WO2015071359A1

WO2015071359A1 - Mikroskopische abbildungseinrichtung

Info

Publication number: WO2015071359A1
Application number: PCT/EP2014/074485
Authority: WO
Inventors: Artur Degen; Matthias Wald; Lars-Christian Wittig; David Shafer
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2015-05-21
Also published as: DE102013112601A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine mikroskopische Abbildungseinrichtung mit einem Objektiv (7), das durch eine transparente Abdeckung hindurch auf einen abzubildenden Bereich einer Probe (1) gerichtet ist, insbesondere einer in einem Probenbehälter (3) befindlichen und von einem Immersionsmedium (2) umschlossenen Probe (1), wobei der Strahlengang die transparente Abdeckung, mindestens eine Wandungen des Probenbehälters (3) und das Immersionsmedium (2) durchdringt. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine mikroskopische Abbildungseinrichtung der genannten Art so weiterzubilden, dass sowohl bei senkrechter als auch schräger Durchstrahlung einer Probenbehälterwandung oder der transparenten Abdeckung Änderungen der Dicke oder Änderungen der Brechzahl der zu durchdringenden Medien oder des Immersionsmediums (2} schon während der Probenbeobachtung ausgeglichen werden. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass im Strahlengang der mikroskopischen Abbildungseinrichtung zwischen der Probe (1) und dem Objektiv (7) Mittel zur Kompensation von Abbildungsfehlern schon während der Probenbeobachtung vorgesehen sind, welche die beschriebenen Ursachen haben.

Description

Mikroskopische Abbiidunqseinrichtung

Die Erfindung bezieht sich auf eine mikroskopische Abbildungseinrichtung mit einem Objektiv, das durch eine transparente Abdeckung hindurch auf einen abzubildenden Bereich einer Probe gerichtet ist. Vorzugsweise befindet sich die Probe in einem Probenbehälter und ist von einem Immersionsmedium umschlossenen, wobei der Strahlengang die transparente Abdeckung, das Immersionsmedium und gegebenenfalls eine Wandung des Probenbehälters und durchdringt.

Nach Stand der Technik sind Abbildungseinrichtungen dieser Art mit sehr gut auf unendlich korrigierten Objektiven ausgestattet und bieten eine gute Abbildungsqualität. Nachteilig dabei ist jedoch, dass die Abbildungsqualität sehr empfindlich auf Veränderungen der optischen Bedingungen im Probenraum reagiert, wie zum Beispiel Änderungen der Dicke der zu durchdringenden Fenster oder Änderungen der Brechzahl des Fenstermaterials und des Immersionsmediums, insbesondere in Abhängigkeit von Temperatureinflüssen. Diese Empfindlichkeit besteht vor allem bei objektseitig sehr hoher numerischer Apertur, wie z.B. NA 1.2 in Wasser.

Infolge der stets wachsenden Anforderungen an die Abbildungsquaütät bei mikroskopischen Abbildungseinrichtungen der beschriebenen Kategorie besteht das Bedürfnis, Abbildungsfehler, die aus den genannten Gründen während der Probenbeobachtung entstehen, zeitgleich oder zumindest zeitnah mit ihrer Entstehung zu kompensieren. Bei diesbezüglich bisher bekannten Kompensationsmitteln erfolgt der Ausgleich von Veränderungen im Probenraum, die solche Abbildungsfehler bzw. Aberrationen zur Folge haben, durch axiale Verschiebung und / oder radiale Drehung von einer oder mehreren in das Objektiv integrierten Korrekturlinsen oder Korrekturlinsengruppen.

Ein Beispiel dafür ist in DE 43 23 721 C2 veröffentlicht. Hier weist ein Mikroskopobjektiv mehrere Linsengruppenfassungen auf, von denen eine als Korrekturfassung zur Anpassung an unterschiedliche Deckglasdicken ausgebildet ist. Diese Korrekturfassung ist zwischen relativ zu den anderen Linsengruppenfassungen axial verschiebbar und um die optische Achse des Mikroskopobjektivs verdrehbar angeordnet. Das Verschieben in axialer Richtung erfolgt zwecks Ausgleichs sich verändernder Deckglasdicken, die Drehung soll Verkippungen beim Verschieben vermeiden bzw. ausgleichen. Bekannt ist weiterhin, die Verschiebung der Korrekturfassungen in solchen Objektiven manuell oder motorisch auszulösen.

Eine manuell zu bedienende Vorrichtung zur Einstellung oder Justierung optischer Komponenten in einem Mikroskopobjektiv ist in DE 10 2007 002 863 B3 beschrieben. Dabei wird die per Hand vorgegebene Verstellkraft mit mechanischen Mitteln auf die optische Komponente übertragen.

Bei einer Vorrichtung zum Antreiben eines Korrekturrings nach US 7,593,173 B2 ist ein Drehkranz an einer Objektivlinse angebracht. Ist eine Verstellung der Linse erforderlich, wird die Drehkraft eines Motors auf den Korrekturring übertragen und damit die Position der Linse korrigierend verändert.

In US 2013/0094016 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die geeignet sind, sphärische Fehler eines Mikroskops-Abbildungsstrahlengangs bei der Abbildung einer Probe durch ein Deckglas hindurch zu erfassen. Dabei wird ein Meßstrahl durch das Objektiv auf die Probe gerichtet, der an einer Grenzfläche des Deckglases reflektierte Meßstrahl wird durch das Objektiv auf einen Detektor geleitet, der Intensitätsverlauf des Meßstrahles wird registriert und aus dem Intensitätsverlauf wird auf sphärische Abbildungsfehler geschlossen.

