TW202208615A - 乾癬及其他自體免疫疾病抗原免疫調節劑（aim）治療性平台 - Google Patents

乾癬及其他自體免疫疾病抗原免疫調節劑（aim）治療性平台 Download PDF

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泰漢摩 歐爾本
賈拉赫吉 海曼
納拉 多布尼
皮爾斯 多布尼
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英商法姆製藥有限責任公司
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Abstract

本發明提供自患有自體免疫病症的受試者製備免疫細胞樣品的方法，前述方法包含：自前述受試者獲得組織樣品；及使用雷射擷取顯微解剖自前述組織樣品原位分離單一免疫細胞。

Description

乾癬及其他自體免疫疾病抗原免疫調節劑（AIM）治療性平台
[相關申請案之交互參照]
本申請案主張2020年6月26日申請的美國臨時申請案第63/044,586號的優先權權益。前述申請案的全部內容係以引用方式併入本文。
自體免疫疾病係全球性問題。例如，乾癬係主要影響皮膚及常常影響關節的慢性自體免疫疾病；全世界流行率估計為2-3%，亦即，約1億2千5百萬人。此外，乾癬的發生率正在增加：在1970年至1974年間，在回溯性成年人同齡群中，乾癬的發生率為每10萬人約50.8例，且在1995年至1999年間，發生率為約每10萬人約100.5例。不管其流行率，自體侵襲性免疫細胞之鑑別及用於鑑別及/或治療乾癬的推定目標自身抗原有待發現。
提供自患有乾癬的受試者製備免疫細胞樣品的方法，該方法包含：獲得乾癬組織樣品；及使用雷射擷取顯微解剖（laser capture microdissection）自乾癬組織樣品原位分離單一免疫細胞。提供自患有乾癬的受試者製備免疫細胞樣品的方法，該方法包含：獲得乾癬組織樣品；及使用實質上不改變免疫細胞之細胞生物化學概況（cellular biochemical profile）的技術自乾癬組織樣品原位分離單一免疫細胞。經分離的單一免疫細胞可為未操縱的單一免疫細胞。該技術可包含以下一或多種：雷射擷取顯微解剖（例如，免疫引導雷射擷取顯微解剖）、顯微操作、真空脈衝輔助技術、免疫磁性細胞分離、密度梯度離心、沉降、黏著、適配體、浮力活化細胞分選、螢光活化細胞分選（fluorescence-activated cell sorting；FACS）、及微流體。
在一些態樣中，乾癬組織樣品為約5 μm至約15 μm厚。在一些態樣中，乾癬組織樣品係藉由自乾癬病灶水平地切割生檢試樣來獲得。在一些態樣中，乾癬組織樣品係藉由在微摻合機中將自乾癬病灶獲得的生檢試樣摻合來獲得。
一些態樣包含：（a）壓縮乾癬組織樣品，及（b）將經壓縮的樣品塗抹在載玻片上。在一些態樣中，壓縮係利用平坦的圓形固體玻璃頭來執行。
在一些態樣中，乾癬組織樣品係藉由垂直地切割自乾癬病灶獲得的生檢試樣來獲得。
一些態樣包含：（a）凍結乾癬組織樣品及（b）切斷凍結的樣品。在一些態樣中，凍結包含將試樣敷設在乾冰上。在一些態樣中，凍結係利用液態氮蒸汽或異戊烷。
一些態樣包含在切斷組織樣品之前將該樣品嵌入在嵌埋基底中。在一些態樣中，嵌入係在凍結樣品之前執行。在一些態樣中，嵌埋基底為黃芪膠或最佳切割溫度（optimal cutting temperature；OTC）介質。在一些態樣中，切斷係利用切片機或低溫恆溫器來執行。
在一些態樣中，乾癬組織樣品係藉由切割自乾癬病灶獲得的生檢試樣來獲得，且其中該方法進一步包含：（a）急驟凍結樣品，（b）將凍結的樣品粉碎成碎片，（c）將碎片解凍，（d）垂直地粉碎一或多個經解凍的碎片並水平地推動經解凍的碎片，及隨後（e）將碎片塗抹在載玻片上。
一些態樣包含在生長培養基中培養經分離的免疫細胞。
一些態樣包含偵測與經分離的免疫細胞相關聯的T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合。一些態樣包含偵測與經培養的免疫細胞中的一或多個相關聯的T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合。在一些態樣中，偵測係經由流式細胞術、深測序、分光光度測定法、或酶聯免疫吸附檢定來執行。
一些態樣進一步包含對經培養的免疫細胞執行抗原挑戰。在一些態樣中，抗原挑戰包含使免疫細胞與抗原接觸且隨後偵測與經培養的免疫細胞或經分離的免疫細胞（例如，未操縱的單一免疫細胞）相關聯的T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合。在一些態樣中，抗原為角蛋白、黑色素細胞-ADAMTSL5、或抗微生物肽LL37。在一些態樣中，將抗原與自受試者獲得的皮膚組織樣品分離。
一些態樣包含（a）將皮膚組織樣品均質化及分餾，（b）對經均質化及經分餾的皮膚組織樣品進行抗原挑戰，（c）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的分餾物，（d）藉由執行三維凝膠層析來分離所偵測的分餾物中的多肽，（e）對經分離的多肽進行抗原挑戰，及（f）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的經分離的多肽。
一些態樣包含在自受試者獲得的周邊血液樣品中偵測存在或不存在（i）具有經偵測的T細胞表面標誌及/或轉錄因子的一或多種免疫細胞及/或（ii）誘導T細胞刺激的經分離的多肽。
一些態樣包含合成誘導T細胞刺激的多肽中的一或多種。一些態樣包含將多肽中的一或多種投與至患有乾癬的受試者。
此外，提供自患有自體免疫病症的受試者製備免疫細胞樣品的方法，該方法包含：自受試者獲得組織樣品；及使用雷射擷取顯微解剖或真空脈衝輔助技術自組織樣品原位分離單一免疫細胞。提供自患有乾癬的受試者製備免疫細胞樣品的方法，該方法包含：獲得乾癬組織樣品；及使用實質上不改變免疫細胞之細胞生物化學概況的技術自乾癬組織樣品原位分離單一免疫細胞。經分離的單一免疫細胞可為未操縱的單一免疫細胞。該技術可包含以下一或多種：雷射擷取顯微解剖（例如，免疫引導雷射擷取顯微解剖）、顯微操作、真空脈衝輔助技術、免疫磁性細胞分離、密度梯度離心、沉降、黏著、適配體、浮力活化細胞分選、螢光活化細胞分選（FACS）、及微流體。
在一些態樣中，自體免疫病症為乾癬、1型糖尿病、類風濕性關節炎、或多發性硬化症。
在一些態樣中，組織樣品為約5 μm至約15 μm厚。在一些態樣中，組織樣品係藉由自受影響組織水平地切割生檢試樣來獲得。在一些態樣中，組織樣品係藉由在微摻合機中將自受影響組織獲得的生檢試樣摻合來獲得。一些態樣進一步包含：（a）壓縮組織樣品，及（b）將經壓縮的樣品塗抹在載玻片上。在一些態樣中，壓縮係利用平坦的圓形固體玻璃頭來執行。在一些態樣中，組織樣品係藉由垂直地切割自受影響組織獲得的生檢試樣來獲得。
一些態樣進一步包含：（a）凍結組織樣品及（b）切斷經凍結的樣品。在一些態樣中，凍結包含將試樣敷設在乾冰上。在一些態樣中，凍結係利用液態氮蒸汽或異戊烷。一些態樣包含在切斷樣品之前將組織樣品嵌入在嵌埋基底中。在一些態樣中，嵌入係在凍結樣品之前執行。在一些態樣中，嵌埋基底為黃芪膠或最佳切割溫度（OTC）介質。在一些態樣中，切斷係利用切片機或低溫恆溫器來執行。
在一些態樣中，組織樣品係藉由切割自受影響組織獲得的生檢試樣來獲得，且其中該方法進一步包含：（a）急驟凍結組織樣品，（b）將凍結的樣品粉碎成碎片，（c）將碎片解凍，（d）垂直地粉碎一或多個經解凍的碎片並水平地推動一或多個經解凍的碎片，及隨後（e）將碎片塗抹在載玻片上。
一些態樣進一步包含在生長培養基中培養經分離的免疫細胞。
一些態樣進一步包含偵測與經分離的免疫細胞相關聯的T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合。一些態樣進一步包含偵測與經培養的免疫細胞中的一或多個相關聯的T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合。在一些態樣中，偵測係經由流式細胞術、深測序、分光光度測定法、或酶聯免疫吸附檢定來執行。
一些態樣進一步包含鑑別刺激經分離的免疫細胞的主要抗原。在一些態樣中，鑑別包含培養經分離的免疫細胞以產生經培養的免疫細胞，且對經培養的免疫細胞執行抗原挑戰。在一些態樣中，抗原挑戰包含使免疫細胞與抗原接觸且隨後偵測與經培養的免疫細胞或經分離的免疫細胞（例如，未操縱的單一免疫細胞）相關聯T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合。在一些態樣中，將抗原與自受試者獲得的組織樣品分離。
