JP5949024B2

JP5949024B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5949024B2
Application number: JP2012066821A
Authority: JP
Inventors: 元夫小山
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: JP2013200330A

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。

顕微鏡装置の一例である走査型顕微鏡は、レーザ光等の照明光を励起光とし、この励起光を対物レンズを介して試料に照射することで発生する蛍光を観察光として取得してこの試料の観察を行う。このような走査型顕微鏡には、試料上を励起光により走査して試料全体の画像を取得するために走査ユニットが設けられており、試料で発生した観察光（蛍光）はこの走査ユニットでデスキャンされた後、検出される。そのため、このような走査型顕微鏡装置では、励起光が通過する光路の一部を観察光が通過するので、この光路から観察光を分離するために、所定の波長の光（例えば励起光）を透過し、残りの波長の光（例えば観察光）を反射する波長選択部（ダイクロイックミラー等）が設けられている（例えば、特許文献１参照）。

特開２０１１−１０２９７０号公報

このような走査型顕微鏡において、試料を観察するための励起光や観察光の波長を変更する場合には、その波長に合わせて、透過及び反射する波長帯域が異なる（波長特性が異なる）波長選択部であるダイクロイックミラーを用いる必要がある。そのため、従来の走査型顕微鏡では、波長特性が異なる複数のダイクロイックミラーをターレットを用いて光路上に出し入れするように構成されたものがある。しかしながら、様々な波長特性に対応するためには、多数のダイクロイックミラーを用意する必要があり、交換が煩雑で、且つ、部品点数増加に伴いコストアップしてしまうという課題があった。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、照明光及び観察光の波長に合わせて波長選択部の波長特性を変化させることができるように構成された顕微鏡装置を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡装置は、光源から放射された所定の波長を有する照明光を試料に照射するとともに、この試料から放射される所定の波長とは異なる波長を有する観察光を集光する対物レンズと、光源と対物レンズとの間に配置され、光源からの照明光を対物レンズに導くとともに、対物レンズからの観察光を光検出部に導く波長選択部と、を有し、波長選択部は、所定の反射率を有する平面が所定の間隔で対向するように配置された２つの光透過部材と、この間隔を変化させる間隔調整部並びに光透過部材に対する照明光及び観察光の入射角度を変化させる角度調整部の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする。

このような顕微鏡装置は、入力部で入力された蛍光色素の種類、照明光の波長及び観察光の波長の少なくとも一つに対応して間隔調整部及び角度調整部の少なくとも一方を制御する制御部を有することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置は、制御部により制御される間隔調整部の間隔を蛍光色素の種類、照明光の波長及び観察光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、この記憶部から読み出された間隔になるように、制御部により間隔調整部を制御することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置は、制御部により制御される角度調整部の入射角度を蛍光色素の種類、照明光の波長及び観察光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、この記憶部から読み出された入射角度になるように、制御部により角度調整部を制御することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置は、照明光の波長の切り替えによって生じる間隔の補正値、及び照明光の波長の切り替えによって生じる入射角度の補正値の少なくとも一方に基づいて、制御部により間隔調整部及び角度調整部の少なくとも一方を制御することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置において、光透過部材の平面の各々には、反射率が異なる少なくとも２以上の領域が形成され、２つの光透過部材は、光軸に直交する面内を移動させて照明光が入射する領域を変化させる位置調整部を有することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置は、波長選択部の波長特性を検知する検出部を有し、この検出部で検出した結果に基づいて、所望の波長特性になるように、間隔調整部及び角度調整部の少なくとも一方を制御することが好ましい。