Insbesondere dann, wenn das Deckglas oder eine sonstige transparente Abdeckung schief durchstrahlt wird, der Hauptstrahl des Achsbündels also nicht parallel zur Flächennormalen der Abdeckung verläuft, werden durch Änderungen der Dicke der zu durchdringenden Medien zusätzlich auch Abbildungsfehler infoige unsymmetrischer Aberrationen verursacht, die sich mit den bisher bekannten Korrekturmitteln, nämlich durch axiale oder radiale Bewegungen von Linsen oder Linsengruppen im Objektiv, nicht kompensieren lassen.

Davon ausgehend besteht die Aufgabe der Erfindung darin, eine mikroskopische Abbildungseinrichtung der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass sowohl bei senkrechter als auch schräger Durchstrahlung der transparenten Abdeckung schon während der Probenbeobachtung Abbildungsfehler kompensiert werden, die ihre Ursache in Änderungen der optischen Bedingungen im Probenraum haben, wie Änderungen der Temperatur und damit Änderungen der Dicke und der Brechzahl der zu durchdringenden Medien.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass im Strahlengang der mikroskopischen Abbildungseinrichtung zwischen der Probe und dem Objektiv Mittel zur Kompensation solcher Abbildungsfehler vorgesehen sind, welche die vorbeschriebenen Ursachen haben. Die Kompensationsmittel umfassen optische Komponenten, die für den Beleuchtungs- oder Abbiidungsstrahlengang transparent sind und die zwei zu durchdringende Grenzflächen aufweisen, deren in Durchtrittsrichtung gemessener Abstand zueinander variierbar ist. Während einer Probenbeobachtung wird dieser Abstand in Abhängigkeit von auftretenden Abbildungsfehlern so eingestellt, dass diese Abbildungsfehler kompensiert werden. Die Brechzahl der optischen Komponenten ist mit der Brechzahl der sonstigen im Probenraum zu durchdringenden Medien entweder identisch oder weicht maximal um eine vorgegebene Toleranz, beispielsweise von 5%, davon ab.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Abbildungseinrichtung sind zwei keilförmige optische Komponenten vorgesehen, bei denen der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen durch Verschiebung von mindestens einer dieser Komponenten senkrecht zur Durchstrahlungsrichtung relativ der zur anderen veränderbar ist. Dabei sind die optischen Komponenten sinngemäß als zwei identische Keile so im Strahlengang aufeinander folgend angeordnet, dass die zu durchdringenden Grenzflächen den äußeren Grenzflächen einer planparallelen Platte entsprechen. In unterschiedlichen Ausgestaltungen kann vorgesehen sein, dass entweder nur ein Keil relativ zu dem anderen bewegt wird oder beide Keile in entgegengesetzter Richtung bewegt werden, um den Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen in Abhängigkeit von zu kompensierenden Abbildungsfehlern zu verändern. Vorteilhaft kann zwischen den Keilen eine Zwischenschicht aus einem flüssigen Medium vorgesehen sein, dessen Brechzahl der Brechzahl des Keilmediums entspricht oder maximal um eine Toleranz von 10% davon abweicht, so dass die Keile leicht gegeneinander beweglich sind. Dieses Medium kann insbesondere bei Numerischen Aperturen im Abbildungssystems im Bereich von 1 und >1 zugleich dazu dienen, das Auftreten von totalen inneren Reflexionen zu verhindern. Ein solches Medium kann beispielsweise Öl oder Wasser sein. Die Keilbewegung kann in unterschiedlichen Ausgestaltungen manuell oder auch motorisch ausgelöst werden. in einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Abbildungseinrichtung erfolgt die Komponentenverschiebung hydraulisch indem ein Druckmedium, vorzugsweise ein Öl, aus einem Reservoir zwischen die Komponenten gedrückt wird, so dass sich der Abstand der Komponenten und damit auch der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen zueinander vergrößert, oder umgekehrt das Druckmedium aus dem Komponentenzwischenraum in das Reservoir gesaugt wird, so dass sich der Abstand verringert. Die Brechzahl des Öls ist mit der Brechzahl der zu durchdringenden Medien identisch oder weicht lediglich um eine vorgegebene Toleranz davon ab. Im Rahmen der Erfindung liegt es dagegen auch, zur Verschiebung einer Komponente einen elektromechanischen Antrieb vorzusehen, etwa auf der Basis eines hochauflösenden Schrittmotors oder von Piezoelementen. In beiden dargestellten Fällen bilden die beiden optischen Komponenten aufgrund ihrer miteinander kommunizierenden Funktionsweise einen Kompensator zum Ausgleich von Abbildungsfehlern.

Vorteilhaft kann in drei weiteren unterschiedlichen Ausführungsformen der Erfindung vorgesehen sein, dass die optische Achse des Objektivs

zu der Flächennormaien der zu durchdringenden Grenzflächen parallel ausgerichtet ist, mit der Flächennormaien der zu durchdringenden Grenzflächen einen von Null verschiedenen Winkel 5 einschließt, oder

mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt und ein zusätzliches Korrekturelement vorgesehen ist.

Im vorgenannten ersten bewirken die oben beschriebenen Kompensationsmittel die Kompensation der Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen.

Im zweiten Fall werden wiederum die Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, mit den oben beschriebenen Kompensationsmitteln kompensiert. Mittel für eine Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehend, sind hier nicht vorgesehen. Diese Korrektur könnte beispielsweise außerhalb des Probenraumes mit einer entsprechend ausgelegten Abbildungsoptik vorgenommen werden.

