DE8504192U1 - Vorrichtung zur Elektrofusion von Zellen - Google Patents

Description

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PATENTANWÄLTE ÜKLÄriDSTKÄSSE 14 ö D 7GCC STUTTSAST 1

A 46 320 b Anmelderin: GCA Corporation

g - 1 92 209 Burlington Road

24. Juni 1985 Bedford, Mass. Öl 730

USA

Beschreibung :

>. Vorrichtung zur Elektrofusion von Zellen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Elektrofusion von Zellen mit zwei im Abstand voneinander angeordneten Elektroden, zwischen denen zur Elektrofusion erforderliche elektrische Felder erzeugbar sind.

Bisher ist ein Verfahren zur Elektrofusion von Zellen bekannt, bei welchem diese in einer Zellsuspension durch Dielektrophorese im inhomogenen elektrischen Feld längs der Feldlinien in Form sogenannter Perlenketten aufgereiht werden. Danach wird ein geeigneter Feldimpuls appliziert, welcher Löcher im Bereich einer Membrankontaktzone zwischen jeweils zwei sich berührenden Zellen erzeugt, so daß es zu einer Brückenbildung zwischen den Membranen beider Zellen in der Membrankontaktzone kommt und schließlich eine fusionierte Zelle entsteht.

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Des weiteren ist noch ein Verfahren bekannt, bei dem eine Zellsuspension mit hoher Zelldichte verwendet wird, in welcher ebenfalls die zur Fusion notwendigen Feldimpulse appliziert werden, so dass die Membranen der Zellen durchlöchert werden und sich statistisch zwischen einzelnen Zellen in der Suspension Brücken bilden und folglich ebenfalls fusionierte Zellen entstehen.

Alle bekannten Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass die Zahl der miteinander fusionierenden Zellen nur sehr schwer oder überhaupt nicht kontrollierbar ist. Bei dem zuletzt genannten Verfahren, bei welchem sich statistisch Brücken zwischen den Membranen einzelner Zellen bilden, entstehen die Fusionsprodukte aus zwei oder mehreren Zellen entsprechend einer statistischen Verteilung und sind nur über die Konzentration der Zelldichte indirekt beeinflussbar. Es ist jedoch keinesfalls möglich, im wesentlichen nur Fusionsprodukte aus zwei -Zellen herzustellen. Desgleichen ist auch beim zuerst genannten Verfahren die Länge der einzelnen Perlenketten nur indirekt beeinflussbar und es ist ebenfalls nicht möglich, das Verfahren so zu führen, dass eine überwiegende Zahl der Perlenketten nur aus zwei Zellen besteht, so dass .. Fusionsprodukte im wesentlichen nur aus zwei miteinander fusionierten Zellen entstehen.

Bei der Anwendung der Elektrofusion in biotechnologischen Verfahren ist es jedoch in zunehmendem Masse erforderlich, eine möglichst grosse Zahl von Fusionsprodukten gezielt herzustellen, d.h. gezielt eine genau definierte Zahl von Zellen miteinander zu fusionieren. Dies ist vor allem deshalb notwendig,

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weil es nach der Zellfüsion sehr schwierig ist, zu Unterscheiden, ob das Fusionsprodukt genau die gewünschte Zahl fusionierter Zellen umfasst oder ob unerwünschterweise mehr oder weniger Zellen als beabsichtigt miteinander fusioniert wurden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der gattungsgemässen Art zu schaffen, bei welchem in einfacher Weise eine gezielte Fusion zweier Zellen möglich ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Zellen an einem ersten und einem zweiten Träger fixiert werden, dass die beiden Träger so angeordnet werden, dass sich die auf diesen fixierten Zellen gegenüberliegen, dass die Zellen aufeinanderzu bewegt werden, so dass sich im wesentlichen Paare von Zellen bilden, welche eine Zelle von dem ersten und eine Zelle von dem zweiten Träger umfassen, und dass die Zellen der Paare anschliessend fusioniert werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass durch die auf den Trägern fixierten Zellen und das anschliessende Aufeinanderzubewegen im wesentlichen nur Paare von Zellen hergestellt werden können, so dass nach der Fusion nahezu nur Fusionsprodukte vorliegen, die aus jeweils einem derartigen Paar bestehen. Dabei beschränkt sich dieses Verfahren selbstverständlich nicht auf die Herstellung von Fusionsprodukten aus nur zwei Zellen, sondern es kann beispielsweise nach der Fusion zweier Zellen das Fusions-

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produkt auf einem Träger fixiert bleiben und auf dem anderen Träger eine weitere Zelle fixiert werden, die anschliessend mit dem nach der ersten Fusion entstandenen Fusionsprodukt wiederum fusioniert werden kann, so dass das neue Fusionsprcdukt sich aus drei Zellen zusammensetzt. Damit hat man die Möglichkeit, in gezielter Weise eine beliebige Zahl von Zellen miteinander zu fusionieren.

Besonders interessant ist das erfindungsgemässe Verfahren, wenn zwei unterschiedliche Zeilen miteinander fusioniert werden sollen. Beispielsweise ist hier an die Herstellung von Hybridomzellen zu denken. Eine derartige Fusion zweier unterschiedlicher Zellen ist bei den eingangs beschriebenen, bereits bekannten Verfahren in gezielter Weise überhaupt nicht möglich, da jeweils nur mit einer Zellsuspension gearbeitet werden kann, in der die beiden unterschiedlichen Zellen zwar in einem bestimmten Verhältnis, jedoch in statischer Verteilung vorliegen. Das Verfahren ist durch keinen äusseren Parameter so beeinflussbar, dass nur jeweils Zellen unterschiedlicher Art miteinander fusionieren, d.h. beispielsweise, dass sich Perlenketten aus Zellen einer Sorte A und einer Sorte B zusammensetzen. Aus diesem Grund ist bei einem besonders vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens daran gedacht, dass auf dem ersten Träger Zellen einer Sorte A und auf dem zweiten Träger Zellen einer Sorte B fixiert werden. Damit lassen sich zum einen Fusionsprodukte mit der Konfiguration A-A oder B-B und zum anderen Fusionsprodukte aus mehr als zwei Zellen im wesentlichen vermeiden.

Um eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung von Fusionsprodukten aus den Zellen auf dem ersten Träger und den Zellen auf dem zweiten Träger zu erreichen,

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sollte einer Zelle auf dem ersten Träger mit grosser Wahr- j

scheinlichkeit eine Zelle auf dem zweiten Träger gegenüber- |)

liegen, die dann zu einem Paar zusammengeführt werden kön- | ·

nen, so dass es zweckmässig ist, wenn auf den Trägern so $

viele Zellen fixiert werden, dass eine Belegungsdichte von i

idindestens ungefähr 60 % einer Oberfläche der Träger erreicht f

wird. L

Wenn jedoch sichergestellt werden soll, dass auf jeden Fall einer Zelle auf dem ersten Träger eine Zelle auf dem zweiten Träger gegenüberliegt, kann dies auch dadurch erreicht werden, dass die Oberfläche der Träger mit mindestens einer Schicht von Zellen der jeweiligen Zellsorte belegt wird.

