外面、及び鏡筒３の内面は、可動部２２が鏡筒３内に嵌め込まれ、アタッチメント部２１が顕微鏡５０の接続ポートＰ１に接続された状態において、それらの形状を含む球面の中心Ｃ１が、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の結像面Ｓ１上に位置するような形状とされている。
　上記構造の煽り調整機構２３が鏡筒３の先端側に嵌め込まれたような取り付け構造によれば、顕微鏡５０に取り付けられた状態において、可動部２２を鏡筒３の摺動面２４に対して摺動させることにより、アタッチメント部２１に対する鏡筒３の角度を変更可能に鏡筒３を支持することができる。このとき、可動部２２の外面及び鏡筒３の内面が球面状に形成されているので、鏡筒３がアタッチメント部２１に対して回転可能にされ、アタッチメント部２１の中心軸に対する鏡筒３の中心軸の角度を二次元的に調整可能とされる。すなわち、煽り調整機構２３は、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の光軸とスキャンレンズ７の光軸とが平行になるように、アタッチメント部２１に対する鏡筒３の角度を変更可能に構成される。
　以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１によれば、各サブユニット６ａ～６ｄの光源１０ａ～１０ｄから照射された励起光（照射光）が、スキャンミラー４、スキャンレンズ７、及び外部の顕微鏡５０を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた蛍光（観察光）が、外部の顕微鏡５０、スキャンレンズ７、及びスキャンミラー４を経由して各サブユニット６ａ～６ｄの光検出器１３ａ～１３ｄで検出される。この共焦点顕微鏡ユニット１は、スキャンレンズ７が固定される鏡筒３がアタッチメント部２１によって顕微鏡５０の接続ポートＰ１に取り付けられ、そのアタッチメント部２１に対する鏡筒３の角度が変更可能とされている。このような構成により、取り付け先の顕微鏡５０に対応してスキャンレンズ７の光軸を顕微鏡５０の顕微鏡光学系の光軸の方向に合わせることができる。その結果、信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができる。
　図４は、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。第１のサブユニット６ａから照射される波長λ１の励起光に応じて生じる蛍光の波長範囲Δλ１は、一般的には、波長λ１の近傍であって波長λ１より長波長の範囲となる。これに対して、第２のサブユニット６ｂから照射される励起光の波長λ２、及びそれによって生じる蛍光の波長範囲Δλ２は、波長λ１及び波長範囲Δλ１よりも長波長の範囲となる。ここで、第１のサブユニット６ａのダイクロイックミラー９ａの光分割の境界波長λｄ１は、波長λ１及び波長範囲Δλ１よりも長波長であり、かつ、波長λ２及び波長範囲Δλ２よりも短波長となる値に設定されている。これにより、第１のサブユニット６ａを用いた波長λ１及び波長範囲Δλ１の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第２のサブユニット６ｂを用いて、波長λ２及び波長範囲Δλ２の範囲の共焦点計測が可能となる。同様に、第２のサブユニット６ｂのダイクロイックミラー９ｂの光分割の境界波長λｄ２は、波長λ２及び波長範囲Δλ２よりも長波長であり、かつ、波長λ３及び波長範囲Δλ３よりも短波長となる値に設定されており、第３のサブユニット６ｃのダイクロイックミラー９ｃの光分割の境界波長λｄ３は、波長λ３及び波長範囲Δλ３よりも長波長であり、かつ、波長λ４及び波長範囲Δλ４よりも短波長となる値に設定されている。これにより、同一の装置の第３のサブユニット６ｃを用いた波長λ３及び波長範囲Δλ３の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第４のサブユニット６ｄを用いて、波長λ４及び波長範囲Δλ４の範囲の共焦点計測が可能となる。
　ここで、煽り調整機構２３の可動部２２はスキャンレンズ７の光軸と顕微鏡５０の顕微鏡光学系の光軸とが平行になるように鏡筒３の角度を変更可能に構成されている。この場合、スキャンレンズ７の光軸の方向と顕微鏡光学系の光軸を合わせることで、スキャンミラー４と対物レンズ５２の瞳位置を共役位置に配置でき、対物レンズ５２のＮＡを最大限使用することが可能となり、光検出器１３ａ～１３ｄで検出される信号の信号強度及び分解能を確実に向上させることができる。
　特に、可動部２２は、アタッチメント部２１に対して回転可能に構成されている。このような構成により、スキャンレンズ７の方向と顕微鏡光学系の光軸を二次元的に合わせることができ、光検出器１３ａ～１３ｄで検出される信号の信号強度及び分解能を確実に向上させることができる。さらに、可動部２２の回転中心Ｃ１は顕微鏡光学系の結像面Ｓ１に含まれるように構成されている。こうすれば、視野に影響を与えることなく、調整できるため、視野調整と角度調整を交互に繰り返す必要がなくなる。
　図５には、共焦点顕微鏡ユニット１においてスキャンレンズ７の光軸の方向と顕微鏡光学系の光軸の方向とが不一致の場合の励起光あるいは蛍光の導光のイメージを示し、図６には、共焦点顕微鏡ユニット１においてスキャンレンズ７の光軸の方向と顕微鏡光学系の光軸の方向とが一致した場合の励起光あるいは蛍光の導光のイメージを示す。
