CN1865432A - 激光显微切割后细胞收集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种激光显微切割后细胞收集方法，先将带电荷的薄膜平铺在显微镜载玻片上；再将待分离的组织切片放置在载玻片的薄膜上；并将带与薄膜异性电荷的收集材料放置在组织切片的前方；然后，利用激光显微切割系统产生的激光束切割待分离的细胞和其附着的薄膜；最后，切割下带有细胞的薄膜受载玻片上带同种电荷的薄膜排斥而远离载玻片的薄膜侧，并受带异种电荷的收集材料吸引而吸附至收集材料上，完成收集过程。此操作方便简单，并可为后续分析提供均一的细胞标本。

Description

激光显微切割后细胞收集方法
技术领域
本发明涉及一种激光显微切割后细胞收集方法。
背景技术
在生命科学研究领域，需要对组织中某一特定的细胞群体进行基因和蛋白质的研究，可从多样性的组织中分离出形态单一的细胞群体，从而避免实验标本中其他细胞群的污染，使基因和蛋白的分析更加准确特异。较早出现的显微切割技术是用手工或在显微操作仪器的引导下，采用玻璃微针或其他工具对所需要的细胞群体进行机械分离，但该方法操作难度较大，效率较低，精确度较差，对实验者的实验技能要求较高，同时经过机械分离的生物样品被分离后生物活性较低。1996年，开始出现用激光束作为切割手段对所需要的细胞群体进行精细分离。从此，激光显微切割仪器作为一种新型有效的分离切割工具在生物医学领域得到迅速运用和推广。
成熟的激光显微切割仪器应具有切割效果好，收集效率高和对后续基因蛋白检测影响小的特征。其中，不同的收集技术是各种激光显微切割系统的核心技术。到目前为止，基于激光显微切割发展起来的细胞分离技术可分为激光捕获显微切割技术(LCM)，激光弹射技术(LPC)，膜粘黏技术和激光切割后重力收集技术。激光捕获切割技术是采用激光束作用热融塑料薄膜，薄膜受热后体积膨胀，包绕所分离的组织周围并和该组织粘黏，薄膜分离时，将与其粘黏的目标组织从组织切片上分离。该方法的主要缺点是利用热融塑料薄膜粘黏力将组织机械地分离，对组织有一定的损伤；同时精确度较低，会将分离组织周围的非目标组织一同分离。激光弹射技术采用激光束直接切割目标组织，利用激光束产生的冲力将切割后的组织克服重力向上方弹射入收集管中。该方法的主要缺点是激光束的弹射作用对生物组织活性有一定程度的损伤。膜粘黏技术是激光将组织切割后，用某种特制的材料将组织切片上的切割组织进行粘黏而分离。该方法所用的特制材料制成的收集管造价较高。激光切割后重力收集技术是采用正置显微镜下切割，切割后的组织因重力作用自动降落到正下方的收集管中。该方法因采用正置显微镜而在应用方面有一定的限制，如无法对培养的活细胞进行显微切割。
发明内容
本发明的目的在于提供一种激光显微切割后细胞收集方法，其操作方便简单，并可为后续分析提供均一的细胞标本。
本发明的解决方案是：先将带电荷的薄膜平铺在显微镜载玻片上；再将待分离的组织切片放置在载玻片的薄膜上；并将带与薄膜异性电荷的收集材料放置在组织切片的前方；然后，利用激光显微切割系统产生的激光束切割待分离的细胞和其附着的薄膜；最后，切割下带有细胞的薄膜受载玻片上带同种电荷的薄膜排斥而远离载玻片的薄膜侧，并受带异种电荷的收集材料吸引而吸附至收集材料上，完成收集过程。
其中：为了更好地固定薄膜，可将上述薄膜用粘连剂平铺在显微镜载玻片上，粘连剂可选用为紫外线固化胶。
上述薄膜选用带负电荷的聚酰亚胺薄膜，收集材料选用带正电荷的琼脂糖凝胶。
上述聚酰亚胺薄膜厚度控制在4um±0.1um，能很好地穿透激光能量，而不影响激光切割效果。
上述琼脂糖收集材料为1.0-1.5％琼脂糖的磷酸缓冲盐溶液在室温下放置形成的凝胶。
采用上述方法后，本发明借助薄膜使组织切片与载玻片不直接接触，切割后的组织容易与载玻片分离，且薄膜带电荷，被切割下的带有目标组织的薄膜被静电排斥，而收集材料携带异性电荷，与带荷的薄膜配套使用，利用静电吸附原理，恰可收集切割后的带有细胞的薄膜，操作方便简单；薄膜的存在对切割前组织切片的制备和切割后DNA、RNA和蛋白质生物学检测无不良影响，且收集材料对切割细胞后进行的DNA、RNA和蛋白质研究无不良影响，由此，利用该技术能够准确和有效地从组织中筛选和分离出所需要的细胞，为后续的DNA、RNA和蛋白质等分子生物学研究分析提供均一的细胞标本。
附图说明
图1为本发明所采用的激光显微切割系统外观图；
图2A显示薄膜借紫外固化胶粘连在显微镜载玻片上，组织切片放置在薄膜载玻片上；
图2B显示盛有带正电荷琼脂糖凝胶的离心管管盖倒扣在组织切片的正上方；
图2C显示激光束切割后的组织和薄膜被正上方的琼脂糖凝胶吸附；
图2D显示离心管管盖与相应的离心管管体扣紧，晃动管内液体，切割后的组织进入液体中；
图3A为带薄膜的载玻片外观图；
图3B为组织切片放置在带薄膜的载玻片之薄膜侧的外观图；
图4A显示在离心管盖中的琼脂糖凝胶材料外观图；
图4B显示装有琼脂糖凝胶的离心管管盖放置在收集支架上的外观图；