また、このような顕微鏡装置において、波長選択部は、照明光を透過し、観察光を反射するように構成されていることが好ましい。

また、このような顕微鏡装置は、波長選択部と対物レンズとの間に配置され、照明光により試料を走査する走査ユニットを有することが好ましい。

本発明を以上のように構成すると、照明光及び観察光の波長に合わせて波長選択部の波長特性を変化させることができる顕微鏡装置を提供することができる。

走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。波長選択部の構成を示す正面図である。図２のＩＩＩ−ＩＩＩ断面図である。波長選択部の２つの平面の間の光束の状態を示す説明図である。波長選択部の波長特性を示す説明図であり、（ａ）は面間隔を３００ｎｍとしたときを示し、（ｂ）は面間隔を８００ｎｍとしたときを示す。検出部の構成を示す説明図であって、（ａ）は透過光及び反射光の強度比率から波長選択部の波長特性を検出する検出部の構成を示し、（ｂ）アライメント顕微鏡により波長選択部の波長特性を検出する検出部の構成を示す。波長選択部の波長特性を示すグラフである。測長干渉計により波長選択部の波長特性を検出する検出部の構成を示す説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。図１に示すように、顕微鏡装置の一例である走査型顕微鏡１０は、光源２０から放射されたレーザ光（照明光又は励起光）を観察試料の試料面５０に照射して走査する走査光学系３０と、試料面５０からの観察光（励起光により発生する蛍光）を検出する検出光学系４０と、を有して構成される。

走査光学系３０は、光源２０側から順に、ビームエキスパンダ３１、波長選択部３２、走査ユニット３３、スキャンレンズ３４、第２対物レンズ３５、及び、対物レンズ３６から構成されている。また、検出光学系４０は、走査光学系３０の側方に配置され、波長選択部３２側から順に、結像レンズ４１、遮光板４２、及び、光検出部４３から構成されている。また、この走査型顕微鏡１０には、走査ユニット３３で走査する位置（試料面５０上の座標）及び光検出部４３で検出された値を処理する制御部７０が設けられている。なお、この制御部７０は、後述するように波長選択部３２の波長特性も制御するように構成されている。

この走査型顕微鏡１０において、光源２０から放射されたレーザ光は、ビームエキスパンダ３１で必要なビーム径の略平行光束となり、波長選択部３２を透過し、走査ユニット３３に入射する。この走査ユニット３３は、光軸に直交する方向にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、レーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸と直交する面内で所定の方向に偏向させる第１の偏向素子と、この第１の偏向素子で反射されたレーザ光をさらに反射することにより、このレーザ光を光軸と直交する面内で前記所定の方向と直交する方向に偏向させる第２の偏向素子とから構成されている。なお、これらの第１及び第２の偏向素子は、駆動部６０のモータで回転されるように構成されている。そして、この走査ユニット３３を出射したレーザ光（略平行光束）はスキャンレンズ３４により一次像面Ｉに結像された後、第２対物レンズ３５を通過することにより再び略平行光束となり、対物レンズ３６によって試料面（対物レンズ３６の焦点面）５０上に集光される。

試料面５０上に集光されて形成されたレーザ光の像は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３６の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。この試料面５０上の点像の領域（照射領域）において励起した試料から生じる蛍光である観察光は、再び対物レンズ３６で集光されて略平行光束となり、第２対物レンズ３５により一次像面Ｉに結像された後、さらにスキャンレンズ３４で略平行光束にされて走査ユニット３３に入射する。そして、この走査ユニット３３でデスキャンされて出射した観察光（略平行光束）は波長選択部３２で反射されて検出光学系４０内に入り、結像レンズ４１により遮光板４２の開口部４２ａ上に集光される。この遮光板４２の開口部４２ａを通過した光のみが光検出部４３に到達し検出される。

上述の構成により、遮光板４２の開口部４２ａは試料面５０上に結像されたレーザ光の点像と共役であり、試料面５０上の照射領域から出た光（蛍光である観察光）はこの開口部４２ａを通過することができる。一方、試料面５０上の他の領域から出た光のほとんどはこの開口部４２ａ上には結像されず、通過することができない。以上より、制御部７０が走査ユニット３３の走査に同期させて光検出部４３で検出された信号を処理することにより、試料面５０の二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で試料面５０の像を得ることができる。ここで、上記処理により得られた試料面５０の画像は、ハードディスクやフラッシュメモリで構成され制御部７０に接続された記憶部７３に記憶されても良いし、ディスプレイ等で構成され制御部７０に接続された出力部７２に出力されても良い。

なお、このような走査型顕微鏡１０において、レーザ光の２次元スキャンによりムラのない２次元画像を得るためには、走査ユニット３３を構成する第１及び第２の偏向素子によるレーザ光の回転中心（振り角の中心）と対物レンズ３６の射出瞳Ｐの位置とを共役関係とすることが必要である。そのため、スキャンレンズ３４は、対物レンズ３６の射出瞳Ｐの像を走査ユニット３３の回転中心若しくはその近傍に形成するように構成されている。