　共焦点顕微鏡ユニット１では、顕微鏡５０の対物レンズ瞳がスキャンミラー４上に結像するように顕微鏡光学系及びスキャンレンズ７が予め調整される。これにより、スキャンミラー４の駆動による角度の変更が、対物レンズ５２の瞳で励起光あるいは蛍光の光線の角度を振ることと等価となり、光線のロスを低減して対物レンズ５２の性能を十分に発揮できることとなる。ここで、対物レンズ瞳のサイズは対物レンズ５２によって異なっており、励起光あるいは蛍光の光線径はその瞳サイズと同等以上である必要があるが、一般にＭＥＭＳミラー等で構成されるスキャンミラー４は径が小さく振り角が大きいため、瞳の大きい低倍率・低ＮＡの対物レンズ５２の使用時にはスキャンミラー４上に対物レンズ瞳が収まらない場合がある。
　また、顕微鏡５０においては、接続ポートＰ１（図１）に対し、顕微鏡の光軸が組立誤差により、傾いている場合がある。この傾きは、観察光を撮像・検出する際に問題になり、特に、走査型顕微鏡として使用する場合には問題になる。その結果、図４に示すように、顕微鏡５０に対して共焦点顕微鏡ユニット１を取り付けた際に、顕微鏡光学系の光軸Ａ１に対してスキャンレンズ７の光軸Ａ２が角度θ（＞０）ほど傾く場合がある。このような場合は、スキャンミラー４を駆動して励起光の結像位置を変更して光線Ｂ１，Ｂ２として試料Ｍに向けて照射した際に光線Ｂ１，Ｂ２の位置が対物レンズの絞りからずれてしまい、励起光が一部けられてしまうことが起こりうる。その結果、サブユニット６ａ～６ｄ用いて生成される画像における信号量・分解能の低下を招く。
　これに対して、図６に示すように、顕微鏡５０に対して共焦点顕微鏡ユニット１を取り付けた際に、顕微鏡光学系の光軸Ａ１に対してスキャンレンズ７の光軸Ａ２の方向を合わせるように煽り調整機構２３を用いて調整することにより、励起光の結像位置を変更して光線Ｂ１，Ｂ２として試料Ｍに向けて照射した際に光線Ｂ１，Ｂ２の位置を対物レンズの絞り位置に一致させることができる。その結果、励起光がけられてしまうことが防止でき、サブユニット６ａ～６ｄ用いて生成される画像における信号量・分解能を高めることができる。
　本実施形態の煽り調整機構２３を用いた煽り調整は、図７に示すような冶具を用いて実現することができる。図７は、共焦点顕微鏡ユニット１を対象にした煽り調整時に用いる冶具の構成を示す図である。冶具としては、円盤状のターゲット部材３１と、そのターゲット部材３１を対物レンズ５２に代えて顕微鏡５０に取り付けるためのマウント部３２とを含んだものを採用できる。ターゲット部材３１の表面の中心には円形のマーキング３３が施されており、マウント部３２によって顕微鏡５０に取り付けた際にマーキング３３の位置が対物レンズ５２の瞳位置と一致するように構成される。
　このような構成の冶具を用いて、共焦点顕微鏡ユニット１を用いて励起光を出力しながらターゲット部材３１に照射される励起光のスポットＳＰ１を、外部のカメラ等を用いて観察する。そして、励起光のスポットＳＰ１がターゲット部材３１上のマーキング３３に一致するように煽り調整を行うことにより、顕微鏡光学系の光軸に対してスキャンレンズ７の光軸の方向を合わせるような調整が可能となる。
　また、スキャンミラー４はＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。
　さらに、各サブユニット６ａ～６ｄにおいては、スキャンミラー４を介して戻る観察光の光束を制限するピンホール板１２ａ～１２ｄが備えられ、光検出器１３ａ～１３ｄは、ピンホール板１２ａ～１２ｄを通過した観察光を検出するように構成されている。この場合、共焦点観察において信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができる。
　以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。
　上記実施形態の煽り調整機構２３は、球面状の摺動面を有する可動部２２の構成には限定されず、ゴム製の部材、あるいは蛇腹形状の部材によって可動部２２を構成してもよい。
　また、上記実施形態においては、各サブユニット６ａ～６ｄによって励起光を照射し、その励起光に応じて生じた蛍光を検出可能に構成されていたが、照射光の照射に応じて試料Ｍで生じる反射光を検出可能に構成されていてもよい。
　また、上記実施形態は、共焦点顕微鏡として用いる場合には限定されず、スキャンミラーを用いた走査型顕微鏡であれば一般的な蛍光顕微鏡、あるいは反射型顕微鏡などに用いられてもよい。
　また、上記実施形態は、スキャンミラーを用いた走査型顕微鏡応用に限らず、レンズを有する光学ユニットを光学顕微鏡の接続ポートＰ１に取り付ける際に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の光軸と光学ユニットのレンズの光軸とが平行になるように光学ユニットの筐体を傾ける際にも有効である。この場合、光学顕微鏡と光学ユニットとの光軸調整が容易になる。
　上記実施形態は、共焦点光学系を構成するために絞り部材としてピンホール板を用いているが、絞り部材は光束を制限する光学素子であればよく、例えば、色彩絞りやファイバコアなどであってもよい。ファイバ出力タイプの光源を用いる場合、ファイバコア端面の位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよい。
