EP2076810A1 - Method and assembly for focussing optics, objects and condensers in microscopes - Google Patents

Method and assembly for focussing optics, objects and condensers in microscopes

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Publication number
EP2076810A1
EP2076810A1 EP07818633A EP07818633A EP2076810A1 EP 2076810 A1 EP2076810 A1 EP 2076810A1 EP 07818633 A EP07818633 A EP 07818633A EP 07818633 A EP07818633 A EP 07818633A EP 2076810 A1 EP2076810 A1 EP 2076810A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
condenser
movement
focusing
lens
coupled
Prior art date
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Ceased
Application number
EP07818633A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Peter Dietrich
Christian Boeker
Henning Schrader
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss MicroImaging GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss MicroImaging GmbH filed Critical Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Publication of EP2076810A1 publication Critical patent/EP2076810A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing

Definitions

  • the invention relates to a method and an arrangement for focusing lenses, objects and condensers in different types of microscope, in which either the lens and the condenser are focused, as in fixed-stage microscopes and inverse microscopes in which the object to be examined on a fixed Table is arranged, or the object and the condenser can be focused, as in upright microscopes in which the object to be examined is moved in the Z direction.
  • the image quality can be visibly diminished without the condenser tracking.
  • the condenser optics should be used not only to illuminate the object, but also for the signal detection.
  • One application example of this is multiphoton microscopy with detection of fluorescence signals in transmitted light. A pulsed IR laser is focused into the sample. The pulse energy of the long-wave light is high enough only in the focal point to allow the formation of more subtle fluorescent light by the simultaneous absorption of several IR photons.
  • detectors are also used under the condenser.
  • images with conventional transmitted light contrast methods such as differential interference contrast (DIC) can be generated by using the condenser as imaging optics.
  • DIC differential interference contrast
  • Condenser focusing is crucial for both fluorescence detection and imaging quality in transmitted light processes.
  • Working with thick samples according to the known methods has the disadvantage that the optimum condenser setting applies only to a plane to be examined within the object. If the condenser is not tracked during a movement of the object (upright microscopes) or the objective (fixed stage and inverted microscopes), not optimal lighting and imaging conditions apply to all other object planes.
  • the object of the invention is to provide a simple method and a cost-effective arrangement for focusing lenses, objects and condensers for different microscope types, with which optimal Illumination and imaging conditions for the object planes to be examined are obtained by an optimal tracking of the condenser during a movement of a lens or an object, in particular for the examination of thick samples.
  • the method for focusing lenses, objects and condensers for different microscope types is characterized in that by a coupled
  • the axial extent is a multiple of the depth of field of the lens, a focus of the lens and a focus of the condenser always in the object plane to be considered are to be examined object so that object details illuminated in all planes of the object and at the same time the illumination and imaging beam path are coordinated.
  • the coupled movement of lens and condenser is synchronous so that with each same sierh paragraph a given object plane is reached, or the coupled movement of the object and condenser is reversed synchronously so that with the same size but opposite directed focusing strokes a predetermined object level is achieved while maintaining an adjustable distance from the lens and condenser.
  • the coupled movement of the objective and condenser or object and condenser taking into account different refractive media between object and lens on the one hand and object and condenser on the other hand with different sierh Claus.
  • This is provided, for example, when the objective is above the object in aqueous solution, and the condenser is separated from the object below by air distance and glass bottom. Then the focusing characteristics of lens and condenser must be included in the coupling.
  • the coupled movement of objective and condenser or object and condenser at the same refraction values below and above the object takes place in such a way that the different focal depths of the condenser and of the objective within the object are taken into account.
  • an arrangement is proposed by means of which, taking into account refractive indices, specimen thickness and depth of focus within the object coupled focusing movement to focus the lens and the condenser or the object and the condenser at any time optimal conditions for lighting and Detection are ensured, with a sufficient and constant distance between the lens and condenser when focusing by thick samples by decoupling the condenser movement is provided by the object table movement or by decoupling the condenser movement of the lens movement.
  • a particularly simple embodiment of the arrangement according to the invention, especially when focusing through thick samples is that in upright microscopes without motorization for decoupling the condenser movement of the stage movement or the lens movement with fixed-stage microscopes in the stage guide or in the lens carrier in Fixed Stage tripods integrated guide is provided for the condenser, wherein the guide is pressed by spring force against a contact point and when lowering the stage by means of a mechanical driver is displaced downwards.
  • the fixed connection between the stage and the condenser is canceled, so that the lens and the condenser when focusing through thick samples always the have the same distance from each other and at the same time the object is protected by the spring.
  • a mechanical or electronic coupling of the focusing movement of the lens and condenser or stage and condenser is preferred.
  • the condenser focusing can also be done separately via the movement of the condenser.
  • the focusing is done by motor.
  • Condenser and lens carriers are driven by a motor.
  • condenser in which the field-of-view is at infinity. This ensures that the diameter of the field diaphragm irrespective of the focused plane is always the same and does not need to be adjusted.
  • the condenser and lens should have sufficient working distance to safely approach each plane within a thick object.
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of fixed-stage microscopes
  • FIG. 2 shows an embodiment of upright microscopes
  • FIG. 5 shows an embodiment of a device for tracking the condenser in upright microscopes.
  • Fig. 6 is a guide for moving the condenser in front view
  • Fig. 7 shows the guide to the movement of the condenser in plan view.