また、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０の光源２０は、異なる波長のレーザ光を放射することができるように構成されている。そのため、観察者は、観察する試料に応じてこの試料を励起するための光の波長を選択することができる。

このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は試料を励起するための励起光（レーザ光）の波長を選択することができるため、励起光（照明光）の波長が変化するとともに、これらの励起光により発生する蛍光（観察光）の波長も変化する。そのため、本実施形態の波長選択部３２は、励起光及び蛍光の波長に応じてその波長特性（透過及び反射する波長帯域）を調整できるように構成されている。以下に、図２〜図８を用いてこの波長選択部３２の構成について説明する。

波長選択部３２は、図３に示すように、所定の間隔を有して近接して配置された２つの平面Ｓ１，Ｓ２を有して構成されている。これらの平面Ｓ１，Ｓ２は、例えば、光を透過する光学部材である２枚の平板状の光透過部材３２ａ，３２ｂを対向させて配置し、対向する面に設けられた反射膜により構成される。図４に示すように、これらの平面Ｓ１，Ｓ２に挟まれた空間（以下、「干渉空間３２ｃ」と呼ぶ）に入射した光束は、２つの平面Ｓ１，Ｓ２で一部が透過し残りが反射することによりこの干渉空間３２ｃ内で反射を繰り返し、これらの平面Ｓ１，Ｓ２の間で多重干渉を起こす。ここで、図４に示すように、一方の平面（例えば、図４においては平面Ｓ１）から入射した光束に関し、この入射光束の干渉空間３２ｃでの入射角度をφ′とし、光束の入射位置での平面Ｓ１，Ｓ２の間隔（以下、「面間隔」と呼ぶ）をｄとし、干渉空間３２ｃの媒質の屈折率をｎ′として、δを次式（１）のように定義する。なお、図４に示す構成では干渉空間３２ｃには空気が満たされており、屈折率ｎ′はおよそ１である。また、光透過部材３２ａ，３２ｂの媒質の屈折率をｎとし、この光透過部材３２ａ，３２ｂにおける上記光束の入射角度をφとすると、スネルの法則により、ｎｓｉｎφ＝ｎ′ｓｉｎφ′が成立する。

そして、各平面Ｓ１，Ｓ２のエネルギー反射率をＲ₀とすると、上述のように近接して配置された２つの平面Ｓ１，Ｓ２の多重干渉によるエネルギー透過率Ｔｆｐは、式（１）に示すδを用いて次式（２）のように表される。

これらの式（１）及び式（２）から明らかなように、上述した構成の波長選択部３２を透過する光の波長及びこの波長選択部３２で反射する光の波長は、平面Ｓ１及び平面Ｓ２に挟まれた干渉空間３２ｃにおける光束の入射角度φ′、平面Ｓ１及び平面Ｓ２の間隔ｄ並びにエネルギー反射率Ｒ₀により決定される。例えば、干渉空間３２ｃが空気で満たされており（ｎ′＝１）、面間隔ｄが３００ｎｍ、平面Ｓ１，Ｓ２のエネルギー反射率Ｒ₀が８０％、干渉空間３２ｃにおける光束の入射角度φ′が４５度のときの波長選択部３２の波長特性を図５（ａ）に示す。なお、図５において、実線が透過する光の波長特性を示し、破線が反射する光の波長特性を示している。このような構成の波長選択部３２では、４２０ｎｍ付近の波長の光が透過し、それ以外の波長の光が反射する。そのため、例えば、４２０ｎｍの光を励起光にし、その他の波長の光を観察光とすることができる。また、面間隔ｄを８００ｎｍとし、その他の条件を上述の構成と同一にしたときの波長選択部３２の波長特性を図５（ｂ）に示す。このような構成の波長選択部３２では、３８０ｎｍ付近と５６０ｎｍ付近の波長の光が透過し、それ以外の波長の光が反射する。そのため、例えば、３８０ｎｍ又は５６０ｎｍの光を励起光にし、その他の波長の光を観察光とすることができる。もちろん、光束の入射角度φ′又はエネルギー反射率Ｒ₀を変化させてもこの波長選択部３２の波長特性を変化させることができる。

