DE102004062218A1

DE102004062218A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Erstellen von Aufnahmeserien von biologischen Objekten und zur Laser-Mikrodissektion

Info

Publication number: DE102004062218A1
Application number: DE200410062218
Authority: DE
Inventors: Karin Dr. Schütze; Raimund SCHÜTZE; Thomas Rheingans; Jörg Bachmann
Original assignee: PALM Microlaser Technologies GmbH
Current assignee: PALM Microlaser Technologies GmbH
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2006-07-13

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Erstellen von Bildaufnahmen, insbesondere Aufnahmeserien, von biologischen Objekten bereitgestellt. Dabei wird eine biologische Masse bereitgestellt und eine Mehrzahl von Orten (A-F) der biologischen Masse, entsprechend einer Mehrzahl von biologischen Objekten, ausgewählt und eine zeitliche Abfolge zum Erstellen von jeweils einer Mehrzahl von Aufnahmen an jeder der Mehrzahl von Orten festgelegt, wobei zumindest zwischen zwei Aufnahmen an einem ersten Ort der Mehrzahl von Orten eine Aufnahme an einem zweiten Ort der Mehrzahl von Orten liegt. Die biologische Masse wird dann entsprechend der zeitlichen Abfolge relativ zu Bildaufnahmemitteln wie einer CCD-Kamera positioniert, um entsprechend der zeitlichen Abfolge mit den Bildaufnahmemitteln Aufnahmen der biologischen Masse an der Mehrzahl von Orten anzufertigen.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erstellen von Aufnahmeserien von biologischen Objekten insbesondere mit Hilfe eines Mikroskopaufbaus sowie auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion, welche insbesondere zur Verwaltung von bei der Laser-Mikrodissektion anfallenden Daten biologischer Objekte, oder von mit dem Verfahren zum Erstellen von Aufnahmeserien gewonnen Bilddaten ausgestaltet sind.

Die vorliegende Erfindung kann dabei im Zusammenhang mit Laser-Mikrodissektionssystemen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise aus der WO 97/29355 A oder WO 01/73398 A oder WO 03/036266 A der Anmelderin bekannt ist.

Mit den in diesen Druckschriften beschriebenen Laser-Mikrodissektionssystemen können einzelne oder mehrere biologische Objekte, welche auf einem planaren Träger angeordnet sind, rechnergestützt selektiert und mit einem Laserstrahl bearbeitet werden. Dabei kann insbesondere ein ausgewähltes Objekt von einer umgebenden Masse beispielsweise mit Hilfe des Laserstrahls rechnergestützt abgetrennt werden und dann durch einen laserinduziertes Transportvorgang mit einem gezielten Laserimpuls von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung katapultiert werden. Insbesondere ist es mit einer derartigen Vorrichtung auch möglich, aus einer auf dem Träger angeordneten biologischen Masse eine Vielzahl von biologischen Objekten rechnergestützt in eine Vielzahl von Aufnahmebehältern, beispielsweise in Behälter einer Mikrotiterplatte, zu katapultieren.

Bei derartigen Laser-Mikrodissektionssystemen wird der Laser im Allgemeinen über ein Mikroskopobjektiv auf den Träger fokussiert. Über dieses Mikroskopobjektiv ist gleichzeitig – durch Einsatz entsprechender Strahlteiler – eine visuelle Kontrolle der biologischen Objekte möglich, wobei auch eine Kamera, insbesondere eine CCD-Kamera (Charge Coupled Device) zum Einsatz kommen kann, um die visuellen Daten an einen Computer zu übertragen. Des Weiteren kann eine um zwei oder drei Achsen bewegliche Einheit vorgesehen sein. An dieser Einheit angebracht oder auch separat kann ein Mikromanipulator vorgesehen sein, mit welchem beispielsweise Flüssigkeiten in eine auf dem Träger befindliche biologische Masse an verschiedenen Orten injiziert werden kann.

Nach Injektion dieser Flüssigkeit können an verschiedenen Orten der biologischen Masse verschiedene Reaktionen auftreten. Zur Dokumentation wäre es nun wünschenswert, diesen Reaktionsverlauf, welcher vor dem Ausschneiden und Katapultieren der entsprechenden Proben, aber auch danach stattfinden kann, entsprechend zu dokumentieren.

Dementsprechend ist es eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erstellen von Aufnahmeserien von biologischen Objekten bereitzustellen, wobei insbesondere eine einfache Realisierung innerhalb bestehender Mikroskopanordnungen wie beispielsweise Laser-Mikrodissektionssystemen möglich sein soll.

Wie bereits erläutert können aus der biologischen Masse eine Vielzahl von biologischen Objekten ausgeschnitten werden und zu verschiedenen Auffangbehältern katapultiert oder auf andere Weise transportiert werden. In den Auffangbehältern können die biologischen Objekte dann auf verschiedene Weise weiterverarbeitet oder untersucht werden. Dies kann an anderen Orten außerhalb des Laser-Mikrodissektionsystems erfolgen. Dementsprechend ist es nötig, dass die erstellten Aufnahmeserien weiterhin den jeweiligen biologischen Objekten zugeordnet werden können und dann diese und auch andere Daten betreffend den Laser-Mikrodissektionsvorgang, beispielsweise Positionen der verschiedenen biologischen Objekte innerhalb der ursprünglichen biologischen Masse, an andere Orte übertragen und dort ausgewertet werden können.

Es ist daher eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion zu schaffen, wobei anfallende Daten biologischer Objekte effizient verwaltet werden und insbesondere eine einfache Übertragbarkeit der Daten und eine Weiterverarbeitung der Daten an verschiedenen Orten möglich ist.

Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 bzw. ein Verfahren gemäß Anspruch 11 sowie durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 16 bzw. eine Vorrichtung gemäß Anspruch 17. Die abhängigen Ansprüche definieren jeweils vorteilhafte oder bevorzugte Ausführungsbeispiele

Zur Lösung der ersten Aufgabe wird ein Verfahren zum Erstellen von Aufnahmeserien von biologischen Objekten bereitgestellt, wobei eine Mehrzahl von Orten der biologischen Objekte ausgewählt wird, wobei rechnergestützt eine zeitliche Abfolge zum Erstellen von jeweils einer Mehrzahl von Aufnahmen an jeder der Mehrzahl von Orten festgelegt wird, wobei zumindest zwischen zwei Aufnahmen an einem ersten Ort eine Aufnahme an einem zweiten Ort liegt, und wobei automatisch eine Relativbewegung zwischen den biologischen Objekten und den Bildaufnahmemitteln entsprechend der zeitlichen Abfolge durchgeführt wird, um entsprechend der zeitlichen Abfolge mit den Bildaufnahmemitteln Aufnahmen der biologischen Masse an der Mehrzahl von Orten anzufertigen. Unter einer Mehrzahl von Orten sind dabei im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung mindestens zwei Orte zu verstehen.

Durch ein derartiges Verfahren können also Aufnahmeserien mehrer biologischer Objekte, welche sich an einer Mehrzahl von Orten befinden, angefertigt werden. Diesbezüglich ist zu beachten, dass die biologischen Objekte in diesem Zusammenhang auch eine zusammenhängende Masse bilden können. Es kann sich aber beispielsweise auch um eine Mehrzahl von in verschiedenen Aufnahmeeinheiten wie Behältern einer Mikrotiterplatte befindlichen biologischen Objekten oder um einzelne Zellen handeln.

Das Verfahren wird bevorzugt in einem Mikroskopsystem durchgeführt, wobei die biologischen Objekte auf einem Träger angeordnet sein können, welcher zur Positionierung der biologischen Objekte relativ zu den Bildaufnahmemitteln relativ zu einem mit den Bildaufnahmemitteln gekoppelten Mikroskopobjektiv positioniert wird. Die Bildaufnahmemittel können dabei insbesondere eine CCD-Kamera umfassen.

Die angefertigten Aufnahmen können dann entsprechend der Mehrzahl von Orten gruppiert werden, so dass an einem Ort angefertigte Aufnahmen eine Aufnahmeserie bilden. Diese Aufnahmeserie kann insbesondere in einer schnellen Abfolge abgespielt werden, so dass sich eine Zeitrafferaufnahme ergibt.

Die Mehrzahl von Orten kann dabei aus einer Liste von Orten bzw. biologischen Objekten ausgewählt werden, welche für eine Laserbehandlung in einer Laser-Mikrodissektionsvorrichtung vorgesehen sind. Dabei können insbesondere Zeitdauern bzw. Zeitintervalle zwischen einzelnen Aufnahmen vorgegeben werden.

