DE112006001276T5 - Verfahren und Systeme für das Sammeln von Zellen im Anschluss an Laser-Mikrodissektion - Google Patents

Verfahren und Systeme für das Sammeln von Zellen im Anschluss an Laser-Mikrodissektion Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Sammlung von Zellen aus Gewebe, wobei das Verfahren umfasst:
Anbringen einer negativ geladenen Membran auf einer ersten Seite eines Substrats;
Anbringen eines Zielobjekts auf der Membran;
Positionieren eines Sammlungsmaterials neben dem Zielobjekt;
Durchführen eines Laserstrahls von einer zweiten Seite des Substrats durch das Substrat, die Membran und das Zielobjekt, um Zielbereiche aus dem Zielobjekt zu präparieren, wodurch die präparierten Zielbereiche an dem Sammlungsmaterial anhaften.

Description

  • PRIORITÄT
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der Anmeldung Nummer 200510034838.3 , eingereicht in der Republik China am 20. Mai 2005.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren und ein neues System für die kontaktfreie Sammlung von Zellen oder anderer Zielbereiche im Anschluss an Laser-Mikrodissektion aus Gewebeabschnitten, Zellpräparationen, die aus Gewebe stammen, anderen biologischen Materialien oder nicht biologischen Materialen, die auf einem speziell präparierten Objektträger angebracht wurden.
  • In dem Gebiet der Biowissenschaft ist die Auswahl und die erfolgreiche Sammlung interessierender homogener Zellen aus heterogenen Gewebeproben ohne Kontamination eine Voraussetzung für die genaue und spezifische Isolierung und Charakterisierung von biologisch relevanten Molekülen, die den normalen, kranken oder malignen Zustand der Zellpopulation betreffen.
  • Die früheste Technik für die Mikrodissektions-Separation verwendete eine Glasnadel oder ein anderes Werkzeug, um Zielbereiche mechanisch von den Gewebeabschnitten zu separieren, eine Operation, die per Hand oder unterstützt durch einen Manipulator erfolgte. Dieses Verfahren wies viele Nachteile auf, einschließlich einem hohen Schwierigkeitsgrad, einem hohen Zeitverbrauch, einer geringen Effizienz und Präzision, einer hohen Anforderung an die Fähigkeiten des Operateurs und einer geringen Bioaktivität von separierten biologischen Proben, die durch die mechanische Beschädigung verursacht wurde.
  • 1996 wurde der Laser eingeführt, um präzise mikroskopische Zielbereiche von Interesse auszuschneiden bzw. zu präparieren („dissect"). Seit dieser Zeit werden Laser-Mikrodissektionssysteme für die Dissektion und Separation im Gebiet der Biologie und der Medizin verwendet. Laser-Mikrodissektionssysteme sind gekennzeichnet durch eine hervorragende Effizienz der Präparation, der hohen Wirksamkeit des Sammelns und der rechtzeitigen Komplettierung; es gibt geringfügige nachteilige Wirkungen auf die nachfolgende Analyse der Gene oder Proteine. Bisher umfassen die Techniken für die Separation und Sammlung auf der Grundlage von Laser-Mikrodissektion die Laser Capture Microdissection Technik (LCM), die Laser Pressure Catapulting Technik (LPC), die klebrige Membran-Transfertechnik (sticky membrane transfer technique) und eine Sammlungstechnik unter Verwendung der Schwerkraft. Diese unterschiedlichen Verfahren für die Sammlung sind die Kerntechniken des Laser-Mikrodissektionssystems.
  • Die Laser Capture Microdissection Technique nutzt einen Niederenergieinfrarotlaser, um einen speziellen thermoplastischen Film über Zielbereichen der Gewebeabschnitte zu schmelzen (zum Beispiel, Bear et al., Laser Capture Microdissection Method and Apparatus, PCT Nr. PCT/US98/02388 ). Der geschmolzene Film dehnt sich nach Aufnahme der Laserenergie aus und bindet an die darunter liegenden Gewebebereiche. Wenn der Film entfernt wird, werden die an den Film anhaftenden Zielbereiche erfolgreich von den Gewebeabschnitten separiert. Die Hauptnachteile dieser Technik schließen eine mechanische Beschädigung der biologischen Proben während der Separation und eine geringe Präzision ein, weil der Film ebenfalls an Zellen um die Zielbereiche herum anhaften kann.
