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Beschreibung
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Verfahren und Vorrichtung zur gezielten Fusion von Zellen Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Elektrofusion von Zellen, bei welchem die Zellen miteinander
in Membrankontakt gebracht und mittels eines geeigneten Feldimpulses fusioniert
werden.
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Des weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung
des Verfahrens mit zwei im Abstand voneinander angeordneten Elektroden, zwischen
denen zur Elektrofusion erforderliche elektrische Felder erzeugbar sind.
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Bisher ist ein Verfahren zur Elektrofusion von Zellen bekannt, bei
welchem diese in einer Zellsuspension durch Dielektrophorese im inhomogenen elektrischen
Feld längs der Feldlinien in Form sogenannter Perlenketten aufgereiht werden. Danach
wird ein geeigneter Feldimpuls appliziert, welcher Löcher im Bereich einer Membrankontaktzone
zwischen jeweils zwei sich berührenden Zellen erzeugt, so dass es zu einer Brückenbildung
zwischen den Membranen beider Zellen in der Membrankontaktzone kommt und schliesslich
eine fusionierte Zelle entsteht.
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Des weiteren ist noch ein Verfahren bekannt, bei dem eine Zellsuspension
mit hoher Zelldichte verwendet wird, in welcher ebenfalls die zur Fusion notwendigen
Feldimpulse appliziert werden, so dass die Membranen der Zellen durchlöchert werden
und sich statistisch zwischen einzelnen Zellen in der Suspension Brücken bilden
und folglich ebenfalls fusionierte Zellen entstehen.
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Alle bekannten Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass die Zahl
der miteinander fusionierenden Zellen nur sehr schwer oder überhaupt nicht kontrollierbar
ist. Bei dem zuletzt genannten Verfahren, bei welchem sich statistisch Brücken zwischen
den Membranen einzelner Zellen bilden, entstehen die Fusionsprodukte aus zwei oder
mehreren Zellen entsprechend einer statistischen Verteilung und sind nur über die
Konzentration der Zelldichte indirekt beeinflussbar. Es ist jedoch keinesfalls möglich,
im wesentlichen nur Fusionsprodukte aus zwei -Zellen herzustellen. Desgleichen ist
auch beim zuerst genannten Verfahren die Länge der einzelnen Perlenketten nur indirekt
beeinflussbar und es ist ebenfalls nicht möglich, das Verfahren so zu führen, dass
eine überwiegende Zahl der Perlenketten nur aus zwei Zellen besteht, so dass Fusionsprodukte
im wesentlichen nur aus zwei miteinander fusionierten Zellen entstehen.
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Bei der Anwendung der Elektrofusion in biotechnologischen Verfahren
ist es jedoch in zunehmendem Masse erforderlich, eine möglichst grosse Zahl von
Fusionsprodukten gezielt herzustellen, d.h. gezielt eine genau definierte Zahl von
Zellen miteinander zu fusionieren. Dies ist vor allem deshalb notwendig,
weil
es nach der Zellfusion sehr schwierig ist, zu unterscheiden, ob das Fusionsprodukt
genau die gewünschte Zahl fusionierter Zellen umfasst oder ob unerwünschterweise
mehr oder weniger Zellen als beabsichtigt miteinander fusioniert wurden.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der gattungsgemässen
Art zu schaffen, bei welchem in einfacher Weise eine gezielte Fusion zweier Zellen
möglich ist.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss bei einem Verfahren der eingangs
beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Zellen an einem ersten und einem zweiten
Träger fixiert werden, dass die beiden Träger so angeordnet werden, dass sich die
auf diesen fixierten Zellen gegenüberliegen, dass die Zellen aufeinanderzu bewegt
werden, so dass sich im wesentlichen Paare von Zellen bilden, welche eine Zelle
von dem ersten und eine Zelle von dem zweiten Träger umfassen, und dass die Zellen
der Paare anschliessend fusioniert werden.
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Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass durch die auf
den Trägern fixierten Zellen und das anschliessende Aufeinanderzubewegen im wesentlichen
nur Paare von Zellen hergestellt werden können, so dass nach der Fusion nahezu nur
Fusionsprodukte vorliegen, die aus jeweils einem derartigen Paar bestehen. Dabei
beschränkt sich dieses Verfahren selbstverständlich nicht auf die Herstellung von
Fusionsprodukten aus nur zwei Zellen, sondern es kann beispielsweise nach der Fusion
zweier Zellen das Fusionsprodukt
auf einem Träger fixiert bleiben
und auf dem anderen Träger eine weitere Zelle fixiert werden, die anschliessend
mit dem nach der ersten Fusion entstandenen Fusionsprodukt wiederum fusioniert werden
kann, so dass das neue Fusionsprodukt sich aus drei Zellen zusammensetzt.
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Damit hat man die Möglichkeit, in gezielter Weise eine beliebige Zahl
von Zellen miteinander zu fusionieren.
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Besonders interessant ist das erfindungsgemässe Verfahren, wenn zwei
unterschiedliche Zellen miteinander fusioniert werden sollen. Beispielsweise ist
hier an die Herstellung von Hybridomzellen zu denken. Eine derartige Fusion zweier
unterschiedlicher Zellen ist bei den eingangs beschriebenen, bereits bekannten Verfahren
in gezielter Weise überhaupt nicht möglich, da jeweils nur mit einer Zellsuspension
gearbeitet werden kann, in der die beiden unterschiedlichen Zellen zwar in einem
bestimmten Verhältnis, jedoch in statischer Verteilung vorliegen. Das Verfahren
ist durch keinen äusseren Parameter so beeinflussbar, dass nur jeweils Zellen unterschiedlicher
Art miteinander fusionieren, d.h.
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beispielsweise, dass sich Perlenketten aus Zellen einer Sorte A und
einer Sorte B zusammensetzen. Aus diesem Grund ist bei einem besonders vorteilhaften
Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens daran gedacht, dass auf dem
ersten Träger Zellen einer Sorte A und auf dem zweiten Träger Zellen einer Sorte
B fixiert werden. Damit lassen sich zum einen Fusionsprodukte mit der Konfiguration
A-A oder B-B und zum anderen Fusionsprodukte aus mehr als zwei Zellen im wesentlichen
vermeiden.
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Um eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung von
Fusionsprodukten aus den Zellen auf dem ersten Träger und den Zellen auf dem zweiten
Träger zu erreichen,
sollte einer Zelle auf dem ersten Träger mit
grosser Wahrscheinlichkeit eine Zelle auf dem zweiten Träger gegenüberliegen, die
dann zu einem Paar zusammengeführt werden können, so dass es zweckmässig ist, wenn
auf den Trägern so viele Zellen fixiert werden, dass eine Belegungsdichte von mindestens
ungefähr 60 % einer Oberfläche der Träger erreicht wird.