Zur Lösung der zweiten Aufgabe wird ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion bereitgestellt, wobei mit einem Laserstrahl biologische Objekte aus einer biologischen Masse ausgeschnitten werden, wobei eine erste Datenstruktur bereitgestellt wird, wobei in einer ersten Gruppe von Datensätzen der ersten Datenstruktur ein Datensatz gespeichert wird, welcher eine Quelle der biologischen Masse bezeichnet, wobei die erste Datenstruktur weitere Gruppen von Datensätzen umfasst, wobei die Datensätze der weiteren Gruppen jeweils einem Datensatz der ersten Gruppe zugeordnet sind, wobei in den weiteren Gruppen von Datensätzen bei der Laser-Mikrodissektion Kenndaten von aus der biologischen Masse gewonnen biolo gischen Objekten und/oder an den biologischen Objekten durchgeführte Arbeitsvorgänge gespeichert werden, wobei jedem Datensatz der ersten Gruppe jeweils eine zweite Datenstruktur zugeordnet ist, wobei in der zweiten Datenstruktur weitere Daten bezüglich der aus der jeweiligen biologischen Masse gewonnen biologischen Objekte und/oder der an den jeweiligen biologischen Objekten durchgeführten Arbeitsvorgänge gespeichert werden, wobei die weiteren Daten einen höheren Speicherbedarf aufweisen als in der ersten Datenstruktur gespeicherten Daten. Die zweite Datenstruktur kann entweder ebenfalls in dem Speichermedium oder in einem weiteren Speichermedium gespeichert werden. Das Speichermedium und/oder das weitere Speichermedium können sowohl ein Speicher in einer Datenverarbeitungsanlage als auch ein mobiler Speicher wie beispielsweise eine CD-ROM oder eine DVD-ROM sein.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine Datenstruktur geschaffen, mit welcher auf einfache Weise eine Zuordnung verschiedener Objektdaten wie beispielsweise Aufnahmen zu bestimmten biologischen Objekten vorgenommen werden kann. Die gespeicherten Datensätze und die jeweiligen Datenstrukturen können auf einfache Weise an andere Vorrichtungen, beispielsweise Datenverarbeitungsvorrichtungen, übertragen werden, so dass die Informationen auch an anderen Orten zur Verfügung stehen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
1 ein zum Erstellen von Aufnahmenserien von biologischen Objekten und zum Speichern bzw. Verwalten von Daten biologischer Objekte ausgestaltetes Laser-Mikrodissektionssystem,
2 ein Flussdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Erstellen von Aufnahmeserien von biologischen Objekten,
3 einen Träger mit biologischen Objekten,
4 Listen, welche in dem in 2 dargestellten Verfahren Verwendung finden,
5 eine schematische Darstellung des Ablaufs des erfindungsgemäßen Verfahrens bezüglich der biologischen Objekte aus 3, und
6 eine bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Laser-Mikrodissektion erstellte Datenstruktur.
In 1 ist ein Laser-Mikrodissektionssystem dargestellt, welches auf den bereits in der Beschreibungseinleitung beschriebenen Systemen beruht und zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ausgestaltet ist. Dabei zeigt das in 1 dargestellte Laser-Mikrodissektionssystem eine Laservorrichtung 4, in der eine Laserlichtquelle, insbesondere ein Ultraviolettlaser, zur Erzeugung eines Laserstrahls untergebracht ist. Des Weiteren ist in der Laservorrichtung 4 eine Optik 6 untergebracht, die erforderlich ist, um den Laserstrahl in ein Mikroskop 1 einzukoppeln und den Laserfokus in der Objektebene auf den optischen Fokus des Mikroskops 1 abzustimmen. Bei dem Laser kann es sich beispielsweise um einen gepulsten UV-Stickstofflaser mit einer Wellenlänge von 337 nm, einer Impulsenergie von 270 μJ, einer Impulsdauer von 3 ms und einer Impulsfrequenz von 1-30 Impulsen pro Sekunde handeln.
Der Laserstrahl wird über mehrere beschichtete Strahlteiler in das Mikroskop 1 eingekoppelt und zu einem Objektiv 12 hin abgelenkt. Der über das Objektiv 12 emittierte Laserstrahl trifft schließlich auf einen motorisierten und durch einen Computer 7 gesteuerten Mikroskop- oder Trägertisch 3, auf welchem ein Träger mit einer zu bearbeitenden biologischen Masse angeordnet ist. Unter biologischer Masse wird dabei jedwede Art von biologischem Material, beispielsweise Zellkulturen, Gewebeschnitte oder ähnliches, verstanden. Der motorisierte Trägertisch 3 ist dabei entlang zweier linearer Achsen verfahrbar.
Durch das Mikroskop 1 kann ebenfalls über das Mikroskopobjektiv 12 die biologische Masse auf dem Träger beobachtet werden. Bei dem Mikroskop 1 kann es sich dabei um ein beliebig ausgestaltetes Mikroskop handeln, wobei insbesondere sowohl die Verwendung eines inversen als auch eines aufrechten Mikroskops denkbar ist, wobei es sich bei dem in 1 dargestellten Mikroskop um ein inverses Mikroskop handelt, bei welchem das Objektiv unterhalb des Trägers angeordnet ist. Eine Lichtquelle 11 dient dabei zur Beleuchtung der biologischen Masse.
Das Mikroskop 1 ist dabei mit einer Kamera, insbesondere einer CCD-Kamera 5 („Charge Coupled Device") ausgestattet, mit welchem Aufnahmen der auf dem Träger 3 befindlichen biologischen Masse im Bereich oberhalb des Objektivs 12 angefertigt werden können. Ein Videosignal der Kamera wird dabei dem Computer 7, welcher ein handelsüblicher Büro- bzw. Heimcomputer („Personal Computer") sein kann, zugeführt und dort verarbeitet, so dass das entsprechende aufgenommene Bild in Echtzeit auf einem Bildschirm 8 des Computers dar gestellt werden kann. Zudem ist ein Speichern einzelner Bilder auf einem Speichermedium des Computers 7 möglich. Der Computer 7 verfügt weiterhin über eine Tastatur 9, eine Maus 10 und Speicherlaufwerke 13 wie beispielsweise eine Festplatte, einen CD- oder DVD-Brenner oder ein Diskettenlaufwerk.