  • Die Laserkatapulttechnik verwendet einen Laserstrahl zum Präparieren der Zielbereiche, gefolgt davon, dass der Laser defokussiert wird, um auf das Glas aufzutreffen was zu einer photoakustischen Druckwelle führt, was die ausgeschnittenen Zielbereiche dazu bringt, durch Überwindung der Schwerkraft in eine Sammlungsvorrichtung katapultiert zu werden (zum Beispiel, United States Patent Nr. 5,998,129 nach Schutze et al., Method and Device for the Contactless Laser Assisted Microinjection, Sorting and Production of Biological Objects Generated in a Planar Manner). Die Nachteile dieser Technik schließen die zusätzliche für die Defokussierung des Lasers erforderliche Zeit ein, dann die Refokussierung auf die Probe und die Möglichkeit, dass der UV-Laserstrahl auf die Mitte der Zelle auftreffen kann, wo die DNS (engl.: DNA) und die RNS (engl.: RNA) durch den Laser verändert werden können.
  • Die klebrige Membran-Transfertechnik nutzt eine spezielle klebrige Membran, um ausgeschnittene Zielbereiche anzuhaften und die Probe nach dem Präparieren zu sammeln (zum Beispiel, M. Böhm et al., Membrane-Based Laser Microdissection in Molecular Oncology, ONKOLOGIE, 2000; 22: 296–301). Die in diesem Verfahren verwendete Membran kann zu höheren Kosten führen.
  • Die Sammlung durch die Schwerkraft muss auf dem aufrechtem Mikroskop aufgebaut sein (Koelble et al., The Leica Microdissection System: Design and Applications, J. MOL MED. 78 (7): B24–25,2000). Die ausgeschnittenen Zielbereiche fallen durch die Schwerkraft direkt in einen Sammlungsbehälter, der unterhalb der Objektivlinse und dem Mikroskopobjektträger angeordnet ist (welcher umgedreht werden muss, um ihn auf dem Gestell des Mikroskops vor dem Beginn der Prozedur anzuordnen). Das Verfahren kann einige Beschränkungen in der Anwendung verbunden mit einem aufrechten Mikroskop haben. Zum Beispiel ist dieses System aufgrund des kurzen Arbeitsabstands der Objektive nicht in der Lage, in Flaschen kultivierte lebende Zellen zu präparieren.
  • Es gibt einen Bedarf für ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Zellen im Anschluss an Laser-Mikrodissektion zu sammeln, die die Probleme des Stands der Technik vermeiden. Die vorliegende Erfindung stillt dieses Bedürfnis.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Kurz gefasst, und in Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden, ist die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren für die Sammlung von Zielbereichen aus einem Zielobjekt. Das Verfahren in einer Ausführungsform umfasst das Anbringen einer negativ geladenen Membran auf einer ersten Seite eines Substrats, das Anbringen eines Zielobjekts auf der Membran, Positionieren eines Sammlungsmaterials neben das Zielobjekt und Durchführen eines Laserstrahls von einer zweiten Seite des Substrats durch das Substrat, die Membran und das Zielobjekt, um Zielbereiche aus dem vorbereiteten Gewebeabschnitt zu präparieren, wodurch die präparierten Zielbereiche an das Sammlungsmaterial anhaften. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Zielobjekte Gewebe und die Zielbereiche sind Zellen.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung ein System für das Sammeln von Zielbereichen aus einem Zielobjekt. In einer Ausführungsform umfasst das System ein Substrat mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, einer an der ersten Seite des Substrats anhaftenden, negativ geladenen Membran und einem Sammlungsmaterial, das neben der Membran angebracht werden kann. In einer anderen Ausführungsform umfasst das System weiterhin ein umgekehrtes Mikroskop bzw. gestürztes Mikroskop (inverted microscope), ein Gestell für das Halten des Substrats über dem Mikroskop, einen Generator, der betrieben werden kann, um einen Laserstrahl durch das Substrat von der zweiten Seite zu führen, und um Zielbereiche aus dem auf der Membran angebrachten Zielobjekt zu präparieren, wodurch die präparierten Bereiche an das Sammlungsmaterial anhaften. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Zielobjekte Gewebe und die Zielbereiche sind Zellen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Organisation und die Art der Struktur und der Funktionsweise der Erfindung können zusammen mit anderen Aufgaben und Vorteilen davon am besten durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung zusammengenommen mit den beigefügten Zeichnungen verstanden werden, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente bezeichnen, in welchen:
  • 1 ist eine Gesamteinsicht eines Laser-Mikrodissektionssystem der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 2A ist eine Seitenaufrissansicht einer Membran, eines Glasobjektträgers und eines Klebstoffs der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 2B ist die in 2A veranschaulichte Kombination, die neben einem Sammlungsmaterial der bevorzugten Ausführungsform angeordnet ist und mikropräparierte (microdissected) Gewebezellen zeigt.
