DE10118355A1

DE10118355A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Mehrphotonenanregung einer Probe

Info

Publication number: DE10118355A1
Application number: DE10118355A
Authority: DE
Inventors: Stefan Hell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2001-04-12
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: US7115885B2; WO2002084265A1; DE10118355B4; US20040114138A1; JP2005508489A; EP1377816A1

Abstract

Zur Mehrphotonenanregung einer Probe (24), wobei ein Laserstrahl (10) in mindestens zwei kohärente Teilstrahlen (11, 12) gleicher Intensitätsverteilung um die jeweilige Strahlachse aufgespalten wird und wobei die Teilstrahlen (11, 12) aus unterschiedlichen Richtungen kommend auf eine gemeinsame, quer zu den Strahlachsen verlaufenden Meßebene ausgerichtet werden, so daß sie in dem Bereich der Meßebene miteinander interferieren, werden die Teilstrahlen (11, 12) zueinander unter einen Kippwinkel (14) < 1 ausgerichtet und durch ein gemeinsames Linsensystem (21) auf die Meßebene ausgerichtet werden, so daß eine durch die Interferenz der Teilstrahlen (11, 12) hervorgerufene Intensitätsverteilung in der Meßebene Bereiche maximaler Intensität neben Bereichen minimaler Intensität aufweist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Mehrphotonen anregung einer Probe nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die Mehrphotonenanregung einer Probe in einem Meßpunkt erfolgt beispielsweise in einem Rastermikroskop, bei dem eine besonders hohe örtlich Auflösung erreicht werden soll. So ist bei einer Zweiphotenenanregung einer Probe die Intensitätsverteilung des von der Probe emittierten Fluoreszenzlichts proportional zum Quadrat der Intensitätsverteilung des Anregungslichts. Ent sprechend ist bei einer Dreiphotonenanregung der Probe die Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts proportional zur dritten Potenz der Intensitätsverteilung des Anregungslichts. So kann bei der begrenzten minimalen Halbwertsbreite der Inten sitätsverteilung des Anregungslichts in jedem Meßpunkt die effektive Ortsauflösung bei der Analyse des Fluoreszenzlichts von einer Mehrphotonenanregung erhöht werden.

Bei einem Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und einer Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 8, die aus der DE 196 53 413 A1 bekannt sind, wird dem Nachteil der Mehrphotonenanregung einer Probe, der darin besteht, daß die Intensität des Fluoreszenzlichts durch die oben beschriebenen Abhängigkeiten von einer Potenz der Intensität des Anregungs lichts bei Intensitäten des Anregungslichts, die eine Beschädi gung der Probe ausschließen, häufig nur gering ist und deshalb längere Meßzeiten erfordert, dadurch begegnet, daß die Probe in mehreren in einer Meßebene nebeneinanderliegenden Meßpunkten gleichzeitig angeregt wird. Dies erfolgt dadurch, daß ein ankommender Laserstrahl auf ein Mikrolinsenarray fällt und hierdurch in eine Vielzahl von nebeneinanderliegenden Brenn punkten fokussiert wird. Diese Brennpunkte werden dann mit einem Abbildungssystem in die Meßpunkte in der Meßebene abgebildet. In der DE 196 53 413 A1 sind in diesem Zusammenhang auch Ausführungsformen des Verfahrens und der Vorrichtung beschrieben, bei der die einzelnen Mikrolinsen des Mikrolinsenarrays unterschiedliche Positionen entlang der Strahlachse und/oder unterschiedliche Brennweiten aufweisen, so daß die Meßpunkte auf unterschiedlicher Tiefe in der Probe angeordnet sind, um diese auch in der Tiefe abzurastern. Diese Variante, bei der die Meßpunkte nicht exakt in eine geometrische Ebene fallen, soll hier eingeschlossen sein, auch wenn von mehreren Meßpunkten die Rede ist, die in einer senkrecht zu der jeweiligen Strahlachse verlaufenden Meßebene nebeneinander liegen.