Das Zusammenführen der auf den einander gegenüberliegenden Trägern angeordneten Zellen ist auf verschiedene Art und Weise möglich.

Ein Ausführungsbeispiel sieht vor, dass die Zellen durch mechanisches Zusammenführen der Träger aufeinanderzu bewegt werden, so dass die auf den Oberflächen der Träger angeordneten Zellen gegeneinander gedrückt und dadurch für die Fusion in Membrankontakt miteinander gebracht werden. Der Vorteil dieser Lösung ist darin zu sehen, dass zur Herstellung des Membrankontakts keine zusätzlichen Massnahmen erforderlich sind und somit auch die mit diesen zusätzlichen Massnahmen verbundenen Probleme nicht auftreten. Beispielsweise bringt die Verwendung der Dielektrophorese für das Zusammenführen der Zellen stets eine unerwünschte und für die Zellen schädliche Erwärmung der Zellsuspension aufgrund des für die Dielektrophorese notwendigen elektrischen Wechselfeldes mit sich. Aber auch ein Zusammenführen der Zellen durch

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Magnetfelder hat Nachteile, die sich in einem verschlechterten Wachstum der fusionierten Zellen aufgrund der auf der Membran haftenden Magnetpartikel äussern.

Eine weitere Möglichkeit zum Zusammenführen der Zellen besteht darin, dass die Träger mechanisch bis auf einen geringen Abstand voneinander zusammengeführt werden, dass die Zellen von mindestens einem der Träger gelöst werden und dass die Zellen durch Dielektrophorese vollends zur Bildung von Paaren aufeinanderzu bewegt werden. Dieses Ausführungsbeispiel hat den Vorteil, dass die Zellen nicht wie beim mechanischen Zusammenführen teilweise einem grossen mechanischen Druck ausgesetzt und dadurch gequetscht und geschädigt werden, sondern dass sie durch die Dielektrophorese in leichtem Membrankontakt miteinander gehalten werden. Die Erwärmung der Zellsuspension durch Dielektrophorese ist bei dieser Verfahrensführung deshalb nicht sehr gross, weil die Zellen bereits durch das mechanische Zusammenführen in geringem Abstand einander gegenüberliegen, so dass das Wechselfeld für die Dielektrophorese nur für kurze Zeiten angelegt werden muss und daher auch nur eine unwesentliche Erwärmung auftritt.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel sieht vor, dass eine Membran der Zellen mit ferromagnetischen Partikeln versehen wird, dass die Träger mechanisch bis auf einen geringen i-bstand voneinander zusammengeführt werden und dass die Zellen durch ein äusseres Magnetfeld vollends zur Bildung von Paaren aufeinanderzu bewegt worden. Auch hierbei werden die Zellen nicht wie beim vollständigen mechanischen Zusammenführen gequetscht und einem mechanischen Druck ausgesetzt und es kann jegliche Erwärmung im Gegensatz zur Dielektrophorese vermieden werden, da die Zellen die letzte kurze Distanz bis

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zur Bildung von Paaren durch ein äusseres Magnetfeld aufeinanderzu bewegt werden. Der einzige Nachteil dieser Methode ist darin zu sehen, dass durch das Versehen der Membran der Zellen mit ferromagnetischen Partikeln teilweise das Wachstum der fusionierten Zellen später gehemmt wird.

Welches der drei vorgenannten Ausführungsbeispiele für die jeweils zu fusionierenden Zellen Anwendung finden soll, ist von den Eigenschaften und Empfindlichkeiten dieser Zellen abhängig zu machen, da die Zellen auf die in Kauf zu nehmenden Nachteile bei jedem der drei Ausführungs'yeispiele des Verfahrens in unterschiedlicher Weise ansprechen, so dass das geeignete Verfahren jeweils in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Zelltyps ausgewählt werden muss.

Bei den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen des erfindungsgemässen Verfahrens wurden im Detail noch keine Aussagen darüber gemacht, wie die Zellen auf den Träger aufgebracht und auf diesem fixiert werden können. Hierbei sind zunächst prinzipiell alle Möglichkeiten denkbar, durch welche die Zellen beim Fixieren und Aufbringen nicht geschädigt werden. Besonders zweckmässig ist es, wenn die Träger so ausgebildet sind, dass eine Flüssigkeit durch sie hindurchgesaugt werden kann, so dass zu einem Aufbringen der Zellen auf die Träger die Zellsuspension durch diese hindurchgesaugt wird und die Zellen auf der Oberfläche des Trägers haften bleiben.

Damit die Zellen jedoch nach dem Aufbringen auf die Oberfläche der Träger nicht sofort wieder durch Flüssigkeit von diesen abgespült werden, sollte eine Bindung zwischen den

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c Seilen auf der Oberfläche der Träger und den Trägern selbst

erfolgen.

Dies ist dadurch möglich, dass die Zellen durch Haftung in. Poren der Träger fixiert werden. Das Aufbringen £ der Zellen erfolgt dabei beispielsweise, wie oben beschrie-

ben, durch Hindurchpumpen einer Zellsuspension durch die

' Träger, so dass sich die Zellen in - den Poren auf der Ober-

.« fläche festsetzen. Ein derartiges Fixieren der Zellen auf

p dem Träger erlaubt sämtliche Methoden des Zusammenführens

: der beiden Träger, da die Zellen sowohl durch Dielektror

phorese wie auch durch ein entsprechendes magnetisches Feld leicht aus den Poren der Träger herausgezogen und auf die gegenüberliegende Zelle zu bewegt werden können.

Ein anderes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens sieht vor, dass die Zellen durch elektrostatische Wechselwirkung auf den Trägern fixiert werden. Dabei kjinn

{ eine Belegung der Oberfläche entweder dadurch erfolgen, dass

die Zellsuspension durch einen entsprechend ausgebildeten Träger hindurchgepumpt wird oder dass die Zellsuspension parallel zur Oberfläche an dem Träger vorbeiströmt und durch die ι- .. .- . elektrostatische Wechselwirkung die Zellen aus der Zellsuspension herausgezogen und auf den Trägern fixiert werden. Das mechanische Zusammenführen der beiden Träger ist bei einer darartigen Wechselwirkung ohne weiteres möglich, Probleme können jedoch dann ent^t..;hen, wenn das mechanische Zusammenführen zusätzlich mit Dielektro^/horese oder mit einem magnetischen Zusammenführen der Zellen zu Paaren kombiniert ist, da dann dia elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Zellen und den Trägern so klein sein muss, dass die ZeI-

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len bei der Dielektrophorese oder bei dem magnetischen Zusam menführen trotzdem noch von einem der Träger gelöst werden können. Eine derartige Einstellung der Stärke der elektrostatischen Wechselwirkung der Zellen mit dem Träger erfolgt bevorzugterweise durch geeignete Wahl des pH-Wertes in der

Schliesslich besteht auch noch die Möglichkeit, dass die Zellen durch Bindung mittels Antikörpern auf den Trägern fixiert werden. Auch hier ist ein mechanisches Zusammenführen der Zellen ohne weiteres möglich, jedoch muss ebenfalls bei einem kombinierten Zusammenführen der Zellen einerseits durch mechanisches Aufeinanderzubewegen der Träger und andererseits durch Dielektrophorese oder mittels magnetischer Felder sichergestellt werden, dass die Zellen durch die dabei auf diese ausgebübten Kräfte von zumindest einem der Träger ablösbar sind, d.h. dass die Bindungen zwischen den Zellen und den Antikörpern so schwach sind, dass sie von den Kräften aufgehoben werden können, die durch das bei der Dielektrophorese angewandte Wechselfeld oder das Magnetfeld entstehen.

Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zu schaffen.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass zwischen den Elektroden zwei Trägerei entente mit gegeneinander gerichteten und Zellen tragenden Oberflächen positionierbar sind, wobei die Oberflächen einen ersten Abstand voneinander auf-

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weisen. Vorteilhaft bei dieser Vorrichtung ist, dass sie erlaubt/ das eingangs beschriebene erfindungsgemasse Verfahren in sehr einfacher Weise durchzuführen, wobei vor allem die zwischen die Elektroden positionierbaren Trägerelemente eine sehr einfache Möglichkeit bieten, in gezielter Weise Paare von Zellen zu erzeugen und zur Fusion zwischen den Elektroden zu placieren.

Dabei kann es zweckmässig sein, wenn eine Verstellvorrichtung vorgesehen ist, mittels welcher die Oberflächen von einem zweiten, wesentlich grösseren Abstand bis auf den ersten Abstand aufeinanderzu bewegbar sind, so dass die Trägerelemente zunächst mit einem grösseren zweiten Abstand in die Verstellvorrichtung eingesetzt werden können und anschliessend die Möglichkeit besteht, die Trägerelemente und dadurch auch die auf deren Oberfläche fixierten Zellen bis zu dem gewünschten ersten Abstand aufeinanderzu zu bewegen.

Wenn die Zellen mechanisch zu Paaren zusammengeführt werden sollen, ist es notwendig, dass der erste Abstand so gering ist, dass die Zellen an den Oberflächen der beiden Trägerelemente in Membrankontakt kommen, d.h. der erste Abstand richtet sich danach, welche Grosse die Zellen haben, und wie weit die auf den Oberflächen fixierten Zellen von diesen maximal abstehen.

Wenn vorgesehen ist, dass die Zellen zunächst durch mechanisches Zusammenführen in einem bestimmten Abstand voneinander angeordnet werden und das letzte Stück durch Dielektrophorese oder Magnetfelder aufeinanderzu bewegt werden, ist es vor- § teilhaft, wenn der erste Abstand ungefähr einem Mehrfachen

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des Durchmessers der Zellen entspricht/ sü dass nur diese geringe Strecke durch Dielektrophorese oder Zusammenführen mittels Magnetfeldern überbrückt werden muss. Weiterhin ist bei einem mechanischen Zusammenführen der Trägerelemente bis zu einem dem Durchmesser mehrerer Zellen entsprechenden ersten Abstand von Vorteil/ dass es zur Herstellung einer Schicht aus Fusionsmedium zwischen den Trägerelementen, in welcher die Zellen schwimmend mittels elektrischen oder magnetischen Feldern bewegt werden können, nicht notwendig ist, diese Trägerelemente selbst oder mitsamt den Elektroden so auszugestalten, dass ein Behältnis j entsteht, welches die Flüssigkeit zwischen den Trägerelemen-

tem hält, sondern dass bei einem derart geringen ersten Abstand der auf jedem Trägerelement noch haftende Flüssigkeitsfilm für die Ausbildung der Schicht aus Fusionsmedium ausreicht .

Bei Anwendung der Dielektrophorese für das Zusammenführen der Zellen zu Paaren ist keine : besondere Ausgestaltung

der Vorrichtung notwendig, da das für die Dielektrophorese

■ - erforderliche Wechselfeld mittels derselben Elektroden erzeugt werden kann wie sie auch für die Erzeugung des für die Elektrofusion notwendigen Feldimpulses verwendet werden.

Beim Zusammenführen der Zellen, mittels Magnetfeldern ist es notwendig, dass Spulen zur Erzeugung quer zu den Oberflächen verlaufender magnetischer Felder vorgesehen sind, wobei vorteilhafterweise Feldlinien dieser magnetischen Felder im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche der Träger-

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·■ elemente verlaufen, damit die Zellen von einem Trägerelement

{ auf die gegenüberliegenden Zellen des anderen Trägerelements

zu bewegt werden und kein Bewegen der Zellen parallel zu

J? den Oberflächen der Trägerelemente erfolgt.

i Wenn eine Fixierung 4er fellen auf der Oberfläche der Trägerelemente in den Poren dieser Trägerelemente erfolgen soll, k ist es vorteilhaft, wenn die Trägerelemente Filter mit

ψ einer dem Durchmesser der jeweils zu fusionierenden Zellen

I entsprechenden Porengrösse sind, da diese Materialien einer-

I seits erlauben, Feldsuspension zum Aufbringen der Zellen auf

ϊ die Trägerslemente durch diese hindurchzusaugen, so dass ein

f einfaches Belegen der Trägerelemente mit Zellen möglich ist,

und andererseits nur die Zellen oder Partikel, die ungefähr der Zellgrösse entsprechen, sich in den Poren festsetzen <■ und in diesen formschlussähnlich gehalten sind.

r_ Der Nachteil einer Fixierung der Zellen in den Poren auf

Ij ■ ■ ■ . der Oberfläche der Trägerelemente ist jedoch hauptsächlich r .· * - - darin zu sehen, dass beim Hindurchsaugen neben den Zellen, ei .:...,.. ,-wie bereits beschrieben, auch Schmutzpartikel sich in den I ' \ Poren festsetzen, so dass bei einer Zellsuspension, die

neben den Zellen vergleichbar grosse derartige Partikel enthält, eine hohe Belegungsdichte der Oberfläche der Trägerelemente mit Zellen nicht erreichbar ist. Aus diesem Grund % ist es beispielsweise von Vorteil, wenn die Trägerelemente

-| zum Fixieren der Zellen auf ihren Oberflächen ein Ionen-

|| austauschermaterial tragen. Ein derartiges Material ist

Μ ebenfalls einfach und billig zu beschaffen und bietet an-

jt dererseits die Möglichkeit, dass aufgrund der weit spezifi-

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scheren Wechselwirkung zwischen den Trägerelementen und den Zellen auch bei mit Schmutzteilen befrachteter Zellsuspension eine hohe Belegungsdichte auf den Oberflächen erreicht werden kann/ da zumindest ein Teil der Schmutzpartikel durch das Ionenaustauschermaterial nicht an die Oberfläche der Trägerelemente gebunden wird. Ausserdem hat eine derartige Ausführung der Trägerelemente noch den Vorteil/

is dass es nicht unbedingt notwendig ist, die Trägerelemente j| aus einem porösen Material herzustellen, durch das zum Belegen von deren Oberfläche mit Zellen die Zellsuspension hin- j durchgesaugt werden muss, sondern dass man auch beispiels- j weise die Möglichkeit hat, die Zellsuspension parallel zur Oberfläche der Trägerelemente an diesen vorbeiströmen zu \ lassen, wobei sich aufgrund der elektrostatischen Wechsel- Γ wirkung die Zellen trotzdem an der Oberfläche der Trägerelemente anlagern. ·

