DE102019100332B4

DE102019100332B4 - Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems sowie optisches Messsystem

Info

Publication number: DE102019100332B4
Application number: DE102019100332.6A
Authority: DE
Inventors: Markus Schappacher; Ralf Adelhelm
Original assignee: BMG Labtech GmbH
Current assignee: BMG Labtech GmbH
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2023-05-25
Anticipated expiration: 2039-01-09
Also published as: DE102019100332A1

Abstract

Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems (1), insbesondere eines Mikroplatten-Lesegeräts, welches zumindest einen optischen Detektor (2), zumindest eine erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (4), eine Messstrahlungsquelle sowie zumindest einen Strahlungsleiter (9) oder ein Strahlungsumlenkelement aufweist, mit den folgenden Schritten:a) Leiten einer Kalibrierstrahlung von der zumindest ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4) zu dem optischen Detektor (2) mittels des Strahlungsleiters (9) oder des Strahlungsumlenkelements, wobei die auf den optischen Detektor (2) auftreffende Kalibrierstrahlung eine Bestrahlungsstärke E aufweist;b) Bestimmen eines ersten Detektorausgangssignals IE,V1bei einem ersten Verstärkungswert V1des optischen Detektors (2);c) Bestimmen eines zweiten Detektorausgangssignals IE,V2bei einem zweiten Verstärkungswert V2des optischen Detektors (2);d) Ermitteln eines ersten Kalibrierfaktors IE,V2/IE,V1anhand des Verhältnisses des ersten Detektorausgangssignals IE,V1und des zweiten Detektorausgangssignals IE,V2zueinander.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems, insbesondere eines Mikroplatten-Lesegeräts, sowie ein optisches Messsystem, insbesondere ein Mikroplatten-Lesegerät.
Zur Durchführung von optischen Messungen an biologischen und chemischen Proben benötigt ein derartiges optisches Messsystem einen optischen Detektor bzw. Strahlungsempfänger mit hoher Detektionsempfindlichkeit, damit eine von den Proben emittierte Probenstrahlung vom optischen Detektor detektiert und in ein ausreichend hohes Detektorausgangssignal I umgewandelt werden kann. Je nach Art der von den Proben emittierten Probenstrahlung kann die Intensität der Probenstrahlung stark variieren. Beispielsweise können fluoreszierende Proben eine Probenstrahlung mit deutlich höherer Intensität im Vergleich zu biolumineszenten Proben emittieren. Weiterhin kann die Intensität der Probenstrahlung auch mit der Konzentration der fluoreszierenden Probe oder der biolumineszenten Probe variieren. Das optische Messsystem kann zudem auch eine geeignete Messstrahlungsquelle aufweisen, deren Messstrahlung zur Anregung der Probe verwendet werden kann. Werden mehrere Proben unterschiedlicher Probenstrahlungsintensität in dem optischen Messsystem untersucht bzw. analysiert, so muss der verwendete optische Detektor einen breiten Intensitätsbereich der Probenstrahlung detektieren und in ein ausreichend hohes Detektorausgangssignal I umwandeln können. Hierfür werden üblicherweise optische Detektoren verwendet, welche unterschiedliche Verstärkungswerte V aufweisen. Das bedeutet, dass ein Detektoreingangssignal, welches durch die auf den optischen Detektor auftreffende Probenstrahlung erzeugt wird, durch den optischen