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Wenn jedoch sichergestellt werden soll, dass auf jeden Fall einer
Zelle auf dem ersten Träger eine Zelle auf dem zweiten Träger gegenüberliegt, kann
dies auch dadurch erreicht werden, dass die Oberfläche der Träger mit mindestens
einer Schicht von Zellen der jeweiligen Zellsorte belegt wird.
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Das Zusammenführen der auf den einander gegenüberliegenden Trägern
angeordneten Zellen ist auf verschiedene Art und Weise möglich.
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Ein Ausführungsbeispiel sieht vor, dass die Zellen durch mechanisches
Zusammenführen der Träger aufeinanderzu bewegt werden, so dass die auf den Oberflächen
der Träger angeordneten Zellen gegeneinander gedrückt und dadurch für die Fusion
in Membrankontakt miteinander gebracht werden. Der Vorteil dieser Lösung ist darin
zu sehen, dass zur Herstellung des Membrankontakts keine zusätzlichen Massnahmen
erforderlich sind und somit auch die mit diesen zusätzlichen Massnahmen verbundenen
Probleme nicht auftreten. Beispielsweise bringt die Verwendung der Dielektrophorese
für das Zusammenführen der Zellen stets eine unerwünschte und für die Zellen schädliche
Erwärmung der Zellsuspension aufgrund des für die Dielektrophorese notwendigen elektrischen
Wechselfeldes mit sich. Aber auch ein Zusammenführen der Zellen durch
Ma;netfelder
hat Nachteile, die sich in einem verschlechterten Wachstum der fusionierten Zellen
aufgrund der auf der Membran haftenden Magnetpartikel äussern.
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Eine weitere Möglichkeit zum Zusammenführen der Zellen besteht darin,
dass die Träger mechanisch bis auf einen geringen Abstand voneinander zusammengeführt
werden, dass die Zellen von mindestens einem der Träger gelöst werden und dass die
Zellen durch Dielektrophorese vollends zur Bildung von Paaren aufeinanderzu bewegt
werden. Dieses Ausführungsbeispiel hat den Vorteil, dass die Zellen nicht wie beim
mechanischen Zusammenführen teilweise einem grossen mechanischen Druck ausgesetzt
und dadurch gequetscht und geschädigt werden, sondern dass sie durch die Dielektrophorese
in leichtem Membrankontakt miteinander gehalten werden. Die Erwärmung der Zellsuspension
durch Dielektrophorese ist bei dieser Verfahrensführung deshalb nicht sehr gross,
weil die Zellen bereits durch das mechanische Zusammenführen in geringem Abstand
einander gegenüberliegen, so dass das Wechselfeld für die Dielektrophorese nur für
kurze Zeiten angelegt werden muss und daher auch nur eine unwesentliche Erwärmung
auftritt.
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Ein weiteres Ausführungsbeispiel sieht vor, dass eine Membran der
Zellen mit ferromagnetischen Partikeln versehen wird, dass die Träger mechanisch
bis auf einen geringen Abstand voneinander zusammengeführt werden und dass die Zellen
durch ein äusseres Magnetfeld vollends zur Bildung von Paaren aufeinanderzu bewegt
werden. Auch hierbei werden die Zellen nicht wie beim vollständigen mechanischen
Zusammenführen gequetscht und einem mechanischen Druck ausgesetzt und es kann jegliche
Erwärmung im Gegensatz zur Dielektrophorese vermieden werden, da die Zellen die
letzte kurze Distanz bis
zur Bildung von Paaren durch ein äusseres
Magnetfeld aufeinanderzu bewegt werden. Der einzige Nachteil dieser Methode ist
darin zu sehen, dass durch das Versehen der Membran der Zellen mit ferromagnetischen
Partikeln teilweise das Wachstum der fusionierten Zellen später gehemmt wird.
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Welches der drei vorgenannten Ausführungsbeispiele für die jeweils
zu fusionierenden Zellen Anwendung finden soll, ist von den Eigenschaften und Empfindlichkeiten
dieser Zellen abhängig zu machen, da die Zellen auf die in Xauf zu nehmenden Nachteile
bei jedem der drei Ausführungsbeispiele des Verfahrens in unterschiedlicher Weise
ansprechen, so dass das geeignete Verfahren jeweils in Abhängigkeit von den Eigenschaften
des Zelltyps ausgewählt werden muss.
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Bei den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen des erfindungsgemässen
Verfahrens wurden im Detail noch keine Aussagen darüber gemacht, wie die Zellen
auf den Träger aufgebracht und auf diesem fixiert werden können. Hierbei sind zunächst
prinzipiell alle Möglichkeiten denkbar, durch welche die Zellen beim Fixieren und
Aufbringen nicht geschädigt werden. Besonders zweckmässig ist es, wenn die Träger
so ausgebildet sind, dass eine Flüssigkeit durch sie hindurchgesaugt werden kann,
so dass zu einem Aufbringen der Zellen auf die Träger die Zellsuspension durch diese
hindurchgesaugt wird und die Zellen auf der Oberfläche des Trägers haften bleiben.
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Damit die Zellen jedoch nach dem Aufbringen auf die Oberfläche der
Träger nicht sofort wieder durch Flüssigkeit von diesen abgespült werden, sollte
eine Bindung zwischen den
Zellen auf der Oberfläche der Träger
und den Trägern selbst erfolgen.
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Dies ist dadurch möglich, dass die Zellen durch Haftung in Poren der
Träger fixiert werden. Das Aufbringen der Zellen erfolgt dabei beispielsweise, wie
oben beschrieben, durch Hindurchpumpen einer Zellsuspension durch die Träger, so
dass sich die Zellen in den Poren auf der Oberfläche festsetzen. Ein derartiges
Fixieren der Zellen auf dem Träger erlaubt sämtliche Methoden des Zusammenführens
der beiden Träger, da die Zellen sowohl durch Dielektror phorese wie auch durch
ein entsprechendes magnetisches Feld leicht aus den Poren der Träger herausgezogen
und auf die gegenüberliegende Zelle zu bewegt werden können.
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Ein anderes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens
sieht vor, dass die Zellen durch elektrostatische Wechselwirkung auf den Trägern
fixiert werden. Dabei kann eine Belegung der Oberfläche entweder dadurch erfolgen,
dass die Zellsuspension durch einen entsprechend ausgebildeten Träger hindurchgepumpt
wird oder dass die Zellsuspension parallel zur Oberfläche an dem Träger vorbeiströmt
und durch die elektrostatische Wechselwirkung die Zellen aus der Zellsuspension
herausgezogen und auf den Trägern fixiert werden.
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Das mechanische Zusammenführen der beiden Träger ist bei einer derartigen
Wechselwirkung ohne weiteres möglich, Probleme können jedoch dann entstehen, wenn
das mechanische Zusammenführen zusätzlich mit Dielektrophorese oder mit einem magnetischen
Zusammenführen der Zellen zu Paaren kombiniert ist, da dann die elektrostatische
Wechselwirkung zwischen den Zellen und den Trägern so klein sein muss, dass die
Zellen
bei der Dielektrophorese oder bei dem magnetischen Zusammenführen
trotzdem noch von einem der Träger gelöst werden können. Eine derartige Einstellung
der Stärke der elektrostatischen Wechselwirkung der Zellen mit dem Träger erfolgt
bevorzugterweise durch geeignete Wahl des pH-Wertes in der Zellsuspension.
