Verfahren und Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei Mikroskopen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei unterschiedlichen Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv und der Kondensor fokussierbar sind, wie bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen, bei denen das zu untersuchende Objekt auf einem festen Tisch angeordnet ist, oder das Objekt und der Kondensor fokussierbar sind, wie bei aufrechten Mikroskopen, bei denen das zu untersuchende Objekt in Z-Richtung bewegt wird.
Es ist bekannt, dass bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage und bei inversen Mikroskopen das Objektiv und der Kondensor getrennt auf ein zu untersuchendes Objekt fokussiert werden. Bei aufrechten Mikroskopen, bei denen das Objekt durch die Bewegung eines Objekttisches in den feststehenden Objektivfokus gebracht wird, wird anschließend der Kondensor ebenfalls auf das zu untersuchende Objekt fokussiert. Die Kondensorfokussierung ist wichtig für die Beleuchtung nach den Köhlerschen Regeln zur Unterdrückung des Streulichts, um einen guten Kontrast und eine maximale Signaldetektion zu erhalten. Bei ausreichend dünnen Objekten, beispielsweise < 50 μm ist ein Nachführen des Kondensors beim Fokussieren durch die Probe im Allgemeinen nicht erforderlich. Bei dickeren Proben dagegen, wie z.B. den mehrere 100 μm dicken Gehirnschnitten, die in der Elektrophysiologie verwendet werden, oder millimeterdicken Zebrafischembryos, die in der Entwicklungsbiologie häufig untersucht werden, lässt die Abbildungsqualität ohne ein Nachführen des Kondensors erkennbar nach. Insbesondere dann
ist ein fehlender Abgleich zwischen Objektiv und Kondensor von Nachteil, wenn die Kondensoroptik nicht nur zum Beleuchten des Objektes, sondern auch für die Signaldetektion genutzt werden soll. Ein Anwendungsbeispiel dafür ist die Multiphotonenmikroskopie mit Detektion von Fluoreszenzsignalen im Durchlicht. Dabei wird ein gepulster IR-Laser in die Probe fokussiert . Die Pulsenergie des langwelligen Lichtes ist nur im Fokuspunkt hoch genug, um durch die simultane Absorption mehrerer IR-Photonen die Entstehung von kurzweiligerem Fluoreszenzlicht zu erlauben. Um das so entstandene Fluoreszenzsignal möglichst effizient auffangen zu können, werden auch unter dem Kondensor Detektoren benutzt. Auch Abbildungen mit konventionellen Durchlichtkontrastverfahren, wie z.B. differentiellem Interferenzkontrast (DIC) , lassen sich durch Benutzung des Kondensors als Abbildungsoptik erzeugen. Insbesondere bei dicken Proben ist die
Kondensorfokussierung sowohl für die Fluoreszenzdetektion als auch für die Abbildungsqualität bei Durchlichtverfahren von entscheidender Bedeutung. Das Arbeiten mit dicken Proben nach den bekannten Verfahren hat den Nachteil, dass die optimale Kondensoreinstellung nur jeweils für eine zu untersuchende Ebene innerhalb des Objektes gilt. Wenn der Kondensor bei einer Bewegung des Objektes (aufrechte Mikroskope) oder des Objektivs (Fixed Stage und inverse Mikroskope) nicht nachgeführt wird, gelten für alle weiteren Objektebenen nicht optimale Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen .
Ausgehend von diesem Stand der Technik besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein einfaches Verfahren und eine kostengünstige Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren für unterschiedliche Mikroskoparten zu schaffen, mit denen optimale
Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen für die zu untersuchenden Objektebenen durch eine optimale Nachführung des Kondensors bei einer Bewegung eines Objektivs oder eines Objektes insbesondere für die Untersuchung dicker Proben erhalten werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale und durch eine Anordnung zum Fokussieren bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 6 angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren für unterschiedliche Mikroskoparten ist dadurch gekennzeichnet, dass durch eine gekoppelte
Fokussierbewegung eines Objektivs und eines Kondensors oder eines zu untersuchenden Objektes und des Kondensor auf eine Objektebene innerhalb des zu untersuchenden Objektes, dessen axiale Ausdehnung ein Vielfaches der Tiefenschärfe des Objektivs beträgt, ein Fokus des Objektivs und ein Fokus des Kondensors stets in der zu betrachtenden Objektebene des zu untersuchenden Objektes liegen, so dass Objektdetails in allen Ebenen des Objektes beleuchtet und gleichzeitig der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang aufeinander abgestimmt sind.
Vorteilhaft ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor synchron so erfolgt, dass mit jeweils gleichen Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene erreicht wird, oder die gekoppelte Bewegung von Objekt und Kondensor erfolgt entgegengesetzt synchron so, dass mit jeweils gleich großen aber entgegengesetzt
gerichteten Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene unter Beibehaltung eines einstellbaren Abstands von Objektiv und Kondensor erreicht wird.
