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Die Erfindung betrifft einerseits ein Verfahren zur Lokalanalyse und Verteilungsanalyse („Imaging” oder „Mapping”) zur quantitativen Bestimmung von Elementkonzentrationen in Substraten, insbesondere in dünnen Gewebeschnitten, an einzelnen Zellen oder Zellorganellen, und der in-situ Charakterisierung von Probenoberflächen (Topographie) vor und nach der chemischen Analyse mit lateraler Auflösung im Mikrometer- bis in den Nanometerbereich. Ferner betrifft die Erfindung eine zur Durchführung der vorgenannten Verfahren geeignete Vorrichtung.
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Stand der Technik
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Als Analysenmethode zur quantitativen Bestimmung von lateralen Elementverteilungen mit Ortsauflösung im μm-Bereich und zur Bestimmung von Spurenelementen bis in den ng/g und sub-ng/g-Konzentrationsbereich werden in der Element-Massenspektrometrie zur direkten Ablation des zu untersuchenden Probenmaterials verschiedene Verfahren, z. B. unter Verwendung von fokussierten Laserstrahlen, angewandt. Bekannt ist beispielsweise das Verfahren der Laserablations – induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry – LA-ICP-MS), das für die Spuren-, Isotopenaber auch Oberflächen- und Mikrolokalanalyse an festen Probenmaterialien eingesetzt wird. Dieses Verfahren ist nachteilig jedoch nicht in der Lage, Elementverteilungen und –konzentrationen in dünnen Gewebeschnitten (Mapping oder Imaginganalyse) mit einem hohen lateralen Auflösungsvermögen, und insbesondere im unteren mikro- und nanoskaligen Maßstab unterhalb von 5 μm, zu bestimmen, wie es beispielsweise bei der Analyse an einzelnen Zellen oder auch Zellorganellen gefordert wird.
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In zunehmendem Maße werden in der Analytik Laser, wie beispielsweise der Nd-YAG-Laser, mit einer Wellenlänge im UV-Bereich (λ = 266 nm oder 213 nm) eingesetzt. Diese Laser werden häufig für den Probeneintrag in Kombination mit nachweisstarken ICP-Massenspektrometern verwendet. Zurzeit sind Nd-YAG-Lasersysteme mit einem Laserspotdurchmesser von einigen μm bis zu einigen hundert μm zur Mikrolokalanalyse kommerziell verfügbar (z. B. LSX 213, 500 CETAC Technologies, Ohama, USA oder UP 213, 266 New WAVE Research, Fremont, USA). Als nachteilig wird empfunden, dass mit derartigen kommerziellen Laserablationssystemen in der Regel biologische Matrizes bei einem lateralen Auflösungsvermögen im unteren μm-Bereich direkt mit hoher Effizienz nicht ablatiert werden können. Der begrenzende Faktor ist dabei die Beugungsgrenze, die ein Laser regelmäßig nicht unterschreiten kann. Dies bedeutet, dass die mögliche minimale Auflösungsgrenze im Bereich einer Wellenlänge des Lasers liegt. Ortsaufgelöste Analysen unterhalb von 1 μm sind daher regelmäßig gar nicht möglich.
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Für viele medizinisch-molekularbiologische Fragestellungen, z. B. zur Verteilungsanalyse von Metallen in biologischen Proben (wie in Gehirnschnitten), wird jedoch ein laterales Auflösungsvermögen des zu verwendenden Analysenverfahrens im unteren Mikrometer- bzw. von einigen hundert nm bis in den unteren nm-Bereich gefordert. Eine solche Ortsauflösung könnte dazu führen, dass eine direkte Nanolokalanalytik an einzelnen Zellorganellen durchführbar wäre. Zudem sind für viele Fragestellungen quantitative Aussagen der Metallverteilung von kranken gegenüber gesunden Gewebeschnitten erforderlich.