Die Ausführungsform innerhalb der DE 196 53 413 A1, die dem Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und der Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 8 entspricht, spaltet den Laserstrahl, nachdem er auf das Mikrolinsenarray gefallen ist und damit auf eine Vielzahl von nebeneinander liegenden Brennpunkten verteilt wurde, in zwei Teilstrahlen gleicher Intensitätsverteilung um die jeweilige Strahlachse auf. Diese Teilstrahlen werden dann mit zwei Linsensystemen aus diametral entgegengesetzten Richtungen, d. h. auf die Probe bezogen von vorne und von hinten, in den Meßpunkten in der Meßebene fokussiert. Aufgrund der Kohärenz der Teilstrahlen ergibt sich in den Meßpunkten jeweils ein Interferenzmuster, bei dem die Bereiche maximaler und minimaler Intensität eine Abfolge in Richtung der Strahlachsen aufweisen. Konkret bildet sich in der Meßebene direkt um den Meßpunkt ein Hauptmaximum aus, in dem eine nennenswerte Anregung der Probe erfolgt. Die vor bzw. hinter der Meßebene liegenden Nebenmaxima sind allein aufgrund der Intensitätsverteilung jedes Teilstrahls in dem Meßpunkt nur von untergeordneter Bedeutung, so daß sie zu einer Mehrphotonenanregungen der Probe nicht nennenswert beitragen. Auf diese Weise wird die Tiefenauflösung bei der Mehrphotonenanregung der Probe verbessert. Der hierzu notwendige Aufbau ist aber relativ aufwendig, da sich die Aufteilung des Laserstrahls in die zwei Teilstrahlen gleicher Intensitätsverteilung bis zur Probe hin erstreckt. Zudem muß die Probe von beiden Seiten für jeweils einen der Teilstrahlen zugänglich sein.

Dem Problem der möglichst guten Ausnutzung der Lichtleistung des von einem Laser zur Verfügung gestellten Laserstrahls begegnet die DE 196 53 413 A1 dadurch, daß die einzelnen Mikrolinsen des Mikrolinsenarrays möglichst unmittelbar aneinander angrenzen, so daß keine Anteile des Laserstrahls ausgeblendet werden. Die Mehrzahl der in der Meßebene nebeneinanderliegenden Meßpunkte, in denen die Probe jeweils mit etwa gleicher Intensität über einen Mehrphotonenprozeß angeregt wird, ist bei dem bekannten Verfahren und der bekannten Vorrichtung nicht immer problemlos. Es gibt Proben, die eine stark unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem Anregungslicht aufweisen. So werden sie bei einer gleichen Intensität über die verschiedenen Meßpunkte in einigen Meß punkten bereits durch das Anregungslicht beschädigt, während in anderen Meßpunkten noch nicht einmal eine auswertbare Intensität des Fluoreszenzlichts vorliegt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 8 aufzuzeigen, mit denen die zur Verfügung stehende Intensität eines Laserstrahls zur Mehrphotonenanregung einer Probe optimiert ausgenutzt wird.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Mehrphotonenanregung einer Probe mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 7 beschrieben.

Bei dem neuen Verfahren werden die Teilstrahlen nicht aus diametral entgegengesetzten Richtungen im Bereich der Meßebene zur Interferenz gebracht. Vielmehr kommen die Teilstrahlen, deren Anzahl auch größer als zwei sein kann, im wesentlichen aus derselben Richtung, wobei nur der kleine Kippwinkel von weniger als 1 jeweils zwischen ihnen vorliegt. Damit ergibt sich ein Interferenzmuster, bei dem die Bereiche maximaler und minimaler Intensität nicht in der Tiefe der Probe aufeinander abfolgen, sondern in der Meßebene und zwar in der Richtung des Kippwinkels. Der Abstand der Bereiche maximaler Intensität in diesem Interferenzmuster hängt neben dem Kippwinkel auch von den optischen Daten des Linsensystems ab. Er kann je nach Bedarf eingestellt werden. Ganz unabhängig von diesem Abstand weist das erfindungsgemäße Verfahren aber den Vorteil auf, daß die Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Intensität des Laserstrahls dadurch verbessert wird, daß durch das Interferenzmuster eine inhomogene Intensitätsverteilung in der Meßebene eingestellt wird. Die hieraus resultierende bessere Ausnutzung der zur Verfügung stehenden tichtleistung des Anregungslichts beruht auf der Nichtlinearität der Fluores zenzlichtausbeute bei einer Mehrphotonenanregung. Geht man von einer Zweiphotonenanregung aus, so wird durch ein Inter ferenzmuster, das eine mittlere relative Intensität von 1 auf Bereiche relativer Intensität von 2 und 0 aufteilt, in den Bereichen der relativen Intensität von 2 eine relative Anregung von 2² = 4 erzielt. Dies entspricht einer mittleren Anregung von 2. Demgegenüber wird bei der ursprünglichen Intensität nur eine mittlere Anregung von 1² = 1 erzielt. Wenn die diesem Beispiel zugrundeliegende Intensitätsverteilung des Anregungslichts auch theoretisch bleibt, so verdeutlicht das Beispiel doch das Potential der vorliegenden Erfindung. Mit anderen Worten gesagt verbessert das Interferenzmuster in der Meßebene per se die relative Ausbeute an Fluoreszenzlicht bei einer Mehrphotonen anregungen. Dieser Effekt ist bei einer Dreiphotonenanregung oder einem Prozeß, an dem noch mehr Photonen beteiligt sind, sogar noch stärker ausgeprägt. Das bis hierher gesagte gilt im übrigen unabhängig davon, ob bei der Beobachtung des Fluoreszenzlichts von der Probe die Intensitätsverteilung des Anregungslichts aufgrund des Interferenzmusters in der Meßebene aufgelöst wird oder nicht.