　また、上記実施形態は、固体レーザやダイオードレーザなどのレーザ光源を用いることもできる。この場合、これらのレーザ光源のビームウェストの位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよく、光源自体が絞り部材の役割を果たすことになる。
　上記実施形態においては、可動部はスキャンレンズの光軸と顕微鏡光学系の光軸とが平行になるように筐体の角度を変更可能にするものであってもよい。この場合、スキャンレンズの方向と顕微鏡光学系の光軸を合わせることで、光検出器で検出される信号の信号強度及び分解能を確実に向上させることができる。
　また、可動部は、アタッチメント部に対して回転可能に構成されていてもよい。かかる構成を採れば、スキャンレンズの方向と顕微鏡光学系の光軸を二次元的に合わせることができ、光検出器で検出される信号の信号強度及び分解能を確実に向上させることができる。
　さらに、可動部の回転中心は顕微鏡光学系の結像面に含まれていてもよい。こうすれば、視野に影響を与えることなく、光検出器で検出される信号量の増大と分解能向上の効果が得られる。
　また、スキャンミラーはＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。
　また、光検出器は、照射光の照射に伴い発生した蛍光を観察光として検出してもよく、照射光の照射に伴い発生した反射光を観察光として検出してもよい。かかる構成によれば、様々な種類の観察光のイメージングにおいて信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができる。
　さらに、スキャンミラーを介して戻る観察光の光束を制限する絞り部材をさらに備え、光検出器は、絞り部材を通過した観察光を検出してもよい。この場合、共焦点観察により、光学断層画像を取得することができる。また、この絞り部材はピンホール板であってもよい。
　実施形態は、走査型顕微鏡を構成する走査型顕微鏡ユニットを使用用途とし、信号強度及び分解能の維持されたイメージングを実現することができるものである。
　Ａ１，Ａ２…光軸、Ｃ１…回転中心、Ｍ…試料、Ｐ１…接続ポート、Ｓ１…結像面、ｄ…所定距離、１０ａ～１０ｄ…光源、１２ａ～１２ｄ…ピンホール板（絞り部材）１３ａ～１３ｄ…光検出器、６ａ～６ｂ…第１～第４のサブユニット、９ａ～９ｃ…ダイクロイックミラー、１…共焦点顕微鏡ユニット、２…メイン筐体、３…鏡筒（筐体）、４…スキャンミラー、７…スキャンレンズ、２１…アタッチメント部、２２…可動部、２３…煽り調整機構、２４…摺動面、５０…顕微鏡、５２…対物レンズ。

Claims (9)

  1. 　顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、走査型顕微鏡を構成する走査型顕微鏡ユニットであって、
    　観察対象の試料に向けて照射光を出力する光源と、
    　前記照射光に応じて前記試料から生じる観察光を検出する光検出器と、
    　前記光源から出力された前記照射光を、前記試料上で走査させ、前記照射光に応じて前記試料から生じる前記観察光を前記光検出器に向けて導くスキャンミラーと、
    　前記スキャンミラーによって走査された前記照射光を前記顕微鏡光学系に導光し、前記顕微鏡光学系によって結像された前記観察光を前記スキャンミラーに導光するスキャンレンズと、
    　スキャンレンズが固定された筐体と、
    　前記筐体を前記接続ポートに取り付けるためのアタッチメント部と、
    　前記アタッチメント部に対する前記筐体の角度を変更可能に前記筐体を支持する可動部と、
    を備える走査型顕微鏡ユニット。
  2. 　前記可動部は、前記スキャンレンズの光軸と前記顕微鏡光学系の光軸とが平行になるように前記筐体の角度を変更可能にする、
    請求項１記載の走査型顕微鏡ユニット。
  3. 　前記可動部は、前記アタッチメント部に対して回転可能に構成されている、
    請求項１又は２に記載の走査型顕微鏡ユニット。
  4. 　前記可動部の回転中心は、前記顕微鏡光学系の結像面に含まれる、
    請求項３記載の走査型顕微鏡ユニット。
  5. 　前記スキャンミラーはＭＥＭＳミラーである、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡ユニット。
  6. 　前記光検出器は、前記照射光の照射に伴い発生した蛍光を前記観察光として検出する、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡ユニット。
  7. 　前記光検出器は、前記照射光の照射に伴い発生した反射光を前記観察光として検出する、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡ユニット。
  8. 　前記スキャンミラーを介して戻る前記観察光の光束を制限する絞り部材をさらに備え、
    　前記光検出器は、前記絞り部材を通過した前記観察光を検出する、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡ユニット。
  9. 　前記絞り部材は、ピンホール板である、
    請求項８に記載の走査型顕微鏡ユニット。
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