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Fokussierte IR- und UV-Laserstrahlen werden in kommerziellen Instrumenten (mittels der bekannten lasergestützten Mikrodissektion-LMD) zum Ausschneiden eines exakt definierten Areals aus einem Gewebe eingesetzt. Die Lasermikrodissektion (LMD), die gezielt molekulargenetische Untersuchungen an minimalen Mengen eines spezifischen Gewebes erlaubt, ermöglicht auch die isolierte Untersuchung an ausgewählten Regionen lebender Einzelzellen. Derartige leistungsfähige LMD-Systeme mit einer Ortsauflösung im unteren Mikrometer- bzw. teilweise im Submikrometerbereich werden heutzutage zur Isolierung und Analyse von einzelnen Zellen oder Zellarealen, wie beispielsweise bei der Biopsie einzelner Krebszellen im Vergleich zu umliegenden gesunden Kontrollzellen, kleinen Gewebestücken oder auch DNA-Strängen, für Routine und Forschungsaufgaben in der Medizin (Pathologie), aber auch in der Molekular- und Zellbiologie, eingesetzt. Vorhandene kommerzielle Systeme verfügen über exzellente Möglichkeiten der mikroskopischen Beobachtung der Probenoberflächen und ein sehr präzises Ausschneiden von Gewebestücken durch einen stark fokussierten Laserstrahl. Dieser erreicht unter Verwendung von speziellen Laseroptiken eine hohe Ortsauflösung bis in den Submikrometerbereich (bis zu 0,5 μm). Dabei wird im Gegensatz zu den Laserablationssystemen – hier wird die Ablation des Probenmaterials durch eine definierte Bewegung des Probentisches gesteuert – der Laserstrahl mit Hilfe einer ausgefeilten Optik mit einer Präzision von ca. 0,07 μm über die Probenoberfläche definiert bewegt. Die ausgeschnittenen Gewebeproben werden anschließend meist nach einem tryptischen Verdau (cell lysis) einer weiteren biomolekularen massenspektrometrischen off-line Analyse zugeführt. Eine quantitative Elementanalyse mit LMD on-line ist jedoch regelmäßig nicht möglich. Ein solches LMD-System besitzt gegenüber kommerziell verfügbaren Laserablationssystemen eine Reihe von herausragenden Vorteilen, beispielsweise eine verbesserte Ortsauflösung etwa um eine Größenordnung, eine signifikant verbesserte mikroskopische Auflösung oder auch in Verbindung mit speziellen Färbetechniken (immunostaining) und der Anwendung hochspezieller Softwarepakete die Erkennung spezieller Zellen (z. B. von Krebszellen in gefärbten Gewebeschnitten).
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Aus
DE 10 2006 049 638 A1 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung und Quantifizierung von spezifischen Spurenelementen in Proben von komplexen Matrices bekannt, bei dem eine Laserablations-(LA)-Vorrichtung an ein Fouriertransformations-Ionenzyklotronenresonanz-Massenspektrometer (FT-ICR-MS) gekoppelt ist.
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DE 10 354 787 B4 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung einer ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse zur qualitativen Bestimmung von Elementkonzentrationen einer Probe mit Hilfe der Laserablation induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS).
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Auch in
DE 1993 45 61 A1 wird ein Elementanalyseverfahren sowie eine dazu geeignete Vorrichtung zur Detektion von Spurenelementen durch Laserablation in einer Probenkammer offenbart. Alle aus dem vorgenannten Stand der Technik bekannten Probekammern weisen einen Behälter mit einer Zu- und Abführungsleitung für ein Transportgas auf, wobei der Behälter jeweils gasdicht ist und zumindest eine für Laserlicht durchlässige Oberseite aufweist.
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WO 2007/071985 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur laserinduzierten Übertragung von Material auf ein Substrat. Aus
DE 10 358 566 A1 und
DE 102 34 755 A1 sind jeweils Halte- bzw. Trägervorrichtungen zum Halten eines Aufnahmemittels für ein biologisches Objekt für ein Laser-Mikrodissektionsverfahren bekannt. In
DE 10 346 458 A1 wird zudem ein entsprechendes Verfahren zur Laser-Mikrodissektion beschrieben.