Der seitliche Versatz der Teilstrahlen in der Meßebene aufgrund des Kippwinkels sollte immer < 50% der Halbwertsbreite der Intensitätsverteilung jedes Teilstrahls in der Meßebene sein. Noch mehr bevorzugt ist ein seitlicher Versatz der Teilstrahlen in der Meßebene, der maximal 25% dieser Halbwertsbreite beträgt.

Zur Ausnutzung der grundsätzlichen Vorteile des neuen Verfahren in Bezug auf die Fluoreszenzlichtausbeute ist es zwar nicht erforderlich, zur Ausnutzung der Möglichkeit, bei der Mehrphotonenanregung der Probe eine hohe Ortsauflösung zu realisieren, ist es aber dennoch sinnvoll die Teilstrahlen in mindestens einen gemeinsamen Meßpunkt in der Meßebene zu fokussieren.

Durch den relativ kleinen Kippwinkel zwischen den Teilstrahlen ist es sehr sinnvoll, die Aufspaltung des Laserstrahls in die Teilstrahlen vor jeder weiteren Strahlformung vorzunehmen, d. h. insbesondere vor der Aufteilung der Teilstrahlen auf eine Mehrzahl von nebeneinanderliegenden Brennpunkte beispielsweise eines Mikrolinsenarrays, um diese Brennpunkte anschließend in die Meßpunkten abzubilden.

Neben dem oben beschriebenen grundsätzlichen Vorteil der Inten sitätsverteilung des Interferenzmusters in der Meßebene können besondere Vorteile dadurch erreicht werden, daß der Abstand der Bereiche maximaler Intensität in diesem Interferenzmuster mindestens halb so groß ist wie der Abstand der Meßpunkte. So können zum einen einzelne Meßpunkte die erhöhte relative Ausbeute an Fluoreszenzlicht voll ausnutzen. Zum anderen ist es möglich, unterschiedlich empfindliche Bereiche einer Probe im Rahmen der Intensitätsverteilung des Interferenzmusters mit Anregungslichts unterschiedlicher Intensität anzuregen.

Wenn es bei einer Probe nicht sinnvoll oder erforderlich ist, unterschiedliche Bereiche der Probe unterschiedlich stark mit Anregungslicht anzuregen, kann die Phase mindestens eines Teilstrahls durch Ändern seiner Weglänge moduliert werden, so daß sich die Bereiche maximaler Intensität des Interferenz musters in der Meßebene hin und her bewegen. Sinn dieser Maßnahme ist es nicht unbedingt, die Probe durch das Inter ferenzmuster abzurastern, sondern die Anregungsintensität gleichmäßig "auszuschmieren". Durch die Nichtlinearität der Mehrphotonenanregung ergibt sich trotzdem eine verbesserte Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Intensität, d. h. Licht leistung, des Laserstrahls, wie oben im Zusammenhang mit feinen Interferenzmustern bereits angesprochen wurde.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des neuen Verfahrens ist er findungsgemäß durch die Merkmale des Anspruch 8 gekennzeichnet. Vorteilhafte Ausführungsformen dieser Vorrichtung sind in den Unteransprüchen 9 bis 15 beschrieben.

Die Strahllenkungsmittel können einen Dachspiegel aufweisen, an dessen Firstkante die Teilstrahlen unter dem Kippwinkel zusam mengeführt werden, nachdem sie zuvor durch den Strahlteiler aufgespalten und dann aus etwa entgegengesetzten Richtungen an den Dachspiegel herangeführt wurden. Für die Erfindung kommt es aber allein darauf an, daß zwei Teilstrahlen mit etwa gleicher Intensitätsverteilung vorliegen und diese unter einem kleinen Kippwinkel zueinander ausgerichtet werden. Dies kann auch durch andere bekannte optische Mittel geschehen.