それでは、以上のような構成の波長選択部３２の平面Ｓ１及び平面Ｓ２の面間隔ｄを変化させる方法について説明する。図２及び図３に示すように、本実施形態に係る波長選択部３２は、上述の平面Ｓ１，Ｓ２が形成された平板状の光透過部材３２ａ，３２ｂを有し、これらの光透過部材３２ａ，３２ｂは、平面Ｓ１，Ｓ２が対向するように配置されている。この光透過部材３２ａ，３２ｂは、周縁部の３カ所においてスペーサ３２ｄを挟むことにより干渉空間３２ｃを形成するように構成されている。また、この波長選択部３２は、光透過部材３２ａ，３２ｂ及びスペーサ３２ｄを囲むように保持部材３２ｅが設けられている。この保持部材３２ｅは、上述の平面Ｓ１，Ｓ２を光が透過及び反射可能なように、この平面Ｓ１，Ｓ２に対して直交する方向から見たときに開口部３２ｊが形成された円環形状を有している。また、図３に示すようにその断面はコの字形状を有しており、この保持部材３２ｅにより囲まれた空間に光透過部材３２ａ，３２ｂの周縁部及びスペーサ３２ｄが配置されている。そして、３つのスペーサ３２ｄの各々に対して位置整合するように保持部材３２ｅの一方の面側に取り付けられた３つの固定部材３２ｆを用いて、光透過部材３２ａ，３２ｂ及びスペーサ３２ｄを保持部材３２ｅの他方の面に押しつけてこれらを挟持することにより固定するように構成されている。よって、この波長選択部３２は、固定部材３２ｆによる押さえつける力を調整することにより、スペーサ３２ｄを押し縮める量を調整し、２つの光透過部材３２ａ，３２ｂの面間隔ｄを精度良く調整することが可能となる。このように、スペーサ３２ｄ、保持部材３２ｅ及び固定部材３２ｆは、波長選択部３２の面間隔ｄを調整する間隔調整部３２ｇを構成している。

なお、上述の説明の間隔調整部３２ｇでは、固定部材３２ｆによるスペーサ３２ｄの押し縮め量で間隔ｄを調整する場合について説明したが、これらの代わりにピエゾ素子のような圧電効果を利用した素子により面間隔ｄを調整するように構成しても良いし、ヒーターやペリチェ素子によりスペーサ３２ｄの温度を変化させることによりこのスペーサ３２ｄを膨張・収縮させて面間隔ｄを調整するように構成しても良い。

また、波長選択部３２の平面Ｓ１，Ｓ２の面間隔ｄをピエゾ素子のように電気信号により制御する構成の場合、図１に示した制御部７０によりこの面間隔を制御することができる。例えば、この制御部７０は、試料の性質や光源２０から放射される励起光（照明光）の波長から、試料で発生する蛍光（観察光）の波長を決定し、上述の式（１）及び式（２）を用いて、波長選択部３２が所望の波長特性となる（励起光を透過し、観察光を反射する）面間隔ｄを演算により求め、この面間隔ｄとなるように波長選択部３２の間隔調整部３２ｇを制御するように構成することができる。

また、上述したように、波長選択部３２の波長特性は、平面Ｓ１，Ｓ２に入射する光束の入射角度φ′（φ）により変化する。そのため、波長選択部３２を回転させることによりこの波長選択部３２の平面Ｓ１，Ｓ２の光軸に対する角度を変化させる角度調整部３２ｈ（例えば、ステッピングモータのようなアクチュエータにより構成する）を設け、干渉空間３２ｃにおける入射角度φ′を所望の波長特性となるように制御することも可能である。但し、波長選択部３２の平面Ｓ１，Ｓ２の光軸に対する角度を変化させると、この波長選択部３２で反射された観察光が出射する方向も変化するため、角度調整部３２ｈによる波長選択部３２の回転に合わせて、検出光学系４０を移動させるように構成することが必要である。この場合も、試料の性質や光源２０から放射される励起光（照明光）の波長から、試料で発生する蛍光（観察光）の波長を決定し、上述の式（１）及び式（２）を用いて、波長選択部３２が所望の波長特性となる入射角度φ′を演算により求め、この入射角度φ′となるように波長選択部３２の角度調整部３２ｈを制御するように構成することができる。

