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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zum Fokussieren
von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei unterschiedlichen Mikroskoparten,
bei denen entweder das Objektiv und der Kondensor fokussierbar sind,
wie bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen, bei denen
das zu untersuchende Objekt auf einem festen Tisch angeordnet ist,
oder das Objekt und der Kondensor fokussierbar sind, wie bei aufrechten
Mikroskopen, bei denen das zu untersuchende Objekt in Z-Richtung
bewegt wird.
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Es
ist bekannt, dass bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage und bei inversen
Mikroskopen das Objektiv und der Kondensor getrennt auf ein zu untersuchendes
Objekt fokussiert werden. Bei aufrechten Mikroskopen, bei denen
das Objekt durch die Bewegung eines Objekttisches in den feststehenden Objektivfokus
gebracht wird, wird anschließend
der Kondensor ebenfalls auf das zu untersuchende Objekt fokussiert.
Die Kondensorfokussierung ist wichtig für die Beleuchtung nach den
Köhlerschen
Regeln zur Unterdrückung
des Streulichts, um einen guten Kontrast und eine maximale Signaldetektion
zu erhalten. Bei ausreichend dünnen
Objekten, beispielsweise < 50 μm ist ein
Nachführen
des Kondensors beim Fokussieren durch die Probe im Allgemeinen nicht
erforderlich. Bei dickeren Proben dagegen, wie z.B. den mehrere
100 μm dicken
Gehirnschnitten, die in der Elektrophysiologie verwendet werden,
oder millimeterdicken Zebrafischembryos, die in der Entwicklungsbiologie
häufig
untersucht werden, lässt
die Abbildungsqualität
ohne ein Nachführen
des Kondensors erkennbar nach. Insbesondere dann ist ein fehlender
Abgleich zwischen Objektiv und Kondensor von Nachteil, wenn die
Kondensoroptik nicht nur zum Beleuchten des Objektes, sondern auch
für die Signaldetektion
genutzt werden soll. Ein Anwendungsbeispiel dafür ist die Multiphotonenmikroskopie mit
Detektion von Fluoreszenzsignalen im Durchlicht. Dabei wird ein
gepulster IR-Laser in die Probe fokussiert. Die Pulsenergie des
langwelligen Lichtes ist nur im Fokuspunkt hoch genug, um durch
die simultane Absorption mehrerer IR-Photonen die Entstehung von
kurzweiligerem Fluoreszenzlicht zu erlauben. Um das so entstandene
Fluoreszenzsignal möglichst effizient
auffangen zu können,
werden auch unter dem Kondensor Detektoren benutzt. Auch Abbildungen
mit konventionellen Durchlichtkontrastverfahren, wie z.B. differentiellem
Interferenzkontrast (DIC), lassen sich durch Benutzung des Kondensors
als Abbildungsoptik erzeugen.
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Insbesondere
bei dicken Proben ist die Kondensorfokussierung sowohl für die Fluoreszenzdetektion
als auch für
die Abbildungsqualität
bei Durchlichtverfahren von entscheidender Bedeutung. Das Arbeiten
mit dicken Proben nach den bekannten Verfahren hat den Nachteil,
dass die optimale Kondensoreinstellung nur jeweils für eine zu
untersuchende Ebene innerhalb des Objektes gilt. Wenn der Kondensor
bei einer Bewegung des Objektes (aufrechte Mikroskope) oder des
Objektivs (Fixed Stage und inverse Mikroskope) nicht nachgeführt wird,
gelten für alle
weiteren Objektebenen nicht optimale Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen.