Die spezifischste Wechselwirkung der Zellen mit den Trägerelementen ist dadurch erreichbar, dass die Trägerelemente zum Fixieren der Zellen auf ihren Oberflächen für die jeweils zu fixierenden Zellen spezifische Antikörper tragen. Der Vorteil einer derartigen Ausbildung der Trägerelemente zeigt sich darin, dass die Antikörper so gewählt werden können, dass nur ganz bestimmte Zellen aus der Zellsuspension auf ^! der Oberfläche der Trägerelemente angelagert werden. Damit hat man die Möglichkeit, selbst bei Zellsuspensionen, die mehrere Sorten von Zellen enthalten, nur die jeweils gewünschte Zellsorte auf der Oberfläche der Trägerelemente anzulagern, ohne dass die übrigen, in der Zellsuspension

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noch vorkommenden Zellsorten einen störenden Einfluss ausüben. Des weiteren ist eine Verminderung der Belegungsdichte durch eventuell in der Zellsuspension enthaltene Schmutzpartikel vollständig ausgeschlossen/ da die Antikörper mit. diesen in keinem Fall wechselwirken. Die Antikörper-Zelle-

Wechselwirkung kann sogar so spezifisch sein, dass nui lebende und lebensfähige Zellen auf den Trägerelementen fixiert werden und bereits Zellen, die kurz vor dem Absterben oder bereits abgestorben sind, durch die Antikörper nicht mehr gebunden werden. Des weiteren kann auch, wie bereits beim Ionenaustauschermaterial/ das Auftragen der Zellen auf die Oberfläche der Trägerelemente zum einen durch Durchströmen der Trägerlemente erfolgen, wobei diese dann aus porösem Material hergestellt sein müssen, das jedoch eine Porengrösse haben kann, die weit grosser ist als der Durchmesser der Zelle, so dass auch hier eine Verminderung der Belegungsdichte durch auf den Oberflächen angelagerte Schmutzpartikel wesentlich geringer ist. Zum anderen kann die Zellsuspension parallel zur Oberfläche der Trägerelemente strömen, so dass die sich längs der Oberfläche bewegenden Zellen durch die Antikörper eingefangen werden.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind Gegenstand der folgenden Beschreibung sowie der zeichnerischen Darstellung einiger Ausführungsformen der Erfindung. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine teilweise aufgebrochene Seitenansicht

des ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemässen Vorrichtung; \

Fig.1a einen Ausschnitt im Bereich A in Fig.1;

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Fig. 2 eine perspektivische Frontansicht einer Halterung gemäss Fig. 1;

Fig. 3 ein Aufbringen von Zellen auf ein Trägerelement gemäss einem Ausführungsbeispiel . des erfindungsgemässen Verfahrens und

Fig. 4 eine Ansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels entsprechend Fig. 1.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemässen Vorrichtung in Fig. 1 zeigt im einzelnen eine verstellbare Haltevorrichtung 10, welche zwei einander gegenüber-

% stehende Aufnahmeteile 12 und 14 umfasst, wobei das Aufnahme-

te·'.I 14 direkt an einer Grundplatte 16 gehalten ist und senkrecht von dieser absteht und das Aufnahmeteil 12 seinerseits an 2inem Schlitten 18 befestigt ist, welcher

auf einer auf der Grundplatte 16 angeordneten Führung 20 verschieblich gelagert ist. Auf einer dem Aufnahmeteil 14 entgegengesetzten Seite trägt die Grundplatte 16 noch eine : ' ebenfalls in gleicher Richtung wie das Aufnahmeteil 14

• ·---·-· senkrecht von dieser abstehende Platte 22, an welcher ein Gehäuse 24 einer Mikrometerschraube 26 gehalten ist.

Die Mikrometerschraube 26 dient zur definierten Verschiebung des Schlittens 18 auf der Führung 20, wozu ein Verschiebebolzsn 28 der Mikrometerschraube 26 auf den Schlitten 18 wirkt und mit diesem zumindest bezüglich seiner Verschieberichtung fest verbunden ist.

An jedem der einander gegenüberstehenden Aufnahmeteile 12 und 14 ist jeweils eine von zwei einander gegenüberliegenden Halterungen 30 und 32 befestigt. Diese Halterungen 30

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und 32 tragen auf einanderzugewandten Seiten parallel zueinander verlaufende Elektroden 34 und 36, die so ausge-

\ richtet sind, dass sie senkrecht zu einer Verschieberichtung 38 des Schlittens 18 verlaufen, wobei diese Verschieberichtung 38 im allgemeinen parallel zur Grundplatte 16 verläuft.

Vorteilhaftere/eise umfasst jede der Halterungen 30 und einen Trichter 4o bzw. 42, welcher eine grosse Öffnung

.· bzw. 46 und eine kleine öffnung 48 bzw. 50 besitzt. Dia

t grosse Öffnung 44 bzw. 46 ist mit einem zylindrischen

Flansch 52 bzw. 54 versehen, an welchem die den Trichter bzw. 42 abdeckende Elektrode 34 bzw. 36 gehalten ist. Eine

; Zylinderachse des Flansches 52 bzw. 54 verläuft parallel

zur Verschieberichtung 38. Des weiteren ist die kleine Öffnung 48 bzw. 50 mit einer Olive 56 bzw. 58 ausgerüstet, auf die jeweils ein Saugschlauch 60 bzw. 62 aufsteckbar ist. Dieser steht wiederum mit einer Pumpe 64 bzw. 66 in Verbin-

{' ·. dung, so dass folglich durch diese Pumpen 64 bzw. 66 in .·. _ einem Inneren einer jeden d^r Halterungen 30 und 32 ein Unterdruck erzeugbar ist.

Die beiden mit einer Oberfläche parallel zueinander verlaufender, und senkrecht zu dieser Oberfläche durch die Mikrometer-Schraube 26 verschiebbaren Elektroden 34 und 36 sind jeweils mit einem Trägerelement 68 bzw. 70 überzogen, welches über die jeweilige Elektrode 34 bzw. 36 übersteht und zusätzlich noch auf einer Aussenseite des senkrecht zu der Elektrode 34 bzw. 36 verlaufenden zylindrischen . Flansches 52 bzw. 54 überlappend anliegt. Zur Fixierung

ι des Trägerelements 68, 70 ist dieser Flansch 52 bzw. 54

mit einer Ringnut 72 versehen, in welchen ein diese

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Ringnut 72 überlappender Teil des Trägerelements 68 bzw. 70 durch einen auf dem Trägerelement 68 bzw. 70 aufliegenden Elastomerring 76 bzw. 78 gedrückt ist (Fig.1a).