一些態樣進一步包含（a）將組織樣品均質化及分餾，（b）對經均質化及經分餾的組織樣品進行抗原挑戰，（c）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的分餾物，（d）藉由執行三維凝膠層析來分離經偵測的分餾物中的多肽，（e）對經分離的多肽進行抗原挑戰，及（f）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的經分離的多肽。
一些態樣進一步包含在自受試者獲得的周邊血液樣品中偵測存在或不存在（i）具有經偵測的T細胞表面標誌及/或轉錄因子的一或多種免疫細胞及/或（ii）誘導T細胞刺激的經分離的多肽。
一些態樣進一步包含合成誘導T細胞刺激的多肽中的一或多種。
此外，提供治療患有自體免疫病症的受試者的方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量的經鑑別的主要抗原。
一些態樣進一步包含在誘導調節免疫細胞之形成的生長培養基中培養免疫細胞。一些態樣包含治療患有自體免疫病症的受試者的方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量的經誘導的調節免疫細胞。
除非上下文另外清楚指定，否則如本文所使用，單數形式「一（a/an）」及「該、前述、所述」包括單數及複數提及物。
藉由終點的數值範圍敘述包括相應範圍內包含的所有數及分數以及所敘述的終點。
如本文所使用，在提及諸如參數、量、時間上的持續時間等等時的術語「約」意指涵蓋規定值的及自規定值的變化，諸如自規定值的+/-10%或更小的變化，除非明確認定係意指單獨的變化，諸如規定值的及自規定值的+1-5%或更小、+/-1%或更小、或+/-0.1%或更小。應理解，修飾語「約」所提及的值自身亦被明確地及較佳地揭示。
術語「數量」、「量」及「位準」為同義詞且通常在此項技術中已被良好理解。該等術語可特定地指代在受測試對象中（例如，在細胞、細胞群體、組織、或器官中或上，例如在受試者之生物樣品中）的標誌的絕對定量，或指代在受測試對象中的標誌的相對定量，亦即，相對於另一值，諸如相對於參考值，或相對於指示標誌之基線的值的範圍。例如，基線或參考值可基於對患有自體免疫病症或不患有自體免疫病症或其一或多個症狀的受試者中（或來自該受試者的細胞或細胞群體中）的標誌的數量、位準、或量的測定來獲得。此類值或範圍可如習知所知來獲得。在一些情況下，數量、量、或位準為所量測的濃度。量可使用已知技術來定量，該等已知技術諸如PCR、UV吸收、熱量測定、基於螢光的量測法、二苯胺反應方法、及其他技術。
本發明描述獨特的免疫調節平台，用於診斷及/或治療諸如乾癬的自體免疫疾病。在不受理論約束的情況下，咸信包括乾癬的自體免疫病症係由對特定自身抗原的自身耐受性之損失所引起。自身抗原觸發靶向特定自身抗原對其為特異性的器官的自體免疫過程。例如，在1型糖尿病中，自身抗原在產生胰島素的胰腺β細胞中；在乾癬中，自身抗原在皮膚中；在自體免疫甲狀腺炎中，抗原在甲狀腺中，等等。
乾癬為自體免疫疾病，其具有若干表現型，包括斑塊性（亦稱為尋常性乾癬）、滴狀、反轉型、膿皰性、及紅皮性。乾癬具有位於HLA區域中的強遺傳組分。一種此類基因座為乾癬敏感性基因座1（PSORS1）。乾癬中最強的HLA相關締合對映於白種人群中的HLA-C*06。此疾病之特徵為緩解及病發（flare up）。乾癬在一級親屬間的流行率是高的，亦即，比一般人群高約4-19%。
乾癬病理生理學係表徵為在表皮及真皮中的異常角膜細胞增殖及免疫細胞浸潤。在不受理論約束的情況下，咸信推定的自體抗原的異常識別及呈現觸發自體侵襲性T細胞群體，包括Th1及Th17細胞。促炎性細胞介素（例如，TNF-α、IL-17、IL-22及23、CCL20）可維持並惡化疾病。上皮損傷可觸發諸如CAMP的抗微生物肽，其隨後介導漿細胞樣樹突細胞（plasmacytoid dendritic cell；pDC）活化，從而進一步加劇皮膚破壞。
本發明描述概括健康個體藉以獲得對身體的免疫系統的自身耐受性的過程的方法。例如，在健康個體中，在生命早期，免疫細胞係在嬰兒的胸腺中循環，其中表現不同器官的自身抗原；一些免疫細胞（對特定抗原為特異性的）遭消除；一些免疫細胞則並未消除，但其保持受到亦對此些自身抗原為特異性的調節免疫細胞的控制。自體免疫性可在此些調節細胞失去對未消除的免疫細胞的控制時發生。因此，一些態樣包含將自身抗原引入受試者以刺激調節細胞恢復控制並重新建立健康的免疫平衡。
「抗原」為由免疫系統識別的結構性物質，諸如蛋白質或多肽，且充當用於免疫反應之標靶。「自身抗原」或「自體抗原」為來源於生物體的抗原，其在正常環境下不由彼生物體的免疫系統識別，但可變成免疫攻擊之標靶，從而導致自體免疫疾病。
針對上文背景，本發明提供鑑別患有自體免疫病症的受試者中的T細胞及/或抗原的方法及組合物。在一些態樣中，受試者已經診斷為患有自體免疫病症。在一些態樣中，受試者具有患上自體免疫病症的風險。在一些態樣中，自體免疫病症為乾癬。在一些態樣中，自體免疫病症為類風濕性關節炎。在一些態樣中，自體免疫病症為1型糖尿病。在一些態樣中，自體免疫病症為多發性硬化症。
本發明亦提供治療或預防受試者中的自體免疫病症的方法及組合物。 [製備組織樣品的方法]
本發明提供自患有諸如乾癬的自體免疫病症的受試者製備免疫細胞樣品的新穎及創造性方法。此類方法可例如用於鑑別存在於受試者之組織中的免疫細胞。
一些態樣包含自受試者獲得組織樣品。組織可為受自體免疫病狀影響的任何組織，諸如皮膚、胰腺組織、脊髓液、滑液等等。例如，患有乾癬的受試者之組織可為皮膚。示範性乾癬組織包括乾癬斑塊或病灶、帶有膿皰、紅斑、鮮紅發亮病灶、及/或鱗屑的紅色鱗狀皮膚。患有多發性硬化症的受試者的組織可為腦脊髓液（例如，自脊髓液穿刺獲得）。來自患有1型糖尿病的受試者的組織可具有胰腺細胞。來自患有類風濕性關節炎的受試者的組織可為滑液。
在一些態樣中，組織樣品在自體免疫發病（例如，乾癬病發）期間獲得。在一些態樣中，組織樣品在自體免疫病狀（例如，乾癬）緩解或部分緩解期間獲得。在一些態樣中，組織樣品係自在病狀過程期間獲得的連續生檢分離，例如，用以提供與自體免疫過程及其自身調節治癒過程中的動力學變化相關的資訊。
組織樣品可藉由各種方法中的任何方法獲得。例如，組織樣品可直接自受試者或自受試者獲得的生檢試樣獲得。生檢的示範性類型包括刮除式生檢、衝壓式生檢、切開式生檢、及切除式生檢。在一些態樣中，生檢係藉由用解剖刀自受試者移除一些或所有受影響組織來獲得。在一些態樣中，個體細胞（例如，來自腦脊髓液或滑液）可例如使用帶有顯微操作器的顯微鏡自溶液拾取。
在一些態樣中，組織樣品係藉由水平地切割（例如，平行於皮膚層）自受試者的組織（例如，乾癬病灶）獲得的生檢試樣來獲得。在一些態樣中，組織樣品係藉由垂直地切割自受試者組織獲得的生檢試樣來獲得。此類切割可利用任何已知的手段，諸如利用解剖刀來執行。在一些態樣中，組織樣品係藉由在微摻合機中將自受試者的組織獲得的生檢試樣摻合來獲得。
在一些態樣中，進一步處理自生檢試樣獲得的組織樣品。在一些態樣中，進一步處理不包括切碎或消化組織樣品。在一些態樣中，可將組織樣品壓縮（使用恆定或可變壓力，例如手動地或使用機器輔助製程及硬表面，在垂直方向上壓平組織），粉碎（打擊或壓縮以使得組織分離成較小及較薄的小塊），推動（將組織轉移穿過限定直徑以分離及/或使其變薄），拉動，塗抹，凍結，或其任何組合。
在一些實施例中，組織樣品係例如利用平坦的圓形固體玻璃頭，或利用研缽與桿，或利用壓製機或粉碎機來手動地或機械地壓縮。例如，可將頭旋轉並向下推動及側向推動以機械地壓縮樣品。在一些態樣中，將經壓縮的樣品塗抹在載玻片上，可隨後將其用於樣品之顯微解剖。
在一些態樣中，組織樣品係例如使用急驟凍結或快速凍結技術來凍結。示範性凍結技術包括暴露於乾冰、液態氮蒸汽、或異戊烷。在一些態樣中，將組織樣品在凍結之前低溫保護（例如，藉由將組織樣品暴露於低溫保護劑，諸如4%多聚甲醛及/或蔗糖）。較佳地，組織樣品在樣品細胞中無冰晶生成的情況下凍結。
一些態樣包含將經凍結的組織樣品片段化。此種片段化可藉由將經凍結的組織樣品粉碎成碎片來獲得，例如經由手動或機械壓縮，或利用微摻合機來獲得。在一些態樣中，將片段化的組織樣品解凍，且隨後進一步壓縮或推動（例如，藉由垂直地粉碎經解凍的碎片及/或將其水平地推動）。在一些態樣中，將片段化的組織樣品塗抹在載玻片上。