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US 2003/0075530 A1 offenbart ein Laserschneidegerät, welches zudem noch ein Mikroskop aufweist.
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Aufgabe und Lösung
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zu Verfügung zu stellen, welches einerseits eine qualitative Lokal- und Verteilungsanalyse im Nanometerbereich sowie gleichzeitig die quantitative Bestimmung von Elementkonzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien ermöglicht, und andererseits auch in der Lage ist, auf einfache Weise zeitnah die untersuchte Probenoberfläche vor und nach der Analyse darzustellen und zu charakterisieren.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung zu schaffen.
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Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch ein Verfahren mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Hauptanspruch sowie durch eine Vorrichtung mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausführungen des Verfahrens und der Vorrichtung finden sich in den jeweils darauf rückbezogenen Ansprüchen.
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Gegenstand der Erfindung
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Die Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur Verfügung, welches qualitative Lokal- und Verteilungsanalysen und quantitative Bestimmungen von Elementkonzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien im Nanometerbereich ermöglicht, und zudem über die Möglichkeit verfügt, die zu untersuchende topographische Probenoberflache vor und nach einer Analyse zu beobachten.
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Es ist bekannt, dass Geräte zur Lasermikrodissektion (LMD) bereits über eine sehr entwickelte und hochaufgelöste Optik in Kombination mit der Möglichkeit des Ausschneidens von zuvor beobachteten und definierten Teilen einer Probe mittels eines fokussierten Laserstrahls, der definiert über die Probenoberfläche geführt wird, verfügen. Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun herausgefunden, dass die bislang in den üblichen Lasermikrodissektionsgeräten verwendeten Objekttische mit eingelassenen Objektträgern vorteilhaft derart modifiziert werden können, dass dadurch nunmehr direkt vor Ort auch eine Laserablation zusammen mit einer quantitativen Bestimmung der Elementverteilungen im ausgewählten Probenbereich durchgeführt werden kann.
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Die Erfindung verbindet somit die Vorteile der LMD bezüglich des präzisen Ausschneidens dünner Gewebeschnitte biologischer Proben durch eine definierte Laserablation des untersuchten Analysenbereichs im bekannten Line-Scan-Modus kombiniert mit einer hochaufgelösten mikroskopischen Beobachtung der Probenoberfläche mit den Vorzügen der quantitativen Element-massenspektrometrischen Technik, der Laserablations-ICP-MS. Die Erfindung ermöglicht vorteilhaft eine praktikable Quantifizierungstechnik zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung der analysierten Proben bezüglich der Metall- und Nichtmetallgehalte, wie sie beispielsweise in der Gehirnforschung beim Studium neurodegenerativer Erkrankungen, des Wachstums von cancerogenem Gewebe, von Alterungsprozessen oder bei Fragen der Metallverteilung in einzelnen lebenden Zellen und Zellorganellen in beliebigen biologischen Probenmaterialien erforderlich ist.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die in einer Laserablationskammer befindliche, zu untersuchende Probe in einem ersten Schritt mikroskopisch untersucht, und ein Bereich zur Ablation und damit zur massenspektrometrischen Analyse der Spurenelemente ausgesucht. Dazu kann vorteilhaft die hochaufgelöste Optik eines lasergestützten Mikrodissektionsgerätes (LMD) eingesetzt werden. Es folgt im zweiten Schritt die laserinduzierte Ablation des ausgesuchten Bereichs und die Verteilungsanalyse der chemischen Elemente mit Hilfe des ebenfalls schon in einem LMD vorhandenen Lasers. Optional kann dies zusammen mit wenigstens einem ausgewählten Standard, vorzugsweise aber mit mehreren Standardproben, mit definierten Elementkonzentrationen zur Quantifizierung der chemischen Elemente erfolgen. Je nach Ergebnis kann dann in einem dritten Schritt ein entsprechender analoger Bereich aus der Probe für weitere Untersuchungen ausgeschnitten werden, vorzugsweise durch Lasermikrodissektion (LMD), und nach einem tryptischen Verdau des ausgeschnittenen Gewebes mit biomolekularer Massenspektrometrie bezüglich der Strukturaufklärung der metallbindenden Proteine oder Phosphoproteine analysiert werden.