さらに、波長選択部３２の波長特性は、平面Ｓ１，Ｓ２のエネルギー反射率Ｒ₀により変化する。そのため、光透過部材３２ａ，３２ｂの平面Ｓ１，Ｓ２の各々にエネルギー反射率Ｒ₀の異なる少なくとも２以上の領域を形成し、光透過部材３２ａ，３２ｂを位置調整部３２ｋにより移動させて照明光及び観察光が入射する領域を切り替えることにより、エネルギー反射率Ｒ₀が所望の波長特性となるように制御することも可能である。なお、略平行に延びる平面Ｓ１，Ｓ２に対して、直線方向にエネルギー反射率Ｒ₀の異なる少なくとも２以上の領域を設け、この方向に沿って位置調整部３２ｋにより光透過部材３２ａ，３２ｂを直線的に移動させるように構成しても良いし、円状にエネルギー反射率Ｒ₀の異なる少なくとも２以上の領域を設け、この方向に沿って位置調整部３２ｋにより光透過部材３２ａ，３２ｂを回転させるように構成しても良い。また、平面Ｓ１，Ｓ２におけるエネルギー反射率Ｒ₀は、連続して変化するように構成しても良いし、段階的に変化するように構成しても良い。上記の面間隔ｄ及び入射角度φ′と同様に、試料の性質や光源２０から放射される励起光（照明光）の波長から、試料で発生する蛍光（観察光）の波長を決定し、上述の式（１）及び式（２）を用いて、波長選択部３２が所望の波長特性となるエネルギー反射率Ｒ₀を演算により求め、このエネルギー反射率Ｒ₀となるように波長選択部３２の位置調整部３２ｋを制御するように構成することができる。

また、この波長選択部３２は、面間隔ｄ、入射角度φ′及びエネルギー反射率Ｒ₀のいずれか一つを制御して所望の波長特性となるように構成しても良いし、いずれか２つ若しくはすべてを制御して所望の波長特性となるように構成しても良い。このように、本実施形態に係る波長選択部３２は、間隔調整部３２ｇ、角度調整部３２ｈ及び位置調整部３２ｋのうち少なくとも一つを有していれば、上述の式（１）及び式（２）に基づいて波長特性を変化させることができる。

また、上述したように、照明光及び観察光の波長は、観察する試料や蛍光色素の種類により決定される。以下の表１に、代表的な蛍光色素であるｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）及びフルオレセインの吸収波長（励起波長）及び蛍光波長（蛍光の中心波長）を示す。

（表１）
吸収波長蛍光波長
ｅＣＦＰ 800-900nm 476nm
ｅＧＦＰ 820-950nm 509nm
ｅＹＦＰ 860-950nm 532nm
フルオレセイン 780-820nm 519nm

以上のような波長特性であるため、例えば、ｅＧＦＰを蛍光色素として用いる場合には、波長選択部３２を、蛍光（観察光）の５０９ｎｍの光を反射し、励起光として８２０ｎｍの光を透過するように調整することが必要である。この場合、エネルギー反射率Ｒ₀を９０％ととし、入射角度φ′を４５度ととし、面間隔ｄを５８０ｎｍとすることで、所望の波長特性を得ることができる。

また、光源２０から放射する照明光（励起光）及びこの照明光により発生する観察光（蛍光）の波長を入力部７１により入力して制御部７０に対して設定し、制御部７０で上述の式（１）及び式（２）に基づいて、面間隔ｄ、入射角度φ′及びエネルギー反射率Ｒ₀の中の少なくとも一つを制御してこの光源２０の波長に連動して波長選択部３２の波長特性を制御するように構成することも可能である。あるいは、記憶部７３に、表１に示すような蛍光色素の種類や、この種類に対応する照明光及び観察光の波長の少なくとも一つを記憶しておき、入力部７１から入力された蛍光色素の種類や照明光及び観察光の波長に基づいて、式（１）及び式（２）により面間隔ｄ、入射角度φ′及びエネルギー反射率Ｒ₀の少なくとも一つを算出して波長選択部３２を調整するように構成しても良い（すなわち、入力部７１から入力された蛍光色素に応じて表１から照明光及び観察光の波長を決定しても良いし、観察に使用する照明光及び観察光の波長を直接入力しても良いし、照明光又は観察光のうちのいずれか一方の波長を入力してそこから他方の波長を決定しても良い）。