Ebenso ist bevorzugt vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekt und Kondensor unter Berücksichtigung unterschiedlicher Brechungsmedien zwischen Objekt und Objektiv einerseits und Objekt und Kondensor andererseits mit unterschiedlichen Fokussierhüben erfolgt . Das ist beispielsweise dann vorgesehen, wenn sich das Objektiv oberhalb des Objekts in wässriger Lösung befindet, und der Kondensor unterhalb durch Luftabstand und Glasboden vom Objekt getrennt ist. Es müssen dann die Fokussierkennlinien von Objektiv und Kondensor mit in die Kopplung einbezogen werden.
Alternativ ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekt und Kondensor bei gleichen Brechungswerten unter- und oberhalb des Objektes so erfolgt, dass die unterschiedlichen Fokustiefen des Kondensors und des Objektivs innerhalb des Objektes berücksichtigt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung einer gekoppelte Fokussierbewegung des Objektivs und des Kondensors oder des zu untersuchenden Objektes und des Kondensors auf beliebige Objektebenen innerhalb des zu untersuchenden Objektes wird eine Anordnung vorgeschlagen, mittels der unter Berücksichtigung von Brechungsindices, Probendicke und Fokustiefe innerhalb des Objektes die gekoppelte Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs und des Kondensors oder des Objektes und des Kondensors jederzeit optimale Bedingungen für die Beleuchtung und
Detektion gewährleistet sind, wobei ein ausreichender und konstanter Abstand zwischen Objektiv und Kondensor beim Fokussieren durch dicke Proben durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung oder durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objektivbewegung vorgesehen ist.
Diese Entkopplung betrifft vor allem aufrechte Mikroskope, bei denen das Objekt allgemein durch Anheben und Absenken des Objekttisches durch den Fokus des Objektivs bewegt wird. Der Objekttisch mit dem zu untersuchenden Objekt und der Kondensor können in der Regel separat eingestellt werden. Sie bewegen sich bei diesen Mikroskopen dann aber normalerweise gleichsinnig, da die Kondensorträgermechanik am Tischträger angebracht ist. Die Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung gewährleistet, dass der Kondensor und das Objektiv jeweils auf dieselbe Objektebene innerhalb des Objektes fokussiert werden .
Eine besonders einfache Ausführung der erfindungsgemäßen Anordnung insbesondere beim Fokussieren durch dicke Proben besteht darin, dass bei aufrechten Mikroskopen ohne Motorisierung zur Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung bzw. der Objektivbewegung bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage eine in die Objekttischführung bzw. in den Objektivträger bei Fixed Stage-Stativen integrierte Führung für den Kondensor vorgesehen ist, wobei die Führung mittels Federkraft gegen einen Anlagepunkt gedrückt und beim Absenken des Objekttisches mittels eines mechanischen Mitnehmers nach unten verschiebbar ist. Durch diese integrierte Führung wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch und Kondensor aufgehoben, so dass das Objektiv und der Kondensor beim Fokussieren durch dicke Proben immer den
gleichen Abstand zueinander besitzen und gleichzeitig das Objekt durch die Feder geschützt ist.
Bevorzugt vorgesehen ist eine mechanische oder elektronische Kopplung der Fokussierbewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekttisch und Kondensor. Die Kondensorfokussierung kann aber auch separat über die Bewegung des Kondensortriebs erfolgen. Zweckmäßigerweise erfolgt das Fokussieren motorisch. Kondensor- und Objektivträger werden dazu motorisch angetrieben.
Weiterhin ist es zweckmäßig, einen Kondensor zu verwenden, bei dem das Leuchtfeldblendenbild im Unendlichen liegt. Dadurch ist gewährleistet, dass der Durchmesser der Leuchtfeldblende unabhängig von der fokussierten Ebene immer gleich ist und nicht angepasst werden muss. Kondensor und Objektiv sollten dazu über einen ausreichenden Arbeitsabstand verfügen, um sicher jede Ebene innerhalb eines dicken Objekts anzufahren.
Werden in der Multiphotonenmikroskopie die Signale unterhalb des Kondensors über eine Photonensammeloptik auf einen Detektor ausgekoppelt, ist es vorteilhaft, eine Auskoppeleinrichtung vorzusehen und sie fest mit dem beweglichen Kondensorträger zu verbinden, um verlustfreie Signale in jeder Kondensorposition zu erhalten, so dass damit unabhängig von der Kondensorfokussierung die gleichen optischen Bedingungen hinsichtlich der Signalausbeute vorliegen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines schematisch in Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispieles näher erläutert .
Es zeigen :
Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel für Fixed Stage- Mikroskope;
Fig. 2 ein Ausführungsbeispiel für aufrechte Mikroskope;
Fig. 3 eine Verlagerung der Objektebene bei Fixed Stage- Mikroskopen,-
Fig. 4 eine Verlagerung der Objektebene bei aufrechten Mikroskopen;
Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel einer Einrichtung zum Nachführen des Kondensors bei aufrechten Mikroskopen;
Fig. 6 eine Führung zur Bewegung des Kondensors in Vorderansicht ;
Fig. 7 die Führung zur Bewegung des Kondensors in Draufsicht .
