CN109557068A - 一种用于单细胞拉曼测量和激光显微切割的一体化分选装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单细胞拉曼测量与激光显微切割一体化的分选装置，包括细胞点样芯片、拉曼测量和激光显微切割薄膜以及细胞回收芯片；拉曼测量和激光显微切割薄膜用于固定细胞样品，并对其上单细胞进行拉曼测量和激光切割分选；细胞点样芯片贴合固定于拉曼测量和激光显微切割薄膜正面，通过细胞点样芯片上的微通孔进行细胞样品的点样；细胞回收芯片位于拉曼测量和激光显微切割薄膜背面正下方，通过芯片上的微柱结构粘附回收经切割分离的单细胞。本发明可实现对细胞的拉曼测量和激光切割分选；采用微柱粘附回收结构定向回收目标细胞，并在微井中直接实现细胞裂解及基因组扩增操作，实现了单细胞拉曼测量与激光显微切割分选的一体化耦合。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞分析及分选技术领域，具体涉及一种实现单细胞拉曼测量与激光显微切割相耦合的一体化分选装置。
背景技术
从非均匀细胞群体或异质性样本混合物，比如组织样本、血液、精液样本、环境取样微生物样本中，表征并分离特定的少量细胞甚至单个细胞具有十分重要的研究意义。据此目的发展的激光捕获显微切割技术正是这样一种样品制备技术。其原理为利用激光能量对样品及承载基质进行显微条件下的精细切割，从而从混合样品或异质样品中分离出纯的样品甚至单个细胞，从而在下游微基因组学应用(如新一代测序、Sanger测序、PCR和蛋白质组学)和基因表达分析中获得更加有效和准确的结果。而细胞可以采用荧光标记或原位杂交方法根据其形态、免疫组化表型甚至其基因型加以选择。然而上述表征手段在应用中仍存在诸多限制，例如并非所有样本都有相对应的标记特征，标记过程对细胞活性产生伤害及影响后续的分子操作等。而单细胞拉曼技术在一定程度上恰能解决这些问题。单细胞拉曼光谱技术能够提供细胞内化合物分子构成和结构的信息作为其“分子指纹”，包括核酸、蛋白、多糖及脂类等，这些信息可反映细胞的多种性状，如物种类型、环境响应、代谢活性以及其它表型。结合拉曼光谱对单细胞进行分选则能够实现对特定表型或功能的细胞进行无需标记的定向研究，建立从细胞表型层面或代谢特征到遗传信息和功能基因的直接联系，从而更为准确高效地对单个细胞进行解析。因此，如能将单细胞拉曼技术与激光显微切割手段相结合，则能够提供一种更为灵活和有力的分选工具，从而大大拓展两种技术目前的应用范围。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种耦合单细胞拉曼测量和激光显微切割的薄膜，所述拉曼测量和激光显微切割薄膜包含切割层和拉曼镀层，所述切割层为激光敏感高分子材料，包括PC(聚碳酸酯)、EVA(乙烯-醋酸乙烯共聚物)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)中的一种或多种，所述拉曼镀层材料为不透明金属材料，包括铝、银、金中的一种或多种，所述拉曼测量和激光显微切割薄膜用于单细胞拉曼测量和激光切割分选。
所述切割层厚度为5-50μm，优选地，为10μm。
所述拉曼镀层厚度为10-100nm，优选地，为30nm。
所述拉曼镀层厚度能够掩盖切割层拉曼信号。
所述不透明指透光性小于30％，优选地，小于20％，更优选地，小于10％。
所述单细胞拉曼测量采用连续激光波长为266nm-1064nm，优选为532nm，激光功率为1-50mW，优选地，为10mW，测量时间为1-60s，优选地，为10s。
所述激光切割分选所采用的脉冲激光波长为266nm-1064nm，优选地，为532nm，所述激光脉宽为1fs-1μs，优选地，为1ns，所述激光的能量范围为1μJ-100μJ，优选地，为10μJ，所述激光的脉冲频率为5-16.6kHz，优选地，为11.0-14.6kHz。
所述单细胞拉曼测量和激光切割分选的方法包括1)将组织切片或细胞悬液涂于前述拉曼测量和激光显微切割薄膜的拉曼镀层表面；2)收集单细胞拉曼散射信号，获得单细胞拉曼图谱，分析拉曼图谱识别单细胞；3)打开脉冲激光在识别的单细胞周围进行激光环绕切割，使环绕切割范围内的拉曼测量和激光显微切割薄膜连同识别的单细胞与环绕切割范围外的拉曼测量和激光显微切割薄膜分离。
所述单细胞包括悬浮分散单细胞或组织切片上的单细胞。
本发明的另一目的，提供一种耦合单细胞拉曼测量和激光显微切割的一体化分选装置，所述单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，包含前述拉曼测量和激光显微切割薄膜，还包含细胞点样芯片和细胞回收芯片。