Detektor solcherart verstärkt wird, dass das Detektorausgangssignal I eine ausreichende Signalhöhe aufweist, um von einem Benutzer des optischen Messsystems abgelesen und analysiert werden zu können. Um Detektorausgangssignale I, welche bei unterschiedlichen Verstärkungswerten V des optischen Detektors ermittelt wurden, in einer gemeinsamen Messkurve darstellen und analysieren zu können, ist es erforderlich, die Art der Abhängigkeit des Detektorausgangssignals I von dem Verstärkungswert zu kennen und gegebenenfalls einen Abgleich bzw. eine Kalibrierung dieser Abhängigkeit vorzunehmen.
Meistens wird ein Photomultiplier als optischer Detektor in einem solchen optischen Messsystem verwendet. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit der Verwendung einer Photodiode, einer Multikanalplatte (Muli-Pixel Photon Counter) oder eines anderen Detektors, ggf. mit Verstärker. Ein Photomultiplier bzw. Photoelektronenvervielfacher umfasst unter anderem eine Photokathode und einen nachgeschalteten Sekundärelektronenvervielfacher in einem evakuierten Glaskolben. Die auf die Photokathode auftreffenden Photonen der Probenstrahlung lösen durch den sogenannten äußeren photoelektrischen Effekt Primärelektronen aus einer Photokatodenoberfläche heraus. Durch eine an den Photomultiplier angelegte Hochspannung werden die freigesetzten Primärelektronen in einem elektrischen Feld beschleunigt und treffen auf weitere Elektroden bzw. sogenannte Dynoden. Die Primärelektronen schlagen aus deren Dynodenoberfläche mehrere Sekundärelektronen heraus, welche wiederum durch das elektrische Feld beschleunigt werden. Aufgrund dessen nimmt die Anzahl der Sekundärelektronen von Dynode zu Dynode exponentiell zu. Schlussendlich treffen die Sekundärelektronen auf eine Anode und fließen zur Masse ab. Dabei erzeugen sie einen Stromfluss der proportional zur Photonenanzahl ist sowie elektrotechnisch gemessen wird und das zuvor beschriebene Detektorausgangssignal I generiert. Dieses Detektorausgangssignal I verhält sich idealtypisch proportional zur Bestrahlungsstärke (Photonenanzahl). Weiter steht das Signal I im Zusammenhang mit der am Photomultiplier angelegten Hochspannung, welche auch als (frei zugeordneter) Verstärkungswert V bezeichnet wird. Die angelegte Hochspannung bzw. der zugeordnete Verstärkungswert V kann von einem Benutzer frei gewählt werden und die Angabe eines Messwertes ist nur in Kombination mit Angabe des Verstärkungswertes sinnvoll. Derartige Photomultiplier haben den Vorteil, dass sie einen breiten Detektionsbereich für Strahlung unterschiedlichster Intensität aufweisen.
Um mehrere Detektorausgangssignale I, welche bei unterschiedlichen Verstärkungswerten V gemessen wurden, auf einer gemeinsamen Messskala anzeigen zu können, benötigt das optische Messsystem einen diesbezüglichen Abgleich bzw. eine Kalibrierung. Grund hierfür ist, dass die auf den optischen Detektor auftreffende Probenstrahlung bei gleicher Probenstrahlungsintensität zu unterschiedlichen Detektorausgangssignalen I führt, wenn sie bei unterschiedlichen Verstärkungswerten V gemessen wurde. Dieser Abgleich bzw. diese Kalibrierung wird im Weiteren stets allein Kalibrierung genannt, auch wenn bei strenger Auslegung des Begriffs Kalibrierung nicht alle Voraussetzungen für dessen Verwendung gegeben sein sollten, insbesondere die Kalibrierstrahlungsquelle selbst nicht auf einen Standard (ein Strahlungsnormal) zurückgeführt worden ist.