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Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt unter anderem darin, dass die drei vorgenannten Schritte mit Hilfe einer kommerziellen Vorrichtung, bei der lediglich ein neuer, eine Laserablationskammer aufweisender Objekttisch konstruiert werden muss, durchgeführt werden können und die Probe und gegebenenfalls geeignete Standards zur Quantifizierung ständig auf einem Objektträger verbleiben können.
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Ermöglicht wird dieses Verfahren durch eine spezielle Laserablationskammer, bei der das für Laserlicht durchlässige Deckglas durch einen Objektträger gebildet wird, der gleichzeitig für die Lasermikrodissektion eingesetzt werden kann. Auf diesem austauschbaren Objektträger können sowohl die Probe als auch die für die Analytik benötigten Standardproben (in der Gehirnforschung verwendet man meist matrixangepasste synthetische Laborstandards) fixiert werden. Der Objektträger mit der Probe und den Standardproben wird zur Untersuchung dabei derart in das Lasermikrodissektionsgerät eingebracht, dass sich Probe und Standardproben auf der Unterseite des Objektträgers befinden. Zuvor wird der Objektträger derart mit einem das Unterteil einer Laserablationskammer bildenden Behälter zu einer Ablationskammer verschlossen, so dass sich Probe und Standard im Inneren der Kammer befinden. Die so gebildete Ablationskammer verfügt zudem über einen Zuführungs- und eine Abführungsleitung für ein Transportgas des ablatierten Materials (z. B. Ar), wobei die Abführungsleitung direkt an eine Analytikeinrichtung, insbesondere an ein induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometer-ICP-MS), angeschlossen werden kann. Vorteilhaft sind die Abmaße der Laserablationskammer derart gewählt, dass die komplette Kammer anstelle eines normalen Objektträgers, bzw. eines in einen Deckglashalter eingelegten Objektträgers als Objekttisch in ein vorhandenes Lasermikrodissektionsgerät eingebracht werden kann.
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Die zu untersuchende Probe kann zunächst mit Hilfe der vorhandenen hochaufgelösten Optik des Mikroskops der LMD Apparatur (etwa bei einer 150 fachen Vergrößerung) untersucht werden. Für die Ablation wird der ebenfalls vorhandene Laser mit einer entsprechenden Leistungsdichte (mit einem Spotdurchmesser unterhalb von 20 μm) auf die Probe fokussiert, so dass das biologische Material vollständig ablatiert wird.
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Gemeinsam mit der Ablation des Probenmaterials werden unter denselben Bedingungen auch die auf dem Objektträger befindlichen Standardproben ablatiert. Das so ablatierte Material von Probe und Standards wird vorteilhaft mit einem Trägergas, beispielsweise einem Argon-Strom, in das induktiv gekoppelte Plasma eines hochempfindlichen und selektiven ICP-Massenspektrometers transportiert und ionisiert. Anschließend werden die Ionen im Trennsystem des Massenspektrometers auf bekannte Art und Weise separiert und detektiert. Es erfolgt eine Bestimmung der elementaren Zusammensetzung bis in den Ultraspurenbereich und eine Verteilungsanalyse des untersuchten Probenmaterials. Als alternatives Analysengerät kommt beispielsweise auch die ICP-OES in Betracht.
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Nach dem Vorliegen der Ergebnisse der Verteilungsanalyse von Metallen und Nichtmetallen in der untersuchte Probe ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren anschließend möglich, bestimmte analoge Bereiche des Gewebes, in denen Metalle oder Phosphor nachgewiesen wurden (z. B. Plaques), nunmehr auch für eine weitere Analytik der Metalloproteine und/oder Phosphoproteine auszuschneiden. Dazu werden mittels eines fokussierten Laserstrahls die ausgewählten Bereiche ablatiert (ausgeschnitten) und in dafür geeigneten Probenbehältern, die nach der Laserablationsuntersuchung unter den Objektträger montiert werden, aufgefangen.
