CN113916624A - 一种组织切割收集装置及收集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织切割收集装置及收集方法,属于光电成像技术领域。组织切割收集装置包括激光器、切割系统、载体台和收集器。其中,激光器,用于提供脉冲激光;载体台,用于放置组织切片;切割系统,用于将激光聚焦成一光斑,光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区和组织切片的分割和目标微区的弹起;收集器位于目标微区上方,收集器带有静电,用于在静电场作用下吸附弹起的目标微区。在激光边缘弹射结合静电吸附的作用下实现收集,既避免了对目标微区额外的热损伤和直接的静电损伤,又实现了收集和切割的同步,提高了收集效率。
Description
技术领域
本发明涉及光电成像技术领域,特别涉及一种组织切割收集装置及收集方法。
背景技术
组织是构成生物体的基本成分,是由很多不同细胞组成的复杂空间结构。在生命科学研究中,为了研究特异性组织和细胞的功能,就需要将它们从周围复杂组织和细胞中分离出来。然而,无论是动物还是植物,它们的组织一般都非常微小,常规分离非常困难,同时很难避免周围其他成分的污染。因此,对于微小组织区域甚至单细胞分离方法提出了高精度、无污染等需求。
激光显微捕获切割是近几年发展起来的新兴技术,能在显微镜下观察特异性组织和细胞,利用微激光束收集到纯净细胞群或单一细胞,成功地解决了细胞异质性问题,有助于提取含空间定位信息的RNA、DNA或蛋白质用于下游分析。
目前,一般采用粘附性硅胶管盖收集组织的方法,该方法的缺点是在粘附过程中硅胶管盖会和除了目标微区以外的组织切片接触,存在周围组织污染的风险。
发明内容
为了无污染的快速收集切割下来的目标微区,本发明实施例提供了一种组织切割收集装置及方法。所述技术方案如下:
一方面,本发明实施例提供了一种组织切割收集装置。具体包括:
激光器,用于提供脉冲激光;
载体台,用于放置组织切片;
切割系统,用于将所述激光聚焦成一光斑,所述光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区和所述组织切片的分割和所述目标微区的弹起;以及,
位于所述目标微区上方的收集器,所述收集器带有静电,用于利用静电效应收集弹起的所述目标微区。
可选地,所述组织切割收集装置还包括:
静电发生器,用于产生静电;
与所述静电发生器相连的静电发生头,用于对所述收集器均匀施加静电。
可选地,所述收集器的中心点与所述目标微区的切割完成点之间的横向距离不超过50μm。
可选地,所述收集器的下表面与所述组织切片的上表面之间的高度差在200-1200μm之间。
可选地,所述激光器为紫外脉冲激光器。
可选地,所述载体台上设置有组织切片载体,所述组织切片载体上表面附着一层透明薄膜,所述透明薄膜对紫外光的吸收率大于所述组织切片对紫外光的吸收率,所述组织切片置于所述组织切片载体的所述透明薄膜上。
可选地,所述收集器为多个阵列排布的收集器。
另一方面,本发明实施例还提供了一种组织切割收集方法,所述方法包括:
S1、使所述收集器带有静电;
S2、调整收集器到目标微区的上方;
S3、提供一脉冲激光,将所述脉冲激光聚焦成一光斑,所述光斑的能量达到切割阈值,实现所述目标微区和组织切片的分割以及所述目标微区的弹起;
S4、所述目标微区被静电吸附到带静电的所述收集器中。
可选地,实现所述目标微区的弹起包括:
当所述目标微区的厚度不大于20μm,所述目标微区的直径在5~120μm之间时,通过所述目标微区和组织切片完全分离的瞬间的激光冲击波弹射所述目标微区;
当所述目标微区的厚度不大于20μm,所述目标微区的直径在120~200μm之间时,在所述目标微区和组织切片完全分离后,光斑移动到目标微区的中心区域,利用激光冲击波弹射所述目标微区。
可选地,当所述收集器为多个阵列排布的收集器时,所述方法还包括在完成步骤S4之后,调整空余的收集器的位置到下一个目标微区的上方,重复步骤S3-S4,直至没有空余收集器。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果至少包括:
1、本发明的组织切割收集方法,利用激光对组织切割过程中产生的冲击波,结合带电收集器的静电场,在切割完成的瞬间便能完成对目标微区的捕获,大大提高了收集速度。