  • 2C ist die in 2B veranschaulichte Kombination, die die mikropräparierten Zellen zeigt, die an dem positiv geladenen Sammlungsmaterial anhaften.
  • 2D ist eine Seitenansicht eines Zentrifugationsröhrchens, das Lysepuffer und mikropräparierte Zellen mit der negativ geladenen Membran enthält.
  • 3A ist eine perspektivische Draufsicht auf einen membranbeschichteten Objektträger der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 3B ist eine Ansicht des Objektträgers der 3A mit einem darauf angebrachten Gewebe.
  • 4A ist eine perspektivische Draufsicht auf den Streifen der Sammlungsvorrichtungen der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 4B ist eine perspektivische Draufsicht auf den Streifen der 4A, der über dem Objektträger der 3B angeordnet ist.
  • 5A ist ein Bild einer Gewebeprobe, die durch ein umgekehrtes Mikroskop vor einer Runde der Laser-Mikrodissektion genommen wurde.
  • 5B ist ein Bild der Gewebeprobe der 5A, das während der Laser-Mikrodissektion aufgenommen wurde.
  • 5C ist ein Bild der Gewebeprobe der 5B, das zeigt, dass der ausgeschnittene Zielbereich aus dem Gewebeabschnitt durch die elektrostatische Kraft abgestoßen wurde.
  • 5D ist ein Bild der Gewebeprobe der 5C, das zeigt, dass nach Laser-Mikrodissektion der präparierte Zielbereich auf der Oberfläche des Agargel-Sammlungsmaterials eingefangen ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Während die Erfindung empfänglich für Ausführungsformen in verschiednen Formen ist, wird in den Zeichnungen und hierin ausführlich eine spezifische Ausführungsform beschrieben, mit dem Verständnis, dass die vorliegende Offenbarung eine beispielhafte Offenbarung der Prinzipien der Erfindung ist, und nicht beabsichtigt, die Erfindung auf das, was hier veranschaulicht und beschrieben wird, zu begrenzen.
  • Das neuartige Verfahren und die neuartige Vorrichtung der vorliegenden Erfindung besteht aus dem kontaktfreien Transfer eines Zielbereichs aus einem Zielobjekt, wie etwa Zellen in einem angebrachten Gewebeabschnitt auf einem gebrauchsfertigen Objektträger, durch elektrostatische Abstoßung bzw. Repulsion der kleinen Masse der Zielbereiche durch die statische elektrische Ladung der viel größeren dielektrischen Membran, auf welcher die Gewebeabschnitte angebracht sind, und die nachfolgende elektrostatische Festhaltung der Laser-mikrodissektierten Zielbereiche an ein polares Sammlungsmaterial, wie etwa ein Agargel, das oberhalb des gebrauchsfertigen Objektträgers angeordnet ist. Die elektrostatische Abstoßung der Laser-dissektierten kleinen Masse wirkt effektiv als ein Antriebsauslöser der Zielbereiche der die Schwerkraft für die Zielbereiche ausreichend lange überwindet, um das Agargel in dem Sammlungsbehälter der über dem gebrauchsfertigen Objektträger angeordnet ist, zu erreichen, und die Gewebeabschnitte, Zellen oder anderen daran angebrachten Material daran anzuhaften.
  • Wie in der 1 gezeigt, schließt das Laser-Mikrodissektionssystem in der vorliegenden Erfindung ein umgekehrtes biologisches Mikroskop 1, einen Lasergenerator 2, ein motorisiertes Gestell 3, einen Drei-Achsen-Joystick 4, eine zentrale Steuerung 5, eine Kamera 6 und einen Computer 7 ein.
  • Wie in der 3A gezeigt, wird eine negativ geladene Membran 10 an eine erste Seite eines Substrats 8 angeheftet. Das Substrat 8 in der veranschaulichten Ausführungsform ist ein Standardobjektträger aus Glas für Mikroskope, mit einer Dicke von etwa 1,0 mm. Das Substrat 8 kann alternativ ein Substrat aus Siliciumoxidgrundlage, wie etwa ein Wafer, sein, oder kann ein Biochip, ein Polymer oder ein anderes Material für das Halten des Zielobjekts sein.
  • Die Membran 10 ist bevorzugt ein Material mit einer hohen dielektrischen Leistungsfähigkeit der Zurückhaltung einer starken elektrostatischen Ladung, die für den Abstoßungsantrieb und den Antrieb einer kleinen, negativ geladenen Masse von der ersten Seite des Substrats 8 geeignet ist. Das Material der Membran 10 absorbiert stark UV, Nahe-UV und violette Strahlung (etwa 199 bis 440 nm). Die Membran 10 lässt bevorzugt sichtbares Licht (etwa 450 bis 760 nm) zu wenigstens 90%, am bevorzugtesten zu wenigstens 95%, durch.