在一些態樣中，將組織樣品嵌入基底中。基底可為膠或黏著劑。示範性基底包括聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]、10%明膠、羧甲基纖維素、黃芪膠、及其組合。在一些態樣中，基底在最佳切割溫度（OCT）介質中。示範性OCT介質包括二醇及樹脂之水溶性摻合物，例如，其提供用於切斷組織樣品的基質。參見，例如，FISHER HEALTHCARE™ TISSUE-PLUS™ O.C.T. Compound, or TISSUE-TEK® O.C.T. Compound (SAKURA® Finetek)。在一些態樣中，將經凍結的組織樣品嵌入基底中。在一些態樣中，將新鮮的組織樣品嵌入基底中。在一些態樣中，將片段化的組織樣品嵌入基底中。
一些態樣包含切斷（例如，低溫切斷）或切片組織樣品。例如，組織樣品可使用刀片或刀來切斷。在一些態樣中，組織樣品係使用切片機來切斷。在一些態樣中，組織樣品係使用低溫恆溫器來切斷。
經塗抹或經切斷的組織樣品可為適於顯微解剖的任何厚度。例如，在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品為約5微米至約15微米厚，諸如約8-10微米厚。在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品為約5微米至約15微米厚，諸如約8-10微米厚。在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品具有以下厚度：約5微米、約6微米、約7微米、約8微米、約9微米、約10微米、約11微米、約12微米、約13微米、約14微米、或約15微米。在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品具有以下厚度：5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、或15微米。在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品包含單層細胞。在一些態樣中，經塗抹或經切斷的組織樣品的一部分包含單層細胞。
在一些態樣中，將經塗抹或經切斷的組織樣品置放於載片（例如載玻片）或膜上用於顯微解剖。 [免疫細胞分離]
本發明亦提供自組織樣品分離一或多種免疫細胞的方法。術語「免疫細胞」係指先天或後天免疫系統之細胞，且包括而不限於諸如T細胞及B細胞（包括B細胞譜系中的任何細胞）之淋巴細胞、初始細胞、記憶細胞、抗原呈現細胞（antigen-presenting cell；APC）、樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、自然殺手（natural killer；NK）細胞、肥胖細胞、嗜鹼性球、嗜酸性球、或嗜中性球、以及此類細胞之任何前驅細胞。在某些較佳態樣中，免疫細胞可為T細胞。如本文所使用，術語「T細胞」（亦即，T淋巴細胞）意欲包括T細胞譜系內的所有細胞，包括胸腺細胞、未成熟T細胞、成熟T細胞及類似細胞。術語「T細胞」可包括CD4+ 及/或CD8+ T細胞、T輔助（Th ）細胞，例如，Th 1、Th 2及Th 17細胞、T調節（Treg ）細胞、NKT-細胞（包括變異體及/或未變異細胞）、及γ T細胞。
在一些態樣中，免疫細胞係自在自體免疫發作（例如，乾癬病發）期間獲得的組織分離。在一些態樣中，免疫細胞係自體免疫病狀（例如，乾癬）緩解或部分緩解期間分離。在一些態樣中，免疫細胞係自在病狀過程期間獲得的連續生檢分離，例如，用以提供與自體免疫過程及其自身調節治癒過程中的動力學變化相關的資訊。
在一些態樣中，免疫細胞係自經塗抹的組織樣品分離。在一些態樣中，免疫細胞係自經切斷的組織樣品分離。經塗抹或經切斷的組織樣品可根據上文闡述的方法獲得。
免疫細胞可使用顯微解剖技術，諸如雷射擷取顯微解剖來分離。雷射擷取顯微解剖例如描述於Datta等人，「Laser capture microdissection: Big data from small samples」，Histol Histopathol.，30(11): 1255-1269 (2015)，其以全文引用方式併入本文。簡言之，雷射擷取顯微解剖允許使用裝備有雷射器的倒置光顯微鏡（具有或不具有螢光模組）自組織樣品分離所關注細胞以促進對細胞的目視檢測及獲取。一些態樣利用紅外雷射擷取顯微解剖。一些態樣利用紫外雷射擷取顯微解剖。在一些特定態樣中，雷射擷取顯微解剖為免疫引導雷射擷取顯微解剖。免疫引導雷射擷取顯微解剖將免疫染色與雷射擷取顯微解剖組合，從而允許除形態學及組織位置之外免疫表現型得以使用，以自組織樣品鑑別並分離靶細胞。此技術使用免疫組織化學或免疫螢光來引導用於分離表現特異性分子標誌的細胞的解剖過程，且可在組織染色不識別某些細胞群體時為特別有用的。
在所關注細胞自相鄰組織分離之後，可將其自組織樣品提取。在一些態樣中，將所關注細胞使用非接觸方法自載片轉移，該非接觸方法諸如利用重力（例如，重力輔助顯微解剖）、壓力彈射（例如，雷射壓力彈射器）、或雷射引導正向轉移。在一些態樣中，所關注細胞係藉由將黏性表面按壓至細胞且將其自載片撕去來自該載片轉移。在一些態樣中，使用熱轉移製程提取細胞，該熱轉移製程將所關注細胞黏附於膜而不黏附相鄰組織。在一些態樣中，使用真空脈衝輔助技術提取細胞，該真空脈衝輔助技術可允許手動或自動單細胞分離，例如使用顯微解剖儀器，諸如UnipicK™、UnipicK+™及A-picK™（NeuroInDx, Inc.TM）來進行。
在一些態樣中，免疫細胞可藉由顯微操作來分離。顯微操作係一種手動細胞拾取形式，其係涉及使用倒置顯微鏡及連接至吸取及釋放單元的超薄玻璃毛細管的細胞分離技術。系統移動穿過機動機械台，允許操作者謹慎選擇特定細胞且經由微量吸管施加抽吸以吸取並分離細胞。在特定態樣中，顯微操作可利用真空脈衝輔助技術來執行，該真空脈衝輔助技術可允許手動或自動使單一細胞分離，例如使用顯微解剖儀器，諸如UnipicK™、UnipicK+™及A-picK™（NeuroInDx, Inc.TM）來進行。
在一些態樣中，免疫細胞可使用免疫磁性細胞分離來分離。免疫磁性細胞分離係藉以使用磁性粒子自異質混合物分離靶細胞的技術。為完成此舉，使磁性粒子經由抗體、酶、凝集素、或卵白素結合至靶細胞上的特異性細胞表面蛋白質。隨後將樣品置放於施加在磁性粒子上電磁場中，從而為磁性粒子帶來經標記的細胞。未標記的細胞保留在組織樣品中。
在一些態樣中，免疫細胞可使用密度梯度離心（例如，在流體組織樣品中）來分離。密度梯度離心依賴於異質樣品內的細胞之變化密度。在離心之前將樣品層疊在密度梯度介質之頂部上。在離心期間，每一細胞類型將沉降至其等密度點，此處係介質梯度中的細胞及介質之密度為相同的位置。
在一些態樣中，免疫細胞可使用沉降來分離。沉降係基於重力將致使較大及較緻密的組分比較小及較不緻密的材料更快沉降來工作。樣品中的最大及最緻密組分可歸因於其高速率沉降而經由初始低力離心來團塊化。可隨後將上清液再次旋轉。經由連續離心，可分離具有沉降速率逐漸降低的組分。白血球通常係經由聚葡糖沉降與紅血球分離。
在一些態樣中，免疫細胞可使用黏附來分離。不同細胞類型的獨特黏附概況可用於在來自異質群體的流體樣品中分離靶細胞。藉由選擇適合的生長因子及細胞培養板以選擇性地促進或抑制黏附，可在懸浮液中自細胞分離黏附細胞。例如，巨噬細胞固有地為黏附性的且常常藉由黏附與周邊血液及骨髓分離。單核細胞可利用血清及分化雞尾酒試劑（differentiation cocktail）來培養，從而促進黏附單層巨噬細胞的形成。在移除含有不需要的細胞的上清液之後，可分離出巨噬細胞。替代地，在懸浮液中自然生長或已喪失錨定依賴性的細胞可藉由在意欲用於超低黏附的板中培養異質細胞群體來分離。在沒有要黏附的表面的情況下，黏附細胞將無法生存且靶細胞將保留在懸浮液中。
在一些態樣中，免疫細胞可使用適配體來分離。適配體為形成可結合至高特異性標靶的結構的單鏈RNA或DNA寡核苷酸。經由配位體藉由指數富集配位體系統演化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment；SELEX）技術，可篩選且合成適配體以靶向任何細胞類型。指數富集配位體系統演化（SELEX）係一種實驗程序，其允許自寡核苷酸之初始隨機池提取對給定分子標靶具有所要結合親和力的寡聚物。此些適配體具有針對其標靶的高親和力及特異性，且可利用螢光染料或磁性粒子標記以促進細胞分離。適配體缺乏免疫原性。