  • the present invention includes a method and an arrangement for focusing objectives 2, objects 1 and condensers 5 for different types of microscope, in which either the objective 2 and the condenser 5 can be focused, wherein the object 1 to be examined is arranged on a fixed stage 7 (Fixed Stage microscopes and inverse microscopes) or the object 1 and the condenser 5 are focusable (upright microscopes) and the object 1 is moved in the Z direction.
  • the object 1 lies on a fixed object table 7, as is the case with fixed-stage microscopes and inverted microscopes
  • the object 1 is moved in the Z-direction, as in the case of upright microscopes.
  • FIGS. 1 and 2 schematically illustrate the situation with fixed-stage microscopes.
  • the object 1, a preparation lies on the fixed, not shown, known object table 7 and is imaged by the lens 2.
  • the objective 2 is focused on a respective object plane 3 to be considered, ie the object plane 3 is introduced into a focus 4 of the objective 2.
  • the condenser 5 is also focused with its focus 6 for optimizing the illumination on the object plane 3 to be considered.
  • inverse microscopes For inverse microscopes, only the positions of objective 2 and condenser 5 are reversed.
  • the situation is shown schematically for upright microscopes.
  • the object 1 is moved in upright microscopes in the Z direction.
  • Figures 5, 6 and 7 show an embodiment of an arrangement for carrying out the method according to the invention, is ensured for upright microscopes without motorization that the lens 2 and the condenser 5 always have the same distance when focusing through thick objects 1.
  • This arrangement is intended for the growing number of applications in which transmitted light image stacks are to undergo deconvolution. For this purpose, a defined position of the condenser 5 and thus a constant illumination aperture are required.
  • the condenser 5 is fixed to a condenser carrier 8, which is moved by means of a guide 9, preferably a roller guide on a table support 10 up and down, preferably by a rack gear 11.
  • the guide 9 for the condenser 5 is so in the table support Integrated that moves a guided part 13 on rolling elements 12 along the table support 10.
  • the guide 9 is pressed by a spring 14, which is supported on a base plate 15 of the microscope, against a defined system 16 upwards.
  • the condenser 5 remains focused by the rack gear 11 as before.
  • the condenser 5 When focusing the object table 7, the condenser 5 but does not move, so that the distance to the lens 2 and condenser 5 is maintained. By the spring 14, the object 1 is protected. When the stage 7 is lowered so far that the optics of the condenser 5 against the Object 1 presses, the condenser 5 is pressed against the pressure of the spring 14 by a mechanical driver 17 down.
  • the invention is not limited to the embodiment, the arrangement for carrying out the method is variable and can be realized by different movement mechanisms.

Abstract

The aim of the invention is to provide a method and an assembly for focussing optics, objects and condensers in different types of microscopes, said method and assembly achieving optimal illumination and reproduction conditions for the object planes to be analysed by the optimal tracking of the condenser when the optics or object is or are moved, in particular for analysing thick samples. This is achieved by a method, according to which the focus on an object plane (3) in the object (1) to be analysed remains constant by means of the coupled focussing movement of optics (2) and a condenser or an object (1) to be analysed and the condenser (5), thus illuminating object details on all object planes (3) of the object (1) and matching the illumination and reproduction optical path to one another. The coupled focussing movement for focussing the optics (2) and the condenser (5) or the object (1) and the condenser (5) is maintained either by the decoupling of the condenser movement from the microscope stage or by the decoupling of the condenser movement from the movement of the optics, taking into consideration refractive indices, sample thickness and focus depth in the object (1).

Description

Verfahren und Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei Mikroskopen Method and arrangement for focusing objectives, objects and condensers in microscopes
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei unterschiedlichen Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv und der Kondensor fokussierbar sind, wie bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen, bei denen das zu untersuchende Objekt auf einem festen Tisch angeordnet ist, oder das Objekt und der Kondensor fokussierbar sind, wie bei aufrechten Mikroskopen, bei denen das zu untersuchende Objekt in Z-Richtung bewegt wird.The invention relates to a method and an arrangement for focusing lenses, objects and condensers in different types of microscope, in which either the lens and the condenser are focused, as in fixed-stage microscopes and inverse microscopes in which the object to be examined on a fixed Table is arranged, or the object and the condenser can be focused, as in upright microscopes in which the object to be examined is moved in the Z direction.