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Schliesslich besteht auch noch die Möglichkeit, dass die Zellen durch
Bindung mittels Antikörpern auf den Trägern fixiert werden. Auch hier ist ein mechanisches
Zusammenführen der Zellen ohne weiteres möglich, jedoch muss ebenfalls bei einem
kombinierten Zusammenführen der Zellen einerseits durch mechanisches Aufeinanderzubewegen
der Träger und andererseits durch Dielektrophorese oder mittels magnetischer Felder
sichergestellt werden, dass die Zellen durch die dabei auf diese ausgebübten Kräfte
von zumindest einem der Träger ablösbar sind, d.h. dass die Bindungen zwischen den
Zellen und den Antikörpern so schwach sind, dass sie von den Kräften aufgehoben
werden können, die durch das bei der Dielektrophorese angewandte Wechselfeld oder
das Magnetfeld entstehen.
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Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung
zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zu schaffen.
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Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen
Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass zwischen den Elektroden zwei Trägerelemente
mit gegeneinander gerichteten und Zellen tragenden Oberflächen positionierbar sind,
wobei die Oberflächen einen ersten Abstand voneirander aufweisen.
Vorteilhaft
bei dieser Vorrichtung ist, dass sie erlaubt, das eingangs beschriebene erfindungsgemässe
Verfahren in sehr einfacher Weise durchzuführen, wobei vor allem die zwischen die
Elektroden positionierbaren Trägerelemente eine sehr einfache Möglichkeit bieten,
in gezielter Weise Paare von Zellen zu erzeugen und zur Fusion zwischen den Elektroden
zu placieren.
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Dabei kann es zweckmässig sein, wenn eine Verstellvorrichtung vorgesehen
ist, mittels welcher die Oberflächen von einem zweiten, wesentlich grösseren Abstand
bis auf den ersten Abstand aufeinanderzu bewegbar sind, so dass die Trägerelemente
zunächst mit einem grösseren zweiten Abstand in die Verstellvorrichtung eingesetzt
werden können und anschliessend die Möglichkeit besteht, die Trägerelemente und
dadurch auch die auf deren Oberfläche fixierten Zellen bis zu dem gewünschten ersten
Abstand aufeinanderzu zu bewegen.
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Wenn die Zellen mechanisch zu Paaren zusammengeführt werden sollen,
ist es notwendig, dass der erste Abstand so gering ist, dass die Zellen an den Oberflächen
der beiden Trägerelemente in Membrankontakt kommen, d.h. der erste Abstand richtet
sich danach, welche Grösse die Zellen haben, und wie weit die auf den Oberflächen
fixierten Zellen von diesen maximal abstehen.
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Wenn vorgesehen ist, dass die Zellen zunächst durch mechanisches Zusammenführen
in einem bestimmten Abstand voneinander angeordnet werden und das letzte Stück durch
Dielektrophorese oder Magnetfelder aufeinanderzu bewegt werden, ist es vorteilhaft,
wenn der erste Abstand ungefähr einem Mehrfachen
des Durchmessers
der Zellen entspricht, so dass nur diese geringe Strecke durch Dielektrophorese
oder Zusammenführen mittels Magnetfeldern überbrückt werden muss. Weiterhin ist
bei einem mechanischen Zusammenführen der Trägerelemente bis zu einem dem Durchmesser
mehrerer Zellen entsprechenden ersten Abstand von Vorteil, dass es zur Herstellung
einer Schicht aus Fusionsmedium zwischen den Trägerelementen, in welcher die Zellen
schwimmend mittels elektrischen oder magnetischen Feldern bewegt werden können,
nicht notwendig ist, diese Trägerelemente selbst oder mitsamt den Elektroden so
auszugestalten, dass ein Behältnis entsteht, welches die Flüssigkeit zwischen den
Trägerelementen hält, sondern dass bei einem derart geringen ersten Abstand der
auf jedem Trägerelement noch haftende Flüssigkeitsfilm für die Ausbildung der Schicht
aus Fusionsmedium ausreicht.
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Bei Anwendung der Dielektrophorese für das Zusammenführen der Zellen
zu Paaren ist keine besondere Ausgestaltung der Vorrichtung notwendig, da das für
die Dielektrophorese erforderliche Wechselfeld mittels derselben Elektroden erzeugt
werden kann wie sie auch für die Erzeugung des für die Elektrofusion notwendigen
Feldimpulses verwendet werden.
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Beim Zusammenführen der Zellen mittels Magnetfeldern ist es notwendig,
dass Spulen zur Erzeugung quer zu den Oberflächen verlaufender magnetischer Felder
vorgesehen sind, wobei vorteilhafterweise Feldlinien dieser magnetischen Felder
im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche der Trägerelemente
verlaufen,
damit die Zellen von einem Trägerelement auf die gegenüberliegenden Zellen des anderen
Trägerelements zu bewegt werden und kein Bewegen der Zellen parallel zu den Oberflächen
der Trägerelemente erfolgt.
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Wenn eine Fixierung der Zellen auf der Oberfläche der Trägerelemente
in den Poren dieser Trägerelemente erfolgen soll, ist es vorteilhaft, wenn die Trägerelemente
Filter mit einer dem Durchmesser der jeweils zu fusionierenden Zellen entsprechenden
Porengrösse sind, da diese Materialien einerseits erlauben, Feldsuspension zum Aufbringen
der Zellen auf die Trägerelemente durch diese hindurchzusaugen, so dass ein einfaches
Belegen der Trägerelemente mit Zellen möglich ist, und andererseits nur die Zellen
oder Partikel, die ungefähr der Zellgrösse entsprechen, sich in den Poren festsetzen
und in diesen formschlussähnlich gehalten sind.