So können die Strahlteilungsmittel und die Strahllenkungsmittel gemeinsam von einem optischen Element ausgebildet werden. Beispielsweise kann das optische Element eine aktive Oberfläche aufweisen, die aus in Gruppen gegeneinander verkippten oder verkippbaren Mikrospiegeln zusammengesetzt ist. Solche optischen Elemente sind von der Firma Texas Instruments in den USA erhältlich. Sie können beispielsweise schachbrettartig in zwei Gruppen von Mikrospiegeln aufgeteilt und angesteuert werden, wobei dann jeweils die "schwarzen" und die "weißen" Felder bzw. Mikrospiegel eine übereinstimmende Orientierung aufweisen und zusammen einen der Teilstrahlen des Laserstrahls ausformen.

Das optische Element kann aber auch einen aktiven Durchgangs bereich aufweist, der aus Gruppen unterschiedlicher oder unter schiedlich ansteuerbarer Verzögerungsplättchen zusammengesetzt ist. Optische Elemente mit elektronisch ansteuerbaren Flüssig keitskristallverzögerungssegmenten sind beispielsweise von der Firma DisplayTech in den USA erhältlich. Auch hier ist eine schachbrettartige Aufteilung des optischen Elements zur Erzeugung der beiden unter dem Kippwinkel zueinander ausgerichteten Teilstrahlen aus dem Laserstrahl möglich. Wenn optische Elemente mit Flüssigkristallverzögerungssegmenten auch bislang noch eine relativ geringe Transmission aufweisen, ist doch abzusehen, daß sie mit weiter verbesserten Transmissionswerten zukünftig eine erste Wahl bei der Realisation der Erfindung darstellen werden.

Zur Verteilung der Teilstrahlen auf eine Vielzahl nebeneinander liegender Brennpunkte, kann das Linsensystem ein Mikrolinsen array aus mehreren in einer Ebene nebeneinander angeordneten Mikrolinsen aufweisen. Es sind grundsätzlich auch andere Möglichkeiten, wie beispielsweise eine Mehrfachlochblende, zu diesem Zweck einsetzbar. Doch weisen alle Blenden den Nachteil auf, daß der einfallende Laserstrahl bzw. die einfallenden Teilstrahlen teilweise ausgeblendet werden und somit wertvolle Lichtleistung verloren geht.

Bei Verwendung eines Mikrolinsenarrays gilt für eine sinvolle Obergrenze für den Kippwinkel die Abschätzung, daß er kleiner als Lambda/(M.NA.f) sein sollte, wobei Lambda die Wellenlänge des Laserstrahls und der Teilstrahlen, M der Abbildungsmaßstab bei der Fokussierung der Teilstrahlen in jedem Meßpunkt, NA die numerische Apertur des Linsensystems und f die Brennweite jeder Mikrolinse des Mikrolinsenarrays ist. Typische Werte für Lambda liegen zwischen 0,0004 und 0,0015 mm, für M zwischen 0,05 und 0,001, für NA zwischen 0,2 und 1,6 und für f zwischen 1 und 20 mm. Hieraus resultiert ein Kippwinkel der kleiner als 0,25.10^-3 sein kann und typischerweise ≦ 1,0 × 10^-3 ist.

Die Strahllenkungsmittel können mindestens ein Umlenkelement aufweisen, das die Phase mindestens eines Teilstrahls durch Ändern seiner Weglänge moduliert. Beispielsweise kann es sich um einen über ein Piezoelement gelagerten Spiegel handeln, dessen Lage durch Ansteuern des Piezoelements periodisch über einen Weg verschoben wird, der ≧ der Wellenlänge des Teilstrahls ist. Wenn die Periodendauer dieses Vorgangs kürzer ist als die zeitliche Auflösung bei der Registrierung des aufgrund der Mehrphotonenanregung emittierten Fluoreszenz lichts, wird die Intensitätsverteilung des Interferenzmusters in der Meßebene somit unter Beibehalten ihres grundsätzlichen Vorteils bei der Mehrphotonenanregung effektiv ausgemittelt.