所述细胞点样芯片、拉曼测量和激光显微切割薄膜以及细胞回收芯片按顺序叠加，形成一体化对应结构。
所述细胞点样芯片为透明软质高分子材料，包括PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅橡胶、PVC(聚氯乙烯)中的一种或多种。
所述细胞点样芯片的厚度为0.2-2mm，优选地，为1mm。
所述细胞点样芯片上设有一个或多个微通孔。
所述微通孔直径为0.5-5mm，优选地，为2.5mm。
所述细胞点样芯片贴合于拉曼测量和激光显微切割薄膜的拉曼镀层形成点样孔，用于细胞点样。
所述细胞回收芯片用于接收激光显微切割分离的单细胞。
所述的细胞回收芯片为透明材料，包括硅酸盐玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)中的一种或多种。
所述细胞回收芯片的厚度为1-5mm，优选地，为2.5mm。
所述细胞回收芯片上设有一个或多个与细胞点样芯片微通孔一一对应的微井。
所述微井的直径为0.5-5mm，优选地，为2mm。
所述微井的高度为0.5-2.5mm，优选地，为1.5mm。
所述微井中含有与微井等高的微柱，所述微柱的直径为0.25-1.5mm，优选地，为1mm。
所述微柱用于粘附回收切割分离的单细胞。
本发明还提供一种单细胞拉曼测量和分选的方法，包括1)将所述细胞点样芯片与拉曼测量和激光显微切割薄膜的拉曼镀层贴合形成点样孔，将组织切片或细胞悬液涂于点样孔中，2)将所述细胞回收芯片贴合于拉曼测量和激光显微切割薄膜的切割层，微柱与点样孔位置一一对应形成一体化装置，3)对单细胞进行拉曼光谱测量，分析单细胞拉曼光谱识别单细胞4)打开脉冲激光在识别的单细胞周围进行激光环绕切割，使环绕切割范围内的拉曼测量和激光显微切割薄膜连同单细胞与环绕切割范围外的拉曼测量和激光显微切割薄膜分离，5)揭开环绕切割范围外的拉曼测量和激光显微切割薄膜及细胞点样芯片，留下环绕切割范围内的拉曼测量和激光显微切割薄膜以及识别的单细胞粘附在微柱上。
本发明的有益效果是：通过采用无拉曼背景的可切割薄膜，同时实现对细胞的拉曼测量和激光切割分选；此外采用微柱粘附回收结构定向回收目标单细胞，并在微井中直接实现细胞裂解及基因组扩增操作，实现了单细胞拉曼测量与激光显微切割分选的一体化耦合。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为拉曼测量和激光显微切割薄膜及其背景拉曼图谱。其中，a为切割层的照片，b为覆盖拉曼镀层后的拉曼测量和激光显微切割薄膜的照片，c为切割层与覆盖拉曼镀层后的拉曼测量和激光显微切割薄膜的背景拉曼图谱，上为切割层的拉曼背景，下为覆盖拉曼镀层后的拉曼测量和激光显微切割薄膜的拉曼背景。
图2为单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置的剖面组合图。
图3为切割分离及接收实际效果图。其中，a为经激光切割后的拉曼测量和激光显微切割薄膜区域图，b为经分离后的拉曼测量和激光显微切割薄膜区域图，c为粘附微柱接收被切割的拉曼测量和激光显微切割薄膜区域图，圆形区域显示微柱表面。
图4为基于激光显微切割的多细胞分选图。其中，a为经激光切割后的细胞，b为粘附微柱接收的细胞。
图5为基于拉曼光谱的单细胞激光切割分选。其中，a为拉曼测量和激光显微切割薄膜上的单个微藻细胞，b为微藻单细胞拉曼图谱，c为经激光切割后的拉曼测量和激光显微切割薄膜，d为经分离后微柱接收到的微藻单细胞。
图6为采用一体化装置对酵母单细胞进行激光切割分选及回收后的单细胞基因组MDA扩增及其产物的PCR质控验证。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，附图为示意图，因此本发明装置和设备并不受所述示意图的尺寸或比例限制。
需要说明的是，在本专利的权利要求和说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
实施例1：拉曼测量和激光显微切割薄膜的材料选择与制作
拉曼测量和激光显微切割薄膜包括切割层与拉曼镀层。其中，切割层(图1a)采用激光敏感高分子材料，包括但不限于PC(聚碳酸酯)，EVA(乙烯-醋酸乙烯共聚物)，PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)，PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)；拉曼镀层采用不透明金属材料，包括但不限于铝，银，金。拉曼镀层采用蒸镀、溅射等沉积方式在切割层表面形成拉曼镀层(图1b)，拉曼镀层厚度制作为10-100nm。拉曼镀层本身无拉曼背景，且能够掩盖切割层的拉曼背景(如图1c所示)。