Es ist bekannt, dass bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage und bei inversen Mikroskopen das Objektiv und der Kondensor getrennt auf ein zu untersuchendes Objekt fokussiert werden. Bei aufrechten Mikroskopen, bei denen das Objekt durch die Bewegung eines Objekttisches in den feststehenden Objektivfokus gebracht wird, wird anschließend der Kondensor ebenfalls auf das zu untersuchende Objekt fokussiert. Die Kondensorfokussierung ist wichtig für die Beleuchtung nach den Köhlerschen Regeln zur Unterdrückung des Streulichts, um einen guten Kontrast und eine maximale Signaldetektion zu erhalten. Bei ausreichend dünnen Objekten, beispielsweise < 50 μm ist ein Nachführen des Kondensors beim Fokussieren durch die Probe im Allgemeinen nicht erforderlich. Bei dickeren Proben dagegen, wie z.B. den mehrere 100 μm dicken Gehirnschnitten, die in der Elektrophysiologie verwendet werden, oder millimeterdicken Zebrafischembryos, die in der Entwicklungsbiologie häufig untersucht werden, lässt die Abbildungsqualität ohne ein Nachführen des Kondensors erkennbar nach. Insbesondere dann ist ein fehlender Abgleich zwischen Objektiv und Kondensor von Nachteil, wenn die Kondensoroptik nicht nur zum Beleuchten des Objektes, sondern auch für die Signaldetektion genutzt werden soll. Ein Anwendungsbeispiel dafür ist die Multiphotonenmikroskopie mit Detektion von Fluoreszenzsignalen im Durchlicht. Dabei wird ein gepulster IR-Laser in die Probe fokussiert . Die Pulsenergie des langwelligen Lichtes ist nur im Fokuspunkt hoch genug, um durch die simultane Absorption mehrerer IR-Photonen die Entstehung von kurzweiligerem Fluoreszenzlicht zu erlauben. Um das so entstandene Fluoreszenzsignal möglichst effizient auffangen zu können, werden auch unter dem Kondensor Detektoren benutzt. Auch Abbildungen mit konventionellen Durchlichtkontrastverfahren, wie z.B. differentiellem Interferenzkontrast (DIC) , lassen sich durch Benutzung des Kondensors als Abbildungsoptik erzeugen. Insbesondere bei dicken Proben ist dieIt is known that in the case of fixed-stage microscopes and inverse microscopes, the objective and the condenser are focused separately on an object to be examined. In upright microscopes in which the object is brought into the fixed lens focus by the movement of a stage, the condenser is then also focused on the object to be examined. Condenser focusing is important for Köhler's rules for suppression of stray light for good contrast and signal detection. With sufficiently thin objects, for example <50 μm, tracking the condenser when focusing through the sample is generally not necessary. On the other hand, with thicker samples, such as the several 100 μm thick brain slices used in electrophysiology, or millimeter-thick zebrafish embryos, which are frequently studied in developmental biology, the image quality can be visibly diminished without the condenser tracking. In particular then is a lack of alignment between the lens and condenser disadvantageous if the condenser optics should be used not only to illuminate the object, but also for the signal detection. One application example of this is multiphoton microscopy with detection of fluorescence signals in transmitted light. A pulsed IR laser is focused into the sample. The pulse energy of the long-wave light is high enough only in the focal point to allow the formation of more subtle fluorescent light by the simultaneous absorption of several IR photons. In order to capture the resulting fluorescence signal as efficiently as possible, detectors are also used under the condenser. Also images with conventional transmitted light contrast methods, such as differential interference contrast (DIC), can be generated by using the condenser as imaging optics. Especially with thick samples is the
Kondensorfokussierung sowohl für die Fluoreszenzdetektion als auch für die Abbildungsqualität bei Durchlichtverfahren von entscheidender Bedeutung. Das Arbeiten mit dicken Proben nach den bekannten Verfahren hat den Nachteil, dass die optimale Kondensoreinstellung nur jeweils für eine zu untersuchende Ebene innerhalb des Objektes gilt. Wenn der Kondensor bei einer Bewegung des Objektes (aufrechte Mikroskope) oder des Objektivs (Fixed Stage und inverse Mikroskope) nicht nachgeführt wird, gelten für alle weiteren Objektebenen nicht optimale Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen .Condenser focusing is crucial for both fluorescence detection and imaging quality in transmitted light processes. Working with thick samples according to the known methods has the disadvantage that the optimum condenser setting applies only to a plane to be examined within the object. If the condenser is not tracked during a movement of the object (upright microscopes) or the objective (fixed stage and inverted microscopes), not optimal lighting and imaging conditions apply to all other object planes.
Ausgehend von diesem Stand der Technik besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein einfaches Verfahren und eine kostengünstige Anordnung zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren für unterschiedliche Mikroskoparten zu schaffen, mit denen optimale Beleuchtungs- und Abbildungsbedingungen für die zu untersuchenden Objektebenen durch eine optimale Nachführung des Kondensors bei einer Bewegung eines Objektivs oder eines Objektes insbesondere für die Untersuchung dicker Proben erhalten werden.Based on this prior art, the object of the invention is to provide a simple method and a cost-effective arrangement for focusing lenses, objects and condensers for different microscope types, with which optimal Illumination and imaging conditions for the object planes to be examined are obtained by an optimal tracking of the condenser during a movement of a lens or an object, in particular for the examination of thick samples.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale und durch eine Anordnung zum Fokussieren bei Mikroskopen durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 6 angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.This object is achieved with a method for focusing of lenses, objects and condensers in microscopes by the features specified in the characterizing part of claim 1 and by an arrangement for focusing in microscopes by the features specified in the characterizing part of claim 6 features. Advantageous developments of the invention are the subject of the dependent claims.
Das Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren für unterschiedliche Mikroskoparten ist dadurch gekennzeichnet, dass durch eine gekoppelteThe method for focusing lenses, objects and condensers for different microscope types is characterized in that by a coupled
Fokussierbewegung eines Objektivs und eines Kondensors oder eines zu untersuchenden Objektes und des Kondensor auf eine Objektebene innerhalb des zu untersuchenden Objektes, dessen axiale Ausdehnung ein Vielfaches der Tiefenschärfe des Objektivs beträgt, ein Fokus des Objektivs und ein Fokus des Kondensors stets in der zu betrachtenden Objektebene des zu untersuchenden Objektes liegen, so dass Objektdetails in allen Ebenen des Objektes beleuchtet und gleichzeitig der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang aufeinander abgestimmt sind.Focusing movement of an objective and a condenser or an object to be examined and the condenser on an object plane within the object to be examined, the axial extent is a multiple of the depth of field of the lens, a focus of the lens and a focus of the condenser always in the object plane to be considered are to be examined object so that object details illuminated in all planes of the object and at the same time the illumination and imaging beam path are coordinated.