在一些態樣中，免疫細胞可藉由浮力活化細胞分選來分離。浮力活化細胞分選為典型地利用以對靶細胞為特異性的抗體標記的玻璃微泡的細胞分離技術。當混合至樣品中時，微泡結合至靶細胞。歸因於增大的浮力，微泡漂浮至表面，從而分離出靶細胞。
在一些態樣中，免疫細胞可藉由螢光活化細胞分選（FACS）來分離。FACS為使用流式細胞術及螢光探針來分選細胞之異質混合物的方法。螢光團標記的抗體結合至單細胞懸浮液內的靶細胞上的特異性抗原上的抗原決定基。標記之後，流式細胞儀將細胞懸浮液集中成單細胞之均勻流。隨後將此流傳遞穿過一組雷射器，該組雷射器激發細胞結合的螢光團，引起光散射及螢光發射。基於藉由雷射激發產生的波長，將所得光子訊號轉換成比例數之電子脈衝，其將電荷分配至形成於細胞周圍的液滴。由於每一液滴落在偏轉板之間，其電荷引起液滴偏轉至收集管中或落入廢物腔室中。在一些實施方式中，FACS可用以自經分離細胞的富集樣品分離單細胞，該等樣品包括用本文揭示的其他手段（例如，免疫磁性細胞分離、密度梯度離心、沉降、黏附等等）製備的樣品。
在一些態樣中，免疫細胞可使用微流體來分離。微流體在顯微鏡水平操作流體以促進單細胞分離。微流體技術係頻繁地構建於微晶片上且通常稱為「實驗室晶片（lab-on-a-chip）」裝置。此些裝置具有若干優點，包括使用所需的較小體積的樣品及試劑。實驗室晶片裝置亦為可攜式的，使得其特別適於用作現場診斷工具。微流體方法可分成主動系統及被動系統。主動微流體系統涉及外力，而被動微流體利用細胞的密度及質量與重力組合。此些方法亦可藉由存在或不存在細胞標籤分類。存在若干用於細胞分離的不同微流體方法，包括例如：聲泳、含水二相系統、仿生學微流體、細胞親和力層析法、確定性側向位移、電泳分選、場流分餾法、重力及沉降、磁泳、微過濾、及光學分選。在一些實施方式中，微流體可用以自經分離細胞的富集樣品分離單細胞，該等樣品包括用本文揭示的其他手段（例如，免疫磁性細胞分離、密度梯度離心、沉降、黏附等等）製備的樣品。
在一些態樣中，所關注細胞較佳地自組織樣品以保存細胞生存力的方式分離及提取。在一些態樣中，所關注細胞較佳地自組織以不改變或實質上不改變細胞生物化學概況（例如，蛋白質體、基因組、及/或轉錄組）的方式分離及提取。例如，所關注細胞可自組織以使得細胞保持未操縱的方式分離及提取（例如，可自組織分離及提取未操縱單一免疫細胞）。分離及提取之方式可實質上例如保存細胞上呈現的細胞表面受體。自組織樣品提取細胞之一些技術，諸如例如，涉及不保存組織內的細胞的組織消化劑及/或嵌入劑（例如，石蠟或電子顯微鏡樹脂）的技術可防止將經分離細胞單獨剖析（profile）的能力，可改變組織樣品內的細胞之細胞生物化學概況，及/或可殺死細胞，從而防止表徵對鑑別自體抗原的相關刺激的體外細胞反應的能力，如本文其他處所描述。在一些實施例中，可自血液樣品分離免疫細胞（例如，T細胞）且利用自組織樣品鑑別的抗原挑戰，如本文其他處所描述。然而，對自相關組織樣品（例如，在自體免疫反應期間經歷免疫細胞浸潤的組織）分離及提取的免疫細胞執行抗原挑戰可在提供對所關注自體抗原為特異性的較高濃度或比例/頻率之免疫細胞方面為有利的。
在一些態樣中，在生長培養基中培養所關注細胞例如以產生細胞聚落。在一些態樣中，培養基為完全培養基且實現IL-12刺激。
在一些態樣中，在誘導Treg 細胞或具有Treg 活性之細胞的形成的生長培養基中培養所關注細胞。在一些態樣中，在誘導Foxp3 表現的生長培養基中培養所關注細胞。在一些態樣中，在含有以下一或多種的生長培養基中培養細胞：TGF-β、IL-10、IL-4及IL-35。一些態樣包含根據以下文獻中闡述的方法進行向Treg 細胞的轉化：Chen等人，J. Experimental Medicine, 198(12): 1875-1886 (2003)；Cao等人，J. Am. Soc. Nephrol., 21: 933-942 (2010)；或Collison等人，Nat. Immunol., 11(12): 1093-1101 (2010)，其每一者之揭示內容以全文引用方式併入本文。 [免疫細胞鑑別]
本發明亦提供表徵在生長培養基中培養的經分離的免疫細胞（例如，單一免疫細胞）或細胞聚落的方法。此類表徵可包括但不限於分析免疫細胞之基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、及/或代謝體學。一些態樣包含測定與免疫細胞相關聯的表面標誌、轉錄因子、細胞介素、訊號傳導物、或其組合的表現位準。「表現」係指多核苷酸藉以自DNA模板轉錄的過程（諸如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄物）及/或經轉錄的mRNA藉以隨後轉譯成肽、多肽、或蛋白質的過程。因此，「表現位準」可指代樣品中的核酸（例如mRNA）或蛋白質的量。
在一些態樣中，免疫細胞為T細胞。示範性T細胞表面標誌包括T細胞受體（TCR）、CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、CD25、CD127、FoxP3、CD19/20、CD196 (CCR6)、CD197 (CCR7)、CD62L、CD123、CD 80/86、CD69、及CD45RO/RA。示範性T細胞轉錄因子包括Aiolos、ATM、BATF、Bcl-6、Blimp-1、FOXP3、GATA3、Helios、Ikaros、IRF4、IRF7、Ki-67、NF-kB p65、p53、PCNA、SSRP1、STAT1、STAT4、T-bet、TCL1、Th-POK、及ZAP-70。示範性T細胞細胞介素包括INF-γ、IL-17、TNF-α、IL-6、IL-4、IL10、TGF-β、IL-12、IL-13、IL-2、及IL-23。示範性T細胞訊號傳導物包括JAK1/3、PI3K等等。
表面標誌、轉錄因子、細胞介素、及訊號傳導物可藉由任何適合手段來鑑別。例如，一些態樣包含使用流式細胞術來鑑別表面標誌、轉錄因子、及/或細胞介素。一些態樣包含使用分光光度測定法。一些態樣包含使用酶聯免疫吸附檢定。一些態樣包含使用深測序。一些態樣包含執行RNA-Seq或單細胞RNA-Seq。一些態樣包含執行單細胞-基因組（DNA）測序。一些態樣包含使用四聚物或十二聚物技術，例如，DCODE™ DEXTRAMER®，其可提供對抗原特異性、T細胞受體序列、及/或基因體學剖析的理解。
一些態樣包含鑑別與經分離的T細胞相關聯的T細胞受體（TCR）。更特定而言，TCR α及/或β鏈可使用抗體及/或RT-PCR來表徵。
在一些態樣中，自自體免疫發作（例如，乾癬病發）鑑別免疫細胞。在一些態樣中，免疫細胞係自體免疫病狀（例如，乾癬）緩解或部分緩解期間分離。在一些態樣中，免疫細胞係自在病狀過程期間獲得的連續生檢分離，例如，用以提供與自體免疫過程及其自身調節治癒過程中的動力學變化相關的資訊。例如，CD25hi+/CD127低、FoxP3+群體頻率以及初始及記憶T細胞群體之比率可在連續生檢中表徵以提供與自體免疫過程及其自我調節治癒過程中的動力學變化相關的此類資訊。 [抗原挑戰及鑑別]
本發明亦提供對經培養的免疫細胞執行抗原挑戰的方法。在一些態樣中，使經培養的免疫細胞與抗原接觸，且測定將免疫細胞暴露於抗原之影響，例如藉由量測與免疫細胞相關聯的表面標誌、轉錄因子、新合成的DNA（例如，如藉由-3H-胸苷併入法）、ATP、細胞介素、細胞訊號傳導物、或其組合的表現位準來測定。抗原挑戰例如揭示於Ridgway等人，「Following Antigen Challenge, T Cells Up-Regulate Cell Surface Expression of CD4 In Vitro and In Vivo」，J. Immunol. ， 161: 714-720 (1998)，及Brinke等人，「Monitoring T-Cell Responses in Translational Studies: Optimization of Dye-Based Proliferation Assay for Evaluation of Antigen-Specific Responses」，Fontiers Immunol. ， 8: 1870 (2017)，兩者均以全文引用方式併入本文。一些態樣包含使用T細胞之TCR的深度分析來預測T細胞之抗原特異性，例如，如Fischer等人「Predicting antigen-specificity of single T-cells based on TCR CDR3 regions」，buiRxiv (Aug. 13, 2019)中所闡述，其以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中（例如，在乾癬的情況下），用於抗原挑戰的抗原為角膜細胞（例如，角蛋白）；黑色素細胞（例如，ADAMTSL5）；抗微生物肽（例如，LL37）；前述任何一者的轉譯後修飾的變異體；前述任何一者的片段；及/或其任何組合。