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Die zur Durchführung des Verfahrens geeignete erfindungsgemäße Laserablationskammer weist einen modularen Aufbau auf. Die Laserablationskammer besteht aus dem Deckglas, der Halterung des Deckglases und der eigentlichen flachen Laserablationskammer, vorzugsweise aus Teflon, um Kontaminationen während der LA-ICP-MS Analyse zu vermeiden. Die Deckglashalterung und die restliche Laserablationskammer sind über ein Mittel gasdicht miteinander verbunden. Solch geeignete Mittel können beispielsweise Klammern oder Verschraubungen sein, wobei gegebenenfalls eine zusätzliche Dichtung zwischen der Wandung der Laserablationskammer und dem Deckglas angeordnet ist. Bei dem Deckglas kann es sich insbesondere um einen typischen herkömmlichen Objektträger handeln, der transparent für die Wellenlänge des Laserlichtes des LMD Gerätes ist, und bei dem zur Untersuchung die Probe und eventuelle Standardreferenzproben auf deren Unterseite fixiert werden können.
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Für den Zusammenbau der Laserablationskammer kann beispielsweise zunächst das Deckglas (Objektträger) mit der zu untersuchenden Probe und den Standardproben auf deren Unterseite in die Deckglashalterung auf einen speziellen Mikroskoptisch eingebaut werden, und diese anschließend gasdicht mit dem Behälter verbunden werden, so dass weder Luft in die Kammer noch das Transportgas Ar aus der Kammer in die Umgebung strömen kann. Das ablatierte Material wird mit dem Transportgas Ar gezielt in das induktiv gekoppelte Plasma eines ICP-MS transportiert.
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Alternativ kann aber auch zunächst der Objektträger mit der Probe und einer Standardprobe auf der Unterseite gegebenenfalls über Dichtungen auf dem Behälter angeordnet und mit Hilfe des darauf angeordneten Deckglashalters gasdicht mit diesem verbunden werden. Anschließend wird die gesamte Laserablationskammer in das Lasermikrodissektionsgerät eingebracht. Die speziell für den Objektträger entwickelte LA-ICP-MS Kammer wird vor der Element-massenspektrometrischen Analyse von vorn horizontal über eine vorhandene Verschiebeeinheit in die LMD Apparatur eingeschoben.
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Die gesamte Laserablationskammer kann so mit einem Lasermikrodissektionsgerät verbunden und vorteilhaft mit Hilfe der vorhandenen Positioniereinrichtungen für den Objekttisch des LMD unter den Objektiven positioniert werden.
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Durch die erfindungsgemäße, für den Einsatz in einem herkömmlichen lasergestützten Mikrodissektionsgerät (LMD) geeignete, Ablationskammer kann so auf einfache Weise eine mikroskopische Untersuchung mit einer online LA-ICP-MS Untersuchung, und optional auch noch weitere Untersuchungen kombiniert werden, ohne dass dazu die Probe von einem die Probe aufweisenden Objektträger entfernt werden muss oder dass der Objektträger in verschiedene Untersuchungsgeräte eingesetzt werden muss.
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Spezieller Beschreibungsteil
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Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von zwei Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch eingeschränkt werden soll.
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Die 1 zeigt eine detaillierte Anordnung der erfindungsgemäßen Laserablationskammer 10, die über eine speziell angepasste Halterung zusammen mit einem Objektträger in eine herkömmliche Lasermikrodissektions-Vorrichtung (LMD) eingesetzt werden kann, mit a) Ansicht der Kammer von oben und b) Ansicht der Kammer von der Seite.
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Dabei bedeuten in den 1 und 2:
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Deckglas, z. B. ein üblicher Objektträger
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- Deckglashalterung
- 3
- Behälter (Unterteil der Laserablationskammer)
- 4
- Probe
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- Standardproben zur Quantifizierung der Analysenergebnisse
- 6
- Mittel zum gasdichten Verbinden von Behälter und Objektträger, bzw. Deckglashalterung
- 7
- Dichtung
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Die erfindungsgemäße Ablationskammer ist für die direkte Analyse von kleinen Bereichen biologischer Proben, wie z. B. von Gewebeschnitten oder einzelnen Zellen, mittels LA-ICP-MS geeignet.