Das Trägerelement 68 bzw. 70 dient zur Fixierung von zu fusicnicrsnclsn Zsllsn SO 'Fi". 2^ Bsi dem ers^⁰⁰ E

Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass ein Aufbringen der Zellen 80 durch Hindurchsaugen einer Zellsuspension 84 durch das jeweilige Trägerelement 68 bzw. 70 erfolgt (Fig.3). Dazu müssen die Elektroden 34 bzw. 36 perforiert ausgebildet sein und die darauf aufliegenden Trägerelemente 68 bzw. 70 ebenfalls aus einem flüssigkeitsdurchlässigen Material bestehen. Bevorzugterweise wird, wie in Fig. 2 dargestellt, für die Trägerelemente 68 und 70 ein poröses Filtermaterial verwendet und die darunterliegenden Elektroden 34 bzw. 36 sind aus einem Drahtgeflecht hergestellt. Somit kann durch Evakuieren eines Inneren der Halterung 30 bzw. der Halterung 32 ein Flüssigkeitsstrom sowohl durch das jeweilige Trägerelement 68 bzw. 70 sowie durch die Elektrode 34 bzw. 36 in das Innere der Halterung 30·bzw. 32 erzeugt werden, wobei die in der Zellsuspension 84·enthaltenen Zellen sich auf einer der jeweiligen Elektrode 34 bzw. 36 abgewandten Oberfläche 86 bzw. 88 des jeweiligen Trägerelements 68 bzw. 70 anlagern und entsprechend den eingangs beschriebenen Möglichkeiten fixiert werden.

Ein derartiges Aufbringen der Zellen auf die Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 kann beispielsweise in einer in Fig. 3 dargestellten Vorrichtung erfolgen, wozu die jeweilige Halterung 30 bzw. 32 aus dem entsprechenden Aufnahmeteil 12 bzw. 14 gelöst und in ein Gefäss

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mit einem Bad der Zellsüspehsion 84 eingetaucht wird. Gleichzeitig wird über die an der jeweiligen Halterung 30 bzw. 32 über den Saugschlauch 60 bzw. 62 angeschlossene Pumpe 64 bzw. 66 ein Unterdruck im Innern der Halterung 30 bzw. 32 erzeugt, so dass die Flüssigkeit der Zellsuspension 84 in der beschriebenen Weise durch das TrMgerelement 68 bzw. 70 sowie die Elektrode 34 bzw. 36 hindurchströmt.

Sobald die Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und jeweils mit einer Schicht von Zellen 80 belegt sind, werden die Halterungen 30 und 32 in die vorgesehenen Aufnahmeteile 12 und 14 der Haltevorrichtung 10 eingesetzt und mit diesen Verbunden.

Hierbei ist ein Abstand zwischen den Aufnahmeteilen 12 und 14 derart zu wählen, dass die Oberflächen 86 und 88 einen grossen Abstand voneinander aufweisen und vor allem die Halterungen 30 und 32 bequem in die Aufnahmeteile 12 und 14 einsetzbar sind. Nach Fixieren der Halterungen 30 und 32 wird durch Drehen der Mikrometerschfaube 26 der Schlitten auf der Führung 20 in Verschieberichtung 38 verschoben, so dass die Oberflächen 86 und 88 der beiden Trägerelemente 68 und 70 aufeinanderzu bewegt werden. 7e nach dem beabsichtigten Verfahren der Zellfusion werden die beiden Oberflächen und 88 so lange verschoben bis sie einander berühren, oder es ist zumindest eine der Oberflächen 86 und 88 mit Abstandshaltern 92 versehen, welche das Zusammenführen der beiden Oberflächen 86 und 88 nur bis auf einen durch die Dicke der Abstandshalter 92 definierten Abstand ermöglichen. Diese Abstandshalter 92 werden vor allem dann eingesetzt,

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wenn die Paare von Zellen nach einem Zusammenführen der Oberflächen 86 und 88 auf mechanische Art und Weise vollends durch Dielektrophorese gebildet werden.

Zur Erzeugung eines für die Dielektrophorese erforderlichei'i Wechselfeldes sowie zur späteren Applikation der Fusionsimpulse sind die beiden Elektroden 34 und 36 über elektrische Leitungen 94 und 96 mit einem Spannungsgenerator 98 verbunden, der sowohl in der Lage ist, das für die Elektrophorese erforderliche Feld wie auch die für die Fusion notwendigen Feldimpulse zu erzeugen, wobei selbstverständlich bei vollständigem Zusammenführen der Oberflächen 86 und 88 für die Dielektrophorese kein Feld mehr angelegt werden muss, sondern sofort die Fusionsimpulse appliziert werden können.

Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Vor-.richtung, dargestellt in Fig. 4, besitzt im wesentlichen dieselben Teile, welche auch mit denselben Bezugszeichen wie beim ersten Ausführungsbeispiel versehen sind und daher nicht mehr gesondert beschrieben werden.

Zusätzlich ist bei dieser Vorrichtung noch an den Aufnahmeteilen 12 und 14 jeweils eine die Halterungen 30 bzw. 32 umgebende Spule 100 bzw. 102 vorgesehen, welche vorteilhafterweise einen Innendurchmesser aufweist, der grosser als ein grösster Durchmesser der jeweiligen Halterung 30 bzw. 32. Diese Spulen sind so dimensioniert, dass sie vorzugsweise ein magnetisches Feld erzeugen, dessen Feldlinien ungefähr senkrecht auf den Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 stehen.

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Zur Stromversorgung der Spulen 1Ö0 und 102 ist noch ein Stromversorgungsgerät 104 vorgesehen/ weiches über jeweils zwei Leitungen 106 und 108 mit den Spulen 100 bzw. 102 verbunden ist und den für die Erzeugung einer ausreichend groseen Feldstärke notwendigen Strom liefert.

Das zweite Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Vorrichtung erlaubt somit, sämtliche der eingangs beschriebenen Verfahren zum Zusammenführen der Zellen, d.h. zur Bildung vo:i

ic Zellpaaren anzuwenden.

Es ist möglich, die beiden Oberllächen 86 und 88 nicht mit den Abstandshaltern 92 zu versehen, so dass sie durch die Mikrometerschraube 26 dicht aneinander angelegt werden und dadurch mechanisch Paare von Zellen entstehen.

Es ist aber ebenfalls möglich, die beiden Oberflächen 86 und 88 nur bis zu den durch die Abstandshalter 92 vorgegebenen Abstand zusammenzuführen, so dass dieser Abstand bevorzugter-.weise dem Durchmesser mehrerer Zellen entspricht, jedoch so ,gering ist, dass ein jeweils auf einer der Oberfläche/. 86 und 88 haftender Flüssigkeitsfilm ausreicht, um eine durchgehende Flüssigkeitsschicht zwischen den zusammengeführten Oberflächen 86 und 88 zu bilden, die aufgrund der Kapillarwirkung zwischen diesen Oberflächen gehalten wird und in welcher die Zellen beim Zusammenführen mittels Dielektrophoi^ese oder mittels magnetischer Felder aufeinanderzu schwimmen können.

Je nach dem, ob nun nach dem Zusammenführen der Oberflächen 86 und 88 ein elektrisches Wechselfeld für die Dielek-

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trophorese angelegt wird, oder ob mittels der Spulen 100
und 102 ein Magnetfeld erzeugt wird, werden die Zellen
vor Applikation des Fusionsimpulses durch den Spannungsgenerator 98 entweder durch ein elektrisches Feld oder
durch ein magnetisches Feld zu Paaren zusammengeführt.