在一些態樣中（例如，在多發性硬化症的情況下），用於抗原挑戰的抗原為髓磷脂鹼性蛋白（Myelin basic protein；MBP）、髓磷脂寡樹突膠細胞醣蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein；MOG）肽、α-β-晶體蛋白、S100β、蛋白脂類蛋白（proteolipid protein；PLP）之DM20同功型、髓磷脂相關抗原（myelin-associated antigen；MAG）、髓磷脂相關寡樹突細胞鹼性蛋白（myelin-associated oligo-dendrocyte basic protein；MOBP）、2’,3’-環-核苷酸3’-磷酸二酯酶（CNPase）、前述任何者的轉譯後修飾的變異體、前述任何者的片段、及/或其任何組合。在一些態樣中（例如，在1型糖尿病的情況下），用於抗原挑戰的抗原為前胰島素原、胰島素原、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素C鏈、GAD65、ICA512/Ia2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、神經節苷脂、前述任何者的轉譯後修飾的變異體、前述任何者的片段、及/或其任何組合。在一些態樣中（例如，在類風濕性關節炎的情況下），用於抗原挑戰的抗原為II型膠原；蛋白多醣；人類軟骨細胞醣蛋白39；熱休克蛋白（heat shock protein；HSP）（諸如BiP）；轉譯後修飾的蛋白質（諸如瓜胺酸化聚絲蛋白）；普存蛋白（諸如葡糖-6-磷酸異構酶）；p205；N -乙醯葡萄胺糖-6-硫酸酯酶（GNS）；細絲蛋白（FLNA）；前述任何一者的轉譯後修飾的變異體；前述任何一者的片段；及/或其任何組合。
在一些態樣中，從自患有自體免疫病狀的受試者獲得的組織樣品分離抗原。此類抗原可例如從例如經由生檢自受試者獲得的組織（例如，乾癬組織）分離。在一些態樣中，將組織（例如，乾癬組織）切碎及/或消化。在其他態樣中，不切碎及/或不消化組織（例如，乾癬組織）。
一些態樣包含將組織均質化。一些態樣包含將組織分餾。一些態樣包含對經均質化及經分餾的組織進行抗原挑戰。一些態樣包含偵測在抗原挑戰中誘導T細胞刺激的分餾物。一些態樣包含進一步將組織分餾以鑑別最小反應的分餾物。一些態樣包含自誘導T細胞刺激的一或多個分餾物分離多肽（例如，蛋白質）。此種分離可使用諸如三維層析法的層析技術來發生。一些態樣包含基於諸如大小、電荷、及/或疏水性的性質來分離多肽。一些態樣包含另外使用質譜分析方法來分離多肽，諸如Duong等人，「Review of Three-Dimensional Liquid Chromatography Platforms for Bottom-Up Proteomics」，Int’l. J. Molecular Sci. ， 21(1524): 1-19 (2020)中描述的彼等方法，其以全文引用方式併入本文。一些態樣包含對一或多種經分離的多肽進行抗原挑戰。一些態樣包含鑑別誘導T細胞刺激的經分離的多肽。 [自體免疫偵測/處理]
本發明亦提供偵測患有或疑似患有自體免疫病症（諸如乾癬）的受試者的T細胞及/或抗原的方法。一些態樣包含偵測自受試者獲得的組織（例如，皮膚組織）中的T細胞及/或抗原。一些態樣包含偵測自受試者獲得的血液樣品（例如，周邊血液樣品）中的T細胞及/或抗原。一些態樣包含將具有T細胞及/或抗原的受試者鑑別為患有自體免疫病症（例如，乾癬）。一些態樣包含基於存在T細胞及/或抗原而將受試者診斷為患有自體免疫病症。抗原可為根據本文其他處描述的任何方法自組織樣品鑑別的自體抗原及/或T細胞可為具有對根據本文其他處描述的方法中之任一者自組織樣品鑑別的自體抗原具有抗原特異性的T細胞。一些態樣包含基於存在T細胞及/或抗原而測定自體免疫病症的階段（例如，病發、緩解、部分緩解等等）。一些態樣包含測定受試者將有利地對治療反應的可能性。
本發明亦提供治療（包括預防性治療）經鑑定已患上自體免疫病症或具有患上自體免疫病症風險的受試者的方法。治療包括任何類型的措施，其對罹患自體免疫病症或其症狀或具有患上自體免疫病症或其症狀風險的患者帶來益處。此等益處可包括減慢、控制、逆轉、或停止病症及/或疾病過程自身的一或多個症狀的進程。此類治療可包括但未必需要所有症狀的總體消除或病症的治癒。
一些態樣包含向有需要之受試者投與治療有效量之抗原，諸如根據上文描述的方法鑑別的抗原。在一些態樣中，投與抗原提供針對調節免疫細胞的有益轉變及/或下調病理學免疫反應。一些態樣包含分離或合成用於投與至受試者的抗原。在一些態樣中，抗原係利用佐劑及/或醫藥學上可接受的載劑來投與。在各種態樣中，抗原可根據在2016年12月15日公開的Orban等人的美國專利申請公開案第2016/0361397號中描述的任何方法或通用製劑來投與，該專利係以全文引用方式併入本文。
一些態樣包含向受試者投與 Treg 細胞或具有Treg 活性之細胞。在一些態樣中，Treg 細胞或具有Treg 活性之細胞係藉由在誘導具有Treg 活性之細胞形成的生長培養基中培養所關注細胞來產生。在一些態樣中，經投與的細胞表現Foxp3 。在一些態樣中，經投與的細胞係藉由在含有TGF-β、IL-10、IL-4及IL-35中之一或多種的生長培養基中培養所關注細胞來產生。
包括以下實例來作為本文描述的組合物及方法的說明。實例絕不意欲限制本發明之範疇。其他態樣將對熟習此項技術者而言為明顯的。 [實例] [實例1：免疫細胞分離]
自標靶器官病灶分離未處理、未操縱的免疫細胞。替代將皮膚組織切碎並消化以分離免疫細胞，使用雷射單細胞擷取方法，雷射擷取顯微解剖（Laser Capture Microdissection；LCM）。在不受理論約束的情況下，咸信此類技術允許在不降解細胞外基質的情況下接近固體組織樣品中用於雷射擷取的未改變的免疫細胞。與皮膚生檢相比較而言，用於執行LCM的組織為約5-15微米厚，該皮膚生檢通常為6-8 mm厚。
組織或未改變的細胞係自受自體免疫疾病影響的位點（例如，受影響組織，諸如類風濕性關節炎中的滑液或生檢；多發性硬化症中的腦脊髓液或頭生檢；1型糖尿病中的胰腺生檢；乾癬中的皮膚生檢）獲得。將經分離細胞置放於載玻片上或替代地，根據下文技術中的任何技術來製備組織。
SAS方法（粉碎及塗抹）：使用用於顯微解剖的鋒利解剖刀，儘可能薄地以水平方式（亦即平行於皮膚層）自乾癬病灶切割新鮮的組織樣品（丟棄真皮及脂肪組織之完整部分）。替代地，微摻合機可用於將乾癬病灶分裂成小塊。隨後，用平坦的圓形固體玻璃頭藉由將該頭旋轉且將其向下及側向推動以在硬表面上進一步機械地壓縮樣品來將樣品粉碎（單獨將每一薄切樣品粉碎）。使用鋒利邊緣載玻片，將每一經粉碎的切割物塗抹在載玻片上。
FAST方法#1（急驟凍結及切片，解凍）：使用用於顯微解剖的鋒利解剖刀，儘可能薄地以垂直方式（亦即跨於皮膚層）自乾癬病灶切割新鮮的組織樣品（切割完整組織亦即脂肪等等）。將切片敷設在乾冰上，且其可在-80℃下儲存在無菌容器中或立即使用。在不受理論約束的情況下，咸信在細胞中無冰晶生成的情況下凍結細胞。隨後將切片嵌埋（例如，嵌入黃芪膠中）且使用切片機/低溫恆溫器來將試樣切片至所要厚度（例如，8-10微米）。
FAST方法#2（急驟凍結及切片，解凍）：使用用於顯微解剖的鋒利解剖刀，儘可能薄地以垂直方式（亦即跨於皮膚層）自乾癬病灶切割新鮮的組織樣品。將試樣急驟凍結（例如，使用乾冰或液態氮（無需淹沒）或異戊烷之蒸汽）。在不受理論約束的情況下，咸信在細胞中無冰晶生成的情況下凍結細胞。替代地，在不凍結的情況下使用新鮮試樣。在任一情況下，使用最佳切割溫度（Optimal Cutting Temperature；O.C.T.）介質（含有甘油及樹脂）來嵌埋試樣，且使用切片機/低溫恆溫器將試樣切片至所要厚度（例如，8-10微米）。
FAST及SAS組合方法：使用用於顯微解剖的鋒利解剖刀，以小塊形式自乾癬病灶切割新鮮的組織樣品。將試樣急驟凍結（例如，使用乾冰或液態氮（無需淹沒）或異戊烷或二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide；DMSO）之蒸汽）。在不受理論約束的情況下，咸信在細胞中無冰晶生成的情況下凍結細胞。將凍結試樣粉碎成可能最小的碎片。隨後將碎片解凍，且將每一碎片再次垂直地粉碎及水平地推動。隨後將樣品塗抹在載玻片上。 [實例2：鑑別及表徵乾癬斑塊或其他自體免疫疾病標靶器官中的浸潤免疫細胞]