なお、上述の面間隔ｄ及び入射角度φ′は、上記式（１）及び式（２）から算出される値により波長選択部３２を制御しても良いし（例えば、面間隔ｄが５０９ｎｍであれば、その値になるように光透過部材３２ａ，３２ｂの面間隔を制御する）、予め決められた基準となる位置や、現在の状態における位置に対する補正値（基準となる位置や現在の位置からの差分）として求めて波長選択部３２を制御しても良い。

また、以上の説明では、面間隔ｄ、入射角度φ′及びエネルギー反射率Ｒ₀の少なくとも一つを制御して波長選択部３２を所望の波長特性となるように構成しているが、この波長選択部３２に、波長特性を検出する検出部３２ｍを設けても良い。この場合、波長選択部３２の波長特性を確認するだけでなく、検出部３２ｍで検出される波長特性をフィードバックして面間隔ｄ、入射角度φ′又はエネルギー反射率Ｒ₀の値を調整することにより、この波長選択部３２の波長特性が所望の値になるように制御することも可能である。この検出部３２ｍによる波長選択部３２の波長特性の検出方法としては、光透過部材３２ａ，３２ｂの平面Ｓ１，Ｓ２の間隔を検知することにより検出する方法があり、以下にその構成を説明する。

まず、図６（ａ）を用いて透過光及び反射光の強度比率から波長選択部３２の波長特性を検出する検出部３２ｍの構成について説明する。この検出部３２ｍは、異なる波長の光であって、これらの光が略平行に進んで光透過部材３２ａに所定の入射角度で入射する光を放射する第１の光源１０１及び第２の光源１０２と、第１の光源１０１から放射され光透過部材３２ａ，３２ｂを透過した光を検出する第１の透過センサ１１１、及び、第１の光源１０１から放射され光透過部材３２ｂの平面Ｓ１，Ｓ２の多重干渉で反射して光透過部材３２ａを透過した光を検出する第１の反射センサ１１２と、第２の光源１０２から放射され光透過部材３２ａ，３２ｂを透過した光を検出する第２の透過センサ１２１、及び、第２の光源１０２から放射され光透過部材３２ｂの平面Ｓ１，Ｓ２の多重干渉で反射して光透過部材３２ａを透過した光を検出する第２の反射センサ１２２と、から構成されている。なお、ここでは、第１の光源１０１から放射される光の波長を４００ｎｍとし、第２の光源１０２から放射される光の波長を５５０ｎｍとし、第１及び第２の光源１０１，１０２から放射された光の光透過部材３２ａへの入射角度を１５°とし、また、波長選択部３２の平面Ｓ１，Ｓ２のエネルギー反射率を８０％、間隔ｄを３００ｎｍとして、図７に示す波長特性を有しているものとして説明する。

波長選択部３２の波長特性は、上述したように、平面Ｓ１及び平面Ｓ２に挟まれた干渉空間における光束の入射角度、平面Ｓ１及び平面Ｓ２の間隔並びにエネルギー反射率により決定される。すなわち、これらの値が適切な値であれば、この検出部３２ｍにおいて、第１の光源１０１に対応した第１の透過センサ１１１及び第１の反射センサ１１２で検出される光の強度は、第１の光源１０１から放射される光の波長が４００ｎｍであることから、図７に示すように波長選択部３２の透過率が９５％、反射率が５％となるため、この比率に応じた値となる。同様に、第２の光源１０２に対応した第２の透過センサ１２１及び第２の反射センサ１２２で検出される光の強度は、第２の光源１０２から放射される光の波長が５５０ｎｍであることから、図７に示すように波長選択部３２の透過率が５０％、反射率が５０％となるため、この比率に応じた値となる。図６（ａ）に示すように、第１及び第２の光源１０１，１０２から放射された光の入射角度を、走査型顕微鏡１０における励起光及び観察光の入射角度に設定し、上記センサ１１１，１１２，１２１，１２２で検出される光の強度が上述した割合になるように光透過部材３２ａ，３２ｂの間隔を調整することにより、波長選択部３２の波長特性を所望の値に設定することができる。