  • Die Membran 10 ist bevorzugt ein dünner Polyimidfilm, wie etwa das Material, das unter dem Markennamen Kapton® durch E.I. du Pont de Nemours und Company verkauft wird, am bevorzugtesten die Typen HN, VN und FN. Die Membran 10 kann ebenfalls aus einem anderen Polymermaterial, wie etwa einem Thermoplasten, einem duroplastischen Polymer, einem Elastomer, einem nichtleitfähigen Polymer oder Kombinationen dieser Materialien hergestellt sein. Geeignete Materialien schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Styrol, Polyurethan, Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Cellulose, Gelatine, Chitin, Polypeptide, Polysaccharide, Polynukleotide und Kombinationen dieser Materialien. Die Membran 10 kann ebenfalls aus einem keramischen Hybridpolymer, einem Phospinoxid oder einem Chalcogenid hergestellt sein.
  • Die Membran 10 wird in eine rechteckförmige Größe ein wenig kleiner als die Größe des Substrats 8 geschnitten. Die Membran 10 hat bevorzugt eine Dicke von acht μm, um dem Laserstrahl zu ermöglichen ohne offensichtlichen Energieverlust durchzutreten, wodurch die Wirksamkeit der Dissektion sichergestellt und die elektrostatische Sammlung erleichtert wird.
  • Der Außenbereich der Membran 10 wird an das Substrat 8 durch einen Klebstoff 14 gebunden, wie in der 2A gezeigt (es ist zu bemerken, dass die Mitte der Membran 10 ohne Klebstoff 14 belassen wird). In dem Fall, wo das Zielobjekt 12 eine präparierte Gewebeprobe ist, ist der Klebstoff 14 bevorzugt ein lichthärtbar, bevorzugt UV-härtbar, Klebstoff in medizinischer Reinheit, der kompatibel mit der Analyse nach der Sammlung der biologischen Materialien ist. In der veranschaulichten Ausführungsform wird die Isolation und Identifikation von Nukleotiden (DNS, RNS, iRNS, usw.) betrachtet, sodass der Klebstoff 14 so ausgewählt werden muss, dass er nicht mit der Analyse nach Mikrodissektion interferiert. Der Klebstoff 14 kann, als ein Beispiel aber nicht als Beschränkung, auf Acrylgrundlage, Silikongrundlage oder Cyanoacrylatestergrundlage sein.
  • In dem Fall, wo der Klebstoff 14 ein ultravioletthärtender Klebstoff ist, wird die Kombination der Membran 10, des Substrats 8 und des Klebstoffs 14 mit ultravioletten Strahlen für etwa fünfzehn Sekunden bestrahlt und wird dann in einer reinen Umgebung für die weitere Anwendung gelagert.
  • Wie in den 2A und 3B gezeigt, wird ein Zielobjekt 12 direkt auf die Mitte der Membran 10 angebracht. In der veranschaulichten Ausführungsform ist das Zielobjekt 12 ein vorbereiteter Gewebeabschnitt, wie etwa ein gefrorener Abschnitt oder ein in Paraffin eingebetteter Abschnitt. Eine herkömmliche Behandlung und Färbung kann vor der Laser-Dissektion des Gewebeabschnitts erfolgen.
  • Das Zielobjekt 12 wird dann über dem umgekehrten Mikroskop 1 positioniert. Ein Laserstrahl, der durch den Lasergenerator 2 erzeugt wird, wird durch das Objektiv des Mikroskops 1 und durch das Substrat 8 geführt und zerschneidet schließlich das Zielobjekt 12 zusammen mit der angehafteten Membran 10. Der Verwender der bevorzugten Ausführungsform, der das vergrößerte Zielobjekt 12 durch das Okular oder die Okulare des Mikroskops 1 sieht, manipuliert den Laserstrahl unter Verwendung des Joysticks 4, um die Mikrodissektion auszuführen.
  • In der veranschaulichten Ausführungsform hält ein Streifen 17 auf dem Gestell 3 eine Reihe von Zentrifugenröhrchenkappen 16, die ein Sammlungsmaterial 18 enthalten, wie in den 4A und 4B gezeigt. Das Sammlungsmaterial 18 ist entweder ein positiv geladenes Material oder ein polares Material mit sowohl positiven als auch negativen Ladungen. Das Sammlungsmaterial 18 ist bevorzugt eine mit Phosphat gepufferte Saline (PBS) mit Agar, bevorzugt in einer Konzentration von 1,0 bis 2,5 Gewicht-zu-Volumen-Prozent, am meisten bevorzugt 1,5 Prozent Agar. Dieses Material wird bei Raumtemperatur ein Gel sein aber wird bei 45 bis 50°C zu einer Flüssigkeit schmelzen.