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Der Nachteil einer Fixierung der Zellen in den Poren auf der Oberfläche
der Trägerelemente ist jedoch hauptsächlich darin zu sehen, dass beim Hindurchsaugen
neben den Zellen, wie bereits beschrieben, auch Schmutzpartikel sich in den Poren
festsetzen, so dass bei einer Zellsuspension, die neben den Zellen vergleichbar
grosse derartige Partikel enthält, eine hohe Belegungsdichte der Oberfläche der
Trägerelemente mit Zellen nicht erreichbar ist. Aus diesem Grund ist es beispielsweise
von Vorteil, wenn die Trägerelemente zum Fixieren der Zellen auf ihren Oberflächen
ein Ionenaustauschermaterial tragen. Ein derartiges Material ist ebenfalls einfach
und billig zu beschaffen und bietet andererseits die Möglichkeit, dass aufgrund
der weit spezifischeren
Wechselwirkung zwischen den Trägerelementen
und den Zellen auch bei mit Schmutzteilen befrachteter Zellsuspension eine hohe
Belegungsdichte auf den Oberflächen erreicht werden kann, da zumindest ein Teil
der Schmutzpartikel durch das Ionenaustauschermaterial nicht an die Oberfläche der
Trägerelemente gebunden wird. Ausserdem hat eine derartige Ausführung der Trägerelemente
noch den Vorteil, dass es nicht unbedingt notwendig ist, die Trägerelemente aus
einem porösen Material herzustellen, durch das zum Belegen von deren Oberfläche
mit Zellen die Zellsuspension hindurchgesaugt werden muss, sondern dass man auch
beispielsweise die Möglichkeit hat, die Zellsuspension parallel zur Oberfläche der
Trägerelemente an diesen vorbeiströmen zu lassen, wobei sich aufgrund der elektrostatischen
Wechselwirkung die Zellen trotzdem an der Oberfläche der Trägerelemente anlagern.
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Die spezifischste Wechselwirkung der Zellen mit den Trägerelementen
ist dadurch erreichbar, dass die Trägerelemente zum Fixieren der Zellen auf ihren
Oberflächen für die jeweils zu fixierenden Zellen spezifische Antikörper tragen.
Der Vorteil einer derartigen Ausbildung der Trägerelemente zeigt sich darin, dass
die Antikörper so gewählt werden können, dass nur ganz bestimmte Zellen aus der
Zellsuspension auf der Oberfläche der Trägerelemente angelagert werden. Damit hat
man die Möglichkeit, selbst bei Zellsuspensionen, die mehrere Sorten von Zellen
enthalten, nur die jeweils gewünschte Zellsorte auf der Oberfläche der Trägerelemente
anzulagern, ohne dass die übrigen, in der Zellsuspension
noch vorkommenden
Zellsorten einen störenden Einfluss ausüben. Des weiteren ist eine Verminderung
der Belegungsdichte durch eventuell in der Zellsuspension enthaltene Schmutzpartikel
vollständig ausgeschlossen, da die Antikörper mit diesen in keinem Fall wechselwirken.
Die Antikörper-Zelle-Wechselwirkung kann sogar so spezifisch sein, dass nur lebende
und lebensfähige Zellen auf den Trägerelementen fixiert werden und bereits Zellen,
die kurz vor dem Absterben oder bereits abgestorben sind, durch die Antikörper nicht
mehr gebunden werden. Des weiteren kann auch, wie bereits beim Ionenaustauschermaterial,
das Auftragen der Zellen auf die Oberfläche der Trägerelemente zum einen durch Durchströmen
der Trägerlemente erfolgen, wobei diese dann aus porösem Material hergestellt sein
müssen, das jedoch eine Porengrösse haben kann, die weit grösser ist als der Durchmesser
der Zelle, so dass auch hier eine Verminderung der Belegungsdichte durch auf den
Oberflächen angelagerte Schmutzpartikel wesentlich geringer ist. Zum anderen kann
die Zellsuspension parallel zur Oberfläche der Trägerelemente strömen, so dass die
sich längs der Oberfläche bewegenden Zellen durch die Antikörper eingefangen werden.
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Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind Gegenstand der folgenden
Beschreibung sowie der zeichnerischen Darstellung einiger Ausführungsformen der
Erfindung. In der Zeichnung zeigen: Fig. 1 eine teilweise aufgebrochene Seitenansicht
des ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemässen Vorrichtung; Fig.1a einen
Ausschnitt im Bereich A in Fig.1;
Fig. 2 eine perspektivische Frontansicht
einer Halterung gemäss Fig. 1; Fig. 3 ein Aufbringen von Zellen auf ein Trägerelement
gemäss einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens und Fig. 4 eine
Ansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels entsprechend Fig. 1.
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Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemässen Vorrichtung
in Fig. 1 zeigt im einzelnen eine verstellbare Haltevorrichtung 10, welche zwei
einander gegenüberstehende Aufnahmeteile 12 und 14 umfasst, wobei das Aufnahmeteil
14 direkt an einer Grundplatte 16 gehalten ist und senkrecht von dieser absteht
und das Aufnahmeteil 12 seinerseits an einem Schlitten 18 befestigt ist, welcher
auf einer auf der Grundplatte 16 angeordneten Führung 20 verschieblich gelagert
ist. Auf einer dem Aufnahmeteil 14 entgegengesetzten Seite trägt die Grundplatte
16 noch eine ebenfalls in gleicher Richtung wie das Aufnahmeteil 14 senkrecht von
dieser abstehende Platte 22, an welcher ein Gehäuse 24 einer Mikrometerschraube
26 gehalten ist.
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Die Mikrometerschraube 26 dient zur definierten Verschiebung des Schlittens
18 auf der Führung 20, wozu ein Verschiebebolzen 28 der Mikrometerschraube 26 auf
den Schlitten 18 wirkt und mit diesem zumindest bezüglich seiner Verschieberichtung
fest verbunden ist.
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An jedem der einander gegenüberstehenden Aufnahmeteile 12 und 14 ist
jeweils eine von zwei einander gegenüberliegenden Halterungen 30 und 32 befestigt.
Diese Halterungen 30
und 32 tragen auf einanderzugewandten Seiten
parallel zueinander verlaufende Elektroden 34 und 36, die so ausgerichtet sind,
dass sie senkrecht zu einer Verschieberichtung 38 des Schlittens 18 verlaufen, wobei
diese Verschieberichtung 38 im allgemeinen parallel zur Grundplatte 16 verläuft.
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Vorteilhafterweise umfasst jede der Halterungen 30 und 32 einen Trichter
40 bzw. 42, welcher eine grosse Öffnung 44 bzw. 46 und eine kleine Öffnung 48 bzw.
50 besitzt. Die grosse Öffnung 44 bzw. 46 ist mit einem zylindrischen Flansch 52
bzw. 54 versehen, an welchem die den Trichter 40 bzw. 42 abdeckende Elektrode 34
bzw. 36 gehalten ist. Eine Zylinderachse des Flansches 52 bzw. 54 verläuft parallel
zur Verschieberichtung 38. Des weiteren ist die kleine Öffnung 48 bzw. 50 mit einer
Olive 56 bzw. 58 ausgerüstet, auf die jeweils ein Saugschlauch 60 bzw. 62 aufsteckbar
ist.
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Dieser steht wiederum mit einer Pumpe 64 bzw. 66 in Verbindung, so
dass folglich durch diese Pumpen 64 bzw. 66 in einem Inneren einer jeden der Halterungen
30 und 32 ein Unterdruck erzeugbar ist.