次に、図６（ｂ）を用いてアライメント顕微鏡により波長選択部３２の波長特性を検出する検出部３２ｍ′の構成について説明する。この検出部３２ｍ′は、波長選択部３２を構成する２つの光透過部材３２ａ，３２ｂのそれぞれの位置を正確に計測するため、光透過部材３２ａには第１のアライメント顕微鏡２０１及び第３のアライメント顕微鏡２０３を配置し、光透過部材３２ｂに対しては第２のアライメント顕微鏡２０２及び第４のアライメント顕微鏡２０４をそれぞれ配置して構成している。これにより、それぞれの光透過部材３２ａ，３２ｂを形成する各平面Ｓ１，Ｓ２の位置、あるいは光透過部材３２ａ，３２ｂの側面部に形成されたアライメントマーク（不図示）の位置を精密に計測することで、波長選択部３２の波長特性を検出する、すなわち、これにより光透過部材３２ａと光透過部材３２ｂとの間隔を所望の値に設定している。なお、２つの光透過部材３２ａ，３２ｂ（平面Ｓ１，Ｓ２）の間隔を、より平行に設定するためにはそれぞれの光透過部材３２ａ，３２ｂに対して概ね１２０度の間隔を空けて３組のアライメント顕微鏡を配置するのが良い。またシステムを簡略化するためには光透過部材３２ａと光透過部材３２ｂのうちのどちらか片方の最低一箇所にアライメント顕微鏡を配置すればよい。

最後に、図８を用いて測長干渉計により波長選択部３２の波長特性を検出する検出部３２ｍ″の構成について説明する。この検出部３２ｍ″は、波長選択部３２を構成する２つの光透過部材３２ａ，３２ｂのそれぞれの位置を正確に計測するため、それぞれの同一方向の側面に反射面Ｒ１，Ｒ２を設けて測長干渉計を構成する。具体的には、干渉計ヘッド３０１から出射した光束を偏光ビームスプリッタ３０２にてＰ波及びＳ波に分離し、この偏光ビームスプリッタ３０２を透過したＰ波は光透過部材３２ｂの反射面Ｒ２に、偏光ビームスプリッタ３０２で反射したＳ波は第１のミラー３０３にて光透過部材３２ａの反射面Ｒ１に入射させる。ここで、この偏光ビームスプリッタ３０２で分離された２つの光路のいずれにも第１のλ／４板３０４及び第２のλ／４板３０５が配置されている。そのため、光透過部材３２ａ，３２ｂのそれぞれの反射面Ｒ１，Ｒ２にて反射して再び偏光ビームスプリッタ３０２に入射する際に偏光方向が９０度変換されることになる。すなわち、光透過部材３２ａの反射面Ｒ１で反射した光はＰ波になって第１のミラー３０３で反射され、偏光ビームスプリッタ３０２を透過し、光透過部材３２ｂの反射面Ｒ２で反射した光はＳ波になって偏光ビームスプリッタ３０２で反射されることにより、これらの光が合成されて第２のミラー３０６に入射し、この第２のミラー３０６で反射されてレシーバー３０７に入射する。このレシーバー３０７より出力される出力信号、すなわち波長選択部３２の波長特性に基づいて光透過部材３２ａ，３２ｂの間隔を正確に制御することができる。

なお、図８に示す検出部３２ｍ″においては、干渉計を一つだけ配置しているが、より理想的には複数の干渉計を配置して制御することで光透過部材３２ａ，３２ｂの平行度を良好に保つことが可能となり好ましい。