Oberhalb des Trägertisches 3 befindet sich eine um zwei oder drei Achsen bewegliche oder anders einstellbare Einheit 2, welche vorzugsweise wie der Trägertisch 3 motorisiert und computergesteuert ist. An der motorisierten Einheit 2 kann beispielsweise eine Nadel oder Mikropipette zur Mikroinjektion angebracht sein, um an über den Computer 7 vorgegebenen Stellen der auf dem Träger befindlichen biologischen Masse eine Flüssigkeit zu injizieren. Zudem ist eine Auffangvorrichtung vorgesehen, um durch den Laser aus der biologischen Masse herausgeschnittenen und von dem Träger nach oben katapultierte biologische Objekte aufzufangen. Insbesondere kann die Auffangvorrichtung verschiedene Aufnahmeeinheiten bzw. Behälter beispielsweise in Form einer Mikrotiterplatte umfassen, wobei in jeden Behälter ein Objekt katapultiert wird. Bezüglich der Einzelheiten des Katapultvorgangs sei auf die eingangs zitierten Druckschriften verwiesen. Die Auffangvorrichtung ist ähnlich wie die Einheit 2 verstellbar ausgestaltet und in 1 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht separat dargestellt. Sie kann aber prinzipiell auch mit dem Element 2 gekoppelt sein.
Der Fokus des Objektivs 12 kann dabei auch auf die Ebene der Auffangvorrichtung eingestellt werden, um in der Auffangvorrichtung befindliche Objekte durch das Mikroskop zu betrachten oder Bildaufnahmen von ihnen anzufertigen.
Mit dieser Vorrichtung ist es also beispielsweise möglich, an verschiedenen Orten der biologischen Masse eine Flüssigkeit zu injizieren, an diesen Orten dann mit Hilfe des Lasers biologische Objekte auszuschneiden und diese Objekte in separate Aufnahmeeinheiten zu katapultieren, um sie dann weiter untersuchen zu können.
Diese Injektion von Flüssigkeit kann dabei nicht nur mittels einer Nadel, welche beispielsweise mit einem Mikromanipulator gekoppelt ist, vorgenommen werden, sondern auch durch einen Laserpuls initiiert werden, wobei in diesem Fall ein eine Zelle umgebendes Medium in die Zelle fließt.
Durch die Injektion der Flüssigkeit können insbesondere Veränderungen an entsprechenden Stellen der biologischen Masse hervorgerufen werden. Dabei kann es wünschenswert sein, diese Veränderungen über einen gewissen Zeitraum zu dokumentieren, bevor oder nachdem die bereits erwähnten biologischen Objekte aus der biologischen Masse ausgeschnitten werden. Nachfolgend wird hierzu unter Bezugnahmen auf 2-5 ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erstellung derartiger Aufnahmeserien beschrieben.
Dabei ist vorausstehend zu bemerken, dass dieses Verfahren nicht nur bei Mikrodissektionssystemen wie dem in 1 dargestellten angewendet werden kann, sondern allgemein bei Systemen, bei welchen Beobachtung verschiedener biologischer Objekte bzw. einer biologischen Masse an verschiedenen Orten über einen längeren Zeitraum vorgenommen werden soll. Ein Beispiel hierfür ist eine laserinduzierte Verschmelzung von Zellen. Zudem wäre das Verfahren auch bei einem Mikroskopaufbau wie in 1, welcher nicht über einen Laser verfügt, anwendbar.
2 zeigt dabei ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In Schritt 14 wird das Verfahren gestartet. In Schritt 15 wird dann eine Konfiguration der Aufnahmen festgelegt, d. h. insbesondere festgelegt, an welchen Orten der biologischen Masse bzw. der ausgeschnittenen biologischen Objekte über welchen Zeitraum in welchen Zeitabständen Bildaufnahmen vorgenommen werden sollen.
Diese Konfiguration soll nun anhand der 3 und 4 näher erläutert werden. In 3 sind zwei Einzelträger 20 und 21 dargestellt, welche jeweils vier biologische Objekte A-D bzw. E-H aufweisen. Dies können beispielsweise biologische Objekte sein, welche mit einem Laser wie bereits beschrieben aus einer biologischen Masse ausgeschnitten wurden und in welche eine Flüssigkeit injiziert wurde. Anstelle von zwei Einzelträgern 20, 21 kann auch ein einzelner Träger vorgesehen sein, welcher dann beispielsweise mit dem Träger 3 des Mikroskopaufbaus identisch ist bzw. auf diesem platziert wird. Die Einzelträger 20, 21 können auch nebeneinander auf dem Träger 3 platziert sein oder durch ein automatisches Wechselsystem je nach Bedarf ausgewechselt werden.
Ebenso ist es möglich, dass die Einzelträger 20, 21 jeweils Platten mit mehreren Vertiefungen sind, in welche die biologischen Objekte A-H beispielsweise durch das bereits beschriebene Katapultieren eingebracht wurden.
Im Folgenden wird beispielhaft angenommen, dass von den biologischen Objekten A-F Bildaufnahmen erstellt werden sollen, während die biologischen Objekte G und H nicht von Inte resse sind bzw. – im Falle einer Auffangvorrichtung – G und H Aufnahmeeinheiten bezeichnen, in welchen sich kein biologisches Objekt befindet.