Vorteilhaft ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor synchron so erfolgt, dass mit jeweils gleichen Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene erreicht wird, oder die gekoppelte Bewegung von Objekt und Kondensor erfolgt entgegengesetzt synchron so, dass mit jeweils gleich großen aber entgegengesetzt gerichteten Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene unter Beibehaltung eines einstellbaren Abstands von Objektiv und Kondensor erreicht wird.It is advantageously provided that the coupled movement of lens and condenser is synchronous so that with each same Fokussierhüben a given object plane is reached, or the coupled movement of the object and condenser is reversed synchronously so that with the same size but opposite directed focusing strokes a predetermined object level is achieved while maintaining an adjustable distance from the lens and condenser.
Ebenso ist bevorzugt vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekt und Kondensor unter Berücksichtigung unterschiedlicher Brechungsmedien zwischen Objekt und Objektiv einerseits und Objekt und Kondensor andererseits mit unterschiedlichen Fokussierhüben erfolgt . Das ist beispielsweise dann vorgesehen, wenn sich das Objektiv oberhalb des Objekts in wässriger Lösung befindet, und der Kondensor unterhalb durch Luftabstand und Glasboden vom Objekt getrennt ist. Es müssen dann die Fokussierkennlinien von Objektiv und Kondensor mit in die Kopplung einbezogen werden.Likewise, it is preferably provided that the coupled movement of the objective and condenser or object and condenser taking into account different refractive media between object and lens on the one hand and object and condenser on the other hand with different Fokussierhüben. This is provided, for example, when the objective is above the object in aqueous solution, and the condenser is separated from the object below by air distance and glass bottom. Then the focusing characteristics of lens and condenser must be included in the coupling.
Alternativ ist vorgesehen, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekt und Kondensor bei gleichen Brechungswerten unter- und oberhalb des Objektes so erfolgt, dass die unterschiedlichen Fokustiefen des Kondensors und des Objektivs innerhalb des Objektes berücksichtigt werden.Alternatively, it is provided that the coupled movement of objective and condenser or object and condenser at the same refraction values below and above the object takes place in such a way that the different focal depths of the condenser and of the objective within the object are taken into account.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung einer gekoppelte Fokussierbewegung des Objektivs und des Kondensors oder des zu untersuchenden Objektes und des Kondensors auf beliebige Objektebenen innerhalb des zu untersuchenden Objektes wird eine Anordnung vorgeschlagen, mittels der unter Berücksichtigung von Brechungsindices, Probendicke und Fokustiefe innerhalb des Objektes die gekoppelte Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs und des Kondensors oder des Objektes und des Kondensors jederzeit optimale Bedingungen für die Beleuchtung und Detektion gewährleistet sind, wobei ein ausreichender und konstanter Abstand zwischen Objektiv und Kondensor beim Fokussieren durch dicke Proben durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung oder durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objektivbewegung vorgesehen ist.To carry out the method according to the invention for producing a coupled focusing movement of the objective and the condenser or the object to be examined and of the condenser to arbitrary object planes within the object to be examined, an arrangement is proposed by means of which, taking into account refractive indices, specimen thickness and depth of focus within the object coupled focusing movement to focus the lens and the condenser or the object and the condenser at any time optimal conditions for lighting and Detection are ensured, with a sufficient and constant distance between the lens and condenser when focusing by thick samples by decoupling the condenser movement is provided by the object table movement or by decoupling the condenser movement of the lens movement.
Diese Entkopplung betrifft vor allem aufrechte Mikroskope, bei denen das Objekt allgemein durch Anheben und Absenken des Objekttisches durch den Fokus des Objektivs bewegt wird. Der Objekttisch mit dem zu untersuchenden Objekt und der Kondensor können in der Regel separat eingestellt werden. Sie bewegen sich bei diesen Mikroskopen dann aber normalerweise gleichsinnig, da die Kondensorträgermechanik am Tischträger angebracht ist. Die Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung gewährleistet, dass der Kondensor und das Objektiv jeweils auf dieselbe Objektebene innerhalb des Objektes fokussiert werden .This decoupling concerns above all upright microscopes, in which the object is generally moved by raising and lowering the object table through the focus of the objective. The object table with the object to be examined and the condenser can usually be set separately. However, they usually move in the same direction in these microscopes because the Kondensorträgermechanik is attached to the stage carrier. The decoupling of the condenser movement from the object stage movement ensures that the condenser and the objective are each focused on the same object plane within the object.