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Die beiden mit einer Oberfläche parallel zueinander verlaufenden und
senkrecht zu dieser Oberfläche durch die Mikrometerschraube 26 verschiebbaren Elektroden
34 und 36 sind jeweils mit einem Trägerelement 68 bzw. 70 überzogen, welches über
die jeweilige Elektrode 34 bzw. 36 übersteht und zusätzlich noch auf einer Aussenseite
des senkrecht zu der Elektrode 34 bzw. 36 verlaufenden zylindrischen Flansches 52
bzw. 54 überlappend anliegt. Zur Fixierung des Trägerelements 68, 70 ist dieser
Flansch 52 bzw. 54 mit einer Ringnut 72 versehen, in welchen ein diese
Ringnut
72 überlappender Teil des Trägerelements 68 bzw. 70 durch einen auf dem Trägerelement
68 bzw. 70 aufliegenden Elastomerring 76 bzw. 78 gedrückt ist (Fig.la).
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Das Trägerelement 68 bzw. 70 dient zur Fixierung von zu fusionierenden
Zellen 80 (Fig. 2). Bei dem ersten Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass ein
Aufbringen der Zellen 80 durch Hindurchsaugen einer Zellsuspension 84 durch das
jeweilige Trägerelement 68 bzw. 70 erfolgt (Fig.3).
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Dazu müssen die Elektroden 34 bzw. 36 perforiert ausgebildet sein
und die darauf aufliegenden Trägerelemente 68 bzw. 70 ebenfalls aus einem flüssigkeitsdurchlässigen
Material bestehen. Bevorzugterweise wird, wie in Fig. 2 dargestellt, für die Trägerelemente
68 und 70 ein poröses Filtermaterial verwendet und die darunterliegenden Elektroden
34 bzw. 36 sind aus einem Drahtgeflecht hergestellt. Somit kann durch Evakuieren
eines Inneren der Halterung 30 bzw. der Halterung 32 ein Flüssigkeitsstrom sowohl
durch das jeweilige Trägerelement 68 bzw. 70 sowie durch die Elektrode 34 bzw.
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36 in das Innere der Halterung 30 bzw. 32 erzeugt werden, wobei die
in der Zellsuspension 84 enthaltenen Zellen sich auf einer der jeweiligen Elektrode
34 bzw. 36 abgewandten Oberfläche 86 bzw. 88 des jeweiligen Trägerelements 68 bzw.
70 anlagern und entsprechend den eingangs beschriebenen Möglichkeiten fixiert werden.
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Ein derartiges Aufbringen der Zellen auf die Oberflächen 86 und 88
der Trägerelemente 68 und 70 kann beispielsweise in einer in Fig. 3 dargestellten
Vorrichtung erfolgen, wozu die jeweilige Halterung 30 bzw. 32 aus dem entsprechenden
Aufnahmeteil 12 bzw. 14 gelöst und in ein Gefäss 90
mit einem Bad
der Zellsuspension 84 eingetaucht wird. Gleichzeitig wird über die an der jeweiligen
Halterung 30 bzw. 32 über den Saugschlauch 60 bzw. 62 angeschlossene Pumpe 64 bzw.
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66 ein Unterdruck im Innern der Halterung 30 bzw. 32 erzeugt, so dass
die Flüssigkeit der Zellsuspension 84 in der beschriebenen Weise durch das Trägerelement
68 bzw. 70 sowie die Elektrode 34 bzw. 36 hindurchströmt.
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Sobald die Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 jeweils
mit einer Schicht von Zellen 80 belegt sind, werden die Halterungen 30 und 32 in
die vorgesehenen Aufnahmeteile 12 und 14 der Haltevorrichtung 10 eingesetzt und
mit diesen Verbunden.
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Hierbei ist ein Abstand zwischen den Aufnahmeteilen 12 und 14 derart
zu wählen, dass die Oberflächen 86 und 88 einen grossen Abstand voneinander aufweisen
und vor allem die Halterungen 30 und 32 bequem in die Aufnahmeteile 12 und 14 einsetzbar
sind. Nach Fixieren der Halterungen 30 und 32 wird durch Drehen der Mikrometerschraube
26 der Schlitten 18 auf der Führung 20 in Verschieberichtung 38 verschoben, so dass
die Oberflächen 86 und 88 der beiden Trägerelemente 68 und 70 aufeinanderzu bewegt
werden. Je nach dem beabsichtigten Verfahren der Zellfusion werden die beiden Oberflächen
86 und 88 so lange verschoben bis sie einander berühren, oder es ist zumindest eine
der Oberflächen 86 und 88 mit Abstandshaltern 92 versehen, welche das Zusammenführen
der beiden Oberflächen 86 und 88 nur bis auf einen durch die Dicke der Abstandshalter92
definierten Abstand ermöglichen.
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Diese Abstandshalter 92 werden vor allem dann eingesetzt,
wenn
die Paare von Zellen nach einem Zusammenführen der Oberflächen 86 und 88 auf mechanische
Art und Weise vollends durch Dielektrophorese gebildet werden.
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Zur Erzeugung eines für die Dielektrophorese erforderlichen Wechselfeldes
sowie zur späteren Applikation der Fusionsimpulse sind die beiden Elektroden 34
und 36 über elektrische Leitungen 94 und 96 mit einem Spannungsgenerator 98 verbunden,
der sowohl in der Lage ist, das für die Elektrophorese erforderliche Feld wie auch
die für die Fusion notwendigen Feldimpulse zu erzeugen, wobei selbstverständlich
bei vollständigem Zusammenführen der Oberflächen 86 und 88 für die Dielektrophorese
kein Feld mehr angelegt werden muss, sondern sofort die Fusionsimpulse appliziert
werden können.
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Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Vorrichtung,
dargestellt in Fig. 4, besitzt im wesentlichen dieselben Teile, welche auch mit
denselben Bezugszeichen wie beim ersten Ausführungsbeispiel versehen sind und daher
nicht mehr gesondert beschrieben werden.
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Zusätzlich ist bei dieser Vorrichtung noch an den Aufnahmeteilen 12
und 14 jeweils eine die Halterungen 30 bzw.
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32 umgebende Spule 100 bzw. 102 vorgesehen, welche vorteilhafterweise
einen Innendurchmesser aufweist, der grösser als ein grösster Durchmesser der jeweiligen
Halterung 30 bzw. 32. Diese Spulen sind so dimensioniert, dass sie vorzugsweise
ein magnetisches Feld erzeugen, dessen Feldlinien ungefähr senkrecht auf den Oberflächen
86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 stehen.
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Zur Stromversorgung der Spulen 100 und 102 ist noch ein Stromversorgungsgerät
104 vorgesehen, welches über jeweils zwei Leitungen 106 und 108 mit den Spulen 100
bzw. 102 verbunden ist und den für die Erzeugung einer ausreichend grossen Feldstärke
notwendigen Strom liefert.
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Das zweite Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Vorrichtung
erlaubt somit, sämtliche der eingangs beschriebenen Verfahren zum Zusammenführen
der Zellen, d.h. zur Bildung von Zellpaaren anzuwenden.
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Es ist möglich, die beiden Oberflächen 86 und 88 nicht mit den Abstandshaltern
92 zu versehen, so dass sie durch die Mikrometerschraube 26 dicht aneinander angelegt
werden und dadurch mechanisch Paare von Zellen entstehen.