  • In der veranschaulichten Ausführungsform wird ein Agargel hergestellt durch Tropfen der Agarlösung in PBS in die Kappen 16 bis die Lösung verfestigt ist. Die Oberfläche des Agargels ist leicht niedriger als der Rand der Kappe 16. Die Kappen 16, die das Agargel enthalten, werden verpackt und bei 4°C über Nacht gelagert.
  • Der Streifen 17 wird dann manipuliert, um eine einzelne Kappe 16 direkt oberhalb des Zielobjekts 12 zu positionieren, wie in der 4B gezeigt. In dem Fall, wo das Zielobjekt 12 ein präparierter Gewebeabschnitt ist, ist der Spaltabstand weniger als 0,5 mm. Der Streifen 17 in der bevorzugten Ausführungsform wird manuell bedient, kann aber ebenfalls durch mechanische Bestandteile bedient werden.
  • Der Bediener manipuliert den durch den Lasergenerator 2 erzeugten Laserstrahl unter Verwendung des Joysticks 4, um interessierende Bereiche innerhalb des Zielobjekts zu separieren. Der Verwender bestimmt, welche der interessierenden Regionen der Dissektion unterzogen werden und verwendet den Laserstrahl, um Zielbereiche 20 und ihre angehaftete Membran 10 zu präparieren. Wenn der Bediener den Zielbereich 20 präpariert, um diesen Zielbereich 20 von dem Rest des Zielobjekts 12 zu separieren, werden der ausgeschnittene Zielbereich 20 und die angehaftete negativ geladene Membran 10 von dem Sammlungsmaterial 18 gerade oberhalb des Zielobjekts 12 angezogen und auf der Oberfläche des Sammlungsmaterials 18 in der Kappe 16 eingefangen (wie in den 2C und 5D gezeigt).
  • Ein Forscher kann die Anzahl der Zielbereiche 20, welche an der Oberfläche des Agargels 18 angehaftet sind beobachten und die Effizienz der Dissektion bewerten. Eine Anzahl der Zielbereiche 20 eines speziellen Typs kann in einer einzelnen Kappe 16 gesammelt werden. Der Bediener kann den Streifen 17 dann manipulieren, um eine andere Kappe 16 über dem Zielobjekt 12 anzuordnen, und kann dann die Zielbereiche 20 eines unterschiedlichen Typs, aber aus dem gleichen Gewebe, in dieser Kappe 16 sammeln. Alternativ dazu kann natürlich ein anderes Substrat 8 mit einem anderen Zielobjekt 12 für die Sammlung der Zielbereiche 20 des gleichen Typs aber aus einer unterschiedlichen Quelle eingefügt werden. In der veranschaulichten Ausführungsform gibt es acht Kappen 16 im Streifen 17, aber die Kappen 16 können alleine, angeordnet in einer Anordnung (Array) oder in einer anderen Art und Weise ausgerichtet verwendet werden.
  • Nachdem die Zielbereiche 20 präpariert und gesammelt wurden, werden die Kappen 16, die die Zielbereiche 20 auf der Oberfläche des Sammlungsmaterials 18 tragen (wie veranschaulicht, das Agargel), vorsichtig vom Streifen 17 entfernt und fest mit ihren entsprechenden Zentrifugenröhrchenkörpern 21, wie in der 2D gezeigt, verbunden. Der Verwender schüttelt die Röhrchenkörper 20 manuell oder unter Verwendung eines Laborschüttlers, um den geeigneten Lysepuffer 22, der vorher in jeden Röhrchenkörper 21 gegeben wurde, mit den Zielbereichen 20 in Kontakt zu bringen, sodass die Zielbereiche 20, die auf der Oberfläche des Agargels 18 haften, in den Lysepuffer 22 herunterfallen werden und auf eine nachfolgende biologische Analyse warten.