Bei dem dritten Fall bewirken wiederum die erfindungsgemäßen Kompensatäonsmittel die Kompensation der Abbildungsfehler, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, während mit dem zusätzlichen Korrekturelement nun dafür gesorgt ist, dass die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehenden Aberrationen nun bereits im Probenraum korrigiert werden, und zwar je nach Ausgestaltung des Korrekturelementes entweder für eine bestimmte Objektebene oder für ein ganzes Objektvolumen.

Soll die Korrektur nur für eine bestimmte Objektebene vorgenommen werden, umfasst das Korrekturelement eine optische Baugruppe, die nur diese Objektebene abbildet und dabei zugleich die Aberrationen korrigiert, die aufgrund des schiefen Durchgangs bei der Abbildung der betreffenden Objektebene entstehen. Die Korrektur dieser Aberrationen ist mit mindestens einem sphärischen, asphärischen oder optischen Freiformelement vorgesehen. Sollen dagegen die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen für ein ganzes Objektvolumen korrigiert werden, umfasst das Korrekturelement eine optische Baugruppe, die das Objektvolumen abbildet und dabei zugleich die Aberrationen korrigiert, die aufgrund des schiefen Durchgangs bei der Abbildung des betreffenden Objektvolumens entstehen. Die Korrektur dieser Aberrationen ist ebenfalls mit mindestens einem sphärischen, asphärischen oder optischen Freiformelement vorgesehen. Eine Volumenabbildung erfolgt, wenn die Vergrößerung durch die optische Baugruppe die Bedingung =|n/n'| erfüllt, mit der Vergrößerung, n der Brechzahl des zu passierenden Mediums vor dem Korrekturelement und n' der Brechzahl des zu passierenden Mediums nach dem Korrekturelement. Eine solche Baugruppe wird in der Fachsprache als virtuelles Relay bezeichnet. in zwei weiteren Ausführungsformen

befindet sich die Probe in einem Probenbehälter, das mit einem Deckglas abgedeckt ist, durch das hindurch die Probe abzubilden ist, und die Kompensationsmittel sind zwischen dem Deckglas und dem Objektiv angeordnet, oder

die Probe befindet sich in einem Probenbehälter, die Kompensationsmittel sind als Abdeckung des Probenbehälters ausgebildet und die Abbildung der Probe ist durch die Kom ensationsmittel hindurch vorgesehen.

In der ersten der vorgenannten Ausführungsformen wird eine Abweichung der Deckglasdicke durch eine Änderung der Dicke des Kompensators mit gleichem Betrag, aber umgekehrtem Vorzeichen kompensiert, so dass die Gesamtdicke von Deckglas und Kompensator wieder dem vorgegebenen optischen Designweri entspricht. In beiden Ausführungsformen ist es vorteilhaft, ein für die Dicke des Paketes aus Deckglas und Kompensator bzw. für die Dicke des Kompensators korrigiertes Objektiv zu verwenden.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße Abbildungseinrichiung entweder ausgebildet sein

zur Lichtmikroskopie, wobei eine Beleuchtungsoptik zur Beleuchtung der Probe mit einem rotationssymmetrisch um die optische Achse der Beleuchtungsoptik ausgebreiteten Strahlengang im Auflicht oder Durchlicht vorgesehen ist, oder zur Lichtblattmikroskopie, umfassend eine Beleuchtungsoptik zur Beleuchtung der Probe im Aufiicht mit einem Lichtblatt, das mit der optischen Achse der Beleuchtungsoptik in einer Ebene liegt, wobei die Beleuchtungsoptik und das Objektiv in Schwerkraftrichtung gesehen unterhalb des Probenbehälters angeordnet sind.

Als Immersionsflüssigkeit kann Wasser, als Material für die zu durchdringende Probenbehälterwandung, für das Deckglas und / oder für die optischen Komponenten des Kompensators kann ein optisches Glas, PTFE, CYTOP^®, FEP, Teflon^® AF oder ein Polymer vorgesehen sein. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung kann die erfindungsgemäße Abbildungseinrichtung eine Regeleinrichtung zur Variation des Abstandes der zu durchdringenden Grenzflächen der optischen Komponenten in Abhängigkeit von Abbildungsfehlern umfassen, die während der Probenbeobachtung aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien auftreten, so dass diese automatisch zeitnah zu ihrer Entstehung kompensiert werden. Dabei werden die Abbildungsfehler messtechnisch erfasst, aus dem Messergebnis wird eine Stellgröße ermittelt, und unter Vorgabe dieser Stellgröße wird die automatische Korrektur durch Veränderung des Abstandes der zu durchdringenden Grenzflächen der optischen Komponenten veranlasst. Regeleinrichtungen an sich sind prinzipiell aus dem Stand der Technik bekannt und müssen deshalb an dieser Stelle nicht näher erläutert werden.

In einer erweiterten Ausführungsform kann eine Einrichtung zum Ausgleichen eines Keilfehlers des Deckglases vorgesehen sein, wobei als Keitfehler des Deckglases eine Parallelitätsabweichung zwischen einer Normalen der erste Fläche zu der Normalen der zweite Fläche des Deckglases verstanden werden soll. Diesbezüglich können erfindungsgemäß der Kompensator bzw. die zu durchdringenden Grenzflächen des Kompensators mit einer dem Keilfehler des Deckglases entgegengesetzten Keilneigung versehen sein.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne dass der Umfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren können, noch näher erläutert. Es zeigen:

Fig.1 ein Beispiel einer Einrichtung nach Stand der Technik des Sachgebietes, dem die vorbeschriebene Erfindung zuzuordnen ist,

Fig.2 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Einrichtung mit zwei keilförmigen optischen Komponenten als Kompensator und einem Deckglas,