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Ausgehend
von diesem Stand der Technik besteht die Aufgabe der Erfindung darin,
ein einfaches Verfahren und eine kostengünstige Anordnung zum Fokussieren
von Objektiven, Objekten und Kondensoren für unterschiedliche Mikroskoparten
zu schaffen, mit denen optimale Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen
für die
zu untersuchenden Objektebenen durch eine optimale Nachführung des Kondensors
bei einer Bewegung eines Objektivs oder eines Objektes insbesondere
für die
Untersuchung dicker Proben erhalten werden.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem
Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren
bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs
1 angegebenen Merkmale und durch eine Anordnung zum Fokussieren
bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs
6 angegebenen Merkmale gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Das
Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren
für unterschiedliche Mikroskoparten
ist dadurch gekennzeichnet, dass durch eine gekoppelte Fokussierbewegung
eines Objektivs und eines Kondensors oder eines zu untersuchenden
Objektes und des Kondensor auf eine Objektebene innerhalb des zu
untersuchenden Objektes, dessen axiale Ausdehnung ein Vielfaches
der Tiefenschärfe
des Objektivs beträgt,
ein Fokus des Objektivs und ein Fokus des Kondensors stets in der zu
betrachtenden Objektebene des zu untersuchenden Objektes liegen,
so dass Objektdetails in allen Ebenen des Objektes beleuchtet und
gleichzeitig der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang aufeinander
abgestimmt sind.
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Vorteilhaft
ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor
synchron so erfolgt, dass mit jeweils gleichen Fokussierhüben eine
vorgegebene Objektebene erreicht wird, oder die gekoppelte Bewegung
von Objekt und Kondensor erfolgt entgegengesetzt synchron so, dass mit
jeweils gleich großen
aber entgegengesetzt gerichteten Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene
unter Beibehaltung eines einstellbaren Abstands von Objektiv und
Kondensor erreicht wird.
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Ebenso
ist bevorzugt vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv
und Kondensor oder Objekt und Kondensor unter Berücksichtigung unterschiedlicher
Brechungsmedien zwischen Objekt und Objektiv einerseits und Objekt
und Kondensor andererseits mit unterschiedlichen Fokussierhüben erfolgt.
Das ist beispielsweise dann vorgesehen, wenn sich das Objektiv oberhalb
des Objekts in wässriger
Lösung
befindet, und der Kondensor unterhalb durch Luftabstand und Glasboden
vom Objekt getrennt ist. Es müssen
dann die Fokussierkennlinien von Objektiv und Kondensor mit in die
Kopplung einbezogen werden.
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Alternativ
ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor
oder Objekt und Kondensor bei gleichen Brechungswerten unter- und
oberhalb des Objektes so erfolgt, dass die unterschiedlichen Fokustiefen
des Kondensors und des Objektivs innerhalb des Objektes berücksichtigt werden.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Erzeugung einer gekoppelte Fokussierbewegung des Objektivs und
des Kondensors oder des zu untersuchenden Objektes und des Kondensors
auf beliebige Objektebenen innerhalb des zu untersuchenden Objektes
wird eine Anordnung vorgeschlagen, mittels der unter Berücksichtigung
von Brechungsindices, Probendicke und Fokustiefe innerhalb des Objektes
die gekoppelte Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs und
des Kondensors oder des Objektes und des Kondensors jederzeit optimale
Bedingungen für
die Beleuchtung und Detektion gewährleistet sind, wobei ein ausreichender
und konstanter Abstand zwischen Objektiv und Kondensor beim Fokussieren
durch dicke Proben durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung
von der Objekttischbewegung oder durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung
von der Objektivbewegung vorgesehen ist.
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Diese
Entkopplung betrifft vor allem aufrechte Mikroskope, bei denen das
Objekt allgemein durch Anheben und Absenken des Objekttisches durch
den Fokus des Objektivs bewegt wird. Der Objekttisch mit dem zu
untersuchenden Objekt und der Kondensor können in der Regel separat eingestellt
werden. Sie bewegen sich bei diesen Mikroskopen dann aber normalerweise
gleichsinnig, da die Kondensorträgermechanik
am Tischträger
angebracht ist. Die Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung
gewährleistet,
dass der Kondensor und das Objektiv jeweils auf dieselbe Objektebene
innerhalb des Objektes fokussiert werden.
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Eine
besonders einfache Ausführung
der erfindungsgemäßen Anordnung
insbesondere beim Fokussieren durch dicke Proben besteht darin,
dass bei aufrechten Mikroskopen ohne Motorisierung zur Entkopplung
der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung bzw. der Objektivbewegung
bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage eine in die Objekttischführung bzw.
in den Objektivträger
bei Fixed Stage-Stativen integrierte Führung für den Kondensor vorgesehen
ist, wobei die Führung
mittels Federkraft gegen einen Anlagepunkt gedrückt und beim Absenken des Objekttisches
mittels eines mechanischen Mitnehmers nach unten verschiebbar ist.