Zum Erstellen der Bildaufnahmen wird nun wie in 4 dargestellt eine Liste 22 erstellt, welche die gewünschten biologischen Objekte A-F umfasst. Die Liste 22 kann zur Erstellung der Bildaufnahmen von Grund auf erstellt werden. Es ist jedoch auch möglich, eine Liste heranzuziehen, welche beispielsweise zur Steuerung einer Laser-Mikrodissektion verwendet wurde und dabei alle auszuschneidenden biologischen Objekte umfasst. Die Liste 22 kann dabei auch mehr biologischen Objekte umfassen, als bei den Bildaufnahmen berücksichtigt werden sollen. In einer Liste 23 wird dann vorgegeben, in welcher Reihenfolge von den biologischen Objekten A-F Bildaufnahmen angefertigt werden sollen und wie lange ein jeweiliges biologisches Objekt aufgenommen werden soll, wobei entweder eine kontinuierliche Bildaufnahme, also ein Video, oder Bildaufnahmen in bestimmten vorgebbaren Zeitabständen gemacht werden. Die in 23 dargestellte Liste sagt also aus, dass zunächst in einer Zeit tA Bildaufnahmen des biologischen Objekts A gefertigt werden sollen, dann in einer Zeit tC Bildaufnahmen des biologischen Objekt C gefertigt werden sollen usw., bis schließlich in einer Zeit tF Bildaufnahmen des biologischen Objekts F gefertigt werden sollen. Vom Ende der Liste kann automatisch wieder an den Anfang gesprungen werden, wobei eine Anzahl von Wiederholungen vorgebbar ist.
Ebenso ist es möglich, vorzugeben, dass beispielsweise während der Zeit tA nur eine Bildaufnahme des biologischen Objekts A gefertigt werden soll. Gegebenenfalls kann auch ein Zeitabstand zwischen einzelnen Durchläufen der Liste vorgegeben werden, beispielsweise für den Fall langsamer Prozesse, so dass die Liste z. B. nur stündlich abgearbeitet wird.
Des Weiteren ist es natürlich auch möglich, statt einer Anzahl von Wiederholungen der in 23 dargestellten Liste die Liste 23 entsprechend einer Anzahl von gewünschten Wiederholungen zu verlängern.
In Schritt 16 von 2 wird dann der eigentliche Aufnahmeprozess gestartet. Hierzu werden die biologischen Objekte – im Falle der Anordnung von 1 durch ein computergesteuertes Verfahren des Trägers 3 bzw. des Manipulators 2 bei feststehenden Mikroskopobjektiv 12 – entsprechend der Liste 23 nacheinander angefahren. In Schritt 17 werden dann je nach Einstellung eine oder mehrere Bildaufnahmen von dem jeweiligen biologischen Objekt gefertigt.
In Schritt 18 wird überprüft, ob weitere Elemente in der Liste 23 vorhanden sind bzw. ob weitere Wiederholungen der Liste 23 anstehen. Falls ja, wird das nächste biologische Objekt entsprechend der Liste 23 angefahren und wiederum in Schritt 17 die nächste(n) Bildaufnahme(n) angefertigt. Fall nein, wird das Verfahren in Schritt 19 beendet.
In 5 ist diese Abarbeitung der Liste 23 zur Veranschaulichung nochmals dargestellt. Die Ansicht von 5 entspricht dabei im Wesentlichen der Ansicht von 3, wobei nun Pfeile das Verfahren der Einzelträger 20, 21 relativ zu dem Mikroskopobjektiv, d. h. das Verfahren des Trägers 3 oder des Manipulators 2, kennzeichnen. Wie in 5 durch die Pfeile dargestellt, wird zunächst das biologische Objekt A aufgenommen, dann das biologische Objekt C, dann das biologische Objekt B usw., bis schließlich das biologische Objekt F aufgenommen wird. Nach dem biologischen Objekt F wird wiederum das biologische Objekt A aufgenommen. Die Aufnahmezeiten entsprechen dabei jeweils den Zeiten von 23.
Die aufgenommenen Bilder werden von dem Computer 7 aus 1 verarbeitet und derart sortiert, dass die zu einem einzelnen biologischen Objekt gehörigen Bildaufnahmen gruppiert werden. Diese können dann beispielsweise in Form einer Zeitrafferaufnahme schnell abgespielt werden.
Die vorliegende Erfindung macht sich hier also zu Nutze, dass bei langsamen Prozessen in biologischen Objekten mehrere biologische Objekte abwechselnd angefahren werden können, um Aufnahmeserien mehrerer biologischer Objekte gleichsam parallel zu erstellen.
Selbstverständlich sind hier insbesondere in Bezug auf die in 4 dargestellte Konfiguration der Bildaufnahmen viele Abwandlungen denkbar. Beispielsweise wäre es auch möglich, die Vorrichtung aus 1 so auszugestalten, dass für jedes biologische Objekt vorgegeben werden kann, in welchen Zeitabständen es aufgenommen werden kann. Der Computer 7 würde dann mit an sich bekannten Optimierungsverfahren einen optimalen Weg (entsprechend den Pfeilen in 5) berechnen, um die entsprechenden Aufnahmenabstände sicherzustellen, bzw. den Benutzer warnen, falls dies aufgrund der Verfahrgeschwindigkeit des Trägers 3 bzw. des Manipulators 2 nicht möglich sein sollte. Zu beachten ist auch, dass die Aufnahmereihenfolge der biologischen Objekte nicht konstant bleiben muss bzw. es denkbar ist, dass ein Teil der biologischen Objekte öfter aufgenommen wird als ein anderer Teil, beispielsweise wenn in ersteren biologischen Objekten schnellere Prozesse ablaufen und daher eine häufigere Bildaufnahme nötig ist.
Bei einem derartigen Verfahren fallen eine Vielzahl von Bilddaten der biologischen Objekte an, wobei sichergestellt werden muss, dass die Bilddaten eindeutig den verschiedenen biologischen Objekten zugeordnet werden können. Zudem ist es auch wünschenswert, weiter Daten bezüglich der biologischen Objekte zu dokumentieren, beispielsweise eine Herkunft der biologischen Objekte, zur Verarbeitung verwendete Materialien, Protokolle, welche das Ausschneiden und Katapultieren der biologischen Objekte in einer Laser-Mikrodissektionsvorrichtung beschreiben usw. Hierzu sind in 6 geeignete Datenstrukturen gezeigt, welche erfindungsgemäß während des Betriebs des Laser-Mikrodissektionssystems teilweise vollautomatisch, teilweise auf Basis von Benutzervorgaben erstellt wird.