Fig.3 ein Ausführungsbeispiel mit zwei keilförmigen optischen Komponenten als

Kompensator ohne Deckglas,

Fig.4 ein Ausführungsbeispiel mit zwei planparallelen optischen Komponenten als

Kompensator und einem Deckglas,

Fig.5 ein Ausführungsbeispiel mit zwei planparallelen optischen Komponenten als

Kompensator ohne Deckglas, Fig.6 ein Ausführungsbeispiel eines Kompensators mit zwei keilförmigen optischen

Komponenten und einem zusätzlichen Korrekturelement,

Fig.7 ein Ausführungsbeispiel eines Kompensators mit zwei planparallelen optischen

Komponenten und einem zusätzlichen Korrektureiement,

Fig.8 ein Ausführungsbeispiel mit Auflichtbeleuchtung bei inversem Mikroskopaufbau.

In Fig.1 ist der Stand der Technik zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung darstellt. Wie hieraus ersichtlich, befindet sich eine Probe 1 , in eine Immersionsflüssigkeit 2 eingebettet, innerhalb eines Probenbehälters 3. Der mit einem Deckglas 4 abgedeckte Probenbehälter 3 ist auf einem Probentisch 5 abgelegt. Die Beleuchtung der Probe 1 erfolgt mittels eines Beleuchtungsobjektivs 6, hier beispielsweise im Durchlichtverfahren. Der Übersichtlichkeit halber ist von der Abbildungseinrichtung lediglich noch das Objektiv 7 dargestellt. Zum Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, gehören vergleichbare Anordnungen, bei denen die Probe 1 nicht in einem Probenbehälter 3 abgelegt, sondern lediglich mit einem Deckglas 4 abdeckt ist.

Das vom Beleuchtungsobjektiv 6 kommende Beleuchtungslicht gelangt durch ein für die betreffende Wellenlänge transparentes Fenster im Boden des Probenbehälters 3 hindurch in die Probe 1. Die Detektion und Abbildung eines interessierenden Probenbereiches erfolgt mittels des Objektivs 7 durch das Deckglas 4 hindurch.

Ändern sich während der Probenbeobachtung die Deckglasdicke und/oder die Brechzahlen der zu durchdringenden Medien, so hat dies Abbildungsfehler zur Folge. Das trifft sowohl dann zu, wenn die optische Achse 9 des Objektivs 7 mit der Flächennormalen des Deckglases 4 identisch ist oder parallel dazu verläuft, besonders aber auch bei schräger Beobachtung der Probe 1 mit einem (gestrichelt dargestellten) Objektiv 10, wobei dessen optische Achse 11 mit der Flächennormalen des Deckglases 4 einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt. Treten im ersten Fall vorwiegend symmetrische, d.h. sphärische und höher sphärische Aberrationen auf, kommt es bei schräger Beobachtung zusätzlich auch zu unsymmetrischen Aberrationen, wie Koma und Astigmatismus.

Um dem abzuhelfen, ist erfindungsgemäß folgendes vorgesehen. In den zur Erläuterung dienenden Zeichnungen Fig.2 bis Fig.8 werden aus Gründen der Übersichtlichkeit für identische oder vergleichbare Baugruppen auch dieselben Bezugszeichen wie in Fig.1 verwendet.

In der in Fig.2 beispielhaft dargestellten Ausführungsform der Erfindung sind im Unterschied zum Stand der Technik im Strahlengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7 Kompensationsmittel in Form zweier keilförmiger optischer Komponenten 12 und 13 vorhanden, bei denen der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen 14 und 15 durch Verschiebung der Komponente 13 senkrecht zur Flächennormalen des Deckglases 4 relativ der zur Komponente 12 veränderbar ist. Die Abstandänderung ergibt sich aus der Keilform beider Komponenten 12 und 13.

Die Komponenten 12 und 13 bestehen aus einem Material oder weisen zumindest ein Fenster auf, das für den Abbildungsstrahlengang transparent ist, wobei dessen Brechzahl mit der Brechzahl des Matertals identisch ist oder maximal um eine vorgegebene Toleranz davon abweicht, aus dem das Deckglas 4 gefertigt ist. So kann für die Komponenten 12 und 13 und für das Deckglas 4 zum Beispiel D263M, also ein farbloses Borosilikatglas mit extrem geringem Eisengehalt, vorgesehen sein.

Das optische Design dieser Anordnung sieht für das Deckglas 4 eine Dicke d1 vor, und bezüglich der Grenzflächen 14 und 15 einen Abstand d2. Das Paket aus dem Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 hat damit eine Höhe d = d1 + d2.

Kommt es im Probenraum während der Probenbeobachtung zu Temperaturänderungen, ändern sich aufgrund ihrer Temperaturabhängigkeit die Dicken und die Brechzahlen von durchstrahlten Medien, und es treten Abbildungsfehler bzw. Aberrationen auf.

Vergrößert sich die Dicke d1 des Deckglases 4 um einen Betrag Ad und führt diese Deckglasvergrößerung zu Abbildungsfehlern, wird die Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 soweit verschoben, bis der Abstand d2 der Grenzflächen 14 und 15 voneinander um den Betrag Ad verringert ist, so dass im Ergebnis der Verschiebung das Paket aus Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 wieder die ursprünglich vorgegebene Höhe d hat und damit die Ursache für Entstehung dieser Abbildungsfehler behoben ist.

Etwaige Veränderungen der Höhe d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 12 und 13, werden ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 so ausgeglichen, dass die Höhe d konstant ihren vorgegeben Designwert behält bzw. diesen zeitnah wieder einnimmt.