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren und eine Anordnung zum Fokussieren von Objektiven 2, Objekten 1 und Kondensoren 5 für unterschiedliche Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv 2 und der Kondensor 5 fokussierbar sind, wobei das zu untersuchende Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7 angeordnet ist (Fixed Stage- Mikroskope und inverse Mikroskope) oder das Objekt 1 und der Kondensor 5 fokussierbar sind (aufrechte Mikroskope) und das Objekt 1 in Z-Richtung bewegt wird.
Im ersten Fall liegt das Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7, wie das bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen der Fall ist, im zweiten Fall wird das Objekt 1, wie bei aufrechten Mikroskopen, in Z-Richtung bewegt .
In den Figuren 1 und 2 ist die Situation bei Fixed Stage- Mikroskopen schematisch dargestellt. Das Objekt 1, ein Präparat, liegt auf dem festen, nicht näher dargestellten, bekannten Objekttisch 7 und wird durch das Objektiv 2 abgebildet. Dazu wird das Objektiv 2 auf eine jeweils zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert, d.h. die Objektebene 3 wird in einen Fokus 4 des Objektivs 2 eingebracht. Der Kondensor 5 wird mit seinem Fokus 6 zur Optimierung der Beleuchtung ebenfalls auf die zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert . Die gleiche Situation gilt auch für inverse Mikroskope. Bei inversen Mikroskopen sind lediglich die Positionen von Objektiv 2 und Kondensor 5 vertauscht. In den Figuren 3 und 4 ist die Situation bei aufrechten Mikroskopen schematisch dargestellt. Das Objekt 1 wird bei aufrechten Mikroskopen in Z-Richtung bewegt. Unterschiedliche Brechungsindices von Objekt 1 und den umgebenden Medien sind nicht berücksichtigt, so dass die tatsächliche Situation noch erheblich ungünstiger ist. Wenn bei Fixed Stage-Mikroskopen oder bei inversen Mikroskopen das Objektiv 1 bewegt und damit der Fokus 4 des Objektivs 2 innerhalb des Objektes 1 verschoben wird, ohne dass der Kondensor 5 nachgeführt und damit auf die Objektebene 3 fokussiert wird, sind Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal aufeinander abgestimmt (Figur 2) . Vergleichbares gilt bei aufrechten Mikroskopen (Figur 4) . Durch Bewegung des Objektes 1 verschiebt sich die Lage des Fokus 4 innerhalb des Objektes
1. Ohne gegenläufige Bewegungen des Kondensors 5 sind der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal aufeinander abgestimmt.
Die Figuren 5, 6 und 7 zeigen ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem für aufrechte Mikroskope ohne Motorisierung sichergestellt wird, dass das Objektiv 2 und der Kondensor 5 auch beim Fokussieren durch dicke Objekte 1 immer den gleichen Abstand zueinander besitzen. Diese Anordnung ist für die wachsende Zahl von Anwendungen gedacht, bei denen Durchlichtbildstapel einer Deconvolution unterzogen werden sollen. Hierfür sind eine definierte Position des Kondensors 5 und damit eine konstante Beleuchtungsapertur erforderlich .
Um den Abstand zwischen Kondensor 5 und Objektiv 2 konstant zu halten, wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch 7 und Kondensor 5 aufgehoben. Der Kondensor 5 ist an einem Kondensorträger 8 befestigt, der mittels einer Führung 9, vorzugsweise einer Wälzführung, an einem Tischträger 10 auf und ab bewegt wird, vorzugsweise durch ein Zahnstangengetriebe 11. Die Führung 9 für den Kondensor 5 ist dabei so in die den Tischträger 10 integriert, dass sich ein geführtes Teil 13 auf Wälzkörpern 12 entlang des Tischträgers 10 bewegt. Die Führung 9 wird durch eine Feder 14, die sich an einer Grundplatte 15 des Mikroskops abstützt, gegen eine definierte Anlage 16 nach oben gedrückt. Entlang der Führung 9 bleibt der Kondensor 5 nach wie vor durch das Zahnstangengetriebe 11 fokussierbar . Bei Fokussierung des Objekttisches 7 bewegt sich der Kondensor 5 aber nicht mit, so dass der Abstand zum Objektiv 2 und Kondensor 5 erhalten bleibt. Durch die Feder 14 wird das Objekt 1 geschützt. Wenn der Objekttisch 7 so weit abgesenkt wird, dass die Optik des Kondensors 5 gegen das
Objekt 1 drückt, wird der Kondensor 5 gegen den Druck der Feder 14 durch einen mechanischen Mitnehmer 17 nach unten gedrückt .
Die Erfindung beschränkt sich nicht auf das Ausführungsbeispiel, die Anordnung zur Durchführung des Verfahrens ist variabel und kann durch unterschiedliche Bewegungsmechanismen realisiert werden.
Bezugszeichenliste
1 Objekt
2 Objektiv
3 Objektebene
4 Fokus des Objektivs
5 Kondensor
6 Fokus des Kondensors
7 Objekttisch
8 Kondensorträger
9 Führung für Kondensor
10 Tischträger
11 Zahnstangengetriebe
12 Wälzkörper
13 geführtes Teil
14 Feder
15 Grundplatte
16 Anlage
17 Mitnehmer