Die Datenstrukturen umfassen dabei eine erste Datenstruktur 24 und eine Mehrzahl von zweiten Datenstrukturen 25, wobei die zweiten Datenstrukturen 25 mit Elementen der ersten Datenstruktur 24 verknüpft sind bzw. auf diese verweisen. Die Datenstruktur 24 ist zumindest teilweise hierarchisch gegliedert. In einer Tabelle 26, welche gleichsam eine oberste Hierarchiestufe darstellt, sind verschieden Quellen von biologischen Proben aufgelistet. Jede Quelle ist dabei mit einer eindeutigen Quellenidentifikation (Source ID) gekennzeichnet. Derartige Quellen können beispielsweise eine Probe von einem Patienten, eine Zellkultur oder sonstige Gewebeproben sein.
Die Quellenidentifikation stellt dabei einen so genannten „Primary Key" dar, welche die jeweilige Quelle eindeutig in der Tabelle 26 kennzeichnet. Zu jeder Quellenidentifikation können, symbolisiert durch ein Feld 27, verschiedene Informationen aufgenommen sein. Dies kann ein Index sein, welcher auf eine eindeutige Identifikation beispielsweise in einer Patientendatenbank verweist, um so eine Verknüpfung zwischen der Quelle und einem entsprechenden Datensatz in der Patientendatenbank herstellen zu können, falls es sich bei der Quelle um einen Patienten handelt. Weiterhin kann eine Art der Quelle, eine frei eingebbare Beschreibung der Quelle sowie Informationen, welche angeben, ob die Quelle in einer separaten Datenstruktur archiviert werden soll, enthalten sein.
Für jede derartige Quelle wird eine separate zweite Datenstruktur 25 angelegt, in welcher, wie weiter unten näher erläutert, speicherintensive Daten wie beispielsweise mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzeugte Bilddaten abgelegt werden.
Aus jeder in der Tabelle 26 enthaltenen Quelle können – beispielsweise durch die bereits beschriebene Laser-Mikrodissektion mit der in 1 gezeigten Vorrichtung – mehrere Proben bzw. biologische Objekte gewonnen werden, welche in einer Tabelle 28 gespeichert sind. Dabei erhält jede Probe eine Probenidentifikation (Specimen ID), welche wiederum als Primary Key dient. Wiederum werden, wie durch ein Feld 29 symbolisiert, zu jeder Probenidentifikation verschiedene Daten abgespeichert. Diese Daten können beispielsweise eine Identifikationsnummer eines Halters, in welcher sieh die Probe befindet, mit einem eindeutigen Index bezeichnen. Weist dieser Halter Aufnahmeeinheiten für mehrere Proben auf, wie es beispielsweise bei einer Mikrotiterplatte der Fall ist, wird zusätzlich eine Halterunteridentifikation angegeben, welche die jeweilige Aufnahmeeinheit identifiziert. Die Art des Halters kann ebenfalls in dem jeweiligen Feld 29 abgelegt sein.
Zusätzlich ist es möglich, für jede Probenidentifikation weitere Daten einzugeben, beispielsweise eine verwendete Färbung oder Fixierung oder eine ausführlichere Beschreibung der Probe. Zudem erhält jedes einer Probenidentifikation zugeordnete Feld 29, also jeder Datensatz, einen Zeiger, welcher als so genannter „Foreign Key" die Identifikation der jeweiligen Quelle aus Tabelle 26, aus welcher die Probe hervorgegangen ist, angibt. Dabei können aus einer Quelle mehrere Proben gewonnen werden, es können also mehrere Datensätze, welche durch verschiedene Probenidentifikationen gekennzeichnet sind, dieselbe Quellenidentifikation umfassen.
Mit jeder Probe verschiedene Experimente durchgeführt werden, wobei Experiment hier im weitesten Sinne jede Handlung oder jeden Arbeitsvorgang beschreiben kann, welche an der Probe vorgenommen wird. Beispielsweise kann das Ausschneiden der jeweiligen Probe aus der Quelle mit Hilfe eines Laserstrahls ein derartiges Experiment sein.
Jedes Experiment ist mit einer eindeutigen Experimentidentifikation gekennzeichnet, welche wiederum als Primary Key dient. In einem entsprechenden Feld bzw. Datensatz 31 können zu jedem Experiment entsprechende Daten wie beispielsweise ein Experimentator, eine Beschreibung des Experiments, ein Datum des Experiments, eine Aufteilung der Probe in verschieden Element bzw. Objekte durch Laser-Mikrodissektionsvorgänge und ähnliches aufgenommen werden. Zudem enthält jeder Datensatz eine Probenidentifikation als „Foreign Key", wobei diese Probenidentifikation diejenige Probe in Tabelle 28 kennzeichnet, an welcher die Experimente durchgeführt wurden. Wie bereits beschrieben, können im Rahmen eines Experiments aus einer Probe auch – gegebenenfalls sukzessive – mehrere biologische Objekte, welche weitere Proben darstellen, mittels Laser-Mikrodissektion gewonnen werden. Daten dieser Laser-Mikrodissektion sind in einer Tabelle 34 gespeichert. Da bei einer derartigen Laser-Mikrodissektion verschiedene Proben in einer Auffangvorrichtung mit einem oder mehreren Auffangbehältern bzw. Aufnahmeelementen gesammelt werden, kann die Identifikation, mit welcher ein entsprechender Datensatz der Tabelle 34 als Primary Key bezeichnet wird, als „Sammelidentifikation" bezeichnet werden. In einem jeder Sammelidentifikation zugeordneten Feld bzw. Datensatz 35 werden – ähnlich wie in der Tabelle 28 – eine Halteridentifikation eines als Auffangvorrichtung verwendet Halters sowie gegebenenfalls eine Halterunteridentifikation, der Haltertyp sowie eine Beschreibung als auch ein Datum des Vorgangs gespeichert. Zudem können weiter Daten des Laser-Mikrodissektionssystems, beispielsweise eine Laserenergie, ein Laserfokus etc. insbesondere automatisch gespeichert werden. Schließlich enthält jeder Datensatz 35 eine Experimentidentifikation als Foreign Key, welche den jeweiligen Datensatz eindeutig einem Experiment aus Tabelle 30 zuweist.