また、以上の説明では、波長選択部３２により励起光を透過し、観察光（蛍光）を反射するように構成した場合について説明したが、２光子励起により試料を観察する構成の場合には、励起光を反射し、観察光（蛍光）を透過するように構成することも可能である。２光子励起とは、２つの光子を一つの蛍光分子にほぼ同時に衝突させてこの蛍光分子を励起させる観察方法であり、その励起効率は励起光強度の２乗に比例する。このような２光子励起を実現するためには、上述した光源２０として、空間的に対物レンズ３６の焦点に収束させた照明光（光子）を時間的に圧縮するために、非常に光子密度の高いパルス状の照明光（光子）を供給するフェムト秒パルスレーザ（２光子用レーザ光）を用いることが必要である。ここで、対物レンズ３６で集光される２光子用レーザ光の強度は、対物レンズ３６の焦点面からの光軸方向の距離の２乗に反比例して減少する。したがって、２光子励起の場合、その励起効率は近似的に焦点面からの光軸方向の距離の４乗に反比例して減少することになるため、結果として焦点面の近傍にある蛍光分子だけが励起され、蛍光を発することになる。すなわち、光軸方向（縦方向）の分解能が高い試料の画像を得ることができる。また、２光子励起の場合、蛍光分子から放射される蛍光は、照明光（光子）の２倍のエネルギーを有しており、波長が１／２となる。そのため、照明光には長波長の赤外レーザを用いることができるため、励起波長と蛍光波長の差を大きくすることができる。以上より、波長選択部３２を励起光を反射し、観察光（蛍光）を透過するように構成することが可能となる。

但し、図５に示すように、本実施形態における波長選択部３２は、透過する光の波長帯域を先鋭化することができるため、図１に示すように、この波長帯域において照明光（励起光）を透過させ、その他の波長帯域において観察光（蛍光）を反射させるように配置することが望ましい。

１０走査型顕微鏡（顕微鏡装置）２０光源３２波長選択部
３３走査ユニット３２ａ，３２ｂ光透過部材３２ｇ間隔調整部
３２ｈ角度調整部３２ｋ位置調整部
３２ｍ，３２ｍ′，３２ｍ″ 検出部
３６対物レンズ４３光検出部５０試料面７０制御部
７１入力部７３記憶部

Claims

光源から放射された所定の波長を有する照明光を試料に照射するとともに、前記試料から放射される前記所定の波長とは異なる波長を有する観察光を集光する対物レンズと、
前記光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からの前記照明光を前記対物レンズに導くとともに、前記対物レンズからの前記観察光を光検出部に導く波長選択部と、を有し、
前記波長選択部は、
所定の反射率を有する平面が所定の間隔で対向するように配置された２つの光透過部材と、
前記間隔を変化させる間隔調整部並びに前記光透過部材に対する前記照明光及び前記観察光の入射角度を変化させる角度調整部の少なくとも一方と、を含むことを特徴とする顕微鏡装置。
入力部で入力された蛍光色素の種類、前記照明光の波長及び前記観察光の波長の少なくとも一つに対応して前記間隔調整部及び前記角度調整部の少なくとも一方を制御する制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記制御部により制御される前記間隔調整部の前記間隔を前記蛍光色素の種類、前記照明光の波長及び前記観察光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、
前記記憶部から読み出された前記間隔になるように、前記制御部により前記間隔調整部を制御することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記制御部により制御される前記角度調整部の前記入射角度を前記蛍光色素の種類、前記照明光の波長及び前記観察光の波長の少なくとも一つに対応付けて記憶する記憶部を有し、
前記記憶部から読み出された前記入射角度になるように、前記制御部により前記角度調整部を制御することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記照明光の波長の切り替えによって生じる前記間隔の補正値、及び前記照明光の波長の切り替えによって生じる前記入射角度の補正値の少なくとも一方に基づいて、前記制御部により前記間隔調整部及び前記角度調整部の少なくとも一方を制御することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記光透過部材の前記平面の各々には、前記反射率が異なる少なくとも２以上の領域が形成され、
２つの前記光透過部材は、光軸に直交する面内を移動させて前記照明光が入射する前記領域を変化させる位置調整部を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記波長選択部の波長特性を検知する検出部を有し、
前記検出部で検出した結果に基づいて、所望の波長特性になるように、前記間隔調整部及び前記角度調整部の少なくとも一方を制御することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置
前記波長選択部は、前記照明光を透過し、前記観察光を反射するように構成されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記波長選択部と前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光により前記試料を走査する走査ユニットを有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。