  • Eine automatische Mikrodissektionsfunktion kann nach Konturierung aller zu präparierender Zielbereiche 20 verwendet werden. Die Höhe des Streifens 17 kann eingestellt werden und der Abstand zwischen dem gefrorenen Gewebeabschnitt 12 und der Oberfläche des Agargels 18 wird so klein wie möglich verkürzt, aber ohne das Agargel 18 mit dem Gewebeabschnitt 12 direkt in Kontakt zu bringen. Das Agargel 18 wird wie vorher erwähnt zubereitet. Der Verwender konturiert die Zielbereiche 20 unter Verwendung des Joysticks 4, aber ohne Erzeugung eines Laserstrahls. Der Computer 7 nimmt die Bewegungen auf und speichert diese Bewegungen. Der Verwender betätigt dann die automatische Mikrodissektionsfunktion und der Computer steuert die Bewegungen des durch den Generator 2 erzeugten Laserstrahls, um die Zielbereiche 20 zu mikropräparieren. Die präparierten Zielbereiche 20 werden automatisch abgestoßen und schließlich können mehr als 80 Prozent der präparierten Zielbereiche 20 erfolgreich auf der Oberfläche des Agargels 18 in den Kappen 16 eingefangen werden.
  • Die Merkmale und Kennzeichen des vorliegenden Laser-Mikrodissektionssystem werden durch die vorliegenden Beispiele veranschaulicht, auf welche die vorliegende Erfindung nicht zu beschränken ist.
  • Beispiel 1: In diesem Beispiel kann ein umgekehrtes Spezial-20× Fluoridobjektiv in Mikroskop 1 für die Laser-Mikrodissektion verwendet werden. Dieses Objektiv hat eine hohe Durchlässigkeit für einen 337 nm ultravioletten Laserstrahl. Der Forscher kann etwa 61 Prozent der gesamten Laserleistung verwenden, um die frisch präparierten gefrorenen Gewebeabschnitte zu schneiden und eine etwa sechs nm breite Schneidelinie kann erzielt werden.
  • Für den Zweck der DNA-Analyse von Tumorzellen stromabwärts, werden acht μm dicke gefrorene Gewebeabschnitte, die aus hepatischen Karzinomen stammen, in dem pathologischen Labor unter Befolgung der Standardbehandlung präpariert und auf dem Polyimidfilm 10 auf dem regulären ein mm dicken Glasobjektträgern 8 angebracht.
  • Die gefrorenen Abschnitte 12 werden in 70 Prozent Ethanol für 15 Sekunden fixiert, in Wasser getaucht, durch ein herkömmliches Verfahren (z.B. Hämatoxylin) gefärbt und nacheinander in 50 Prozent, 70 Prozent und 100 Prozent Ethanol getaucht. Die Abschnitte 12 werden der Luft ausgesetzt, um für fünf Minuten zu trocknen. Die Objektträger können nun sofort verwendet werden (selbst wenn sie etwas feucht sind) oder bei –80°C tiefgefroren werden.
  • In diesem Beispiel kann der Forscher große Zielbereiche 20 durch das 20×-Objektiv konturieren, welche mit der Hilfe einer histochemischen Farbreaktion, einer morphologisch sichtbaren Änderung oder einer Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht werden könnten. Da ein einzelner Zielbereich 20 etwa eine bis zweihundert Zellen hat, würden etwa zehn bis zwanzig Stücke der präparierten Zielbereiche 20 die Anforderung an die Zellzahl für die DNA-Analyse erfüllen.
  • Anschließend werden die Kappen 16, die die präparierten Zielabschnitte 20 enthalten, in ein 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen 21 eingepasst und durch Schütteln fallen die präparierten Objekte 20 in die Zelllyseflüssigkeit 22 in dem Röhrchen 21 und die nachfolgende DNS-Extraktion und PCR (Polymerase-Kettenreaktion) für spezifische Gene kann einem herkömmlichen, in molekularbiologischen Laboren verwendeten Verfahren folgen. Alternativ kann eine Agargelelektrophorese verwendet werden, um die Ergebnisse der DNS-Analyse zu erhalten.
  • Beispiel 2: In diesem Beispiel kann ein Spezial-100x-Ölimmersions-Objektiv auf einem Mikroskop 1 verwendet werden, um verschiedene interessierende Zellgruppen zu isolieren und zu sammeln, selbst Einzelzellen. Die gesammelten Zellen können extrahiert und nachfolgend der stromabwärts RNS-Analyse von Tumorzellen unterzogen werden.
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden etwa acht μm dicke gefrorene Abschnitte aus Brustkarzinomgewebe auf dem Polyimidfilm 10 auf eine 0,17 mm dicken Deckglas anstelle eines 1,0 mm Glasobjektträgers präpariert, was speziell dafür ist, um mit dem 100×-Ölimmersions-Objektiv abgestimmt zu sein. Die gefrorenen Abschnitte 12 werden wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt.