2、本发明所述的组织切割收集方法,在整个收集过程中,没有对组织产生任何额外的机械和热损伤,仅需要对收集器施加静电,操作简单,并且在整个过程中能持续带电,收集效果稳定。
3、本发明所述的组织切割收集方法,整个过程收集器和组织切片处于非接触状态,大大降低了污染风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种组织切割收集装置的结构示意图;
图2a是本发明所述的组织切割收集装置在收集器无静电情况下的目标微区的弹射示意图;
图2b是本发明所述的组织切割收集装置在收集器有静电情况下的目标微区的弹射示意图;
图3是本发明所述的组织切割收集装置中收集器在不同高度位置的目标微区的弹射示意图;
图4是本发明所述的组织切割收集方法的流程图;
图5是图1的实施例对应的组织切割收集方法的流程图;
图6是本发明的组织切割收集装置切割收集大尺寸目标微区的实施例示意图;
图7是本发明所述的组织切割收集装置一种实施例示意图;
图8是图7的实施例对应的组织切割收集方法的流程图。
附图标记:
激光器101、第一透镜102、第二透镜103、反射镜104、聚焦物镜105、切片载体106、透明薄膜107、组织切片108、目标微区109、收集器110、静电发生头111、静电发生器112、八连管收集器113、大尺寸目标微区114
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
图1是本发明实施例提供的一种组织切割收集装置的结构示意图。如图1所示,本申请的组织切割收集装置包括激光器101、切割系统、载体台和收集器110。其中,激光器101,用于提供脉冲激光;载体台,用于放置组织切片108;切割系统,用于将激光聚焦成一光斑,光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区109和组织切片108的分割和目标微区109的弹起;收集器110位于目标微区109上方,收集器110带有静电,用于在静电场作用下吸附弹起的目标微区109。
激光诱导光学击穿过程会伴随自由电子动能的产生并以瞬态声波形式向周围传播。因此,目标微区109被切下的瞬间会在冲击波作用下被弹射至组织切片108上方,靠近带静电的收集器110。在静电场作用下,目标微区109被吸附到收集器110上,最终实现目标微区109收集。采用上述方案可以看到在激光边缘弹射结合静电吸附的作用下实现收集,既避免了对目标微区109额外的热损伤和直接的静电损伤,又实现了收集和切割的同步,提高了收集效率。
以下结合图2a和图2b阐述本发明组织切割收集装置的收集原理和收集过程。图2a是本发明的组织切割收集装置在收集器110无静电情况下的目标微区109的弹射示意图。如图2a所示,在收集器110无静电情况下的目标微区109的弹射示意图,目标微区109被切下的瞬间,激光束会对目标微区109作用点位置产生冲击波作用,目标微区109边缘受力,克服重力被弹射形成一个类似抛物线型运动轨迹,最终掉落至组织切片108其他位置,无法实现收集。
图2b是本发明的组织切割收集装置在收集器110有静电情况下的目标微区109的弹射示意图。如图2b所示,带静电的收集器110水平固定在组织切片108上方,目标微区109被切下的瞬间在冲击波作用下被弹射发生斜抛运动,上升到最高点靠近带静电的收集器110,最终在静电场作用下被吸附至收集器110。
在一些实施例中,切割系统包括扩束镜和聚焦物镜105,激光经扩束镜扩束成平行光,充满聚焦物镜105的后瞳面,激光经过聚焦物镜105聚焦成光斑。示例性地,如图1所示,扩束镜包括可以包括第一透镜102、第二透镜103和反射镜104。
激光器101发出的脉冲光经过第一透镜102、第二透镜103扩束成平行光并充满聚焦物镜105的后瞳面,经物镜聚焦成直径在0.5μm以内的光斑,入射到样本面,能量达到组织的切割阈值,实现目标微区109的切割。
可选地,激光器101为紫外脉冲激光器。因其短波长的特点实现更小的聚焦光斑,在脉冲能量不变的情况下,达到更高的能量密度,同时实现更精细切割。
可选地,第一透镜102、第二透镜103为高纯度熔融石英材料,且镀有紫外增透膜,以保证高的透射率,减少能量损失。
可选地,激光器101也可以是皮秒脉冲激光器。皮秒脉冲相比纳秒脉冲,存在非线性吸收,在更小的脉冲能量下能够在短距离内产生较强的冲击波压力,从而在实现切割的同时,产生的冲击波足以使目标微区109在被分离的最后一点发生边缘弹射。