Änderungen der Brechzahlen der durchstrahlten Medien können, insbesondere bei der Lichtmikroskopie, sphärische Aberrationen zur Folge haben. Erfindungsgemäß werden die daraus resultierenden Abbildungsfehler - zumindest in erster Näherung - durch Variation der Höhe d des Paketes aus Deckglas 4 und den Komponenten 12 und 13 kompensiert.

Um die Gleitreibung zwischen den Komponenten 12 und 13 möglichst gering zu halten und, insbesondere bei Numerischen Aperturen des Abbildungssystems im Bereich von 1 bis >1 , das Auftreten von totalen inneren Reflexionen zu verhindern, ist eine Zwischenschicht 16 aus einem flüssigen Medium vorhanden, beispielweise Wasser oder Öl, wobei dessen Brechzahl der Brechzahl des Keilmediums entspricht oder maximal um eine Toleranz von 10% davon abweicht.

Vom Umfang der Erfindung eingeschlossen sind selbstverständlich Ausgestaltungsvarianten, bei denen nicht die Komponente 13 gegen die Komponente 12, sondern die Komponente 12 relativ zur Komponente 13 verschoben wird oder auch beide Komponenten 12 und 13 gegeneinander verschiebbar sind. Die Verschiebeweite, die erforderlich ist, um den Beirag Ad auszugleichen, hängt in allen Fällen ersichtlich von dem für die Komponenten 12 und 13 gewählten Keilwinkei ab. Die Verschiebung kann je nach Auslegung der Abbildungseinrichtung manuell oder auch motorisch ausgelöst werden. Auch kann eine Regeleinrichtung zur Verschiebung in Abhängigkeit von einer Messgröfie vorgesehen sein, welche die jeweils aktuellen Abbildungsfehler definiert.

In der beschriebenen Weise bilden die optischen Komponenten 12 und 13 prinzipiell einen Kompensator in Form einer planparallelen Platte mit variablem Abstand der Grenzflächen 14 und 15, der es ermöglicht, Abbildungsfehler zeitgleich oder zeitnah während der Probenbeobachtung zu kompensieren.

Die vorstehend beschriebe Korrekturmöglichkeit gilt sowohl für Abbildungsfehler, die von Dickenabweichungen des Deckglases 4 oder Dickenabweichungen der Komponenten 12 und 13 verursacht sind, als auch für Abbildungsfehler, die aufgrund von Abweichungen der Brechzahlwerte im Probenraum entstehen, beispielsweise hervorgerufen durch Temperatureinflüsse.

Fig.3 zeigt eine von der Darstellung in Fig.2 insofern abweichende Ausführungsform der Erfindung, als hier die beiden keilförmigen, einen Kompensator bildenden optischen Komponenten 12 und 13 anstelle des Deckglases unmittelbar auf dem Probenbehälter 3 aufsitzen und diesen abdecken.

Veränderungen der Höhe d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 12 und 13, werden beispielweise ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 13 in der dargestellten Pfeilrichtung relativ zur Komponente 12 ausgeglichen. Mit der Variation des Abstandes d2 sind ebenso auch Abbildungsfehler korrigierbar, die ihre Ursache in Abweichungen der Brechzahlwerte des Materials haben, aus dem der Probenbehälter 3 und die Komponenten 12 und 13 bestehen, sowie Abbildungsfehler aufgrund von Abweichungen der Brechzahl des Immersionsmediums. In Fig.4 ist eine Ausführungsform der Erfindung dargestellt, bei der im Unterschied zum Stand der Technik im Strahiengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7 Kompensationsmittel in Form zweier planparalleler optischer Komponenten 17 und 18 vorgesehen und über Stege 19 und 20 mechanisch miteinander verbunden sind. Von den Komponenten 17 und 18 und den Stegen 19 und 20 hermetisch dicht umschlossen ist ein mit einem Druckmedium, vorzugsweise einem Öl, gefüllter Innenraum 21 , der über eine Leitung 22 mit einem Reservoir 23 für das Druckmedium in Verbindung steht. Die Brechzahl dieses Öls ist mit der Brechzahl des Deckglases 4 identisch oder weicht lediglich um eine vorgegebene Toleranz davon ab. Wie in den Beispielen nach Fig.2 und Fig.3 weisen auch hier die Komponenten 17 und 18 zwei vom Strahlengang zu durchdringende Grenzflächen 14 und 15 auf.

Die Verbindung der Komponente 18 mit den Stegen 19 und 20 ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass die Komponente 18 an den Stegen 19 und 20 gleitend und von den Siegen 19 und 20 geführt in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 bzw. des Deckglases 4 verschiebbar und mit dieser Verschiebung der Abstand d2 der Grenzflächen 4 und 15 voneinander variierbar ist.

Die Komponenten 7 und 18 bestehen aus einem Material oder weisen zumindest ein Fenster auf, das für den Abbildungsstrahlengang transparent ist, wobei dessen Brechzahl mit der Brechzahl des Materials identisch ist oder maximal um eine vorgegebene Toleranz davon abweicht, aus dem das Deckglas 4 gefertigt ist. So kann für die Komponenten 17 und 18 zum Beispiel auch hier D263M vorgesehen sein.

Das optische Design dieser Anordnung sieht für das Deckglas 4 eine Dicke d1 vor, und bezüglich der Grenzflächen 14 und 15 einen Abstand d2 voneinander. Das Paket aus Deckglas 4 und den Komponenten 17 und 18 hat damit wiederum eine Höhe d = d1 + d2.