  • Vor der Mikrodissektion werden die gefrorenen Abschnitte 12 aufrecht auf dem motorisierten Gestell 3 in dem vorliegenden Laser-Mikrodissektionssystem aufgebracht. Eine geringe Menge an Anisol wird auf die Oberfläche des 100×-Ölimmersions-Objektivs gegeben und das 100×-Objektiv wird in die Richtung der Rückseite des Glasdeckgläschens so nah wie möglich hochgehoben. Nach Beobachtung und Konturierung aller interessierenden separaten Zellgruppen kann der Forscher das Laser-Mikrodissektionssystem bedienen, um automatisch die Zielobjekte 20 zu isolieren. Mit der elektrostatischen Abstoßungskraft können die isolierten Zellen leicht in dem Agargel 18 in den Sammlungskappen 16 eingefangen werden. Während der Laser-Mikrodissektion in diesem Beispiel wird nur 60 Prozent der gesamten Laserleistung verwendet, um effizient isolierte Zellen aus gefrorenem Gewebe zu isolieren und daher ist eine zwei μm breite, feine Schneidelinie erhältlich.
  • Probenbilder der Gewebeproben 12 und der ausgeschnittenen Zielbereiche 20 werden in den 5A bis 5D gezeigt. 5A ist ein Bild einer Gewebeprobe 12, die durch ein umgekehrtes Mikroskop 1 vor einer Runde einer Laser-Mikrodissektion genommen wurde. 5B zeigt die Gewebeprobe 12 während der Laser-Mikrodissektion. 5C zeigt die Gewebeprobe 12, mit den präparierten Zielbereichen 20, die aus dem Gewebeabschnitt 12 durch die elektrostatische Kraft abgestoßen wurden. 5D zeigt die Gewebeprobe 12, mit den präparierten Zielbereichen 20, die auf der Oberfläche des Agargelsammlungsmaterials 18 eingefangen wurden.
  • Aufgrund der geringen Anzahl der gesammelten interessierenden Zellen können spezielle RNS-Extraktionsreagenzien verwendet werden, um das Ergebnis der RNS-Analyse zu fördern. Das Vorgehen, um RNS zu extrahieren, kann in einer herkömmlichen Art und Weise mit einem RNS-Extraktionsreagenz erfolgen. Nach der PCR kann die spezielle Genexpression aus dem RNS-Extrakt (wie etwa c-myc, P53, P27, usw., welche mit der Karzinogenese assoziiert sind) mittels einiger molekularbiologischer Verfahren analysiert werden.
  • Während bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt und beschrieben werden, ist zu vergegenwärtigen, dass die Fachleute verschiedene Modifikationen der vorliegenden Erfindung ohne Abweichung von ihrem Geist und Umfang entwickeln können.
  • Zusammenfassung
  • Ein Verfahren für die Sammlung von Zielbereichen aus einem Zielobjekt wird beschrieben. Das Verfahren in einer Ausführungsform umfasst das Anbringen einer negativ geladenen Membran auf einer ersten Seite eines Substrats, das Anbringen eines Zielobjekts auf der Membran, Positionieren eines Sammlungsmaterials neben das Zielobjekt und Durchführen eines Laserstrahls von einer zweiten Seite des Substrats durch das Substrat, die Membran und das Zielobjekt, um Zielbereiche aus dem vorbereiteten Gewebeabschnitt zu präparieren, wodurch die präparierten Zielbereiche an dem Sammlungsmaterial anhaften. In einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung ein System für das Sammeln von Zielbereichen aus einem Zielobjekt. In einer Ausführungsform umfasst das System ein Substrat mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, einer an der ersten Seite des Substrats anhaftenden, negativ geladenen Membran und einem Sammlungsmaterial, das neben der Membran angebracht werden kann. In einer anderen Ausführungsform umfasst das System weiterhin ein umgekehrtes Mikroskop, ein Gestell für das Halten des Substrats über dem Mikroskop, einen Generator, der betrieben werden kann, um einen Laserstrahl durch das Substrat von der zweiten Seite zu führen, und um Zielbereiche aus dem auf der Membran angebrachten Zielobjekt zu präparieren, wodurch die präparierten Bereiche an dem Sammlungsmaterial anhaften. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Zielobjekte Gewebe und die Zielbereiche sind Zellen.