Mögliche Experimente sind beispielsweise auch das Verschmelzen von mehreren Zellen initiiert durch einen Laserschuss, wovon mit dem Verfahren aus 2 entsprechende Aufnahmeserien erstellt werden können.
Bei derartigen Laser-Mikrodissektionsvorgängen, aber auch bei anderen Experimenten, können beispielsweise mit dem unter Bezugnahmen auf 2-5 beschriebenen Verfahren Aufnahmen, also Bilder, angefertigt werden. In einer Tabelle 32 werden Informationen bezüglich dieser Bilder gespeichert, was wiederum zumindest teilweise automatisch bei den Aufnahmen vorgenommen werden kann. Jeder Datensatz bzw. jedes Feld der Tabelle 32 enthält als Primary Key eine Bildidentifikation, welche das entsprechende Bild eindeutig kennzeichnet. Als weitere Daten kann der jeweilige Datensatz eine Größe des Bildes, Daten betreffend das Mikroskopsystem bei der Aufnahme, wie beispielsweise eine Vergrößerung, die Koordinaten auf dem jeweiligen Träger bzw. Einzelträger (vergleiche 3 und 5), an welchen das Bild aufgenommen wurde, sowie eine Beschreibung des Bildes enthalten. Jeder Datensatz enthält weiterhin einen Foreign Key, welcher einer Experimentidentifikation entspricht, um ein Experiment zu kennzeichnen, bei welchem das Bild aufgenommen wurde, und gegebenenfalls eine entsprechende Sammelidentifikation, welche einen entsprechenden Datensatz der Tabelle 34 kennzeichnet, welcher wiederum einen Dissektionsvorgang beschreibt, bei welchem das Bild aufgenommen wurde. Die Tabelle 32 enthält jedoch keine Bilddaten.
Die Bilddateien selbst sowie andere speicherintensive Daten sind dabei für jede Quelle aus Tabelle 26 in den bereits erwähnten zweiten Datenstrukturen 25 separat gespeichert. Dies hat insbesondere den Vorteil, dass bei großen Datenmengen diese Datenstrukturen auch auf Wechseldatenträgern wie beispielsweise DVD-ROMs abgelegt werden können, wo sie bei Bedarf zur Verfügung stehen, während die zum Suchen von bestimmten Informationen nötigen Daten in der ersten Datenstruktur 24 abgelegt sind. Jede zweite Datenstruktur 25 enthält dabei zunächst eine Tabelle 36, welche binäre Daten der Bilder aus Tabelle 32 enthält. Hier zu umfasst jeder Datensatz 37 der Tabelle 36 eine Bildidentifikation, welche mit der entsprechenden Bildidentifikation der Tabelle 32 übereinstimmt und somit sowohl als Primary Key als auch als Foreign Key dient. Weiterhin umfasst jeder Datensatz die binären Daten des entsprechenden Bildes. Des Weiteren umfasst die zweite Datenstruktur 25 eine Elementtabelle oder Elementliste 38, welche im Wesentlichen der Liste 22 aus 4 entspricht. Hier sind verschiedene in einer Probe ausgewählte biologische Objekte mit ihren Koordinaten und Größen abgelegt, wobei jedes Element mit einer Elementidentifikation als Primary Key gekennzeichnet ist. Zu jedem Element kann auch ein Bild („Thumbnail") abgespeichert sein. In jedem Datensatz verweist eine Experimentidentifikation als Foreign Key auf das entsprechende Experiment aus Tabelle 30. Da bei entsprechend umfangreichen Mikrodissektionsvorgängen die Elementliste 38 entsprechend lang sein kann, kann auch hier ein großer Speicherbedarf nötig sein. Schließlich umfasst die zweite Datenstruktur 25 eine Protokolltabelle 40, welche eine Verknüpfung der Elementliste 38 mit der Sammeltabelle 34 herstellt. Jeder Datensatz der Protokolltabelle 40 enthält zwei Foreign Keys, von welchen einer eine Elementidentifikation aus der Elementliste 38 und der andere eine Sammelidentifikation aus der Sammeltabelle 34 ist. Somit wird jedes Element der Elementliste 38 eindeutig einem Halter aus der Sammelliste 34 zugeordnet.
Selbstverständlich kann die in 6 gezeigte Datenstruktur noch erweitert werden, um bei Bedarf andere Daten aufzunehmen.
Die Datenstruktur wird größtenteils automatisch oder mittels Benutzereingaben (beispielsweise für Beschreibungen) durch das Mikrodissektionssystem aus 1, insbesondere durch den Computer 7, erstellt. Die Datenstruktur kann dann auch komplett auf Wechseldatenträger wie beispielsweise eine CD-ROM oder DVD-ROM geschrieben werden oder mittels eines Netzwerkes, beispielsweise des Internets, an andere Computer übertragen werden. Auf anderen Computern kann dann ein entsprechendes Computerprogramm bereitgestellt werden, mit welchem die Datenstruktur aus 6 nach bestimmten Datensätzen durchsucht werden kann und die entsprechenden Daten angezeigt werden können. Es können hier dann auch weitere Beschreibungen eingegeben werden. Die Daten können in verschiedenen Masken abhängig von der Art der Daten (Text- oder Bilddaten) angezeigt werden. Bei Bildern ist es möglich, einen Maßstab einzublenden. Zudem können eine Reihe von mit dem Verfahren aus 2 erstellten Aufnahmen als Film, insbesondere als Zeitrafferfilm, abgespielt werden. Auch können die Daten als Grundlage für weitere Experimente, beispielsweise für weitere Laser-Mikrodissektionsvorgänge, verwendet werden.
Mittels des Computerprogramms können auch Informationen aus der Datenstruktur von 6 exportiert werden oder Informationen in die Datenstruktur importiert werden sowie ausgedruckt werden.
Das unter Bezugnahme auf 6 beschriebene Verfahren zum Speichern und Verwalten von Daten in einer entsprechenden Datenstruktur lässt sich selbstverständlich auch unabhängig von dem Verfahren aus 2 anwenden.