Eine besonders einfache Ausführung der erfindungsgemäßen Anordnung insbesondere beim Fokussieren durch dicke Proben besteht darin, dass bei aufrechten Mikroskopen ohne Motorisierung zur Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung bzw. der Objektivbewegung bei Mikroskopen vom Typ Fixed Stage eine in die Objekttischführung bzw. in den Objektivträger bei Fixed Stage-Stativen integrierte Führung für den Kondensor vorgesehen ist, wobei die Führung mittels Federkraft gegen einen Anlagepunkt gedrückt und beim Absenken des Objekttisches mittels eines mechanischen Mitnehmers nach unten verschiebbar ist. Durch diese integrierte Führung wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch und Kondensor aufgehoben, so dass das Objektiv und der Kondensor beim Fokussieren durch dicke Proben immer den gleichen Abstand zueinander besitzen und gleichzeitig das Objekt durch die Feder geschützt ist.A particularly simple embodiment of the arrangement according to the invention, especially when focusing through thick samples is that in upright microscopes without motorization for decoupling the condenser movement of the stage movement or the lens movement with fixed-stage microscopes in the stage guide or in the lens carrier in Fixed Stage tripods integrated guide is provided for the condenser, wherein the guide is pressed by spring force against a contact point and when lowering the stage by means of a mechanical driver is displaced downwards. Through this integrated guide the fixed connection between the stage and the condenser is canceled, so that the lens and the condenser when focusing through thick samples always the have the same distance from each other and at the same time the object is protected by the spring.
Bevorzugt vorgesehen ist eine mechanische oder elektronische Kopplung der Fokussierbewegung von Objektiv und Kondensor oder Objekttisch und Kondensor. Die Kondensorfokussierung kann aber auch separat über die Bewegung des Kondensortriebs erfolgen. Zweckmäßigerweise erfolgt das Fokussieren motorisch. Kondensor- und Objektivträger werden dazu motorisch angetrieben.Preferably provided is a mechanical or electronic coupling of the focusing movement of the lens and condenser or stage and condenser. The condenser focusing can also be done separately via the movement of the condenser. Appropriately, the focusing is done by motor. Condenser and lens carriers are driven by a motor.
Weiterhin ist es zweckmäßig, einen Kondensor zu verwenden, bei dem das Leuchtfeldblendenbild im Unendlichen liegt. Dadurch ist gewährleistet, dass der Durchmesser der Leuchtfeldblende unabhängig von der fokussierten Ebene immer gleich ist und nicht angepasst werden muss. Kondensor und Objektiv sollten dazu über einen ausreichenden Arbeitsabstand verfügen, um sicher jede Ebene innerhalb eines dicken Objekts anzufahren.Furthermore, it is expedient to use a condenser, in which the field-of-view is at infinity. This ensures that the diameter of the field diaphragm irrespective of the focused plane is always the same and does not need to be adjusted. The condenser and lens should have sufficient working distance to safely approach each plane within a thick object.
Werden in der Multiphotonenmikroskopie die Signale unterhalb des Kondensors über eine Photonensammeloptik auf einen Detektor ausgekoppelt, ist es vorteilhaft, eine Auskoppeleinrichtung vorzusehen und sie fest mit dem beweglichen Kondensorträger zu verbinden, um verlustfreie Signale in jeder Kondensorposition zu erhalten, so dass damit unabhängig von der Kondensorfokussierung die gleichen optischen Bedingungen hinsichtlich der Signalausbeute vorliegen.If in multiphoton microscopy the signals are coupled out below the condenser to a detector via a photon collection optics, it is advantageous to provide a decoupling device and firmly connect it to the movable condenser carrier in order to obtain lossless signals in each condenser position, thus independent of the condenser focusing the same optical conditions exist with regard to the signal yield.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines schematisch in Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispieles näher erläutert . Es zeigen :The invention will be explained in more detail with reference to an embodiment schematically illustrated in drawings. Show it :
Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel für Fixed Stage- Mikroskope;1 shows an exemplary embodiment of fixed-stage microscopes;
Fig. 2 ein Ausführungsbeispiel für aufrechte Mikroskope;FIG. 2 shows an embodiment of upright microscopes; FIG.
Fig. 3 eine Verlagerung der Objektebene bei Fixed Stage- Mikroskopen,-3 shows a displacement of the object plane in fixed-stage microscopes,
Fig. 4 eine Verlagerung der Objektebene bei aufrechten Mikroskopen;4 shows a displacement of the object plane in upright microscopes;
Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel einer Einrichtung zum Nachführen des Kondensors bei aufrechten Mikroskopen;5 shows an embodiment of a device for tracking the condenser in upright microscopes.
Fig. 6 eine Führung zur Bewegung des Kondensors in Vorderansicht ;Fig. 6 is a guide for moving the condenser in front view;
Fig. 7 die Führung zur Bewegung des Kondensors in Draufsicht .Fig. 7 shows the guide to the movement of the condenser in plan view.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren und eine Anordnung zum Fokussieren von Objektiven 2, Objekten 1 und Kondensoren 5 für unterschiedliche Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv 2 und der Kondensor 5 fokussierbar sind, wobei das zu untersuchende Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7 angeordnet ist (Fixed Stage- Mikroskope und inverse Mikroskope) oder das Objekt 1 und der Kondensor 5 fokussierbar sind (aufrechte Mikroskope) und das Objekt 1 in Z-Richtung bewegt wird. Im ersten Fall liegt das Objekt 1 auf einem festen Objekttisch 7, wie das bei Fixed Stage-Mikroskopen und inversen Mikroskopen der Fall ist, im zweiten Fall wird das Objekt 1, wie bei aufrechten Mikroskopen, in Z-Richtung bewegt .The present invention includes a method and an arrangement for focusing objectives 2, objects 1 and condensers 5 for different types of microscope, in which either the objective 2 and the condenser 5 can be focused, wherein the object 1 to be examined is arranged on a fixed stage 7 (Fixed Stage microscopes and inverse microscopes) or the object 1 and the condenser 5 are focusable (upright microscopes) and the object 1 is moved in the Z direction. In the first case, the object 1 lies on a fixed object table 7, as is the case with fixed-stage microscopes and inverted microscopes, in the second case the object 1 is moved in the Z-direction, as in the case of upright microscopes.