实施例2：细胞点样芯片、细胞回收芯片的制作及一体化装置组装
细胞点样芯片2采用透明软质高分子材料，包括但不限于PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅橡胶、PVC(聚氯乙烯)，厚度制作为0.2-2mm，芯片上制作阵列微通孔2-1，微通孔直径制作为0.5-5mm。
细胞回收芯片3采用透明材料，包括但不限于硅酸盐玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；芯片上包含一定深度的微井3-1结构，微井3-1中心制作有与微井3-1深度等高的微柱3-2，微柱表面具有一定粘附性。细胞回收芯片3上微井3-1及微柱3-1位置与细胞点样芯片2中微通孔2-1位置一一对应。
所述一体化装置通过将玻璃盖玻片4、细胞点样芯片2、拉曼测量和激光显微切割薄膜1及细胞回收芯片3顺序贴合进行组装(如图2所示示意图)。拉曼测量和激光显微切割薄膜1正面即拉曼镀层1-2向上平置于细胞回收芯片3之上，切割层1-1与细胞回收芯片3贴和，使拉曼测量和激光显微切割薄膜1支撑于细胞回收芯片3的微井3-1上，并平铺于微柱3-2表面。细胞点样芯片2贴合在拉曼测量和激光显微切割薄膜1表面，并使点样微通孔2-1与微井3-1及微柱3-2一一对应，微通孔2-1用于滴涂细胞悬液。玻璃盖玻片4平置于细胞点样芯片2之上，封闭微通孔2-1以防止样品暴露于外部环境而造成污染。
实施例3：采用一体化装置进行单细胞拉曼测量及细胞分选
在上述一体化装置中，可采用532nm高能脉冲激光对拉曼测量和激光显微切割薄膜进行激光显微切割，随后单独分离细胞回收芯片，由于微柱的粘附性，经切割的拉曼测量和激光显微切割薄膜1在分离时遗留在微柱表面，从而实现对切割区域的分离回收，其中，图3a为经激光切割后的拉曼测量和激光显微切割薄膜1区域图，图3b为经分离后的拉曼测量和激光显微切割薄膜1区域图，图3c为粘附微柱3-2接收被切割的拉曼测量和激光显微切割薄膜1区域图，圆形区域显示微柱表面。在分离细胞时，细胞悬液滴涂于点样孔中拉曼测量和激光显微切割薄膜1表面，利用脉冲激光对选定细胞所在的外围区域进行完全切割，随后分离细胞回收芯片3可获得如图4所示的分离效果，其中，图4a为经激光切割后的细胞，图4b为粘附微柱3-2接收的细胞。
由于拉曼测量和激光显微切割薄膜1无拉曼背景，因此可对薄膜表面的细胞进行单细胞拉曼光谱的测量，以此筛选出目标单细胞，并对其进行显微切割分选回收。图5所示为对拉曼测量和激光显微切割薄膜1表面的单个微藻细胞进行拉曼光谱测量并切割分选已回收单个细胞的操作。其中，图5a为拉曼测量和激光显微切割薄膜1上的单个微藻细胞，图5b为微藻细胞拉曼图谱，图5c为经激光切割后的拉曼测量和激光显微切割薄膜，图5d为经分离后微柱3-2接收到的微藻单细胞。单细胞回收后，可进行常规的单细胞裂解与基因组扩增和测序。
实施例4：采用一体化装置分选回收单细胞用于单细胞基因组研究
以酿酒酵母为对象，采用上述单细胞激光切割一体化装置，利用实施例3所述细胞分选方法对单细胞进行分选回收，完成切割后取下细胞回收芯片3，向微井3-1中加入碱性裂解液没过微柱3-2表面，对单细胞进行裂解并分别转入离心管中，加入核酸扩增混合试剂及DNA合成酶，采用多重置换常温扩增技术(MDA)进行单细胞基因组扩增。随后对扩增产物进行真核细胞保守基因18S rRNA全长的PCR扩增，以验证产物是否源于目标单细胞DNA；同时进行细菌进化标记基因16S rRNA全长的PCR扩增，以验证分选及扩增过程是否受到外源污染。最终获得如图6所示凝胶电泳结果。其中，#1至#3及#5、#6为单个酵母细胞分选回收后的结果，#4为未分选细胞的空白切割对照，N、P分别为MDA扩增的阴性对照和阳性对照、N18S、P18S分别为18S rRNA基因PCR的阴性对照和阳性对照，N16S、P16S为分别为16S rRNA基因PCR的阴性对照和阳性对照。图6表明，激光切割分选耦合单细胞扩增，可至少获得60％的成功结果；同时，未见有外源污染引入，表明采用上述一体化装置和方法可有效完成对单细胞基因组进行研究的目的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)，其特征在于，所述拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)包括切割层(1-1)和拉曼镀层(1-2)，所述切割层(1-1)为激光敏感高分子材料，包括PC(聚碳酸酯)、EVA(乙烯-醋酸乙烯共聚物)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)中的一种或多种，所述拉曼镀层(1-2)为低拉曼背景、不透明金属材料，包括铝、银、金中的一种或多种，所述拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)用于单细胞拉曼测量和激光切割分选。