Durch diese integrierte Führung
wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch und Kondensor aufgehoben,
so dass das Objektiv und der Kondensor beim Fokussieren durch dicke
Proben immer den gleichen Abstand zueinander besitzen und gleichzeitig
das Objekt durch die Feder geschützt
ist.
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Bevorzugt
vorgesehen ist eine mechanische oder elektronische Kopplung der
Fokussierbewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekttisch und
Kondensor. Die Kondensorfokussierung kann aber auch separat über die
Bewegung des Kondensortriebs erfolgen. Zweckmäßigerweise erfolgt das Fokussieren
motorisch. Kondensor- und Objektivträger werden dazu motorisch angetrieben.
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Weiterhin
ist es zweckmäßig, einen
Kondensor zu verwenden, bei dem das Leuchtfeldblendenbild im Unendlichen
liegt. Dadurch ist gewährleistet, dass
der Durchmesser der Leuchtfeldblende unabhängig von der fokussierten Ebene
immer gleich ist und nicht angepasst werden muss. Kondensor und Objektiv
sollten dazu über
einen ausreichenden Arbeitsabstand verfügen, um sicher jede Ebene innerhalb
eines dicken Objekts anzufahren.
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Werden
in der Multiphotonenmikroskopie die Signale unterhalb des Kondensors über eine
Photonensammeloptik auf einen Detektor ausgekoppelt, ist es vorteilhaft,
eine Auskoppeleinrichtung vorzusehen und sie fest mit dem beweglichen
Kondensorträger zu
verbinden, um verlustfreie Signale in jeder Kondensorposition zu
erhalten, so dass damit unabhängig
von der Kondensorfokussierung die gleichen optischen Bedingungen
hinsichtlich der Signalausbeute vorliegen.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand eines schematisch in Zeichnungen
dargestellten Ausführungsbeispieles
näher erläutert.
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Es
zeigen:
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1 ein
Ausführungsbeispiel
für Fixed
Stage-Mikroskope;
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2 ein
Ausführungsbeispiel
für aufrechte Mikroskope;
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3 eine
Verlagerung der Objektebene bei Fixed Stage-Mikroskopen;
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4 eine
Verlagerung der Objektebene bei aufrechten Mikroskopen;
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5 ein
Ausführungsbeispiel
einer Einrichtung zum Nachführen
des Kondensors bei aufrechten Mikroskopen;
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6 eine
Führung
zur Bewegung des Kondensors in Vorderansicht;
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7 die
Führung
zur Bewegung des Kondensors in Draufsicht.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren und eine Anordnung
zum Fokussieren von Objektiven 2, Objekten 1 und
Kondensoren 5 für
unterschiedliche Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv 2 und
der Kondensor 5 fokussierbar sind, wobei das zu untersuchende
Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7 angeordnet
ist (Fixed Stage-Mikroskope
und inverse Mikroskope) oder das Objekt 1 und der Kondensor 5 fokussierbar
sind (aufrechte Mikroskope) und das Objekt 1 in Z-Richtung
bewegt wird.
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Im
ersten Fall liegt das Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7,
wie das bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen der
Fall ist, im zweiten Fall wird das Objekt 1, wie bei aufrechten
Mikroskopen, in Z-Richtung bewegt.
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In
den 1 und 2 ist die Situation bei Fixed
Stage-Mikroskopen
schematisch dargestellt. Das Objekt 1, ein Präparat, liegt
auf dem festen, nicht näher
dargestellten, bekannten Objekttisch 7 und wird durch das
Objektiv 2 abgebildet. Dazu wird das Objektiv 2 auf
eine jeweils zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert,
d.h. die Objektebene 3 wird in einen Fokus 4 des
Objektivs 2 eingebracht. Der Kondensor 5 wird
mit seinem Fokus 6 zur Optimierung der Beleuchtung ebenfalls
auf die zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert. Die gleiche
Situation gilt auch für
inverse Mikroskope. Bei inversen Mikroskopen sind lediglich die
Positionen von Objektiv 2 und Kondensor 5 vertauscht.