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Vorteilhaft wird die bereits montierte Laserablationskammer mit dem Objektträger (der die Probe und die Standardreferenzmaterialien auf der Unterseite trägt) von vorn anstelle eines üblichen Objektträgerrahmens in eine vorhandene LMD Apparatur eingefahren. Der Objektträger kann aber auch auf einem speziell entwickelten Tisch des LMD fixiert werden, wobei die Halterung des Objektträgers bereits Teil des Tisches sein kann. Der Tisch hat hier nur eine Aussparung für den Objektträger, der von unten mit dem Behälter als Unterteil der Laserablationskammer über eine Dichtung gasdicht (z. B. durch Verschraubungen oder Klemmungen) verbunden ist. Die Probe und die Standardproben befinden sich immer auf der Unterseite des Objektträgers, d. h. im Innern der Laserablationskammer.
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Die einfachste und praktikabelste Variante ist, die Laserablationskammer außerhalb des LMD zusammenzubauen und zur Analyse (Mikroskopie und Elementanalyse) von vorn derart in die LMD Apparatur einzuschieben, dass der zu untersuchende Analysenbereich in den Fokus des Laserstrahles gebracht wird. Zur Einführung der Laserablationskammer existiert bereits eine präzise Verschiebeeinheit im LMD. Unter Verwendung dieser Anordnung wird im ersten Schritt die Probenoberfläche im Auflicht-Mikroskopmodus beobachtet und der Analysenbereich ausgewählt. Im zweiten Schritt wird vorteilhaft mit derselben Anordnung dieser Bereich definiert ablatiert und bezüglich der Metall- und Nichtmetallverteilung massenspektrometrisch analysiert. Eine Verschiebung oder Nachjustierung der Probe durch eine Überführung in eine externe Laserablationskammer ist somit nicht nötig.
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In einer weiteren Variante wird anschließend eine Probe komplett ablatiert, bzw. für weitere Untersuchungen ausgeschnitten. Dazu wird der Objektträger mit der Probe und gegebenenfalls Standardproben aus der erfindungsgemäßen Laserablationskammer entfernt und in den herkömmlichen Originalprobentisch des LMD mit den darunter befindlichen Probenbehältern eingesetzt und in das LMD eingeschoben. Auf bekannte Art und Weise lassen sich nun gezielt bestimmte Bereiche der Probe mittels des fokussierten Laserstrahls in dem LMD ausschneiden und in den darunter befindlichen Probenbehältern auffangen. Mittels massenspektrometrischer Methoden lassen sich somit einmal die Strukturen und Sequenzen der in der Probe befindlichen Proteine bestimmen, und zum anderen die Analysenergebnisse der LA-ICP-MS mit ICP-MS nach Aufschluss eines analogen Probebereiches validieren. Die letztere Technik erlaubt Aussagen über die Durchschnittsgehalte, z. B. der Metallkonzentrationen und Phosphorgehalte, im untersuchten Proben- bzw. Standardmaterial.
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Prinzipiell sind somit zwei unterschiedliche Verfahrensabläufe denkbar, die nachfolgend kurz zusammengefasst sind:
- 1 a) Die Probe befindet sich gegebenenfalls mit Standardproben auf einem Objektträger im LMD. Es erfolgt die Auswahl des zu untersuchenden Bereichs.
b) Der Objektträger verbleibt im LMD und wird mit einem Behälter (Unterteil der Laserablationskammer) zur Laserablationskammer zusammengebaut. Der Zusammenbau ist auf Grund der beengten Räumlichkeit unterhalb des Probentisches schwierig, aber prinzipiell machbar. Die Laserablationskammer wird gasdicht verschlossen. Es erfolgt die LA-ICP-MS Untersuchung ausgewählter Bereiche nach bekanntem Analysenprotokoll.
c) Der Objektträger wird aus der Laserablationskammer entfernt und einzeln wieder ins LMD zusammen mit den Auffangbehältern für die auszuschneidenden Gewebeproben eingebaut.