2.根据权利要求1所述的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)，其特征在于，所述切割层(1-1)厚度为5-50μm，所述拉曼镀层(1-2)能够掩盖切割层的拉曼信号，厚度为10-100nm。
3.根据权利要求1所述的拉曼测量和激光显微切割薄膜，其特征在于，所述激光切割分选所采用的脉冲激光波长为266nm-1064nm，激光脉宽为1fs-1μs，激光的能量范围为1μJ-100μJ，激光的脉冲频率为5-16.6kHz。
4.一种单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)，细胞点样芯片(2)和细胞回收芯片(3)；所述细胞点样芯片(2)、拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)以及细胞回收芯片(3)按顺序叠加，形成一体化对应结构。
5.根据权利要求4所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，所述细胞点样芯片(2)为透明软质高分子材料，包括PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅橡胶、PVC(聚氯乙烯)中的一种或多种，所述的细胞回收芯片(3)为透明材料，包括硅酸盐玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，所述细胞点样芯片(2)的厚度为0.2-2mm，所述细胞回收芯片(3)的厚度为1-5mm。
7.根据权利要求6所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，所述细胞点样芯片(2)上设有一个或多个微通孔(2-1)，所述微通孔(2-1)直径为0.5-5mm。
8.根据权利要求7所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，所述细胞回收芯片(3)上设有一个或多个与细胞点样芯片(2)上微通孔(2-1)一一对应的微井(3-1)结构，所述微井的直径为0.5-5mm，所述微井的高度为0.5-2.5mm。
9.根据权利要求8所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置，其特征在于，所述微井(3-1)中含有与微井(3-1)等高的微柱(3-2)，所述微柱(3-2)的直径为0.25-1.5mm。
10.一种利用权利要求4-9任一所述的单细胞拉曼测量和激光显微切割一体化分选装置进行单细胞拉曼测量和分选的方法，包括
1)将所述细胞点样芯片(2)与拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)的拉曼镀层(1-2)贴合形成点样孔，将组织切片或细胞悬液涂于点样孔中；
2)将所述细胞回收芯片(3)贴合于拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)的切割层(1-1)，微柱(3-2)与点样孔位置一一对应形成一体化装置；
3)对单细胞进行拉曼光谱测量，分析单细胞拉曼光谱识别单细胞；
4)打开脉冲激光在识别的单细胞周围进行激光环绕切割，使环绕切割范围内的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)连同单细胞与环绕切割范围外的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)分离；
5)揭开环绕切割范围外的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)及细胞点样芯片(2)，留下环绕切割范围内的拉曼测量和激光显微切割薄膜(1)以及识别的单细胞粘附在微柱上。
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