Die vorliegende Erfindung betrifft keine neue Art der Registrierung oder Beobachtung des von der Probe emittierten Fluoreszenzlichts. Es versteht sich aber, daß der Fachmann entsprechende bekannte Verfahrensschritte bzw. entsprechende bekannte Einrichtungen bei der Vorrichtung zum Erfassen des Fluoreszenzlichts vorsehen wird. Hierzu gehören beispielsweise eine elektronische Kamera, wie eine CCD- oder CMOS-Kamera, oder ein oder mehrere Photomultiplier. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform ist jeder Mikrolinse eines Mikrolinsenarrays ein solcher Photomultiplier zugeordnet, wobei die Anordnung der Mikrolinsen relativ zu den Photomultipliern fest ist und die Probe beispielsweise mit Hilfe eines Galvanospiegels oder durch Verschieben der Probe selbst abgerastert wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungs beispiels näher erläutert und beschrieben, dabei zeigt

Fig. 1 den Aufbau der neuen Vorrichtung,

Fig. 2 ein Detail der Vorrichtung gemäß Fig. 1,

Fig. 3 die Intensitätsverteilungen von Anregungslicht über einen Querschnitt durch die Meßebene bei der Vorrichtung gemäß Fig. 1 als Ergebnis theoretischer Überlegungen,

Fig. 4 die tatsächlich gemessenen Intensitätsverteilungen gemäß Fig. 3,

Fig. 5 eine der Intensitätsverteilungen gemäß Fig. 4 in der Meßebene,

Fig. 6 eine zweite Intensitätsverteilung gemäß Fig. 4 in der Meßebene und

Fig. 7 eine dritte Intensitätsverteilung gemäß Fig. 4 in der Meßebene.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung 1 besteht aus zwei Teilanordnungen 2 und 3, deren Bereiche in der vorliegenden Darstellung jeweils mit einer Linie umrandet sind. Dies bedeutet aber nicht, daß die Teilanordnungen 2 und 3 in unterschiedlichen Gehäusen angeordnet sein müssen oder irgendeine andere räumliche oder körperliche Abgrenzung vorhanden sein muß. Die Aufteilung der Vorrichtung 1 auf die Teilanordnungen 2 und 3 ist vielmehr rein funktioneller Natur.

Die Teilanordnung 2 der Vorrichtung 1 weist einen Laser 4, einen Strahlteiler 5, Umlenkspiegel 6, 7 und 8 und einen Dach spiegel 9 auf. Der Laser 4 emittiert einen kohärenten Laser strahl 10. Von dem Strahlteiler 5 wird der Laserstrahl 10 in zwei Teilstrahlen 11 und 12 aufgespalten, die wechselweise kohärent sind und jeweils eine gleiche Intensitätsverteilung um die Strahlachse aufweisen. Die Teilstrahlen 11 und 12 werden durch die Umlenkspiegel 6 bis 8 umgelenkt und aus unter schiedlichen Richtungen an die Firstkante 13 des Dachspiegels 9 herangeführt. Sie werden dort so umgelenkt, daß sie bis auf einen zwischen ihnen liegenden Kippwinkel 14 wieder auf einer gemeinsamen optischen Achse 15 verlaufen. Dabei sind die Umlenkspiegel 6 zum Umlenken des Teilstrahls 11 und die Umlenkspiegel 7 und 8 zum Umlenken des Teilstrahls 12 vorgesehen, und die Weglängen beider Teilstrahlen sind zwischen dem Strahlteiler 5 und dem Dachspiegel 9 gleich lang.

Dementsprechend sind die Teilstrahlen hinter dem Dachspiegel 9 zu Interferenz miteinander geeignet. Dort entstehende Interferenzmuster können durch Ansteuern eines Piezoelements 16, über den der Umlenkspiegel 8 im optischen Weg des Teilstrahls 12 gelagert ist, variiert werden, weil eine Variation der Weglänge des Teilstrahls 12 eine relative Phasen verschiebung zu dem Teilstrahl 11 bedeutet. Der Winkel 14 zwischen den Teilstrahlen 11 und 12 nach dem Dachspiegel 9 beträgt hier 8,4 × 10^-4.