Kommt es im Probenraum während der Probenbeobachtung zu Temperaturänderungen, ändern sich - wie auch im bereits beschriebenen Ausführungsbeispiel nach Fig.3 - aufgrund ihrer Temperaturabhängigkeit die Dicken und die Brechzahlen der durchstrahlten Medien, und es treten Abbildungsfehler bzw. Aberrationen auf.

Im Falle von Abbildungsfehlern, die ihren Ursprung in einer Vergrößerung der Dicke d1 des Deckglases 4 um einen Betrag Ad haben, wird die Komponente 18 in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 bzw. des Deckglases 4 soweit verschoben, bis der Abstand d2 der Grenzflächen 17 und 18 voneinander um den Betrag Ad verringert ist, so dass im Ergebnis der Verschiebung das Paket aus Deckglas 4 und Komponenten 17 und 18 wieder die ursprünglich vorgegebene Höhe d hat und damit die Ursache für diese Abbildungsfehler behoben ist. Abbildungsfehler, die aus sphärischen Aberrationen aufgrund von Änderungen der Brechzahlen der durchstrahlten Medien resultieren, werden - wiederum zumindest in erster Näherung - durch Variation der Höhe d des Paketes aus Deckglas 4 und den Komponenten 17 und 18 kompensiert.

Etwaige Veränderungen des Abstandes d2, zum Beispiel aufgrund von Materialausdehnungen der Komponenten 17 und 18, werden ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 18 so ausgeglichen, dass die Höhe d konstant bleibt bzw. zeitnah ihr vorgegebenes Maß wieder einnimmt.

Die Verschiebung der Komponente 18 zwecks Vergrößerung oder Verringerung des Abstandes d2 wird mittels Variation des Druckes des zwischen den beiden Komponenten befindlichen Druckmediums mittels einer zeichnerisch nicht dargestellten Förderpumpe ausgelöst, der Druckausgleich erfolgt dabei über das Reservoir 23.

Die optischen Komponenten 17 und 18 bilden gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 auch hier einen Kompensator in Form einer planparallelen Platte mit variablem Abstand der Grenzflächen 14 und 15, der es ermöglicht, Abbildungsfehler zeitgleich oder zeitnah während der Probenbeobachtung zu kompensieren.

Die vorstehend beschriebene Korrekturmöglichkeit gilt auch hier sowohl für Abbildungsfehler, die von Dickenabweichungen des Deckglases 4 oder der Komponenten 17 und 18 verursacht sind, als auch für Abbildungsfehler, die aufgrund von Abweichungen der Brechzahlwerte im Probenraum entstehen.

Vergleichbar zu Fig.3 zeigt Fig.5 eine Ausführungsform, bei welcher der Kompensator, gebildet aus den planparallelen optischen Komponenten 17 und 18 und den Stegen 19 und 20, anstelle des Deckglases 4 (vgl. Fig. ) unmittelbar auf dem Probenbehälter 3 aufsitzt und diesen abdeckt.

Veränderungen des Abstandes d2, zum Beispiel aufgrund von Matenalausdehnungen der Komponenten 17 und 18, werden hier ebenfalls durch Verschiebung der Komponente 18 in Richtung der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 ausgeglichen. Mit der Variation des Abstandes d2 sind auch hierbei Abbildungsfehler korrigierbar, die ihre Ursache in Abweichungen der Brechzahlwerte des Materials haben, aus dem der Probenbehälter 3 und die Komponenten 17 und 18 bestehen, sowie Abbildungsfehler aufgrund von Abweichungen der Brechzahl des Immersionsmediums. Anders als bei den anhand Fig.2 bis Fig.5 beschriebenen Ausführungsformen fällt in den nachfolgenden Ausführungsformen nach Fig.6 und Fig.7 die optische Achse 9 des Objektivs 7 nicht mit der Flächennormalen der Grenzflächen 14 und 15 zusammen, sondern schließt mit dieser einen von Null verschiedenen Winkel δ ein, so dass die Probenbeobachtung aus schräger Blickrichtung erfolgt.

Mit einem aus zwei keilförmigen optischen Komponenten 12 und 13 (vgl. Fig.2 und Fig.3) oder einem aus zwei planparallelen optischen Komponenten 17 und 18 gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 gebildeten Kompensator (vgl. Fig.4 und Fig.5) und der jeweils dort beschriebenen Funktionsweise allein lassen sich unsymmetrische Aberrationen, wie Koma und Astigmatismus, die bei schräger Beobachtung zusätzlich zu sphärischen und höher sphärischen Aberrationen auftreten, nicht kompensieren.

Abbildungsfehler, die in diesem Fall aufgrund von Änderungen der Dicke und der Brechzahlen der zu durchdringenden Medien entstehen, werden ebenso wie in den anhand Fig.2 bis Fig.5 bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Kompensationsmitteln ausgeglichen.

Dagegen müssen Aberrationen, die aufgrund des schiefen Durchgangs entstehen, mit anderen als den anhand Fig.2 bis Fig.5 beschriebenen Kompensationsmitteln ausgeglichen werden. Erfindungsgemäß ist zu diesem Zweck, wie in den Ausführungsbeispielen nach Fig.6 und Fig.7 gezeigt, ein Korrekturelement 24 vorgesehen, das es je nach Ausgestaltung ermöglicht, die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen entweder nur für eine bestimmte Objektebene oder für ein ganzes Objektvolumen zu korrigieren.

In Fig.6 und Fig.7 wird beispielhaft davon ausgegangen, dass die beim schiefen Durchgang entstehenden Aberrationen für ein ganzes Objektvolumen korrigiert werden sollen. Dazu besteht das Korrekturelement 24 aus asphärischen Linsen 26 und 27, mit denen die Abbildung des zu untersuchenden Objektvolumens erfolgt und dabei zugleich die Korrektur dieser Aberrationen vorgenommen wird.