优选地,根据聚焦光斑大小、切割速度以及样本切片厚度综合考虑,皮秒激光的脉冲能量范围为50~500nJ,重复频率的范围为10Hz~5kHz,以保证目标微区109能够被完整切割并收集,并且不会对组织周围产生损伤。
在一些实施例中,载体台上设置有切片载体106,切片载体106上表面附着一层透明薄膜107,透明薄膜107对紫外光的吸收率大于组织切片108对紫外光的吸收率,组织切片108置于切片载体106的透明薄膜107上。由于透明薄膜107对紫外光的吸收率大于组织切片108对紫外光的吸收率,透明薄膜107的切割阈值低于组织切片108,透明薄膜107会容易被一起切下,从而使得组织切片108与切片载体106(例如载玻片)能够更好的分离,减少目标微区109弹起时的阻力。
可选地,透明薄膜107的材料为聚萘二甲酸乙二醇酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯,透明薄膜107的厚度为1~8μm,优选为1.2μm。
载体台还包括控制位移部件,可以实现载体台的曲线运动,从而实现任意形状的目标微区109的切割,结合静电吸附的方式实现完整收集。实现时,可以先对组织切片108进行成像,确定目标微区109的边缘位置,以便设定切割轨迹。
可选地,组织切片108的厚度在1-80μm均可以实现完整切割收集。以组织切片108的厚度20μm为例,目标微区109的直径在5-200μm之间均可以实现完整切割收集
在一些实施例中,组织切割收集装置还包括静电发生器112、与静电发生器112相连的静电发生头111。其中,静电发生器112用于产生静电;静电发生头111用于对收集器110均匀施加静电。
在实现时,组织切割收集装置还可以包括固定装置,固定装置用于将收集器110固定在静不大于4cm,以便静电发生头111可以为收集器110提供足够的静电力。
可选地,静电发生头111的静电量优化参数范围为0.2~1.5kV,使得目标微区109能够被稳定收集在收集器110电发生头111与载体台之间。优选地,收集器110与静电发生头111的最小距离上,并且能够连续收集。
在一些实施例中,收集器110为PCR管盖,表面平整且透光性较好,便于收集和成像,并且能够与后续的RNA、蛋白质组学测试相兼容。如图2所示,收集器110的中心点与所述目标微区的切割完成点的之间的横向距离L不超过50μm,以便收集器110能够顺利收集到目标微区。这里的切割完成点也是目标微区和组织切片分离,在冲击波作用下被弹射的位置。在实现时,载物台会移动使得目标微区的切割起始点位于视场中心,固定装置的位移台移动使收集器110的中心点位于视场中心。
优选地,为配合后续RNA、蛋白质测序,可以在PCR管盖的中心点滴加裂解液。为了使得裂解液和目标微区109能够更好的接触,目标微区109在收集器110中的吸附位置与收集器110的中心的横向距离不超过500μm。
通过调节收集器110下表面与组织切片108上表面之间的高度差H,能够更好地控制目标微区109弹射吸附在收集器110上的位置,使得系统的自由度更高。
图3是本发明的组织切割收集装置中收集器110在不同高度位置的目标微区109的弹射示意图。图3a为收集器110的下表面与组织切片108的上表面的高度差大于1200μm的弹射吸附收集示意图,当两者距离过大,收集率会下降,存在目标微区109被弹射至超出收集器110范围的情况。当本发明收集器110的下表面和组织切片108的上表面的高度差控制在合理范围内如200-1200μm之间,则目标微区109能被稳定收集在收集器110上,如图3b所示。而在该范围内随着高度差的减小,目标微区109会被收集到收集器110上更靠近中心的位置,如图3c所示。
本申请还公开了一种组织切割收集方法,该方法适用于前述的组织切割收集装置,参见图4,该方法包括:
步骤S1、使收集器带有静电。
步骤S2、调整收集器到目标微区的上方。
步骤S3、提供一脉冲激光,将所述脉冲激光聚焦成一光斑,光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区和组织切片的分割以及目标微区的弹起。
步骤S4、目标微区被静电吸附到带静电的收集器中。