In der Teilanordnung 3 der Vorrichtung 1 werden die einfallenden Teilstrahlen 11 und 12 wie folgt durch ein Linsensystem 21 umgeformt, das hier aus einem Teleskop 17, einem Mikrolinsenarray 18, mehreren Linsen 22 und einem Ölobjektiv 23 besteht. Zunächst werden die Teilstrahlen 11 und 12 jeweils durch das Teleskop 17 aufgeweitet, und dann treffen sie aufgeweitet auf das Mikrolinsenarray 18, das von einer um eine Achse 19 rotierenden Mikrolinsenscheibe 20 ausgebildet wird. Das Mikrolinsenarray 18 fokussiert die Teilstrahlen 11 und 12 jeweils in einer Vielzahl der nebeneinanderliegenden Brennpunkten, die dann über die Linsen 22 und das Ölobjektivs 23 in verschiedene Meßpunkte in einer Meßebene innerhalb einer Probe 24 abgebildet werden. Dabei überlappen in jedem Meßpunkt die Intensitätsverteilungen der Teilstrahlen 11 und 12 derart, daß Ihr relativer Versatz nur ungefähr 20% der Halbwertsbreite ihrer jeweiligen Intensitätsverteilung ausmacht. Durch den Kippwinkel 14 zwischen den Teilstrahlen 11 und 12 kommt es zu der Ausbildung eines Interferenzmusters über die einzelnen Meßpunkte in der Meßebene hinweg, wobei die Art der Interferenz, d. h. destruktiv oder konstruktiv von der relativen Phasenlage und damit von der Ansteuerung des Piezoelements 16 abhängt, der den Umlenkspiegel 8 lagert. Hierauf wird im folgenden im Zusammenhang mit Fig. 3 näher eingegangen werden. Dort wo sich die Teilstrahlen 11 und 12 konstruktiv überlagern und eine resultierende Anregungs intensität ergeben, wird die Probe 24 in einer Mehrphotonen anregungen, hier einer Zweiphotonenanregung, zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Dieses Fluoreszenzlicht kann über ein Okular 25 direkt betrachtet oder mit einer elektronischen Kamera 26 registriert werden. Hierzu sind im Strahlengang der Vorrichtung 1 noch zwei Spiegel 27 und 28 vorgesehen. Der Spiegel 27 ist vorzugsweise ein Farbteiler, der die Teilstrahlen 11 und 12 zu der Probe 24 hin ablenkt, aber das Fluoreszenzlicht von der Probe zu dem Okular 25 bzw. der Kamera 26 durchläßt, wobei er die unterschiedlichen Wellenlängen der Teilstrahlen 11 und 12 einerseits und des Fluoreszenzlichts andererseits ausnutzt. Auch zusätzlich zu dem als Farbteiler ausgebildeten Spiegel 27 kann ein hier nicht dargestelltes Filter in dem zu der Kamera 26 bzw. dem Okular 25 führenden Strahlengang angeordnet sein, um von der Probe 24 reflektiertes Laserlicht zur Verbesserung des Signal-/Hintergrund- Verhältnisses bzw. zum Schutz der Augen zu absorbieren. Der Spiegel 28 kann ein halbdurchlässiger Spiegel sein. Vorzugs weise handelt es sich aber bei ihm um einen in den Strahlengang einschieb- oder -schwenkbaren Vollspiegel, um die Probe unter jeweils voller Ausnutzung der Intensität des Fluoreszenzlichts entweder mit der elektronischen Kamera 26 zu erfassen oder durch das Okular 25 mit dem Auge zu betrachten.

Fig. 3 zeigt die Anregung der Probe zur Emission von Fluores zenzlicht aufgetragen über den Probenort, d. h. über einen Querschnitt durch die Meßebene, entlang dem einzelne Meßpunkte angeordnet sind. Durch das um die Achse 19 rotierende Mikro linsenarray 18 wird der in Fig. 3 dargestellte Querschnitt durch die Meßebene abgetastet. In Fig. 3 zeigt eine Kurve 29 die Intensitätsverteilung der Zweiphotonenanregung an, die sich ohne die Aufteilung des Laserstahls 10 in die Teilstrahlen 11 und 12 ergeben würde. Es handelt sich um eine gaußförmige Intensitätsverteilung. Demgegenüber zeigt die Kurve 30 eine konstruktive Überlagerung im Mittelpunkt der Überlappung der Teilstrahlen 11 und 12 an. Es ergeben sich drei nebeneinander liegende Bereiche 31 maximaler Intensität, zwischen denen die Anregung von Fluoreszenzlicht auf null zurückgeht. Die Kurve 32 zeigt den Fall destruktiver Interferenz im Mittelpunkt der beiden Intensitätsverteilungen. Entsprechend geht die Fluoreszenzanregung in den Bereichen 31 der Kurve 30 auf Null zurück. Statt dessen bilden sich dazwischen Bereiche 33 maximaler Intensität aus. Wenn man die Kurven 30 und 32 bzw. alle relativen Phasenlagen der Teilstrahlen 11 und 12 mittelt, ergibt sich für die Fluoreszenzanregung der Probe 24 die Kurve 34. Die Kurve 34 entspricht beispielsweise der Messung der Fluoreszenz mit einer geringeren zeitlichen Auflösung als eine periodische Schwingung des Piezoelements 16, der den Umlenkspiegel 8 lagert. Als Ausfluß der Nichtlinearität der der Fluoreszenz zugrundeliegenden Mehrphotonenanregung liegt die Kurve 34 deutlich oberhalb der Kurve 29, d. h. durch die Interferenz der beiden Teilstrahlen 11 und 12 im Bereich der Probe 24 kann die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einer Mehrphotonenanregung der Probe verbessert werden. Bei einer Zweiphotonenanregung sollte die Ausbeute an Fluoreszenzlicht durch die Interferenz der beiden Teilstrahlen praktisch um bis zu 50% höher liegen als bei einer direkten Verwendung des Laserstrahls. Bei einer Dreiphotonenanregung beträgt die Verbesserung bis zu 150%.