自經分離的單一免疫細胞，生長純系且藉由流式細胞術表徵以提供病灶中的T細胞之完全譜線，例如，用以闡明CD4+ T細胞在乾癬中的作用。此外，表徵以下表面標誌：CD8；CD4；CD3；CD25；CD127；FoxP3；CD19/20；CD45RO/RA；CD62L-；CD123；CD80/86。監視連續生檢（例如，在部分緩解及/或在病發期間）且表徵連續生檢中的T細胞之譜線。亦表徵連續生檢中的CD25hi+/CD127低、FoxP3+ 群體頻率以及初始及記憶T細胞群體的比率以提供與自體免疫過程及其自我調節治癒過程中的動力學變化相關的資訊。另外或替代地，對免疫細胞進行遺傳學分析（例如，深度TCR分析）、免疫表型（例如使用細胞表面標誌）、及/或蛋白質體及類花生酸分析（例如，白三烯（LTB4等等））。 [實例3：標靶抗原鑑別及測試]
在細胞培養測試中使用來自乾癬病灶的T細胞純系「取出」其相應自體抗原。表徵對T細胞的抗原反應，連同T細胞的細胞介素概況（例如，INF-γ、IL-17、TNF-α、IL-6、IL-4、IL10、TGF-β及IL-13）。
在乾癬的情況下，使用三種推定的抗原即角蛋白、黑色素細胞-ADAMTSL5及抗微生物肽LL37中之一或多種來進行抗原挑戰。使用相關患者的自身皮膚組織鑑別另外的抗原。更特地而言，將皮膚組織均質化及分餾，且進一步分餾誘導顯著T細胞刺激指數的分餾物。藉由3D凝膠層析分離最小反應分餾物，且針對經分離的蛋白質/肽測試T細胞純系以鑑別誘導T細胞反應的抗原。將經鑑別的抗原選殖且測序。
在1型糖尿病的情況下，使用以下一或多種進行抗原挑戰：前胰島素原、胰島素原、胰島素A、胰島素、鏈B、胰島素鏈C鏈、GAD65、ICA512/Ia2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、神經節苷脂、及前述任何者的免疫活性片段或變異體（包括前述任何者的轉譯後修飾的衍生物）。使用相關患者的自身胰腺組織鑑別另外的抗原。
在類風濕性關節炎的情況下，使用以下一或多種進行抗原挑戰：II型膠原、蛋白多醣、人類軟骨細胞醣蛋白39、熱休克蛋白（HSP）、轉譯後修飾的蛋白質（諸如瓜胺酸化聚絲蛋白）、普存蛋白（諸如葡糖-6-磷酸異構酶或p205）；應力期間分泌的HSP（諸如BiP）；N -乙醯葡萄胺糖-6-硫酸酯酶（GNS）；細絲蛋白（FLNA）；及前述任何一者的轉譯後修飾的變異體及/或片段。使用相關患者的自身受影響關節鑑別另外的抗原。
在多發性硬化症的情況下，使用以下一或多種進行抗原挑戰：髓磷脂鹼性蛋白（MBP）、髓磷脂寡樹突膠細胞醣蛋白（MOG）肽、α-β-晶體蛋白、S100β、蛋白脂類蛋白（PLP）之DM20同功型、髓磷脂相關抗原（MAG）、髓磷脂相關寡樹突細胞鹼性蛋白（MOBP）、2',3'-環-核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNPase）、及前述任何一者的轉譯後修飾的變異體及/或片段。使用相關患者的自身受影響腦脊髓液或腦組織鑑別另外的抗原。 [實例4：鑑別對抗原的周邊血液免疫細胞反應]
自受試者收集周邊血液樣品，同時收集組織樣品（例如，皮膚生檢；滑液或生檢；腦脊髓液或腦生檢；胰腺生檢），且自組織樣品的發現結果與患者的自身血液樣品相關聯。更特地而言，表徵血液樣品以測定在存在或不存在自標靶器官（例如，皮膚生檢）鑑別的T細胞及/或其相關抗原。若確認標靶器官中存在此類細胞及/或抗原，此類組分可在血液中得以鑑別，即使其以低頻率存在時亦如此。
給定與自體免疫病症相關聯的非均質性（亦即，具有對自體免疫性的不同自體抗原反應的不同患者群組的可能性），血液測試可用於開發基於與病理學反應相關聯的自體抗原的個體化免疫調節療法。血液測試亦可用作有風險受試者或患有早期疾病（例如，具有早期或非典型疾病呈現）的受試者的診斷工具。 [實例5：在患有乾癬的患者中驗證標誌及計量活性位準及/或隨自體免疫破壞之時間推移的進程的自體免疫細胞生物標誌]
疾病特異性及/或抗原特異性記憶T細胞可用於評估自體免疫活性或疾病進程之位準。在不受理論約束的情況下，咸信整體記憶T細胞增加，因為自體免疫過程活化初始T細胞，隨後其變成疾病特異性T細胞並增大記憶T細胞池。因此，初始相對新鑑別的疾病特異性記憶細胞的數量可用於測定疾病之進程，從而提供強得多的訊號，其相對於在等式中使用全部記憶細胞池而言具有增加的精度、靈敏度及特異性，尤其在自體免疫過程早期如此。例如，2019年5月9日公開的Orban的美國專利申請公開案第2019/0137483號（以全文引用方式併入本文）中所揭示的用於診斷自體免疫性存在的自體免疫細胞標誌經測試來測定標誌可預知乾癬之強度及其即將病發。更特地而言，對來自受試者的血液樣品執行流式細胞術以鑑別表現型標誌。使用螢光活化細胞分選（FACS），使用以螢光團標記的抗CD4抗體偵測CD4+細胞。對於同時偵測CD45RO而言，亦使用具有另一螢光團的特異性抗CD45RO抗體。（螢光標記的抗CD4及抗CD45RO抗體可商購自各種來源，諸如BD Biosciences of San Jose, Calif.）。每一螢光團具有特性峰激發及發射波長，因此使得可能例如藉由使用螢光活化細胞分選儀器，諸如Becton-Dickinson FACSCALIBURTM 或FACSARIATM 系統來在螢光團之間進行區分。針對單細胞分析之背景幕（backdrop），初始相對經鑑別的記憶細胞的數量可隨時間推移（例如，在變化的時間點偵測細胞時）變化。 [實例6：在患有自體免疫病症的患者中驗證標誌及計量活性位準及/或隨自體免疫破壞之時間推移的進程的自體免疫細胞生物標誌]
疾病特異性及/或抗原特異性記憶T細胞可用於評估自體免疫活性或疾病進程之位準。在不受理論約束的情況下，咸信整體記憶T細胞增加，因為自體免疫過程活化初始T細胞，隨後其變成疾病特異性T細胞並增大記憶T細胞池。因此，初始相對新鑑別的疾病特異性記憶細胞的數量可用於測定疾病之進程，從而提供強得多的訊號，其相對於在等式中使用全部記憶細胞池而言具有增加的精度、靈敏度、及特異性，尤其在自體免疫過程早期如此。例如，2019年5月9日公開的Orban的美國專利申請公開案第2019/0137483號（以全文引用方式併入本文）中所揭示的用於診斷自體免疫性存在的自體免疫細胞標誌經測試來測定標誌可預知自體免疫病症（諸如類風濕性關節炎、多發性硬化症、或1型糖尿病）之強度及其即將病發。更特地而言，對來自受試者的血液樣品執行流式細胞術以鑑別表現型標誌。使用螢光活化細胞分選（FACS），使用以螢光團標記的抗CD4抗體偵測CD4+細胞。對於同時偵測CD45RO而言，亦使用具有另一螢光團的特異性抗CD45RO抗體。（螢光標記的抗CD4及抗CD45RO抗體可商購自各種來源，諸如BD Biosciences of San Jose, Calif.）。每一螢光團具有特性峰激發及發射波長，因此使得可能例如藉由使用螢光活化細胞分選儀器，諸如Becton-Dickinson FACSCALIBURTM 或FACSARIATM 系統來在螢光團之間進行區分。針對單細胞分析之背景幕（backdrop），初始相對經鑑別的記憶細胞的數量可隨時間推移（例如，在變化的時間點偵測細胞時）變化。 [實例7：合成推定的(多種)抗原
經鑑別的一或多種主要抗原係在GMP條件下合成。將經合成的抗原用於臨床前測試以及人類臨床試驗。影響病理學免疫反應的抗原將為藥物開發的基礎。一些抗原可在特定患者群體中為更有效的。 [實例8：臨床前動物測試]
使用對所關注自體免疫疾病而言已知的任何可利用動物模型來進行臨床前動物測試。例如，用於乾癬的此種動物模型揭示於Bochenska等人，Int. J. Mol. Sci.，2017, 18, 2514中，其以全文引用方式併入本文。用於候選抗原測試的兩個適合的動物模型為：（a）帶有乾癬皮膚移植物的SCID/SCID小鼠及（b）使用施加至皮膚的62.5mg/日劑量的5% 咪喹莫特（imiquimod）在Balb/c小鼠中誘導乾癬。在誘導乾癬模型中，表現型乾癬斑塊相當快地生成（皮膚背側上5-6天）且顯示與人類疾病自身的良好相似性。
採用在動物模型中測試候選藥物的毒物學協定，利用用於人類試驗的計分法（乾癬面積及嚴重度指數（Psoriasis Area and Severity Index；PASI）計分（其中PASI 90指示自基線PASI計分的90%或更大改良）及靜態醫師整體評價（static Physician's Global Assessment；sPGA））評估藥物對皮膚病灶的效果。動物研究將以2 mg人類劑量當量之劑量在小鼠中開始。 [實例9：人類試驗]