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Es ist aber ebenfalls möglich, die beiden Oberflächen 86 und 88 nur
bis zu den durch die Abstandshalter 92 vorgegebenen Abstand zusammenzuführen, so
dass dieser Abstand bevorzugterweie dem Durchmesser mehrerer Zellen entspricht,
jedoch so gering ist, dass ein jeweils auf einer der Oberflächen 86 und 88 haftender
Flüssigkeitsfilm ausreicht, um eine durchgehende Flüssigkeitsschicht zwischen den
zusammengeführten Oberflächen 86 und 88 zu bilden, die aufgrund der Kapillarwirkung
zwischen diesen Oberflächen gehalten wird und in welcher die Zellen beim Zusammenführen
mittels Dielektrophorese oder mittels magnetischer Felder aufeinanderzu schwimmen
können.
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Je nach dem, ob nun nach dem Zusammenführen der Oberflächen 86 und
88 ein elektrisches Wechselfeld für die Dielektrophorese
angelegt
wird, oder ob mittels der Spulen 100 und 102 ein Magnetfeld erzeugt wird, werden
die Zellen vor Applikation des Fusionsimpulses durch den Spannungsgenerator 98 entweder
durch ein elektrisches Feld oder durch ein magnetisches Feld zu Paaren zusammengeführt.
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Bei Verwendung magnetischer Felder ist es selbstverständlich, dass
die Materialien für die Halterungen 30 und 32 so gewählt werden müssen, dass sie
für das Magnetfeld durchlässig sind. Die Elektroden 34 und 36, die notwendigerweise
aus einem elektrisch leitenden Material bestehen müssen, können dabei entweder selbst
aus einem ferromagnetischen Material hergestellt sein oder es genügt, wenn diese
eine ausreichende Zahl von Perforationen aufweisen, durch welche das magnetische
Feld hindurchtreten kann.
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Zum Entfernen der fusionierten Zellen von den Oberflächen 86 und 88
der Trägerelemente 68 und 70 werden die beiden Oberflächen 86 und 88 wieder auseinandergeschoben
und vorzugsweise die Halterungen 30 und 32 von den Aufnahmeteilen 12 und 14 gelöst
und die Zellen durch Eintauchen der Halterungen 30 und 32 in eine Lösung abgespült,
wobei selbstverständlich hierzu die Pumpen 64 und 66 nicht mehr benötigt werden.
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Bei den folgenden, im Detail beschriebenen Ausführungsbeispielen des
erfindungsgemässen Verfahrens werden jeweils Hefezellen eines unterschiedlichen
Typs, nämlich Hefezellen des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH 215 und des Stammes
Saccharomyces cerevisiae AH22,miteinander fusioniert, wobei jeweils eine der Oberflächen
86 und 88 mit Zellen des ersten Typs und die andere mit Zellen des zweiten Typs
belegt
wird. Dabei können für die Herstellung der Zellsuspensionen
zwei unterschiedliche Lösungen verwendet werden.
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Als erste, äusserst schwach leitende Lösung dient eine isotone Sorbitollösung,
in welcher zusätzlich noch 0,1 mbiol Calcium-Chlorid und 0,5 mMol Magnesium-Chlorid
sowie 1 mg Albumin/ml enthalten sind. Das Albumin hat dabei nur die Aufgabe, eine
elektrostatische Haftung der Zellen, beispielsweise an Gefässinnenflächen zu vermeiden.
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Als zweite, stark leitende Lösung dient ebenfalls eine isotone Sorbitollösung,
in welcher zu 0,1 mMol Calcium-Chlorid, 0,5 mMol Magnesium-Chlorid und 1 mg Albumin
/ml noch zusätzlich 12 mMol KCl und 40 mMol NaCl zugesetzt sind, wobei relativ zur
ersten Lösung die Konzentration des Sorbits geringer sein muss, um eine konstante
Isoosmolarität zu gewährleisten.
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Eine Zelldichte der Zellsuspension lag bei beiden verwend-9 baren
Lösungen bei ungefähr 10 Zellen/ml.
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Selbstverständlich wurden bei den folgenden Experimenten jeweils beide
Zelltypen vor ihrem Aufbringen auf eine der Oberflächen 86 und 88 getrennt, jedoch
in jeweils derselben Lösung,suspendiert, d.h. beide Typen in Lösung 1 oder beide
Typen in Lösung 2.
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1. Beispiel des Verfahrens Hierbei dient als Trägerelement 68 und
70 jeweils ein Milliporefilter, dessen Porendurchmesser so gewählt wird, dass
er
ungefähr dem Durchmesser der zu fusionierenden Zellen entspricht. Dies bedeutet
bei den vorliegenden Hefezellen einen Porendurchmesser des MillEporefilters von
4 bis 6 jim.
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Die Fixierung der Zellen auf der Oberfläche 86 und 88 des jeweiligen
Milliporfilters erfolgt somit durch Einlagerung der Zellen in den Poren, d.h. durch
einen Formschluss.
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Dazu wird, wie bereits beschrieben, jede der Halterungen 30 und 32
aus den Aufnahmeteilen 12 und 14 entnommen und jede der Halterungen 30 und 32 in
ein Gefäss getaucht, in welchem der jeweilige zu fixierende Typ von Hefezellen in
Form der Zellsuspension vorliegt. Durch Einschalten der Pumpen 64 und 66 wird die
Lösung durch das als Trägerelement 68 und 70 dienende Milliporefilter und auch durch
die dahinterliegende Elektrode 34 bzw. 36 hindurchgesaugt, wobei die auf den Oberflächen
86 bzw. 88 auftreffenden Zellen sich in den Poren des MillireEilters festsetzen.
Das Hindurchsaugen der Lösung erfolgt so lange, bis sich der Strömungswiderstand
merklich erhöht. Nun werden die beiden Halterungen 30 und 32 aus den Suspensionen
entnommen und in das jeweils entsprechende Aufnahmeteil 12 bzw. 14 eingesetzt. Hierbei
ist jedoch noch zu erwähnen, dass es bei der formschlüssigen Fixierung der Zellen
auf den Oberflächen 86 und 88 vorteilhaft ist, auch nach dem Entnehmen der Halterungen
30 und 32 aus den jeweiligen Zellsuspensionen einen geringen Unterdruck im Innern
der Halterungen 30 und 32 aufrecht zu erhalten, damit die darin stehende Lösung
nicht durch die Elektroden 34 bzw. 36 und das darauf liegende Trägerelement 68 bzw.
70 nach aussen strömt und die in den Poren formschlüssig gehaltenen Zellen wieder
von den Oberflächen 86 und 88 wegschwemmt. Aus diesem Grund wird der Unterdruck
im
Innern der Halterungen 30 und 32 zum einen so gross gewählt,
dass die Lösung im Innern nicht wieder zurückströmt, zum andern jedoch so klein,
dass auf der jeweiligen Oberfläche 86 bzw. 88 noch ein ausreichend dicker Flüssigkeitsfilm
bestehen bleibt und vor allem nach dem Entfernen der Halterungen 30 und 32 aus den
Zellsuspensionen keine Luft durch die Milliporefilter hindurchgesaugt wird.