Die in Fig. 3 wiedergegebenen theoretischen Werte werden durch die Meßwerte in Fig. 4 bestätigt, die dort von den Kurven 30, 33 und 34 wiedergeben werden. Die Kurve 29 ist in Fig. 4 nicht eingezeichnet, sie verläuft aber konstant unterhalb der Kurve 34 mit derselben gaußförmigen Grundform.

Die Fig. 5, 6 und 7 zeigen die den Kurven 30, 33 und 34 ent sprechenden Intensitätsverteilungen der angeregten Fluoreszenz einer homogenen Probe in der Meßebene. Während Fig. 7 nur eine Erhöhung der Ausbeute an Fluoreszenzlicht beim Ausschmieren der Interferenzmuster der Teilstrahlen 11 und 12 dokumentiert, lassen die Fig. 5 und 6 erkennen, daß durch das Interferenz muster auch gezielt bestimmte Bereiche einer Probe stärker angeregt werden können als andere, um beispielsweise unter schiedlichen Empfindlichkeiten der Probe Rechnung zu tragen. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen 11 und 12 in der Meßebene muß im übrigen nicht so relativ grob ausfallen, wie dies in den Fig. 5 und 6 zu sehen ist. Es kann auch eine größere Anzahl von Bereichen maximaler Intensität nebeneinander aufweisen. Die grundsätzlichen Vorteile des neuen Verfahrens zur Mehrphotonenanregung einer Probe und einer entsprechenden Vorrichtung bleiben dabei erhalten. Es kann sogar einfacher werden, eine Ausmittlung der Interferenzmuster über unter schiedliche Relativphasen vorzunehmen. Sie ergibt sich quasi automatisch, wenn das Interferenzmuster feiner ist als die Intensitätsverteilung der Teilstrahlen in jedem Meßpunkt.