Claims (30)

  1. Verfahren zur Sammlung von Zellen aus Gewebe, wobei das Verfahren umfasst: Anbringen einer negativ geladenen Membran auf einer ersten Seite eines Substrats; Anbringen eines Zielobjekts auf der Membran; Positionieren eines Sammlungsmaterials neben dem Zielobjekt; Durchführen eines Laserstrahls von einer zweiten Seite des Substrats durch das Substrat, die Membran und das Zielobjekt, um Zielbereiche aus dem Zielobjekt zu präparieren, wodurch die präparierten Zielbereiche an dem Sammlungsmaterial anhaften.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sammlungsmaterial ein positiv geladenes Material ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sammlungsmaterial ein polares Material ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sammlungsmaterial mit Phosphat gepufferte Saline und Agargel ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielobjekt wenigstens eines von einem Gewebeabschnitt, einer aus Gewebe stammenden Zellpräparation, einem biologisch hergeleiteten Material und einem nicht-biologischen Material ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zielbereiche Zellen sind und das Verfahren weiterhin die Extraktion von DNS aus den Zellen umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Schritt der Extraktion der DNS wenigstens eine von einer Polymerase-Kettenreaktion und einer Elektrophorese umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, das weiterhin das Aussetzen der Zellen mit einem Lysepuffer umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Membran eine stark dielektrische Folie ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Folie wenigstens einen von einem Thermoplasten, einem duroplastischen Polymer, einem Elastomer und einem nicht leitfähigen Polymer umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Folie wenigstens einen von einem Polyethylen, einem Polypropylen, einem Polyvinylchlorid, einem Styrol, einem Polyurethan, einem Polyimid, einem Polycarbonat, einem Polyethylenterephthalat, einer Cellulose, einer Gelatine, einem Chitin, einem Polypeptid, einem Polysaccharid und einem Polynukleotid umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Anbringens einer negativ geladenen Membran das Anhaften der Membran an den Objektträger mit einem Haftmittel umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Haftmittel lichthärtbar ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Glassobjektträger, einem Polymerobjektträger, einem Siliciumoxidwafer und einem Biochip.
  15. System für die Laser-Mikrodissektion, wobei das System umfasst: ein Substrat mit einer ersten Seite und mit einer zweiten Seite, eine negativ geladene Membran, die an die erste Seite des Substrats gebunden ist, und einem Sammlungsmaterial, das neben der Membran angebracht werden kann.
  16. System nach Anspruch 15, wobei das Sammlungsmaterial ein positiv geladenes Material ist.
  17. System nach Anspruch 15, wobei das Sammlungsmaterial ein polares Material ist.
  18. System nach Anspruch 15, wobei das Sammlungsmaterial mit Phosphat gepufferte Saline und Agargel ist.
  19. System nach Anspruch 15, wobei das Zielobjekt wenigstens eines von einem Gewebeabschnitt, einer aus Gewebe stammenden Zellpräparation, einem biologisch hergeleiteten Material und einem nicht-biologischen Materials ist.
  20. System nach Anspruch 19, wobei die Zielbereiche Zellen sind und das System weiterhin Mittel zur Durchführung wenigstens einer von einer Polymerase-Kettenreaktion an den Zellen und einer Elektrophorese an den Zellen umfasst.
  21. System nach Anspruch 20, das weiterhin einen Lysepuffer umfasst.
  22. System nach Anspruch 15, wobei die Membran eine stark dielektrische Folie ist.
  23. System nach Anspruch 22, wobei die Folie wenigstens einen von einem Thermoplasten, einem duroplastischen Polymer, einem Elastomer und einem nicht leitfähigen Polymer umfasst.
  24. System nach Anspruch 23, wobei die Folie wenigstens einen von einem Polyethylen, einem Polypropylen, einem Polyvinylchlorid, einem Styrol, einem Polyurethan, einem Polyimid, einem Polycarbonat, einem Polyethylenterephthalat, einer Cellulose, einer Gelatine, einem Chitin, einem Polypeptid, einem Polysaccharid und einem Polynukleotid umfasst.
  25. System nach Anspruch 15, das weiterhin ein Haftmittel umfasst, das die Membran an den Objektträger bindet.
  26. System nach Anspruch 25, wobei das Haftmittel lichthärtbar ist.
  27. System nach Anspruch 15, wobei das Substrat ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Glassobjektträger, einem Polymerobjektträger, einem Siliciumoxidwafer und einem Biochip.
  28. System nach Anspruch 15, ferner umfassend ein umgekehrtes Mikroskop, ein Gestell für das Halten des Substrats über dem Mikroskop, einen Generator, der betrieben werden kann, um einen Laserstrahl durch das Substrat von der zweiten Seite zu führen und um Zielbereiche aus einem auf der Membran angebrachten Zielobjekt zu präparieren, wodurch die präparierten Zielbereiche an dem Sammlungsmaterial anhaften.
  29. System nach Anspruch 26, das weiterhin eine Kamera umfasst, die an das Mikroskop gekoppelt ist.
  30. System nach Anspruch 27, das weiterhin einen Computer und eine Steuerungsvorrichtung umfasst.
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