In den Figuren 1 und 2 ist die Situation bei Fixed Stage- Mikroskopen schematisch dargestellt. Das Objekt 1, ein Präparat, liegt auf dem festen, nicht näher dargestellten, bekannten Objekttisch 7 und wird durch das Objektiv 2 abgebildet. Dazu wird das Objektiv 2 auf eine jeweils zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert, d.h. die Objektebene 3 wird in einen Fokus 4 des Objektivs 2 eingebracht. Der Kondensor 5 wird mit seinem Fokus 6 zur Optimierung der Beleuchtung ebenfalls auf die zu betrachtende Objektebene 3 fokussiert . Die gleiche Situation gilt auch für inverse Mikroskope. Bei inversen Mikroskopen sind lediglich die Positionen von Objektiv 2 und Kondensor 5 vertauscht. In den Figuren 3 und 4 ist die Situation bei aufrechten Mikroskopen schematisch dargestellt. Das Objekt 1 wird bei aufrechten Mikroskopen in Z-Richtung bewegt. Unterschiedliche Brechungsindices von Objekt 1 und den umgebenden Medien sind nicht berücksichtigt, so dass die tatsächliche Situation noch erheblich ungünstiger ist. Wenn bei Fixed Stage-Mikroskopen oder bei inversen Mikroskopen das Objektiv 1 bewegt und damit der Fokus 4 des Objektivs 2 innerhalb des Objektes 1 verschoben wird, ohne dass der Kondensor 5 nachgeführt und damit auf die Objektebene 3 fokussiert wird, sind Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal aufeinander abgestimmt (Figur 2) . Vergleichbares gilt bei aufrechten Mikroskopen (Figur 4) . Durch Bewegung des Objektes 1 verschiebt sich die Lage des Fokus 4 innerhalb des Objektes 1. Ohne gegenläufige Bewegungen des Kondensors 5 sind der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nicht mehr optimal aufeinander abgestimmt.FIGS. 1 and 2 schematically illustrate the situation with fixed-stage microscopes. The object 1, a preparation, lies on the fixed, not shown, known object table 7 and is imaged by the lens 2. For this purpose, the objective 2 is focused on a respective object plane 3 to be considered, ie the object plane 3 is introduced into a focus 4 of the objective 2. The condenser 5 is also focused with its focus 6 for optimizing the illumination on the object plane 3 to be considered. The same situation applies to inverse microscopes. For inverse microscopes, only the positions of objective 2 and condenser 5 are reversed. In Figures 3 and 4, the situation is shown schematically for upright microscopes. The object 1 is moved in upright microscopes in the Z direction. Different refractive indices of object 1 and the surrounding media are not taken into account, so that the actual situation is considerably less favorable. In the case of fixed-stage microscopes or inverse microscopes, when the objective 1 is moved and the focus 4 of the objective 2 is displaced within the object 1 without the condenser 5 being tracked and thus focused on the object plane 3, illumination and imaging beam paths are not more optimally matched to each other (Figure 2). The same applies to upright microscopes (FIG. 4). By moving the object 1, the position of the focus 4 shifts within the object 1. Without opposite movements of the condenser 5 of the illumination and imaging beam path are no longer optimally matched.
Die Figuren 5, 6 und 7 zeigen ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem für aufrechte Mikroskope ohne Motorisierung sichergestellt wird, dass das Objektiv 2 und der Kondensor 5 auch beim Fokussieren durch dicke Objekte 1 immer den gleichen Abstand zueinander besitzen. Diese Anordnung ist für die wachsende Zahl von Anwendungen gedacht, bei denen Durchlichtbildstapel einer Deconvolution unterzogen werden sollen. Hierfür sind eine definierte Position des Kondensors 5 und damit eine konstante Beleuchtungsapertur erforderlich .Figures 5, 6 and 7 show an embodiment of an arrangement for carrying out the method according to the invention, is ensured for upright microscopes without motorization that the lens 2 and the condenser 5 always have the same distance when focusing through thick objects 1. This arrangement is intended for the growing number of applications in which transmitted light image stacks are to undergo deconvolution. For this purpose, a defined position of the condenser 5 and thus a constant illumination aperture are required.