激光诱导光学击穿过程会伴随自由电子动能的产生并以瞬态声波形式向周围传播。因此,目标微区被切下的瞬间会在冲击波作用下被弹射至组织切片上方,靠近带静电的收集器,在静电场作用下,目标微区被吸附到收集器上,最终实现目标微区收集。采用上述方案可以看到在激光边缘弹射结合静电吸附的作用下实现收集,既避免了对目标微区额外的热损伤和直接的静电损伤,又实现了收集和切割的同步,提高了收集效率。
下面以图1的装置为例,结合图5介绍本申请的组织切割收集方法,具体可以包括:
步骤S110、使所述收集器110带有静电。
具体地,设定静电发生器112的电压值,通过静电发生头111对收集器110均匀施加静电。
步骤S120、调整收集器110到目标微区109的上方。
具体地,将收集器110固定到固定装置上,调整位置到目标微区109的上方,并调整其高度保证收集器110与组织切片108高度差在合理范围。
步骤S130、提供一脉冲激光,将所述脉冲激光聚焦成一光斑,光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区109和组织切片108的分割和目标微区109的弹起。具体可以包括:
步骤S131:设定激光参数。
根据组织切片108的厚度和大小,设定合适的激光能量、激光重复频率以及切割速度。
步骤S132:组织切片108成像。
针对不同类型组织切片108进行成像。示例性地,染色组织切片108通过明场成像,荧光标记的组织切片108通过荧光成像。
步骤S133、确定目标区域。
通过步骤S132组织切片108成像确定目标微区109的边缘,并设定切割轨迹。
步骤S134、切割完成、弹射目标微区109。
控制载体台按设定轨迹完成切割,切割下的目标微区109被弹射起。
当目标微区109的厚度不大于20μm,目标微区109的直径在5~120μm之间时,实现目标微区109的弹起,可以是在目标微区109和组织切片108完全分离的瞬间,目标微区109被激光产生冲击波弹射到空中。
图6是本发明的组织切割收集装置切割收集大尺寸目标微区的实施例示意图。如图6所示,当目标微区109的厚度不大于20μm,目标微区109的直径在120~200μm之间时,为大尺寸目标微区适合这种方法。图6a展示的是对于大尺寸目标微区114在切割完成之后的弹射示意图,由于大尺寸目标微区114的面积和重力都变大,聚焦激光束在大尺寸目标微区114边缘产生的冲击波不足以使其弹射,也无法到达上方收集器110所产生的静电场范围内。而图6b展示的是在目标微区109和组织切片108完全分离后,光斑移动到大尺寸目标微区114的中心区域使其受力均匀,利用激光冲击波弹射大尺寸目标微区114到空中。
步骤S140、目标微区被静电吸附到带静电的收集器110中。
如图6c所示,在静电作用下,目标微区109被静电吸附到带静电的收集器110中。
普通目标微区可以是单个的细胞,大尺寸目标微区可以是细胞群,本发明的组织切割收集装置和收集方法对于不同尺寸目标微区的收集有更高的兼容性。
在实现时,在步骤S140之后,还可以包括:
S150:通过收集器110成像判定收集效果。
具体地,通过明场或荧光成像方式判定目标微区109是否被完整收集在收集器110上,并确定目标微区109在收集器110表面的具体位置。
图7是本发明的组织切割收集装置一种实施例示意图。如图7所示,由于收集器静电维持时间远大于切割和吸附一个目标微区的时间,因此,收集器可以为多个阵列排布的收集器,以提高收集效率。例如M×N(1≤M≤10,1≤N≤10,M、N为正整数)纵横阵列的收集器或者蜂窝状排列的收集器。
当所述收集器为多个阵列排布的收集器时,所述方法还包括在完成步骤S4之后,实施步骤S5、调整空余的收集器的位置到下一个目标微区的上方,重复步骤S3-S4,直至没有空余收集器。
示例性地,图7中为标准的八连管收集器,以便和离心机通用,配合后续RNA、蛋白质测序。
图8是图7的实施例对应的组织切割收集方法的流程图,组织切割收集方法包括:
步骤S210、使收集器带有静电。
步骤S210同前述步骤S110,这里不再赘述。
步骤S220、调整第一个收集器到目标微区的上方。
具体地,将八连管收集器113装到固定装置上,调整位置使八连管收集器113的第一个管盖位于目标微区的上方,并调整其高度保证收集器与组织切片高度差在合理范围。
步骤S230、提供一脉冲激光,将所述脉冲激光聚焦成一光斑,光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区和组织切片的分割以及目标微区的弹起。