測試當前的免疫抑制藥物且將其用於所有具有潛在嚴重副作用的乾癬或其他自體免疫病狀治療。本文描述的基於抗原的方法係非免疫抑制性的，其具有最小至輕度的潛在副作用。
使用美國國家癌症學會之不利事件通用術語準則（National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Event；CTCAE）進行1期臨床試驗以測試藥物安全性且監視不利事件。臨床試驗為安慰劑對照雙盲、四臂臨床試驗，其中每一臂20位患者。三臂接受活性藥物（劑量逐步升高）而一臂接收安慰劑。自臨床前研究外推起始劑量。 以下參考文獻併入本文中以達其賦能熟習此項技術者實踐上文所述的方法的程度： 1  Greb J. E.等人，Psoriasis.Nat Rev Dis Primers 2:16082 (2016)。 2  Icen M.等人，Trends in incidence of adult-onset psoriasis over three decades: a population-based study.J Am Acad Dermatol 60(3):394-401 (2009)。 3  Raphael I.等人，T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases.Cytokine 74(1):5-17 (2015)。 4  Lande R.等人，Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.Sci Transl Med 3(73): 73ra19 (2011)。 5  Lande R.等人，Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide.Nature 449:564-569 (2007)。 6  Nederstigt C.等人，Incidence and prevalence of thyroid dysfunction in type 1 diabetes.J Diabetes Complications 30(3):420-425 (2016)。 7  Bakker S. F.等人，Screening for coeliac disease in adult patients with type 1 diabetes mellitus: myths, facts and controversy.Diabetol Metab Syndr 8:51 (2016)。 8  Valdimarsson H.等人，Psoriasis--as an autoimmune disease caused by molecular mimicry.Trends Immunol 30(10):494-501 (2009)。 9  Prinz J. C. Melanocytes: Target Cells of an HLA-C*06:02-Restricted Autoimmune Response in Psoriasis.J Invest Dermatol 137(10):2053-2058 (2017)。 10 Lande R.等人，The antimicrobial peptide LL37 is a T-cell autoantigen in psoriasis.Nature Communications 5:5621 (2014)。 11.      Kim S. M.等人，Analysis of the paired TCR alpha-and beta-chains of single human T cells.PLoS ONE 7(5): e37338 (2012)。 12 Bochenska K.等人，Models in the Research Process of Psoriasis.Int J Mol Sci 18(12) 2514 (2017)。 13 Paul C.等人，Ixekizumab provides superior efficacy compared with ustekinumab over 52 weeks of treatment: Results from IXORA-S, a phase 3 study.J Am Acad Dermatol 80(1):70-79 (2019)
無。
無。
無。

Claims (62)

  1. 一種自患有乾癬的受試者製備免疫細胞樣品的方法，前述方法包含以下步驟： 獲得乾癬組織樣品；及 使用雷射擷取顯微解剖自前述乾癬組織樣品原位分離單一免疫細胞。
  2. 一種自患有乾癬的受試者製備免疫細胞樣品的方法，前述方法包含以下步驟： 獲得乾癬組織樣品；及 使用實質上不改變免疫細胞之細胞生物化學概況的技術自前述乾癬組織樣品原位分離活的單一免疫細胞。
  3. 如請求項1所述之方法，其中前述技術包含以下一或多種：雷射擷取顯微解剖，視情況，免疫引導雷射擷取顯微解剖；顯微操作；真空脈衝輔助技術；免疫磁性細胞分離；密度梯度離心；沉降；黏著；適配體；浮力活化細胞分選；螢光活化細胞分選（FACS）；及微流體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中前述乾癬組織樣品為約5 μm至約15 μm厚。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中前述乾癬組織樣品係藉由自乾癬病灶水平地切割生檢試樣來獲得。
  6. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中前述乾癬組織樣品係藉由在微摻合機中將自乾癬病灶獲得的生檢試樣摻合來獲得。
  7. 如請求項5或6所述之方法，其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）壓縮前述乾癬組織樣品，及 （b）將經壓縮的樣品塗抹在載玻片上。
  8. 如請求項7所述之方法，其中前述壓縮係利用平坦的圓形固體玻璃頭來執行。
  9. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中前述乾癬組織樣品係藉由垂直地切割自乾癬病灶獲得的生檢試樣來獲得。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）凍結前述乾癬組織樣品，及 （b）切斷經凍結的樣品。
  11. 如請求項10所述之方法，其中前述凍結包含將前述生檢試樣敷設在乾冰上。
  12. 如請求項10所述之方法，其中前述凍結係利用液態氮蒸汽或異戊烷。
  13. 如請求項10至12中任一項所述之方法，其進一步包含在切斷前述經凍結的樣品之前將前述乾癬組織樣品嵌入在嵌埋基底中。
  14. 如請求項13所述之方法，其中前述嵌入係在凍結前述乾癬組織樣品之前執行。
  15. 如請求項13或14所述之方法，其中前述嵌埋基底為黃芪膠或最佳切割溫度（OTC）介質。
  16. 如請求項10至15中任一項所述之方法，其中前述切斷係利用切片機或低溫恆溫器來執行。
  17. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中前述乾癬組織樣品係藉由切割自乾癬病灶獲得的生檢試樣來獲得，且其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）急驟凍結前述乾癬組織樣品， （b）將經凍結的樣品粉碎成碎片， （c）解凍前述碎片， （d）垂直地粉碎一或多個經解凍的前述碎片且水平地推動一或多個經解凍的前述碎片，且隨後 （e）將前述碎片塗抹在載玻片上。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之方法，其進一步包含在生長培養基中培養經分離的免疫細胞。
  19. 如請求項1至17中任一項所述之方法，其進一步包含偵測及分析與經分離的免疫細胞相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合。
  20. 如請求項18所述之方法，其進一步包含偵測及分析與經培養的免疫細胞中的一或多個相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、轉錄因子、細胞介素、或其組合。