Das Korrekturelement 24 ist in Fig.6 fest über dem Kompensator aus den zwei keilförmigen optischen Komponenten 12 und 13 platziert, in Fig.7 dagegen fest über dem aus den planparallelen Komponenten 17 und 18 gemeinsam mit den Stegen 19 und 20 gebildeten Kompensator.

In beiden Fällen befindet sich im Zwischenraum 25 zwischen dem Kompensator und der ersten Linse 26 des Korrekturelementes 24 ein Immersionsmedium, beispielsweise Wasser oder Luft. Die beiden Linsen 26 und 27 sind rotationssymmetrisch ausgeführt und durch einen fest vorgegebenen Luftspalt 28 voneinander getrennt. Das Korrekturelement 24 ist vorteilhaft so ausgestaltet, dass es einerseits die beim schiefen Durchgang durch den betreffenden Kompensator entstehenden Aberrationen korrigiert und andererseits gleichzeitig eine Vergrößerung der Abbildung verursacht, beispielsweise von n1/n2 ^* ξ . Hierbei ist n1 der Brechungsindex des Probenmediums (in diesem Fall Wasser mit n=1.32), n2 der Brechungsindex des Mediums zwischen den Linsen des Korrekturelementes 24 bzw. zwischen dem Objektiv 7 und dem Korrekturelement 24, in diesem Fall Luft mit n2=1. Der Wert ξ ist ein frei wählbarer Parameter zwischen 0.5 und 2.

Im Spezialfall ξ = 1 erzeugt das Korrekturelement 24 ähnlich einer Lupe ein korrigiertes virtuelles Volumenabbild der Probe auf der Probenseite. Das Objektiv 7 bildet dementsprechend ein Schnitt des virtuellen Volumenabbilds der Probe 1 ab, das sich im Medium mit dem Brechungsindex n2 (in diesem Fall Luft) befindet. Somit entfällt die Notwendigkeit Immersionsobjektive zu verwenden, wodurch die Handhabung einfacher wird. Denkbar ist diesbezüglich auch, ein Wasserobjektiv zu einem Ölobjektiv umzufunktionieren, wenn n2 Wasser und n1 Öl ist.

Für die Fokussierung muss im Falle der Verwendung eines virtuellen Relais das Korrekturelement 24 nicht bewegt werden, sondern es genügt, das Objektiv 7 zu verschieben oder auch eine Innenfokussierung anzuwenden. Bei der Fokussierung unter Verwendung allgemeiner, sphärischer Linsenelemente zur Korrektur ist es vorteilhafter, diese zusammen mit dem Objektiv 7 zu bewegen.

Zu den Ausführungsformen nach Fig.2 bis Fig.7 ist anzumerken, dass die jeweils dargestellte aufrechte Mikroskopanordnung lediglich beispielhaft ist. Die Korrekturfunktion der beschriebenen technischen Mittel ist ebenso auch bei anderen Beleuchtungsvarianten gegeben, wie zum Beispiel bei einer Ausführungsform der Erfindung mit Auflichtbeleuchtung und inversem Mikroskopaufbau, wie in Fig.8 dargestellt.

Hierbei erfolgt die sowohl die Beleuchtung als auch die Probenbeobachtung durch den Boden des Probenbehälters 3 hindurch, der nun als ein Deckglas wirkt. Insofern befinden sich die erfindungsgemäßen Kompensationsmittel auch hier im Sirahlengang zwischen der Probe 1 und dem Objektiv 7. Das Korrekturelement 24 wird in diesem Fall auch zur Einkopplung der Beleuchtung in den Probenraum genutzt.

Die Beleuchtungsoptik 6 und das Objektiv 7 sind unterhalb des Probenbehälters 3 angeordnet und dort so zur Probe 1 ausgerichtet, dass für die Winkel α + ß = 90° gilt. Der Abstand zwischen der Beleuchtungsoptik 6 bzw. zwischen dem Objektiv 7 und der ersten Linse 26 des Korrekturelementes 24 kann frei eingestellt werden. Wenn es sich bei dem Korrekturelement 24 um ein dreidimensionales rotationssymmetrisches Element mit einer numerischen NA = 1.32 handelt, das innerhalb des gesamten Öffnungswinkels korrigiert ist, können die Winkel α bzw. ß beliebig gewählt werden, solange α + ß = 90° eingehalten wird und die optischen Achsen 8 und 9 der Beleuchtungsoptik 6 und des Objektivs 7 gemeinsam mit der Flächennormalen des Bodens des Probenbehälters 3 in einer Ebene liegen.

Die Ausführungsform nach Fig.8 ist ausdrücklich sowohl zur Lichtmikroskopie geeignet, wobei die Beleuchtung der Probe 1 mit rotationssymmetrisch um die optische Achse 8 der Beleuchtungsoptik 6 geformten Beleuchtungslicht erfolgt, als auch zur Lichtblattmikroskopie, bei der die Beleuchtung der Probe 1 mit einem zu einem Lichtblatt geformten Beleuchtungslicht erfolgt, das mit der optischen Achse 8 der Beleuchtungsoptik 6 in einer Ebene liegt.

Bei der Beleuchtungsoptik 6 und dem Objektiv 7 handelt es sich in allen in Fig.2 bis Fig.8 beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung vorteilhaft um Trockenobjektive, eine Wasserimmersion ist möglich, aber nicht erforderlich.