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Das Zusammenführen der mit Zellen belegten Oberflächen 86 und 88 der
Trägerelemente 68 und 70 kann, wie bereits vorstehend erläutert wurde, auf verschiedene
Art und Weise erfolgen: a) Mechanisches Zusammenführen Hierzu werden mittels der
Mikrometerschraube 26 die beiden Oberflächen 86 und 88 mechanisch bis auf ungefähr
1 Am zusammengeschoben. Dieser Abstand kann beispielsweise durch ein Objekt-Mikrometer
bestimmt und kontrolliert werden.
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Damit stehen die beiden Typen von Hefezellen, von denen der eine
auf der Oberfläche 86 und der andere auf der Oberfläche 88 fixiert ist, in Membrankontakt
miteinander und es müssen nur noch mittels des Spannungsgenerators 98 zwei Fusionsimpulse
im Abstand voneinander von ungefähr 0,5 Sekunden appliziert werden. Die Fusionsimpulse
haben eine Dauer von 10 ßsec und eine Feldstärke und eine Feldstärke von 10 kV/cm.
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0 Bei Raumtemperatur (ungefähr 24 C) können die beiden Oberflächen
86 und 88 nach ungefähr einer Ausheilzeitspanne der Zellen von 10 Minuten durch
Drehen der
Mikrometerschraube 26 voneinander getrennt werden. Die
Halterungen 30 und 32 werden dann wiederum aus den Aufnahmeteilen 12 und 14 entnommen
und in einem bekannten Wachstumsmedium für die Fusionsprodukte von den Trägerelementen
68 und 70, d.h. in diesem Falle den Milliporefiltern abgewaschen. Nach Anziehen
der fusionierten Hybridzellen in dem Wachstumsmedium werden diese kloniert und dann
weiter auf Agar gezogen. Das Wachstumsmedium sowie das Klonieren und weitere Anziehen
der Hybride ist ausführlich in der Publikation von Schnettler et al. (Schnettler,
Zimmermann und Emeis, FEMS Letters 24, (1984) Seite 81-85) beschrieben.
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Nach ungefähr zweiwöchigem Anziehen der fusionierten Zellen konnte
bei Verwendung der Lösung 1 eine Ausbeute von ungefähr 5000 Hybriden und bei Verwendung
der Lösung 2, d.h. der leitenden, einer physiologischen Konzentration ähnlicheren
Lösung,etwa 6000. bis 7000 Hybride gezählt werden.
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Eine Wärmeentwicklung bei Verwendung der leitenden Lösung konnte
nicht beobachtet werden, da die Fusionsimpulse sehr kurz sind, so dass in der Lösung
eine elektrische Leitung durch die Ionen, die zu einer Wärmeentwicklung führt, nur
in unwesentlichem Umfang eintritt.
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b) Mechanisches Zufammenführen in Kombination mit Dielektrophorese
Das Belegen der Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 erfolgte identisch
wie bei a), die Oberflächen
86 und 88 wurden mechanisch, jedoch
nur bis zu einem Abstand von ungefähr 20 ßm zusammengeführt. Hierzu konnten, wie
bereits beschrieben, Abstandshalter 92 mit einer Dicke von 20 ßm verwendet werden.
Durch die sich zwischen den Oberflächen 86 und 58 bildende Schicht aus der ursprünglichen
Lösung können die Zellen bei Anlegen eines für die Dielektrophorese üblichen elektrischen
Wechselfeldes aufeinanderzu bewegt werden, wobei eine der ein Paar bildenden Zellen
aus ihrer Oberfläche herausgelöst wird, was jedoch bei den formschlüssig in den
Poren des Milliporefilters sitzenden Zellen problemlos erfolgen kann. Das Wechselfeld
für die Dielektrophorese wurde 10 Sekunden lang angelegt, wobei die Feldstärke 3
kV/cm betrug. Anschliessend wurden die beiden Fusionsimpulse mit einer Feldstärke
von 10 kV/cm und einer Pulslänge von 10 ijsec im Abstand von 0,5 Sekunden appliziert.
Für die Herstellung der Zellsuspension konnte wie bei a) ebenfalls die Lösung 1
oder die Lösung 2 verwendet werden. Die Verwendung einer elektrisch stark leitenden
Lösung auch bei Dielektrophorese ist deshalb möglich, weil die Zellen nur über eine
sehr kleine Distanz von in diesem Fall 20 ßm aufeinanderzu bewegt werden müssen,
so dass das Wechselfeld nur für eine kurze Zeitspanne anzulegen ist und daher auch
keine sehr grosse Erwärmung auch bei leitender Lösung auftritt.
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Das Entfernen der Fusionsprodukte von den Oberflächen 86 und 88 sowie
das Anziehen der Hybride erfolgt wie bei a).
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Die Ausbeute betrug bei Lösung 1 ungefähr 5800 Hybride und bei Lösung
2 etwa 6500.
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c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit einem Zusammenführen
durch magnetische Felder Auch bei diesem Ausführungsbeispiel können dieselben Lösungen,
d.h. Lösung 1 und Lösung 2, wie bei a) verwendet werden. Damit die Zellen jedoch
durch magnetische Felder aufeinanderzu bewegbar sind, sind die Membranen der Hefezellen
vorher mit magnetischen Teilchen zu versehen. Hierzu wird der Zellsuspension ein
ßg/ml Poylysin zugegeben, durch welches ebenfalls zugegebene Teilchen aus Magnetit
(Mischung aus Fe203 und Fe304>, im Handel unter der Bezeichnung Ferrofluid zu
erwerben, auf einer Oberfläche der Membran der Hefezellen gebunden werden.
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Das Belegen der Membran mit Zellen erfolgt wie bei den vorher beschriebenen
Ausführungsbeispielen und die Oberflächen 86 und 88 werden wie bei b) bis auf eine
Distanz von 20 Am einander angenähert.
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Durch Anlegen eines Magnetfeldes werden die Zellen, wie bei der Dielektrophorese,
von einer der Oberflächen 86 oder 88 abgelöst und aufeinanderzu bewegt Die Fusion
der Zellen sowie das spätere Ablösen von den Oberflächen 86 und 88 erfolgt wie bereits
unter a) und b) beschrieben.
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Bei Verwendung der genannten Lösungen wurden Ausbeuten von ungefähr
2500 Hybriden erreicht.
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2.Beispiel des Verfahrens Die Trägerelemente 68 und 70 sind bei diesem
Ausführungsbeispiel als poröse Ionenaustauschermembran ausgebildet, wobei es sich
bevorzugterweise um einen Kationenaustauscher handelt, welcher in der Lage ist,
an den Oberflächen 86 und 88 positiv geladene Teilchen elektrostatisch zu binden.