Bei Verwendung magnetischer Felder ist es selbstverständlich, dass die Materialien für die Halterungen 30 und 32
so gewählt werden müssen, dass sie für das Magnetfeld

durchlässig sind. Die Elektroden 34 und 36, die notwendiger- I

t weise aus einem elektrisch leitenden Material bestehen

müssen, können dabei entweder selbst aus einem ferromag- Ϊ netischen Material hergestellt sein eier es genügt, wenn I diese eine ausreichende Zahl von Perforationen aufweisen, \ durch welche das magnetische Feld hindurchtreten kann.

Zum Entfernen der fusionierten Zellen von den Oberflächen

86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 werden die beiden '■ Oberflächen 86 und 88 wieder auseinandergeschoben und

vorzugsweise die Halterungen 30 und 32 von den Aufnahme- t-

teilen 12 und 14 gelöst und die Zellen durch Eintauchen |,

der Halterungen 30 und 32 in eine Lösung abgespült, wobei |

selbstverständlich hierzu die Pumpen 64 und 66 nicht mehr \ benötigt werden.

Bei den folgenden, im Detail beschriebenen Ausführungsbei- \ spielen des erfindungsgemässen Verfahrens werden jeweils
Hefezellen eines unterschiedlichen Typs, nämlich Hefezellen
des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH 215 und des Stammes
Saccharomyces cerevisiae AH22, miteinander fusioniert, wobei
jeweils eine der Oberflächen 86 und 88 mit Zellen des
ersten Typs und die andere mit Zellen des zweiten Typs be- ·.

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legt wird. Dabei können für die Herstellung der Zellsuspensionen zwei unterschiedliche Lösungen verwendet werden.

Als erste, äusserst schwach leitende Lösung dient eine isotone Sorbitollösung, in welcher zusätzlich noch 0,1 mMol Calcium-Chlorid und 0,5 mMol Magnesium-Chlorid sowit 1 mg Albumin/ml enthalten sind. Das Albumin hat dabei nur die Aufgabe, eine elektrostatische Haftung der Zellen, beispielsweise an Gefässinnenflächen zu vermeiden.

Als zweite, stark leitende Lösung dient ebenfalls eine isotone Sorbitollösung, in welcher zu 0,1 mMol Calcium-Chlorid, 0,5 mMol Magnesium-Chlorid und 1 mg Albumin /ml noch zusätzlich 12 mMol KCl und 40 mMol NaCl zugesetzt sind, wobei relativ zur ersten Lösung die Konzentration des Sorbits geringer sein muss, um eine konstante Isoosmolarität zu gewährleisten.

Eine Zelldichte der Zellsuspension lag bei beiden verwend-

baren Lösungen bei ungefähr 10 Zellen/ml.

Selbstverständlich wurden bei den folgenden Experimenten jeweils beide Zelltypen vor ihrem Aufbringen auf eine der Oberflächen 86 und 88 getrennt, jedoch in jeweils derselben Lösung,suspendiert, d.h. beide Typen in Lösung 1 oder beide Typen in Lösung 2.

1. Beispiel des Verfahrens

Hierbei dient als Trägerelement 68 und 70 jeweils ein Milliporefilter/ dessen Porendurchmesser so gewählt wird, dass

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er ungefähr dem Durchmesser der zu fusionierenden Zellen entspricht. Dies bedeutet bei den vorliegenden Hefezellen einen Porendurchmesser des Milliporefilters von 4 bis 6 μπι. Die Fixierung der Zellen auf der Oberfläche 86 und 88 des jeweiligen Milliporefilters erfolgt somit durch Einlagerung der Zellen in den Poren, d.h. durch einen Formschluss.

Dazu wird, wie bereits beschrieben, jede der Halterungen 30 und 32 aus den Aufnahmeteilen 12 und 14 entnommen und jede der Halterungen 30 und 32 in ein Gefäss getaucht, in welchem der jeweilige zu fixierende T'/p von Hefezellen in Form der Zellsuspension vorliegt. Durch Einschalten der Pumpen 64 und 66 wird die Lösung durch das als Trägerelement 68 und 70 dienende Milliporefilter und auch durch die dahinter-Iiegend2 Elektrode 34 bzw. 36 hindurchgesaugt, wobei die auf den Oberflächen 86 bzw. 88 auftreffenden Zellen sich in den Poren des Milliporefilters festsetzen. Das Hindurchsaugen der Lösung erfolgt so lange, bis sich der Strömungswiderstand merklich erhöht. Nun werden die beiden Halterungen 30 und :aus den Suspensionen entnommen und in das jeweils entsprechende Aufnahmeteil 12 bzw. 14 eingesetzt. Hierbei ist jedoch noch zu erwähnen, dass es bei der formschlüssigen Fixierung der Zellen auf den Oberflächen 86 und 88 vorteilhaft ist, auch nach dem Entnehmen der Halterungen 30 und aus den jeweiligen Zellsuspensionen einen geringen Unterdruck im Innern der Halterungen 30 und 32 aufrecht zu erhalten, damit die darin stehende Lösung nicht durch die Elektroden 34 bzw. 36 und das darauf liegende Trägerelement 68 bzw. 70 nach aussen strömt und die in den Poren formschlüssig gehaltenen Zellen wieder von den Oberflächen 86 und 88 wegschwemmt. Aus diesem Grund wird der Unterdruck im

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Innern der Halterungen 30 und 32 zum einen so gross gewählt, dass die Lösung im Innern nicht wieder zurückströmt, zum andern jedoch so klein, dass auf der jeweiligen Oberfläche bzw. 88 noch ein ausreichend dicker Flüssigkeitsfilm bestehen bleibt und vor allem nach dem Entfernen der Halterungen 30 und 32 aus den Zellsuspensionen keine Luft durch die Milliporefilter hindurchgesaugt wird.

Das Zusammenführen der mit Zellen belegten Oberflächen 86 und der Trägerelemente 68 und 70 kann, wie bereits vorstehend erläutert wurde, auf verschiedene Art und Weise erfolgen:

a) Mechanisches Zusammenführen

Hierzu werden mitteis der Mikrometerschraube 26 die beiden Oberflächen 86 und 88 mechanisch bis auf ungefähr 1 μπι zusammengeschoben. Dieser Abstand kann beispielsweise durch ein Objekt-Mikrometer bestimmt und kontrolle -u liert werden.

Damit stehen die beiden Typen von Hefezellen, von denen der eine auf der Oberfläche 86 und der andere auf der Oberfläche 88 fixiert ist, in Membrankontakt miteinander und es müssen nur noch mittels■ des Spannungsgenerators 98 zwei Fusionsimpulse im Abstand voneinander von ungefähr 0,5 Sekunden appliziert werden. Die Fusionsimpulse haben eine Dauer von 10 \isec und eine Feldstärke und eine Feldstärke von 10 kV/cm.