  21. 如請求項19或20所述之方法，其中前述偵測係經由流式細胞術、深測序、分光光度測定法、或酶聯免疫吸附檢定來執行。
  22. 如請求項18、20、或21所述之方法，其進一步包含對經培養的前述免疫細胞執行抗原挑戰。
  23. 如請求項22所述之方法，其中前述抗原挑戰包含使前述免疫細胞與抗原接觸，且隨後偵測及分析與經培養的前述免疫細胞或經分離的前述免疫細胞中的一或多個相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、新合成的DNA、ATP、轉錄因子、細胞介素、或其組合。
  24. 如請求項22或23所述之方法，其中前述抗原為角蛋白、ADAMTSL5、或LL37。
  25. 如請求項22至24中任一項所述之方法，其中將前述抗原與自前述受試者獲得的皮膚組織樣品分離。
  26. 如請求項25所述之方法，其進一步包含以下步驟： （a）將前述皮膚組織樣品均質化及分餾， （b）使用經均質化及經分餾的前述皮膚組織樣品進行前述抗原挑戰， （c）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的分餾物， （d）藉由執行三維凝膠層析來分離經偵測的前述分餾物中的多肽， （e）使用經分離的前述多肽進行前述抗原挑戰，及 （f）基於存在或不存在T細胞表面標誌、新合成的DNA、ATP、轉錄因子、細胞介素、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的經分離的前述多肽。
  27. 如請求項25或26所述之方法，其進一步包含在自前述受試者獲得的周邊血液樣品中偵測存在或不存在（i）具有經偵測的T細胞表面標誌及/或轉錄因子的一或多種免疫細胞及/或（ii）誘導T細胞刺激的經分離的前述多肽。
  28. 如請求項26所述之方法，其進一步包含合成誘導T細胞刺激的前述多肽中的一或多種。
  29. 如請求項28所述之方法，其進一步包含將前述多肽中的一或多種投與至患有乾癬的受試者。
  30. 如請求項1至18中任一項所述之方法，其進一步包含在誘導Treg 細胞之形成的生長培養基中培養經分離的前述免疫細胞，及 將前述Treg 細胞投與至患有乾癬的受試者。
  31. 一種自患有自體免疫病症的受試者製備免疫細胞樣品的方法，前述方法包含以下步驟： 自前述受試者獲得組織樣品；及 使用雷射擷取顯微解剖或真空脈衝輔助技術自前述組織樣品原位分離單一免疫細胞。
  32. 一種自患有自體免疫病症的受試者製備免疫細胞樣品的方法，前述方法包含以下步驟： 獲得組織樣品；及 使用實質上不改變免疫細胞之細胞生物化學概況的技術自前述組織樣品原位分離活的單一免疫細胞。
  33. 如請求項32所述之方法，其中前述技術包含：雷射擷取顯微解剖，視情況，免疫引導雷射擷取顯微解剖；顯微操作；真空脈衝輔助技術；免疫磁性細胞分離；密度梯度離心；沉降；黏著；適配體；浮力活化細胞分選；螢光活化細胞分選（FACS）；及微流體。
  34. 如請求項31至33中任一項所述之方法，其中前述自體免疫病症為乾癬、1型糖尿病、類風濕性關節炎、或多發性硬化症。
  35. 如請求項31至34中任一項所述之方法，其中前述組織樣品為約5 μm至約15 μm厚。
  36. 如請求項31至35中任一項所述之方法，其中前述組織樣品係藉由自受影響組織水平地切割生檢試樣來獲得。
  37. 如請求項31至35中任一項所述之方法，其中前述組織樣品係藉由在微摻合機中將自受影響組織獲得的生檢試樣摻合來獲得。
  38. 如請求項36或37所述之方法，其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）壓縮前述組織樣品，及 （b）將經壓縮的樣品塗抹在載玻片上。
  39. 如請求項38所述之方法，其中前述壓縮係利用平坦的圓形固體玻璃頭來執行。
  40. 如請求項31至35中任一項所述之方法，其中前述組織樣品係藉由垂直地切割自受影響組織獲得的生檢試樣來獲得。
  41. 如請求項31至40中任一項所述之方法，其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）凍結前述組織樣品，及 （b）切斷經凍結的樣品。
  42. 如請求項41所述之方法，其中前述凍結包含將前述生檢試樣敷設在乾冰上。
  43. 如請求項41所述之方法，其中前述凍結係利用液態氮蒸汽或異戊烷。
  44. 如請求項41至43中任一項所述之方法，其進一步包含在切斷前述經凍結的樣品之前將前述組織樣品嵌入在嵌埋基底中。
  45. 如請求項44所述之方法，其中前述嵌入係在凍結前述組織樣品之前執行。
  46. 如請求項44或45所述之方法，其中前述嵌埋基底為黃芪膠或最佳切割溫度（OTC）介質。
  47. 如請求項41至46中任一項所述之方法，其中前述切斷係利用切片機或低溫恆溫器來執行。
  48. 如請求項31至35中任一項所述之方法，其中前述組織樣品係藉由切割自受影響組織獲得的生檢試樣來獲得，且其中前述方法進一步包含以下步驟： （a）急驟凍結前述組織樣品， （b）將經凍結的樣品粉碎成碎片， （c）解凍前述碎片， （d）垂直地粉碎一或多個經解凍的前述碎片且水平地推動一或多個經解凍的前述碎片，且隨後 （e）將前述碎片塗抹在載玻片上。
  49. 如請求項31至48中任一項所述之方法，其進一步包含在生長培養基中培養經分離的免疫細胞。
  50. 如請求項31至48中任一項所述之方法，其進一步包含偵測及分析與經分離的免疫細胞相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合。
  51. 如請求項49所述之方法，其進一步包含偵測及分析與經培養的免疫細胞中的一或多個相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合。
  52. 如請求項50或51所述之方法，其中前述偵測係經由流式細胞術、深測序、分光光度測定法、或酶聯免疫吸附檢定來執行。
  53. 如請求項31至52中任一項所述之方法，其進一步包含鑑別刺激經分離的前述免疫細胞的一或多種主要抗原。
  54. 如請求項53所述之方法，其中前述鑑別包含培養經分離的前述免疫細胞以產生經培養的免疫細胞，且對經培養的前述免疫細胞執行抗原挑戰。
  55. 如請求項54所述之方法，其中前述抗原挑戰包含使前述免疫細胞與抗原接觸，且隨後偵測及分析與經培養的前述免疫細胞或經分離的前述免疫細胞中的一或多個相關聯的基因體學、轉錄組學、蛋白質體學、代謝體學、T細胞表面標誌、T細胞受體、單細胞基因組（DNA）序列、新合成的DNA、ATP、轉錄因子、細胞介素、或其組合。
  56. 如請求項55所述之方法，其中將前述抗原與自前述受試者獲得的組織樣品分離。
  57. 如請求項56所述之方法，其進一步包含以下步驟： （a）將前述組織樣品均質化及分餾， （b）使用經均質化及經分餾的前述組織樣品進行前述抗原挑戰， （c）基於存在或不存在T細胞表面標誌、轉錄因子、細胞介素、新合成的DNA、ATP、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的分餾物， （d）藉由執行三維凝膠層析來分離經偵測的前述分餾物中的多肽， （e）使用經分離的前述多肽進行前述抗原挑戰，及 （f）基於存在或不存在T細胞表面標誌、新合成的DNA、ATP、轉錄因子、細胞介素、或其組合來偵測誘導T細胞刺激的經分離的前述多肽。
  58. 如請求項56或57所述之方法，其進一步包含在自前述受試者獲得的周邊血液樣品中偵測存在或不存在（i）具有經偵測的T細胞表面標誌及/或轉錄因子的一或多種免疫細胞及/或（ii）誘導T細胞刺激的經分離的前述多肽。
  59. 如請求項57所述之方法，其進一步包含合成誘導T細胞刺激的前述多肽中的一或多種。
  60. 一種治療患有自體免疫病症或具有患上自體免疫病症風險的受試者的方法，前述方法包含向前述受試者投與治療有效量之請求項53至57中任一項中所鑑別的一或多種前述主要抗原。
  61. 如請求項31至57中任一項所述之方法，其進一步包含在誘導調節免疫細胞之形成的生長培養基中培養前述免疫細胞。
  62. 一種治療患有自體免疫病症或具有患上自體免疫病症風險的受試者的方法，前述方法包含向前述受試者投與治療有效量之請求項61所誘導的前述調節免疫細胞。
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