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Das Belegen der Oberflächen 86 und 88 erfolgt wie bei den bisher beschriebenen
Ausführungsbeispielen ebenfalls durch Hindurchsaugen der Lösung durch die jeweiligen
Trägerelemente 68 und 70 sowie die Elektroden 34 und 36 in das Innere der Halterungen
30 und 32 mittels der Pumpen 64 und 66. Als Lösungen werden wie bei den bisher beschriebenen
Ausführungsbeispielen ebenfalls die Lösungen 1 und 2 verwendet. Die Suspensionsdichte
wird dabei so eingestellt, dass auf den Oberflächen 86 und 88 eine einlagige Schicht
von Zellen entsteht. Die Stärke der elektrostatischen Bindung der Zellen auf den
Oberflächen 86 und 88 der-Ionenaustauschermembran kann durch Variation des pH-Wertes
in der Zellsuspension entsprechend eingestellt werden.
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a) Mechanisches Zusammenführen Hierzu ,werden,wie unter a) des ersten
Beispiels beschrieben, die Oberflächen 86 und 88 bis auf einen Abstand von ungefähr
1 ßm aufeinanderzu bewegt, so dass die Zellen miteinander in Membrankontakt kommen.
Da die Zellen zur Bildung der Paare weder von der Oberfläche 86, noch von der Oberfläche
88 abgelöst werden müssen, kann die
Bindung der Zellen an diese
Oberflächen sehr gut sein, so dass in den Lösungen zunächst mit einem pH-Wert von
ungefähr 7 gearbeitet werden kann. Nach Applikation der Fusionsimpule mit derselben
Stärke wie bei den bisherigen Ausführungsbeispielen wird ebenfalls wieder das Ausheilen
der Zellmembran abgewartet und anschliessend die beiden Oberflächen 86 und 88 voneinander
entfernt.
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Um im folgenden die Zellen von den Oberflächen 86 und 88 leicht abspülen
oder abwaschen zu können, wird ein Nährmedium mit einem pH-Wert verwendet, der ungefähr
bei 6 liegt. Ein derart erniedrigter pH-Wert führt dazu, dass sich auf dem Ionenaustauschermaterial
Protonen anlagern, welche die Bindungen zwischen den Zellen und der Kationenaustauschermembran
lösen, so dass sich diese leichter entfernen lassen. Das Klonieren und Anziehen
der Zellen erfolgt wie bei den bisherigen Ausführungsbeispielen. Als Ausbeute werden
ungefähr 7700 Hybride gezählt.
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b) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit Dielektrophorese
Die Verfahrensführung erfolgt wie bei b) des ersten Ausführungsbeispiels, mit dem
einzigen Unterschied, dass in diesem Fall der pH-Wert der Lösung 1 oder der Lösung
2 so eingestellt werden muss, dass die Zellen von den Oberflächen 86 und 88 durch
das elektrische Feld abgelöst werden können, da ansonsten ein Zusammenführen der
Zellen zu Paaren nicht möglich wäre. Nach dem üblichen Klonieren und Anziehen der
Zellen erhält man eine Ausbeute von 6300 Hybriden.
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c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit einem Zusammenführen
durch Magnetfeld Auch hier ist der pH-Wert so einzustellen, dass die Zellen durch
das angelegte Magnetfeld von dem jeweiligen Ionenaustauschermaterial auf der Oberfläche
86 oder 88 abgelöst und zusammengeführt werden können. Die Verfahrensführung erfolgt
ansonsten genau wie bei c) des ersten Ausführungsbeispiels. Die Ausbeute beträgt
ungefähr 3200 Hybride.
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3.Beispiel des Verfahrens Bei diesem Beispiel wird als Trägerelement
68 und 70 ein poröses Material verwendet, welches auf seinen Oberflächen 86 und
88 mit Antikörpern versehen ist, welche durch Glutataldehyd an dem jeweils verwendeten
Trägerelement 68 oder 70 gebunden sind. Bevorzugterweise wird als Trägerelement
ein poröses Filtermaterial verwendet, welches jedoch hinsichtlich seiner Porengrösse
-keinen -Beschränkungen unterliegt, so dass bevorzugterweise ein Material mit grösseren
Poren verwendet wird, so dass sich auf den Oberflächen 86 und 88 beim Hindurchsaugen
der Lösung möglichst wenig Schmutzpartikel absetzen.
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Die Herstellung derartiger Antikörper entspricht den bisher üblichen
Verfahren und wird beispielsweise in dem Artikel von ausführlich beschrieben.
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a) Mechanisches Zusammenführen Die Verfahrensführung erfolgt wie unter
a) im ersten oder im zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben, wobei ebenfalls die
Lösungen 1 oder 2 Verwendung finden können.
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Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Zelle nach der Fusion
mitsamt den Trägerelementen 68, 70, a welchen sie noch haften, in das Nährmedium
gebracht M Hierin können sich die noch an den Trägerelementen 68 und 70 haftenden
Zellen teilen. Nach 1 bis 2 Tagen werden die Trägerelemente 68 und 70 sorgfältig
ausgewaschen und die Lösung dann abzentrifugiert, wobei hauptsächlich die durch
Teilung entstandenen Tochterzellen von den Trägerelementen 68 und 70 abgelöst werden.
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Das Klonieren der erhaltenen Tochterzellen erfolgt dann wie bei Schnettler
et al. beschrieben.
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Die Ausbeute der erhaltenen Hybride liegt bei ungefähr 5000 bis 6000.
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b) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit Dielektrophorese
Hierbei wird ebenfalls, wie unter b) bei den Beispielen 1 und 2 beschrieben, verfahren.
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Hinzuzufügen ist, dass zum Durchführen der Dielektrophorese auch
die Bindung zwischen den Zellen und den Antikörpern nur so stark sein darf, dass
die Zellen bei der Dielektrophorese zumindest von einer der Oberflächen 86 und 88
abgelöst und auf die gegenüberliegende Oberfläche gebracht
werden
können. Die Auswahl der Antikörper mit der entsprechenden Bindungsstärke erfolgt
durch gezielte Selektion der Antikörper vor ihrem Aufbringen auf die Trägerelemente
68 und 70.
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Die Ausbeute an Hybriden beträgt ungefähr 5000.
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c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit Zusammenführen unter
Verwendung von Magnetfeldern Hierbei wird ebenfalls wie unter c) bei den bereits
beschriebenen Beispielen 1 und 2 verfahren, wobei ebenfalls wie bei b) des dritten
Ausführungsbeispiels die Stärke der Bindung zwischen Zellen und Antikörpern so sein
muss, dass die Zellen durch das Magnetfeld zumindest von einer der Oberflächen 86
und 88 gelöst werden können, wobei die Selektion der Antikörper wie oben beschrieben
erfolgt.
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Die Ausbeute an Hybriden beträgt ungefähr 2000.