Bei Raumtemperatur (ungefähr 24 C) können die beiden Oberflächen 86 und 88 nach ungefähr einer Ausheilzeitspanne der Zellen von 10 Minuten durch Drehen der

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Mikrometerschraube 26 voneinander getrennt werden,, Die Halterungen 30 und 32 werden dann wiederum aus den Aufnahmeteilen 12 und 14 entnommen und in einem bekannten Wachstumsmedium für die Fusionsprodukte von den Trägereiententen 68 und 70, d.h. in diesem Falle dian MilIiporefiltern abgewaschen. Nach Anziehen der fusionierten Hybridzellen in dem Wachstumsmedium werden diese kloniert und dann weiter auf Agar gezogen. Das Wachstumsmedium sowie das Klonieren und weitere Anziehen der Hybride ist ausführlich in der Publikation von Schnettler et al. (Schnettler, Zimmermann und Emeis, FEMS Letters 24, (1984) Seit£ 81-85) beschrieben.

Nach ungefähr zweiwöchigem Anziehen der fusionierten Zellen konnte bei Verwendung der Lösung 1 eine Ausbeute von ungefähr 5000 Hybriden und bei Verwendung der Lösung 2, d.h. der leitenden, einer physiologischen Konzentration ähnlicheren Lösung, etwa 6000 bis 7000 Hybride gezählt werden.

Eine Wärmeentwicklung bei Verwendung der leitenden Lösung konnte nicht beobachtet werden, da die Fusionsimpulse sehr kurz sind, so dass in der Lösung eine elektrische Leitung durch die Ionen, die zu einer Wärmeentwicklung führt, nur in unwesentlichem Umfang eintritt.

b) Mechanisches Zufammenführen in Kombination mit Dielektrophorese

Das Belegen der Oberflächen 86 und 88 der Trägerelemente 68 und 70 erfolgte identisch wie bei a), die Oberflächen

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86 und 88 wurden mechanisch, jedoch nur bis zu einem Abstand von ungefähr 20 μπι zusammengeführt. Hierzu konnten, wie bereits beschrieben, Abstandshalter 92 mit einer Dicke von 20 μπι verwendet werden. Durch die si ich zwischen den Oberflächen 86 und 88 bildende Schicht aus der ursprünglichen Lösung können die Zellen bei Anlegen eines für die Dielektrophorese üblichen elektrischen Wechselfeldes aufeinanderzu bewegt werden, wobei eine der ein Paar bildenden Zellen aus ihrer Oberfläche herausgelöst wird, was jedoch bei den formschlüssig in den Poren des Milliporefilters sitzenden Zellen problemlos erfolgen kann. Das Wechselfeld für die Dielektrophorese wurde 10 Sekunden lang angelegt, wobei die Feldstärke 3 kV/cm betrug. Anschliessend wurden die beiden Fusionsimpulse mit einer Feldstärke von 10 kV/cm und einer Pulslänge von 10 μεεσ im Abstand von 0,5 Sekunden appliziert. Für die Herstellung der Zellsuspension konnte wie bei a) ebenfalls die Lösung 1 oder die Lösung 2 verwendet werden. Die Verwendung einer elektrisch stark leistenden Lösung auch bei Dielektrophorese ist deshalb mög- -lich, -weil die Zellen, nur über eine sehr kleine Distanz von in diesem Fall 20 μπι aufeinanderzu bewegt werden mus-•sen/ so dass das Wechselfeld nur. für eine kurze Zeitspanne anzulegen ist und daher auch keine sehr grosse Erwärmung auch bei leitender Lösung auftritt.

Das Entfernen der Fusionsprodukte von den Oberflächen 86 und 88 sowie das Anziehen der Hybride erfolgt wie bei a).

Die Ausbeute betrug bei Lösung 1 ungefähr 5800 Hybride und bei Lösung 2 etwa 6500.

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c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit einem Zusammenführen durch magnetische Felder

Auch bei diesem Ausführungsbeispiel können dieselben Lösungen, d.h. Lösung 1 und Lösung 2, wie bei a) verwendet werden. Damit die Zellen jedoch durch magnetische

_, Felder aufeinanderev bewegbar sind, sind die Membranen

·. 1 der Hefezellen vorher mit magnetischen Teilchen zu ver-

sehen. Hierzu wird der Zellsuspension ein ug/ml Poylysin zugegeben, durch welches ebenfalls zugegebene Teilchen aus Magnetit (Mischung aus Fe₂O₃ und Fe₃O₄., im Handel unter der Bezeichnung Ferrofluid zu erwerben, auf einer Oberfläche der Membran der Hefezellen gebunden werden.

Das Belegen der Membran mit Zellen erfolgt wie bei den - vorher beschriebenen Ausführungsbeispielen und die Oberflächen 36 und 88 werden wis bei b) bis auf eins Distanz von 20 μπι einander angenähert.

:.: -_:^-- ■■--.*■-■■=.■■ - Durch Anlegen eines Magnetfeldes werden die Zellen, wie "-L"'i;A%rc.u7-.: -..bei der -Dielektrophorese, von "einer der Oberflächen 86 ^l.:.Jk.^.S^\ W.--.I «^oder 88 abgelöst _und äufeinanderzu bewegt.

'<-··, .:.·: iil^v -Die Fusion der Zellen sowie das spätere Ablösen von den

Oberflächen 86 und 88 erfolgt wie bereits unter a) und • b) beschrieben.

Bei Verwendung der genannten Lösungen wurden Ausbeuten von ungefähr 2500 Hybriden erreicht.

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2.Beispiel des Verfahrens

Die Trägerelemente 68 und 70 sind bei diesem Ausführungsbeispiel als poröse Ionenaustauschermembran ausgebildet/ wo- bsi ss sich bsvor zu^tesrweise um einen ^ati^^e^a^s^^^s^^^^¹ handelt/ welcher in der Lage ist, an den Oberflächen 86 und 88 positiv geladene Teilchen elektrostatisch zu binden.

Das Belegen der Oberflächen 86 und 88 erfolgt wie bei den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen ebenfalls durch Hindurch saugen der Lösung durch die jeweiligen Trägerelemente 68 und 70 sowie die Elektroden 34 und 36 in das Innere der Halterungen 30 und 32 mittels der Pumpen 64 und 66. Als Lösungen werden wie bei den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen ebenfalls die Lösungen 1 und 2 verwendet. Die Suspensionsdichte wird dabei so eingestellt/ dass auf den ■Oberflächen 86 und 88 eine einlagige Schicht von Zellen entsteht. Die Stärke der elektrostatischen Bindung der Zellen auf den Oberflächen 86 und 88 derrlonenaustauschermembran kann durch Variation des pH-Wertes in der Zellsuspension entsprechend eingestellt werden.

a) Mechanisches Zusammenführen

Hierzu werden,wie unter a} des ersten Beispiels beschrieben, die Oberflächen 86 und 88 bis auf einen Abstand von ungefähr 1 μΐη aufeinanderzu bewegt, so dass die Zellen miteinander in Membrankontakt kommen. Da die Zellen zur Bildung der Paare weder von der Oberfläche 86, noch von der Oberfläche 88 abgelöst werden müssen, kann die

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Bindung der Zellen an diese Oberflächen sehr gut sein, so dass in den Lösungen zunächst mit einem pH-Wert von ungefähr 7 gearbeitet werden kann. Nach Applikation der Fusionsimpule mit derselben Stärke wie bei den bisherigen Ausführungsbeispielen wird ebenfalls wieder das Ausheilen der Zellmembran abgewartet und anschliessend die beiden Oberflächen 86 und 88 voneinander entfernt.