Bezugszeichenliste

1 Probe

2 Immersionsmedium

3 Probenbehälter

4 Deckglas

5 Probentisch

6 Beleuchtungsoptik

7 Objektiv

8 optische Achse

9 optische Achse

10 Objektiv

11 optische Achse

12 optische Komponente

13 optische Komponente

14 Grenzfläche

15 Grenzfläche

16 Zwischenschicht

17 optische Komponente

18 optische Komponente

19 Steg

20 Steg

21 Innenraum

22 Leitung

23 Reservoir

24 Korrekturelement

25 Zwischenraum

26 Linse

27 Linse

28 Luftspalt

Claims

Patentansprüche

Mikroskopische Abbildungseinrichtung, umfassend

ein Objektiv (7), das durch eine transparente Abdeckung hindurch auf einen abzubildenden Bereich einer Probe (1 } gerichtet ist,

dadurch gekennzeichnet, dass

im Strahlengang zwischen der Probe (1 ) und dem Objektiv (7) Mittel zur Kompensation von Abbildungsfehlern vorgesehen sind, die aufgrund des Durchtritts des Strahlengangs durch die transparente Abdeckung entstehen.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach Anspruch 1 , bei dem

sich die Probe (1 ) gemeinsam mit einem Smmersionsmedium (2) in einem abgedeckten Probenbehälter (3) befindet, und

der Strahlengang die transparente Abdeckung des Probenbehälters, mindestens eine Wandung des Probenbehälters (3) und das Immersionsmedium (2) durchdringt, wobei im Strahlengang der mikroskopische Abbildungseinrichtung zwischen der Probe (1 ) und dem Objektiv (7) Mittel zur Kompensation von Abbildungsfehlern vorgesehen sind, die aufgrund des Durchtritts des Beleuchtungs- oder Abbildungsstrahlengangs durch die transparente Abdeckung, durch die Wandung des Probenbehäiters (3) und das Immersionsmedium (2) entstehen.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompensationsmittel optische Komponenten (12, 13,17,18) umfassen, die zumindest im Durchtrittsbereich für den Strahlengang transparent sind, wobei die Brechzahl dieser optischen Komponenten (12, 13,17,18) mit den Brechzahlen der transparenten Abdeckung und der Wandung des Probenbehälters (3) entweder identisch ist oder maximal um einen bestimmten Wert davon abweicht, und die optischen Komponenten (12,13,17,18) mindestens zwei zu durchdringende Grenzflächen (14, 15) aufweisen, deren in Durchtrittsrichtung gemessener Abstand d2 zueinander variierbar ist.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompensationsmittel umfassen

zwei keilförmige optische Komponenten (12, 13), bei denen der Abstand der zu durchdringenden Grenzflächen (14, 15} durch Verschiebung von mindestens einer dieser Komponente (13) senkrecht zur Durchtrittsrichtung relativ der zur anderen Komponenten (12) veränderbar ist, oder

zwei planparallele optische Komponenten (17,18), bei denen der Abstand d2 der zu durchdringenden Grenzflächen (14, 15) durch Verschiebung von mindestens einer dieser Komponenten (18) in Durchtrittsrichtung relativ der zur anderen Komponenten (17) veränderbar ist.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass

als transparente Abdeckung ein Deckglas (4) vorgesehen ist und die Kompensationsmittel zwischen Deckglas (4) und Objektiv (7) angeordnet sind, oder die Kompensationsmittel als Abdeckung des Probenbehälters (3) ausgebildet sind.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse (9) des Objektivs (7)

zu der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen (14, 15) parallel ausgerichtet ist,

mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen (14, 5) einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt, oder

mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt und ein zusätzliches Korrektureiement (24) vorgesehen ist.

Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach Anspruch 6, bei der die optische Achse (9) des Objektivs (7) mit der Flächennormalen der zu durchdringenden Grenzflächen (14, 5) einen von Null verschiedenen Winkel δ einschließt und ein zusätzliches Korrekturelement (24) mit mindestens einer sphärischen Linse oder mindestens einer asphärischen Linse (26, 27) vorgesehen ist.

8. Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, ausgebildet

zur Lichtmikroskopie, wobei eine Beieuchiungsoptik (6) mit einem rotationssymmetrisch um die optische Achse (8) ausgebreiteten Beleuchtungsstrahl zur Beleuchtung der Probe (1 ) im Auflicht oder Durchlicht vorgesehen ist, oder

zur Lichtblattmikroskopie, umfassend eine Beleuchtungsoptik (6) zur Beleuchtung der Probe (1 ) im Auflicht mittels eines Lichtblattes, das mit der optischen Achse (8) der Beleuchtungsoptik (6) in einer Ebene liegt, wobei die Beleuchtungsoptik (6) und das Objektiv (7) in Schwerkraftrichtung gesehen unterhalb des Probenbehälters (3) angeordnet sind.

9. Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei der als Immersionsflüssigkeit (2) beispielsweise Wasser und als Material für die zu durchdringende Probenbehälterwandung, für das Deckglas (4) und/oder für die optischen Komponenten (12,13,17,18) ein optisches Glas, PTFE, CYTOP^®, FEP, Teflon^® AF oder ein Polymer vorgesehen ist.

10. Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, umfassend eine Regeleinrichtung zur Variation des Abstandes d2 der zu durchdringenden Grenzflächen (14,15) der optischen Komponenten (12,13,17,18) in Abhängigkeit von Abbildungsfehlern.

11. Mikroskopische Abbildungseinrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Kompensationsmittel mit einer einem Keilfehler des Deckglases (4) entgegengesetzten Keilneigung versehen sind, so dass der Keilfehler des Deckglases (4) mittels dieser Keilneigung korrigiert ist.