Um den Abstand zwischen Kondensor 5 und Objektiv 2 konstant zu halten, wird die feste Verbindung zwischen Objekttisch 7 und Kondensor 5 aufgehoben. Der Kondensor 5 ist an einem Kondensorträger 8 befestigt, der mittels einer Führung 9, vorzugsweise einer Wälzführung, an einem Tischträger 10 auf und ab bewegt wird, vorzugsweise durch ein Zahnstangengetriebe 11. Die Führung 9 für den Kondensor 5 ist dabei so in die den Tischträger 10 integriert, dass sich ein geführtes Teil 13 auf Wälzkörpern 12 entlang des Tischträgers 10 bewegt. Die Führung 9 wird durch eine Feder 14, die sich an einer Grundplatte 15 des Mikroskops abstützt, gegen eine definierte Anlage 16 nach oben gedrückt. Entlang der Führung 9 bleibt der Kondensor 5 nach wie vor durch das Zahnstangengetriebe 11 fokussierbar . Bei Fokussierung des Objekttisches 7 bewegt sich der Kondensor 5 aber nicht mit, so dass der Abstand zum Objektiv 2 und Kondensor 5 erhalten bleibt. Durch die Feder 14 wird das Objekt 1 geschützt. Wenn der Objekttisch 7 so weit abgesenkt wird, dass die Optik des Kondensors 5 gegen das Objekt 1 drückt, wird der Kondensor 5 gegen den Druck der Feder 14 durch einen mechanischen Mitnehmer 17 nach unten gedrückt .In order to keep the distance between the condenser 5 and lens 2 constant, the fixed connection between the stage 7 and the condenser 5 is canceled. The condenser 5 is fixed to a condenser carrier 8, which is moved by means of a guide 9, preferably a roller guide on a table support 10 up and down, preferably by a rack gear 11. The guide 9 for the condenser 5 is so in the table support Integrated that moves a guided part 13 on rolling elements 12 along the table support 10. The guide 9 is pressed by a spring 14, which is supported on a base plate 15 of the microscope, against a defined system 16 upwards. Along the guide 9, the condenser 5 remains focused by the rack gear 11 as before. When focusing the object table 7, the condenser 5 but does not move, so that the distance to the lens 2 and condenser 5 is maintained. By the spring 14, the object 1 is protected. When the stage 7 is lowered so far that the optics of the condenser 5 against the Object 1 presses, the condenser 5 is pressed against the pressure of the spring 14 by a mechanical driver 17 down.
Die Erfindung beschränkt sich nicht auf das Ausführungsbeispiel, die Anordnung zur Durchführung des Verfahrens ist variabel und kann durch unterschiedliche Bewegungsmechanismen realisiert werden. The invention is not limited to the embodiment, the arrangement for carrying out the method is variable and can be realized by different movement mechanisms.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
1 Objekt1 object
2 Objektiv2 lens
3 Objektebene3 object level
4 Fokus des Objektivs4 Focus of the lens
5 Kondensor5 condenser
6 Fokus des Kondensors6 Focus of the condenser
7 Objekttisch7 stage
8 Kondensorträger8 condenser carrier
9 Führung für Kondensor9 Guide for condenser
10 Tischträger10 table carriers
11 Zahnstangengetriebe11 rack and pinion gear
12 Wälzkörper12 rolling elements
13 geführtes Teil13 guided part
14 Feder14 spring
15 Grundplatte15 base plate
16 Anlage16 attachment
17 Mitnehmer 17 drivers

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Fokussieren von Objektiven, Objekten und Kondensoren bei unterschiedlichen Mikroskoparten, bei denen entweder das Objektiv und der Kondensor fokussierbar sind und das zu untersuchende Objekt auf einem festen Objekttisch angeordnet ist, oder das zu untersuchende Objekt und der Kondensor fokussierbar sind und das zu untersuchende Objekt in Z-Richtung bewegt wird, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine gekoppelte Fokussierbewegung eines Objektivs (2) und eines Kondensor (5) oder eines zu untersuchenden Objektes (1) und des Kondensors (5) auf eine Objektebene (3) innerhalb des zu untersuchenden Objektes (1), dessen axiale Ausdehnung ein Vielfaches der Tiefenschärfe des Objektivs (2) beträgt, ein Fokus1. A method for focusing lenses, objects and condensers in different types of microscope, in which either the lens and the condenser are focused and the object to be examined is arranged on a solid stage, or the object to be examined and the condenser are focused and that moving object in Z-direction, characterized in that by a coupled focusing movement of a lens (2) and a condenser (5) or an object to be examined (1) and the condenser (5) on an object plane (3) within the object to be examined (1) whose axial extent is a multiple of the depth of field of the objective (2), a focus
(4) des Objektivs (2) und ein Fokus (6) des Kondensors(4) of the objective (2) and a focus (6) of the condenser
(5) stets in der zu betrachtenden Objektebene (3) des zu untersuchenden Objektes (1) liegen, so dass Objektdetails in allen Objektebenen (3) des Objektes(5) always lie in the object plane (3) of the object to be examined (1), so that object details in all object planes (3) of the object
(1) beleuchtet und gleichzeitig der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang aufeinander abgestimmt sind.(1) illuminated and at the same time the illumination and imaging beam path are matched.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv (2) und Kondensor (5) synchron so erfolgt, dass mit jeweils gleichen Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene2. The method according to claim 1, characterized in that the coupled movement of the lens (2) and condenser (5) takes place synchronously so that each with the same Fokussierhüben a given object plane
(3) erreicht wird.(3) is achieved.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Bewegung von Objekt (1) und Kondensor (5) entgegengesetzt synchron so erfolgt, dass mit jeweils gleich großen aber entgegengesetzt gerichteten Fokussierhüben eine vorgegebene Objektebene (3) unter Beibehaltung eines einstellbaren Abstands von Objektiv (2) und Kondensor (5) erreicht wird .3. The method according to claim 1, characterized in that the coupled movement of the object (1) and condenser (5) opposite synchronously takes place so that with the same size but opposite directed focusing strokes a predetermined object plane (3) while maintaining an adjustable distance of the lens (2) and condenser (5) is achieved.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv (2) und Kondensor (5) oder Objekt (1) und Kondensor (5) unter Berücksichtigung unterschiedlicher Brechungsmedien zwischen Objektiv (2) und Kondensor (5) einerseits und Objekt (1) und Kondensor (5) anderseits mit unterschiedlichen Fokussierhüben erfolgt.4. The method according to claim 1, characterized in that the coupled movement of the lens (2) and condenser (5) or object (1) and condenser (5) taking into account different refractive media between the lens (2) and condenser (5) on the one hand and Object (1) and condenser (5) on the other hand done with different Fokussierhüben.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Bewegung von Objektiv (2) und Kondensor (5) oder Objekt (1) und Kondensor (5) bei gleichen Brechungswerten unter- und oberhalb des Objektes (1) so erfolgt, dass die unterschiedlichen Fokustiefen des Kondensors (5) und des Objektivs (2) innerhalb des Objektes (1) berücksichtigt werden.5. The method according to claim 1, characterized in that the coupled movement of the objective (2) and condenser (5) or object (1) and condenser (5) at the same refraction values below and above the object (1) is such that the different focal depths of the condenser (5) and the objective (2) within the object (1) are taken into account.
6. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zum6. Arrangement for carrying out the method for
Fokussieren des Objektivs (2) und des Kondensors (5) oder des Objektes (1) und des Kondensors (5) auf beliebige Objektebenen (3) innerhalb eines zu untersuchenden Objektes (1), dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelten Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs (2) und des Kondensors (5) oder des Objektes (1) und des Kondensors (5) bei unterschiedlichen Mikroskoparten entweder durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung oder durch eine Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objektivbewegung vorgesehen ist, unter Berücksichtigung von Brechungsindices, Probendicke und Fokustiefe innerhalb des Objektes (1), und wobei für das Objektiv (2) und den Kondensor (5) beim Fokussieren durch dicke Proben immer ein konstanter Abstand zueinander bei gleichzeitigem Schutz des Objektes (1) vorgesehen ist.Focusing the objective (2) and the condenser (5) or the object (1) and the condenser (5) on any object planes (3) within an object to be examined (1), characterized in that the coupled focusing movement for focusing the lens (2) and the condenser (5) or the object (1) and the condenser (5) provided for different types of microscope either by decoupling the condenser movement of the object stage movement or by decoupling the condenser movement of the lens movement is, taking into account refractive indices, sample thickness and depth of focus within the object (1), and wherein for the lens (2) and the condenser (5) when focusing through thick samples always a constant distance to each other while protecting the object (1) is.
7. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs (2) und des Kondensors (5) oder des Objektes (1) und des Kondensors (5) elektronisch erfolgt .7. Arrangement according to claim 6, characterized in that the coupled focusing movement for focusing the lens (2) and the condenser (5) or the object (1) and the condenser (5) takes place electronically.
8. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die gekoppelte Fokussierbewegung zum Fokussieren des Objektivs (2) und des Kondensors (5) oder Objektes8. Arrangement according to claim 6, characterized in that the coupled focusing movement for focusing the lens (2) and the condenser (5) or object
(1) und des Kondensors (5) motorisch erfolgt.(1) and the condenser (5) is motorized.
9. Anordnung nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussierung des Kondensors9. Arrangement according to claim 6 to 8, characterized in that the focusing of the condenser
(5) über eine Bewegung des Kondensortriebs erfolgt.(5) via a movement of the condenser drive.
10. Anordnung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei Mikroskopen ohne Motorisierung beim Fokussieren durch dicke Proben zur Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objekttischbewegung oder der Entkopplung der Kondensorbewegung von der Objektivbewegung eine integrierte Führung (9) für den Kondensor (5) zur Aufhebung der festen Verbindung zwischen einem Objekttisch (7) und dem Kondensor (5) vorgesehen ist. 10. Arrangement according to one of claims 6 to 9, characterized in that in microscopes without motorization when focusing by thick samples for decoupling the condenser movement of the stage motion or the decoupling of the condenser movement of the lens movement an integrated guide (9) for the condenser (5 ) is provided for canceling the fixed connection between a stage (7) and the condenser (5).
11. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die integrierte Führung11. Arrangement according to one of claims 1 to 10, characterized in that the integrated guide
(9) für den Kondensor (5) mit einem Tischträger (10) eines Mikroskops verbunden ist, wobei die Führung (9) mittels eines Federelements (14) gegen eine Anlage (16) nach oben drückt und beim Absenken des Objekttisches (7) mittels eines mechanischen Mitnehmers (17) nach unten verschiebbar ist.(9) for the condenser (5) is connected to a table support (10) of a microscope, wherein the guide (9) by means of a spring element (14) against a system (16) pushes upwards and when lowering the object table (7) a mechanical driver (17) is displaceable downwards.
12. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise ein Kondensor (5) vorgesehen ist, dessen Leuchtfeldblendenbild im Unendlichen liegt.12. Arrangement according to one of claims 1 to 11, characterized in that preferably a condenser (5) is provided, the field light aperture image is at infinity.
13. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Multiphotonenmikroskopie eine Auskoppeleinrichtung fest mit einem beweglichen Kondensorträger (8) verbunden ist, wobei unabhängig von der Fokussierung des Kondensors (5) die gleichen optischen Bedingungen bezüglich der Signalausbeute vorliegen. 13. Arrangement according to claim 6, characterized in that for the Multiphotonenmikroskopie a decoupling device is fixedly connected to a movable condenser carrier (8), regardless of the focusing of the condenser (5) the same optical conditions with respect to the signal yield.
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