Um im folgenden die Zellen von den Oberflächen 86 und 88 leicht abspülen oder abwaschen zu können, wird ein Nährmedium mit einem pH-Wert verwendet, der ungefähr bei 6 liegt. Ein derart erniedrigter pH-Wert führt dazu, dass sich auf dem Ionenaustauschermaterial Protonen anlagern, welche die Bindungen zwinchen

den Zellen und der Kationenaustauschermembran lösen, so dass sich diese leichter entfernen lassen. Das Klonieren und Anziehen der Zellen erfolgt wie bei den bisherigen Ausführungsbeispielen. Als Ausbeute werden ungefähr 7700 Hybride gezählt.

b) Mechanisches Zusammenführen in-Kombination mit Dielektrophorese

Die Verfahrensführung erfolgt wie bei b) des ersten Ausführungsbeispiels, mit dem einzigen Unterschied, dass in diesem Fall der pH-Wert der Lösung 1 oder der Lösung 2 so eingestellt werden muss, dass die Zellen von den Oberflächen 86 und 88 durch das elektrische Feld abgelöst werden können, da ansonsten ein Zusammenführen der Zellen zu Paaren nicht möglich wäre. Nach dem üblichen Klonieren und Anziehen der Zellen erhält man eine Ausbeute von 6300 Hybriden.

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c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit einem Zusammenführen durch Magnetfeld

Auch hier ist der pH-Wert so einzustellen, dass die Zellen durch das angelegte Magnetfeld"von dem jeweiligen Ionenaustauschermaterial auf der Oberfläche 86 odfe-· 88 abgelöst und zusammengeführt werden können. Die Verfahrensführung erfolgt ansonsten genau wie bei c) des ersten Ausführungsbeispiels. Die Ausbeute beträgt ungefähr 3200 Hybride.

3.Beispiel des Verfahrens

Bei diesem Beispiel wird als Trägerelement 68 und 70 ein poröses Material verwendet, welches auf seinen Oberflächen 86 und 88 mit Antikörpern versehen ist, welche durch Glutataldehyd an dem jeweils verwendeten Trägerelement 68 oder 70 gebunden sind. Bevorzugterweise wird als Trägerelement ein .poröses Filtermaterial verwendet, welches jedoch hinsichtlich seiner Porerigrösse keinen Beschränkungen unterliegt, so dass bevorzugterweise ein Material mit grösseren Poren verwendet wird, so dass sich auf den Oberflächen 86 und 88 beim Hindurchsaugen der Lösung möglichst wenig Schmutzpartikel absetzen.

Die Herstellung derartiger Antikörpei entspricht den bisher üblichen Verfahren und wird beispielsweise in dem Artikel von

ausführlich beschrieben.

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a) Mechanisches Zusammenführen

Die Verfahrensführung erfolgt wie unter a) im ersten oder im zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben, wobei ebenfalls die Lösungen 1 oder 2 Verwendung finden können.

Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Zelle nach der Fusion mitsamt den Trägerelementen 68, 7O, a welchen sie noch haften, in das Nährmedium gebracht * Hierin können sich die noch an den Trägerelementen 68 und 70 haftenden Zellen teilen. Nach 1 bis 2 Tagen werden die Trägerelemente 68 und 70 sorgfältig ausgewaschen und die Lösung dann abzentrifugiert, wobei hauptsächlich die durch Teilung entstandenen Tochterzellen von den Trägerelementen 68 und 70 abgelöst werden.

Das Kloni ren der erhaltenen Tochterzellen erfolgt dann wie bei Schnettler et al. beschrieben.

Die Ausbeute der erhaltenen Hybride liegt bei ungefähr 5000 bis 6000.

b) Mechanisches Zusammenführen in Kombination mit D!elektrophorese

Hierbei wird ebenfalls; wie unter b) bei den Beispielen 1 und 2 beschrieben, verfahren.

Hinzuzufügen ist, dass zum Durchführen der Dielektrophorese auch die Bindung zwischen den Zellen und den Antikörpern nur so stark sein darf, dass die Zellen bei der Dielektrophorese zumindest von einer der Oberflächen 86 und 88 abgelöst und auf die gegenüberliegende Oberfläche gebracht

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$ werden können. Die Auswahl der Antikörper mit der ent-

sprechenden Bindungsstärke erfolgt durch gezielte Selektion der Antikörper vor ihrem Aufbringen a.uf die Trägerelemente 68 und 70.

< Die Ausbeute an Hybriden beträgt ungefähr 5000.

c) Mechanisches Zusammenführen in Kombination ',it Zusammenfuhren unter Verwendung von Magnetfeldern

ί Hierbei wird ebenfalls wie unter c) bei den bereits be

schriebenen Beispielen 1 und 2 verfahren, wobei ebenfalls wie bei b) des dritten Ausführungsbeispiels die Stärke der Bindung zwischen Zellen und Antikörpern so sein muss, dass die Zellen durch das Magnetfeld zumindest von einer der Oberflächen 86 und 88 gelöst werden können, wobei die Selektion der Antikörper wie oben, beschrieben erfolgt.

< Die Ausbeute an Hybriden beträgt ungefähr 2000.

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Claims (8)

1. Vorrichtung zur Elektrofusion von Zellen mit zwei iiii Abstand voneinander angeordneten Elektroden, zwischen denen zur Elektrofusion erforderliche elektrische Felder erzeugbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Elektroden (34,36) zwei Trägerelemente (68,70) mit gegeneinander gerichteten und Zellen (80,82) tragenden Oberflächen (86,88) positionierbar sind, wobei die Oberflächen (86,88) einen ersten Abstand voneinander aufweisen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verstellvorrichtung (10) vorgesehen ist, mittels welcher die Oberflächen (86,88) von einem zweiten, wesentlich größeren Abstand bis auf den ersten Abstand aufeinander zu bewegbar sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 odsr 2, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Abstand so gering ist, daß die Zellen (80,82) an den. Oberflächen (86,88) der beiden Trägerelemente (68,70) mit-

-1'

einander in Membrankontakt kommen.

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4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

; gekennzeichnet, daß der erste Abstand ungefähr

' einem Mehrfachen des Durchmessers der Zellen (80,82)

,. entspricht.

% 5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, I dadurch gekennzeichnet, daß Spulen (100,102}

i zur Erzeugung quer zu den Oberflächen (86,88)

I verlaufender magnetischer Felder vorgesehen sind.

S-

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

!J dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerelemente

if- (68,70) Filter mit einer ungefähr dem Durchmesser

; der jeweils zu fusionierenden Zellen (80,82) ent

sprechenden Porengröße sind.

(:

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerelemente (68,70) zum Fixieren der Zellen auf ihren Oberflächen (86,88) ein Ionenaustauschermaterial tragen.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerelemente (63,70) zum Fixieren der Zellen (80,82) auf ihren

■'· Oberflächen (86,88) für cie jeweils zu fixierenden

Zellen (80,82) spezifische Antikörper tragen.

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