In den 3 und 4 ist die Situation bei aufrechten
Mikroskopen schematisch dargestellt. Das Objekt 1 wird
bei aufrechten Mikroskopen in Z-Richtung bewegt. Unterschiedliche Brechungsindices
von Objekt 1 und den umgebenden Medien sind nicht berücksichtigt,
so dass die tatsächliche
Situation noch erheblich ungünstiger
ist. Wenn bei Fixed Stage-Mikroskopen oder bei inversen Mikroskopen
das Objektiv 1 bewegt und damit der Fokus 4 des
Objektivs 2 innerhalb des Objektes 1 verschoben
wird, ohne dass der Kondensor 5 nachgeführt und damit auf die Objektebene 3 fokussiert wird,
sind Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal
aufeinander abgestimmt (2). Vergleichbares gilt bei
aufrechten Mikroskopen (4). Durch Bewegung des Objektes 1 verschiebt
sich die Lage des Fokus 4 innerhalb des Objektes 1.
Ohne gegenläufige
Bewegungen des Kondensors 5 sind der Beleuchtungs- und
Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal aufeinander abgestimmt.
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Die 5, 6 und 7 zeigen
ein Ausführungsbeispiel
einer Anordnung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei dem für
aufrechte Mikroskope ohne Motorisierung sichergestellt wird, dass
das Objektiv 2 und der Kondensor 5 auch beim Fokussieren
durch dicke Objekte 1 immer den gleichen Abstand zueinander
besitzen. Diese Anordnung ist für
die wachsende Zahl von Anwendungen gedacht, bei denen Durchlichtbildstapel
einer Deconvolution unterzogen werden sollen. Hierfür sind eine definierte
Position des Kondensors 5 und damit eine konstante Beleuchtungsapertur
erforderlich.
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Um
den Abstand zwischen Kondensor 5 und Objektiv 2 konstant
zu halten, wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch 7 und
Kondensor 5 aufgehoben. Der Kondensor 5 ist an
einem Kondensorträger 8 befestigt,
der mittels einer Führung 9,
vorzugsweise einer Wälzführung, an
einem Tischträger 10 auf
und ab bewegt wird, vorzugsweise durch ein Zahnstangengetriebe 11.
Die Führung 9 für den Kondensor 5 ist
dabei so in die den Tischträger 10 integriert,
dass sich ein geführtes
Teil 13 auf Wälzkörpern 12 entlang
des Tischträgers 10 bewegt.
Die Führung 9 wird
durch eine Feder 14, die sich an einer Grundplatte 15 des
Mikroskops abstützt,
gegen eine definierte Anlage 16 nach oben gedrückt. Entlang
der Führung 9 bleibt
der Kondensor 5 nach wie vor durch das Zahnstangengetriebe 11 fokussierbar.
Bei Fokussierung des Objekttisches 7 bewegt sich der Kondensor 5 aber
nicht mit, so dass der Abstand zum Objektiv 2 und Kondensor 5 erhalten
bleibt. Durch die Feder 14 wird das Objekt 1 geschützt. Wenn
der Objekttisch 7 so weit abgesenkt wird, dass die Optik
des Kondensors 5 gegen das Objekt 1 drückt, wird
der Kondensor 5 gegen den Druck der Feder 14 durch
einen mechanischen Mitnehmer 17 nach unten gedrückt.
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Die
Erfindung beschränkt
sich nicht auf das Ausführungsbeispiel,
die Anordnung zur Durchführung
des Verfahrens ist variabel und kann durch unterschiedliche Bewegungsmechanismen
realisiert werden.
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- 1
- Objekt
- 2
- Objektiv
- 3
- Objektebene
- 4
- Fokus
des Objektivs
- 5
- Kondensor
- 6
- Fokus
des Kondensors
- 7
- Objekttisch
- 8
- Kondensorträger
- 9
- Führung für Kondensor
- 10
- Tischträger
- 11
- Zahnstangengetriebe
- 12
- Wälzkörper
- 13
- geführtes Teil
- 14
- Feder
- 15
- Grundplatte
- 16
- Anlage
- 17
- Mitnehmer