Claims

Verfahren zum Erstellen von Bildaufnahmen von biologischen Objekten, wobei eine Mehrzahl von biologischen Objekten bereitgestellt wird, wobei eine Mehrzahl von Orten (A-F) der biologischen Objekte ausgewählt wird, wobei rechnergestützt eine zeitliche Abfolge (23) zum Erstellen von jeweils einer Mehrzahl von Bildaufnahmen an jeder der Mehrzahl von Orten festgelegt wird, wobei zumindest zwischen zwei Bildaufnahmen an einem ersten Ort eine Bildaufnahme an einem zweiten Ort liegt, und wobei rechnergestützt entsprechend der zeitlichen Abfolge automatisch eine Relativbewegung zwischen den biologischen Objekten und Bildaufnahmemitteln (5) durchgeführt wird und entsprechend der zeitlichen Abfolge mit den Bildaufnahmemitteln Bildaufnahmen der biologischen Masse an der Mehrzahl von Orten angefertigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Objekte in einem Mikroskopsystem (1) bereitgestellt werden, und dass die Bildaufnahmemittel (5) mit einem Mikroskopobjektiv (12) zur Aufnahme der biologischen Masse gekoppelt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mehrzahl von Orten aus einer vorgegebenen Liste (22) von Orten ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Liste (22) eine Liste von Orten für eine Laserbehandlung der biologischen Objekte und/oder für eine Manipulation der biologischen Objekte mit einer Injektionsnadel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Objekte durch eine Laser-Mikrodissektion aus einer biologischen Masse gewonnen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Festlegung der zeitlichen Abfolge jedem der Mehrzahl von Orten eine Aufnahmezeit (tA, ..., tF) zugewiesen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Festlegung der zeitlichen Abfolge für jeden der Mehrzahl von Orten festgelegt wird, in welchem zeitlichen Abstand Bildaufnahmen des jeweiligen Ortes anzufertigen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Festlegung der zeitlichen Abfolge eine Gesamtdauer und/oder eine Gesamtanzahl von Bildaufnahmen festgelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Objekte eine zusammenhängende biologische Masse bilden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mehrzahl von Bildaufnahmen getrennt nach Orten zur Aufnahmeserien gruppiert werden.
Verfahren zur Laser-Mikrodissektion von biologischen Objekten, wobei mit einem Laserstrahl biologische Objekte aus einer biologischen Masse ausgeschnitten werden, wobei eine erste Datenstruktur bereitgestellt wird, wobei in einer ersten Gruppe von Datensätzen der ersten Datenstruktur ein Datensatz gespeichert wird, welcher eine Quelle der biologischen Masse bezeichnet, wobei die erste Datenstruktur weitere Gruppen von Datensätzen umfasst, wobei die Datensätze der weiteren Gruppen jeweils einem Datensatz der ersten Gruppe zugeordnet sind, wobei in den weiteren Gruppen von Datensätzen bei der Laser-Mikrodissektion Kenndaten von aus der biologischen Masse gewonnen biologischen Objekten und/oder an den biologischen Objekten durchgeführte Arbeitsgänge gespeichert werden, wobei jedem Datensatz der ersten Gruppe jeweils eine zweite Datenstruktur (25) zugeordnet ist, wobei in der zweiten Datenstruktur weitere Daten bezüglich der aus der jeweiligen biolo gischen Masse gewonnenen biologischen Objekten und/oder der an den jeweiligen biologischen Objekten durchgeführten Arbeitsvorgängen gespeichert werden, wobei die weiteren Daten einen höheren Speicherbedarf aufweisen als in der ersten Datenstruktur gespeicherte Daten.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Daten Bilddateien, Listen von bei der Laser-Mikrodissektion zu bearbeitenden Orten der biologischen Masse und/oder Protokolle der Laser-Mikrodissektion umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilddateien durch Bildaufnahmen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10 erstellt werden und automatisch in der entsprechenden zweiten Datenstruktur gespeichert werden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Liste von zu bearbeitenden Orten (22) als Liste mit der vorgegebenen Anzahl von Orten für das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11-14, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Gruppen eine Gruppe von Datensätzen, welche aus der jeweiligen Quelle gewonnene biologische Objekte beschreiben, eine Gruppe von Datensätzen, welche an den aus der jeweiligen Quelle gewonnenen biologische Objekte durchgeführte Arbeitsvorgänge beschreiben, eine Gruppe von Datensätzen, welche Versuchsparameter bezüglich der Arbeitsvorgänge beschreiben, und/oder eine Gruppe von Datensätzen, welche Informationen bezüglich von den Proben aufgenommener Bildaufnahmen enthalten, umfassen.
Vorrichtung zum Erstellen von Bildaufnahmen von biologischen Objekten, mit Bildaufnahmemitteln (5) zum Erstellen von Bildaufnahmen eines biologischen Objekts, mit Trägermitteln (2, 3) zum Aufnehmen der biologischen Objekte, mit Positionierungsmitteln zum relativen Positionieren der Bildaufnahmemittel (5) zu durch die Trägermittel (2, 3) aufgenommenen biologischen Objekte, mit Auswahlmitteln (7) zum Auswählen einer Mehrzahl von Orten der biologischen Objekte und zum Festlegen einer zeitlichen Abfolge zum Erstellen von jeweils einer Mehrzahl von Bildaufnahmen an jeder der Mehrzahl von Orten derart, dass zumindest zwei Bildaufnahmen an einem ersten Ort der eine Bildaufnahme an einem zweiten Ort liegt, und mit Steuermitteln, welche derart ausgestaltet sind, dass sie die Positionierungsmittel und die Bildaufnahmemittel (5) entsprechend der zeitlichen Abfolge ansteuern, so dass die Bildaufnahmemittel (5) entsprechend der zeitlichen Abfolge Aufnahmen der biologischen Masse an der Mehrzahl von Orten anfertigen.
Vorrichtung zum Bearbeiten einer biologischen Masse mittels Laser-Mikrodissektion, mit einem Laser-Mikrodissektionssystem (1-13) zur Gewinnung von biologischen Objekten aus der biologischen Masse mit Archivierungsmitteln (7) zum Archivieren von Daten der aus der biologischen Masse gewonnenen biologischen Objekte, wobei die Archivierungsmittel derart ausgestaltet sind, dass sie in einem Speichermedium eine erste Datenstruktur speichern, wobei die erste Datenstruktur eine erste Gruppe von Datensätzen umfasst, wobei jeder Datensatz der ersten Gruppe von Datensätzen eine Quelle einer biologischen Masse bezeichnet, wobei die erste Datenstruktur weitere Gruppen von Datensätzen umfassen, wobei die Datensätze der weiteren Gruppen jeweils einem Datensatz der ersten Gruppe zugeordnet sind und aus der jeweiligen Quelle gewonnene biologische Objekte und/oder an aus der jeweiligen Quelle gewonnen biologische Objekte durchgeführte Arbeitsvorgänge kennzeichnet, und dass sie bei der Laser-Mikrodissektion gewonnenen Daten in den weiteren Gruppen automatisch speichert, wobei jedem Datensatz der ersten Gruppe jeweils eine zweite Datenstruktur (25) zugeordnet ist, wobei in der zweiten Datenstruktur weitere Daten bezüglich der aus der jeweiligen Quelle gewonnenen biologischen Objekte und/oder der an den jeweiligen Quelle gewonnenen biologische Objekte durchgeführten Arbeitsvorgängen gespeichert werden, wobei die weiteren Daten einen höheren Speicherbedarf als Daten der ersten Datenstruktur aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Mikroskop (1) zur Visualisierung der biologischen Masse umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-15 ausgestaltet ist.