BEZUGSZEICHENLISTE

1

Vorrichtung

2

Teilanordnung

3

Teilanordnung

4

Laser

5

Strahlteiler

6

Umlenkspiegel

7

Umlenkspiegel

8

Umlenkspiegel

9

Dachspiegel

10

Laserstrahl

11

Teilstrahl

12

Teilstrahl

13

Firstkante

14

Kippwinkel

15

optische Achse

16

Piezoelement

17

Teleskop

18

Mikrolinsenarray

19

Achse

20

Mikrolinsenrad

21

Linsensystem

22

Linse

23

Objektiv

24

Probe

25

Okular

26

Kamera

27

Spiegel

28

Spiegel

29

Kurve

30

Kurve

31

Bereich

32

Kurve

33

Bereich

34

Kurve

Claims

1. Verfahren zur Mehrphotonenanregung einer Probe, wobei ein Laserstrahl in mindestens zwei kohärente Teilstrahlen gleicher Intensitätsverteilung um die jeweilige Strahlachse aufgespalten wird und wobei die Teilstrahlen aus verschiedenen Richtungen auf eine gemeinsame, quer zu den Strahlachsen verlaufende Meßebene ausgerichtet werden, so daß die Teilstrahlen in dem Bereich der Meßebene miteinander interferieren, dadurch gekenn zeichnet, daß die Teilstrahlen (11, 12) zueinander unter einem Kippwinkel (14) < 1 ausgerichtet werden und daß die Teilstrahlen (11, 12) durch ein gemeinsames Linsensystem (21) auf die Meßebene ausgerichtet werden, so daß eine durch die Interferenz der Teilstrahlen (11, 12) hervorgerufene Inten sitätsverteilung in der Meßebene Bereiche maximaler Intensität (31, 33) neben Bereichen minimaler Intensität aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein seitlicher Versatz der Teilstrahlen (11, 12) in der Meßebene kleiner ist als 50% der Halbwertsbreite der Intensitäts verteilung jedes Teilstrahls in der Meßebene.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilstrahlen (11, 12) in mindestens einen gemeinsamen Meßpunkt in der Meßebene fokussiert werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Phase mindestens eines Teilstrahls (12) durch Ändern seiner Weglänge moduliert wird, so daß sich die Bereiche maximaler Intensität in der Meßebene hin und her bewegen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Teilstrahlen (11, 12) in mehreren gemeinsamen, in der Meßebene nebeneinander liegenden Meßpunkten gleichzeitig fokussiert werden, wobei sie im Bereich aller Meßpunkte miteinander interferieren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand der Bereiche maximaler Intensität (31, 33) mindestens halb so groß ist wie der Abstand der Meßpunkte untereinander.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, mit einem einen Laserstrahl abgebenden Laser, mit den Laserstrahl in mindestens zwei kohärente Teilstrahlen gleicher Intensitätsverteilung um die jeweilige Strahlachse aufspaltenden Strahlteilungsmitteln, mit die Teilstrahlen in unterschiedlichen Richtungen ausrichtenden Strahllenkungsmitteln und mit die Teilstrahlen aus verschiedenen Richtungen auf eine gemeinsame, quer zu den Strahlachsen verlaufende Meßebene ausrichtenden Abbil dungsmitteln, wobei die Strahllenkungsmittel und die Abbildungsmittel so aufeinander eingestellt sind, daß die Teil strahlen in dem Bereich der Meßebene miteinander interferieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahllenkungsmittel (6 bis 9) die Teilstrahlen (11, 12) zueinander unter einen Kippwinkel (14) < 1 ausrichten, bevor die Teilstrahlen (11, 12) durch ein gemeinsames Linsensystem (21) der Abbildungsmittel hindurchtreten, das sie auf die Meßebene ausrichtet, so daß eine durch die Interferenz der Teilstrahlen (11, 12) hervorgerufene Intensitätsverteilung in der Meßebene Bereiche maximaler Intensität (31, 33) neben Bereichen minimaler Intensität aufweist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahllenkungsmittel einen Dachspiegel (9) aufweisen, an dessen Firstkante (13) die Teilstrahlen (11, 12) unter dem Kippwinkel (14) zusammengeführt werden.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich net, daß die Strahllenkungsmittel (6 bis 9) mindestens ein Umlenkelement (8) aufweisen, daß die Phase mindestens eines Teilstrahls (12) durch Ändern seiner Weglänge moduliert.

10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlteilungsmittel und die Strallenkungsmittel gemeinsam von einem optischen Element ausgebildet werden.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element eine aktive Oberfläche aufweist, die aus in Gruppen gegeneinander verkippten oder verkippbaren Mikrospiegeln zusammengesetzt ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element einen aktiven Durchgangsbereich aufweist, der aus Gruppen unterschiedlicher oder unterschiedlich ansteuerbarer Verzögerungsplättchen zusammengesetzt ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch ge kennzeichnet, daß das Linsensystem (21) die Teilstrahlen (11, 12) in mindestens einen gemeinsamen Meßpunkt in der Meßebene fokussiert.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Linsensystem (21) ein Mikrolinsenarray (18) aus mehreren in einer Ebene nebeneinander angeordneten Mikrolinsen aufweist, um die Teilstrahlen (11, 12) in mehreren gemeinsamen, in der Meß ebene nebeneinander liegenden Meßpunkten gleichzeitig zu fokussieren, wobei sie im Bereich aller Meßpunkte miteinander interferieren.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Kippwinkel (14) < Lambda/(M.NA.f) ist, wobei Lambda die Wellenlänge des Laserstrahls (10) und der Teilstrahlen (11, 12), M der Abbildungsmaßstab bei der Fokussierung der Teilstrahlen (11, 12) in jedem Meßpunkt, NA die numerische Apertur des Linsensystems (21) und f die Brennweite jeder Mikrolinse des Mikrolinsenarrays (18) ist.