步骤S230同前述步骤S130,这里不再赘述。
步骤S240、目标微区被静电吸附到带静电的第一个收集器中。
具体地,被弹起的目标微区在上方静电场的作用下被吸附至八连管收集器113的第一个管盖中。
步骤S250:调整空余的收集器的位置,将多余的收集器移动到下一个目标微区的上方,重复步骤S230-S240,直至没有空余收集器。
实现时,在完成第一个目标微区的切割后,载物台会移动使得下一个目标微区的切割起始点位于视场中心。随后,当管盖完成第一个目标微区收集后,可以通过固定装置的位移台控制移动,将下一个空余的收集器对准视场中心,以便使收集器位于下一个目标微区的上方。
在本实施例中,可以先确定八连管收集器113的管盖序号N是否小于等于8,如果是,则横向移动八连管收集器113至紧邻的下一个管盖位于下一个目标微区的上方。
重复步骤S230-S240,直至八连管收集器113的八个管盖均完成目标微区109的收集。
在实现时,在步骤S250之后,还可以包括:
S260:通过收集器成像判定收集效果。
具体地,通过明场或荧光成像方式判定目标微区109是否被完整收集在收集器113上,并确定目标微区109在收集器113不同管盖表面的具体位置。
以上仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种组织切割收集装置,其特征在于,所述组织切割收集装置包括:
激光器(101),用于提供脉冲激光;
载体台,用于放置组织切片(108);
切割系统,用于将所述激光聚焦成一光斑,所述光斑的能量达到切割阈值,实现目标微区(109)和所述组织切片(108)的分割和所述目标微区(109)的弹起;以及,
位于所述目标微区(109)上方的收集器(110),所述收集器(110)带有静电,用于利用静电效应收集弹起的所述目标微区(109)。
2.根据权利要求1所述的切割收集装置,其特征在于,所述组织切割收集装置还包括:
静电发生器(112),用于产生静电;
与所述静电发生器(112)相连的静电发生头(111),用于对所述收集器(110)均匀施加静电。
3.根据权利要求1所述的切割收集装置,其特征在于,所述收集器(110)的中心点与所述目标微区(109)切割完成点之间的横向距离不超过50μm。
4.根据权利要求3所述的切割收集装置,其特征在于,所述收集器(110)的下表面与所述组织切片(108)的上表面之间的高度差在200-1200μm之间。
5.根据权利要求1~3任一项所述的切割收集装置,其特征在于,所述激光器(101)为紫外脉冲激光器。
6.根据权利要求5所述的切割收集装置,其特征在于,所述载体台上设置有切片载体(106),所述切片载体(106)上表面附着一层透明薄膜(107),所述透明薄膜(107)对紫外光的吸收率大于所述组织切片(108)对紫外光的吸收率,所述组织切片(108)置于所述切片载体(106)的所述透明薄膜(107)上。
7.根据权利要求6所述的切割收集装置,其特征在于,所述收集器(110)为多个阵列排布的收集器。
8.一种组织切割收集方法,应用于所述权利要求1的组织切割收集装置,其特征在于,所述组织切割收集方法包括:
S1、使所述收集器带有静电;
S2、调整收集器到目标微区的上方;
S3、提供一脉冲激光,将所述脉冲激光聚焦成一光斑,所述光斑的能量达到切割阈值,实现所述目标微区和组织切片的分割以及所述目标微区的弹起;
S4、所述目标微区被静电吸附到带静电的所述收集器中。
9.根据权利要求8所述的组织切割收集方法,其特征在于,实现所述目标微区的弹起包括:
当所述目标微区的厚度不大于20μm,所述目标微区的直径在5~120μm之间时,通过所述目标微区和组织切片完全分离的瞬间的激光冲击波弹射所述目标微区;
当所述目标微区的厚度不大于20μm,所述目标微区的直径在120~200μm之间时,在所述目标微区和组织切片完全分离后,光斑移动到目标微区的中心区域,利用激光冲击波弹射所述目标微区。
10.根据权利要求8所述的组织切割收集方法,其特征在于,当所述收集器为多个阵列排布的收集器时,所述方法还包括在完成步骤S4之后,调整空余的收集器的位置到下一个目标微区的上方,重复步骤S3-S4,直至没有空余收集器。
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