- 2 a) Der Objektträger wird zusammen mit der Probe und gegebenenfalls Standardproben mit einem Behälter (Unterteil der Laserablationskammer) zur Laserablationskammer zusammengebaut und ins LMD eingeschoben. Es erfolgt erst die Bereichsauswahl und anschließend die LA-ICP-MS-Untersuchung.
b) Der Objektträger wird aus der Laserablationskammer entfernt und einzeln wieder ins LMD zusammen mit den Auffangbehältern für die ausgeschnittenen Proben eingebaut.
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In der zweiten vorgeschlagenen und bevorzugten Vorgehensweise wird die Laserablationskammer mit dem Objektträger komplett außerhalb des LMD zusammengebaut und gasdicht verschlossen, und anschließend beispielsweise von vorn in das LMD eingeschoben und fixiert. Der Objektträger ist bei den Varianten gleichzeitig Deckglas der Laserablationskammer. Der ausgewählte Bereich der zu analysierenden Gewebeprobe wird zusammen mit den Standardproben unter denselben experimentellen Bedingungen mit Laserablation unter Verwendung eines Lasers des LMD in bewährtem Line-Scan-Modus ablatiert (Linie für Linie. Der Beschuss der Probenoberfläche erfolgt dabei mit Photonen eines fokussierten Laserstrahles, insbesondere eines leistungsfähigen Nd:YAG Lasers, wobei eine Ortsauflösung (Laserspotdurchmesser) auf der Oberfläche der Probe wenige μm betragen soll. Geeignete Geräte realisieren dabei Spotdurchmesser von deutlich weniger als 20 μm.
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Die erfindungsgemäße Anordnung der Laserablationskammer, bei der der Deckel gleichzeitig als Objektträger mit der darunter fixierten Probe dient, ist es vorteilhaft möglich, mit einem Objektiv des LMD fast bis an den Objektträger und damit bis fast an die Probe heranzureichen. Dadurch werden Auflösungen bis in den sub-μm Bereich erst möglich. Die Ablation von Probenmaterial ist somit vorteilhaft mit einem Spotdurchmesser von weniger als 1 μm, insbesondere von weniger als 0,5 μm möglich.
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Mit der vorhandenen LMD Instrumentation kann nicht nur die Probenoberfläche vor und nach der Laserablation mikroskopisch untersucht werden, sondern es lassen sich gezielt in einem weiteren Schritt bestimmte Bereiche des Gewebes, in denen Metalle und Phosphor nachgewiesen wurden, für eine weitere Analytik der Metalloproteine ausschneiden und in Probenbehältern, die nach der Laserablation unter den Objektträger montiert werden, auffangen. Dazu muss die originale Anordnung des LMD-Probentisches mit darunter befindlichen Probenbehältern wieder hergestellt werden.
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In der 2 wird die vorteilhafte Kombination der erfindungsgemäßen Laserablationskammer (10) mit einem vorhandenen Lasermikrodissektionsgerät verdeutlicht. Die gesamte erfindungsgemäße Laserablationskammer mit Behälter und Objektträger kann anstelle des sonst üblichen Deckglashalters einfach in das LMD-Gerät eingeschoben werden.
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Anders als bei üblichen Laserablationskammern bei denen der Laserstrahl mehr oder weniger fixiert ist, und nur die Probe über eine Verstelleinrichtung in die gewünschte Position gebracht wird, wird bei einem Laserdissektionsgerät in der Regel die Probe mit Hilfe des verstellbaren Mikroskoptisches in die richtige Position zur Beobachtung gebracht, und anschließend der Laserstrahl über Spiegel an die entsprechende Position geleitet. Der zu analysierende Bereich wird auf dem Bildschirm mit einem Spezialstift umrissen und nach Eingabe der experimentellen Parameter (Laserstrahldurchmesser im Fokus, Geschwindigkeit des Laserstahles, Abstand zwischen den Linien) im Line-Scan-Modus ablatiert.