图5A显示第一次切割后，第二次切割前的镜下图；
图5B显示第二次切割过程中；(20X)
图5C显示第二次切割后细胞因静电排斥从薄膜载玻片上飞起。(20X)
图5D显示吸附在琼脂糖凝胶表面的切割后细胞。(20X)
具体实施方式
如图1所示，本发明所使用的激光显微切割系统主要包括倒置显微镜1、激光发生器2、机动载物台3、三轴控制杆4、中央控制器5和电脑6组成。
本发明具体实施过程是：
第一步，配合图3A所示，采用带负电荷的聚酰亚胺薄膜10(薄膜也可以选用其它可与后述收集材料带异性电荷而配套使用的材料)，聚酰亚胺薄膜10厚度控制在4um±0.1um，能很好地穿透激光能量，而不影响激光切割效果。该薄膜10裁剪成比显微镜载玻片8(经无水乙醇处理过的洁净和干燥的载玻片)略小的矩形形状，如图2A所示，该薄膜10的四周用紫外线固化胶14粘黏在载玻片8上(紫外固化胶为一种经紫外光线照射后转变成粘连剂，并对组织或细胞的基因和蛋白分析没有影响的医用胶)，薄膜10中央和载玻片8接触的部分未用固化胶14粘连(这样做是为了使切割后的组织薄膜能够从载玻片8上顺利分离开；如果薄膜10中央也用固化胶14和载玻片8粘连，则即使激光将组织薄膜切割开，组织薄膜复合体因被粘连也无法被静电排斥，即不能被分离回收)，该带有薄膜10的载玻片8(如图3A)制成后在紫外灯照射15秒种后，放置在干净环境中待用。
第二步，如图2A、3B所示，将制备的组织切片12(石蜡切片和冰冻切片)直接放置在第一步制成的载玻片8上薄膜10的中央，进行常规的组织切片处理，直至染色。
第三步，将第二步制成的组织薄膜切片放置在倒置显微镜1的载物台3上，激光束透过下方的物镜，穿过载玻片8，可以对薄膜10和组织进行切割。
第四步，如图2B所示，在切割组织切处12的正上方放置带正电荷的琼脂糖凝胶材料18(收集材料也可以选用其它可与前述薄膜带异性电荷而配套使用的材料)，琼脂糖凝胶材料18存在于离心管管盖16中(如图4A所示)，离心管管盖16放置在收集支架7上(如图4B所示)，收集支架7可手工操作或机械操作。琼脂糖凝胶材料18不与薄膜8和组织切片12直接接触，相隔几百微米的距离。琼脂糖凝胶材料18的制备为1.0％琼脂糖的磷酸缓冲盐溶液滴加在离心管管盖16中凝固形成的固体凝胶，琼脂糖凝胶材料18的浓度以可形成固体凝胶为准，凝胶高度略低于离心管管盖16的边缘，制备好后，用保鲜膜包裹，放置于4℃冰箱中过夜并保存。
第五步，利用激光显微切割系统产生的激光束切割待分离的细胞20和其附着的薄膜10，配合图5A、5B。切割后的细胞20和薄膜10被带同样负电荷的薄膜10排斥(如图5C所示)，并被正上方的带正电荷的琼脂糖凝胶材料18吸引，最终被吸附到琼脂糖凝胶材料18表面而回收到离心管管盖16中(如图2C、5D所示)。
第六步，观察离心管管盖16表面粘连的切割后细胞20，观察收集效果，达到所要求的细胞20数目时，可终止切割。相同类型的细胞20可收集在同一个离心管管盖16中，不同类型细胞20可收集到不同离心管管盖16中。
第七步，从收集支架7上小心的取出离心管管盖16，与相对应的离心管管体24扣紧，如图2D所示，晃动离心管管体24中预先加入的液体22，粘连在离心管管盖16琼脂糖凝胶材料18表面的细胞20就进入到液体22中，等待后续的生物学检测。

Claims (6)

1、激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：
先将带电荷的薄膜平铺在显微镜载玻片上；
再将待分离的组织切片放置在载玻片的薄膜上；
并将带与薄膜异性电荷的收集材料放置在组织切片的前方；
然后，利用激光显微切割系统产生的激光束切割待分离的细胞和其附着的薄膜；
最后，切割下带有细胞的薄膜受载玻片上带同种电荷的薄膜排斥而远离载玻片的薄膜侧，并受带异种电荷的收集材料吸引而吸附至收集材料上，完成收集过程。
2、如权利要求1所述激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：薄膜用粘连剂平铺在显微镜载玻片上。
3、如权利要求1所述激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：薄膜为带负电荷的聚酰亚胺薄膜，收集材料为带正电荷的琼脂糖凝胶。
4、如权利要求3所述激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：聚酰亚胺薄膜厚度为4um±0.1um。
5、如权利要求3所述激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：琼脂糖收集材料为1.0-1.5％琼脂糖的磷酸缓冲盐溶液在室温下放置形成的凝胶。
6、如权利要求2所述激光显微切割后细胞收集方法，其特征在于：粘连剂为紫外线固化胶。
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