Die DE 600 13 256 T2 offenbart ein System zum Kalibrieren der Empfindlichkeit eines optischen Scanners mit einem optischen Mittel zum Erzeugen eines eingehenden Anregungsstrahls in Richtung einer Probe, mit einem Detektor zum Messen der optischen Leistung des aus der Richtung der Probe gerichteten Lichtes, mit einem diffusen Reflektor, der so angeordnet ist, dass er den eingehenden Anregungsstrahl während der Kalibrieroperationen von der Probe zurück zum Detektor leitet, wobei das System ferner einen Leistungsmesser enthält, der zum Messen der optischen Leistung des eingehenden Anregungsstrahls an einer geeigneten Stelle positioniert ist, wo der Strahl während der Messoperationen auf die Probe trifft.
Die US 2018 / 0 196 246 A1 offenbart ein Mikroskop, welches zur Multi-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie geeignet ist, umfassend eine Strahlungsquelle mit mehreren Lasern und einen optischen Detektor, wobei das Mikroskop zur Kalibrierung eines Verstärkungsfaktors des optischen Detektors mit einer separaten Kalibrierstrahlungsquelle nachgerüstet werden muss.
Aus der EP 3 088 866 A1 geht ein Verfahren zur Kalibrierung eines optischen Messsystems hervor, welches eine Messstrahlungsquelle zur Kalibrierung verwendet. Diese Messstrahlungsquelle ist als Blitzlampe ausgebildet, deren Wiederholgenauigkeit limitiert ist. Aufgrund dessen zielt das Verfahren auf eine höhere Messgenauigkeit mit Hilfe von Mittelungen einer Reihe von Einzelmessungen ab. Nachteilig im Verfahren ist der weitgehend unveränderbare Arbeitspunkt der Messstrahlungsquelle im optischen System, welcher sich negativ auf die Genauigkeit des Kalibrierverfahrens auswirkt.
Eine allgemein bekannte Alternative hierzu sieht die Verwendung von fluoreszierenden Proben als Strahlungsquellen für die Kalibrierung vor. Diese müssen von einem Benutzer entsprechend präpariert, vorbereitet und dem Gerät als Sondermittel zur Kalibrierung zur Verfügung gestellt werden. Unterlaufen dem Benutzer bei der Präparation der fluoreszierenden Proben Fehler, so ist die darauffolgende Kalibrierung des optischen Messsystems fehlerbehaftet. Zudem ist ein derartiges Verfahren sehr zeitintensiv für den Benutzer.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Kalibrierung eines optischen Messsystems sowie ein hierzu geeignetes optisches Messsystem anzugeben, welche sich durch eine hohe Kalibriergenauigkeit ohne zusätzliches Eingreifen durch einen Benutzer sowie die Verwendung von zusätzlichen Sondermitteln für die Kalibrierung auszeichnen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch ein optisches Messsystem mit den Merkmalen des Anspruchs 10 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 9 bzw. 11 bis 20.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems, insbesondere eines Mikroplatten-Lesegeräts, welches zumindest einen optischen Detektor, zumindest eine erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle, eine Messstrahlungsquelle sowie zumindest einen Strahlungsleiter oder ein Strahlungsumlenkelement aufweist, umfasst die folgenden Schritte:

a) Leiten einer Kalibrierstrahlung von zumindest der ersten Kalibrierstrahlungsquelle zu dem optischen Detektor mittels des Strahlungsleiters oder Strahlungsumlenkelements, wobei die auf den optischen Detektor auftreffende Kalibrierstrahlung eine Bestrahlungsstärke E aufweist;
b) Bestimmen eines ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 bei einem ersten Verstärkungswert V₁ des optischen Detektors;
c) Bestimmen eines zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 bei einem zweiten Verstärkungswert V₂ des optischen Detektors;
d) Ermitteln eines ersten Kalibrierfaktors I_E,V2/I_E,V1 anhand des Verhältnisses des ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 und des zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 zueinander.

Ein anderer Aspekt der Erfindung sieht ein optisches Messsystem, insbesondere ein Mikroplatten-Lesegerät vor, welches einen optischen Detektor, einen von einer Probenposition zu dem optischen Detektor führenden Detektionslichtweg, zumindest eine erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle, eine Messstrahlungsquelle sowie zumindest einen Strahlungsleiter oder ein Strahlungsumlenkelement umfasst. Der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement dienen zur Leitung der von der zumindest ersten Kalibrierstrahlungsquelle ausgestrahlten Kalibrierstrahlung in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors. Dieses optische Messsystem sowie seine nachfolgend beschriebenen vorteilhaften Ausgestaltungen sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Kalibrierverfahrens geeignet.
Bei dem optischen Messsystem kann es sich neben dem bereits genannten Mikroplatten-Lesegerät auch um ein Fluorometer, Luminometer, Photometer, Spektrophotometer, Spektrometer oder dergleichen handeln.
Der Begriff Detektionslichtweg bezieht sich auf einen Lichtweg im optischen Messsystem, den eine von einer Probe emittierte Probenstrahlung von der Probenposition zum optischen Detektor zurücklegt. Das erfindungsgemäße optische Messsystem weist neben der zumindest ersten Kalibrierstrahlungsquelle auch eine Messstrahlungsquelle auf, insbesondere eine Blitzlampe, eine Gleichlichtlampe, eine Leuchtdiode oder einen Laser. Mit dieser Messstrahlungsquelle kann die Probe solcherart angeregt werden, dass diese beispielsweise fluoresziert. Diese fluoreszente Probenstrahlung kann daraufhin durch den Detektionslichtweg zum optischen Detektor gelangen.
Der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumleitelement dienen zur Leitung der von der zumindest ersten Kalibrierstrahlungsquelle ausgestrahlten Kalibrierstrahlung in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors. Der Strahlungsleiter kann vorzugsweise ein röhrenförmiges, faserartiges oder stabförmiges Bauteil sein, das Strahlung über kurze oder lange Strecken transportieren kann. Die Strahlungsleitung kann dabei durch Reflexion an der Grenzfläche des Strahlungsleiters entweder durch Totalreflexion auf Grund eines geringeren Brechungsindex des den Strahlungsleiter umgebenden Mediums oder durch Verspiegelung der Grenzfläche erreicht werden. Das Strahlungsumlenkelement kann als Parabolspiegel ausgebildet sein, welcher aufgrund seiner konkaven Form zum Sammeln der Kalibrierstrahlung von zumindest der ersten Kalibrierstrahlungsquelle und Fokussieren dieser Kalibrierstrahlung auf den optischen Detektor dient. Weiterhin kann das Strahlungsumlenkelement jedoch auch als Strahlteiler, teil-transparenter Spiegel oder als Glasscheibe ausgebildet sein. Sowohl ein Strahlungsleiter in Form eines röhrenförmigen, faserartigen oder stabförmigen Bauteils als auch ein Strahlungsumlenkelement in Form eines Spiegels, einer (diffus, teil-gerichtet oder gerichtet-) reflektierenden (ausgerichteten, ggf. gekrümmten) Oberfläche, eines Parabolspiegels, eines Strahlteilers, eines teil-transparenten Spiegels oder einer Glasscheibe können die Kalibrierstrahlung von einer oder auch mehreren Kalibrierstrahlungsquellen in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors leiten. Auch kommt für diese Strahlweiterleitung und -umlenkung ein von Material freigestellte Shutterscheibe in Frage, die in der Mitte eine um 45° angestellte, von Eloxal freigefräste (teil-)reflektierende Aluminiumoberfläche besitzt.
Die Intensität der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle sowie deren Abstand von dem optischen Detektor korrelieren mit der Bestrahlungsstärke E, der auf den optischen Detektor auftreffenden Kalibrierstrahlung und damit auch mit dem Detektorausgangssignal I. Die zumindest erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle dient im erfindungsgemäßen Verfahren zur Nachahmung einer tatsächlichen Probe. Der Begriff „steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle“ bezieht sich hierbei auf eine Kalibrierstrahlungsquelle, deren Leistung und damit auch deren Intensität gesteuert, gegebenenfalls auch geregelt werden kann. Mittels einer Regelung kann eine automatische Korrektur der Betriebsbedingungen oder eine Stabilisierung der Intensität vorgenommen werden. Letzteres ist für weniger stabile Strahlungsquellen auf Glühwendel- oder Plasmabasis vorteilhaft.
Die Leistung und damit auch die Intensität der Kalibrierstrahlungsquelle kann vorzugsweise durch eine Steuerung des Stromflusses durch die Kalibrierstrahlungsquelle erfolgen. Ein hoher Stromfluss bewirkt hierbei eine hohe Leistung und damit auch eine hohe Intensität, während ein niedriger Stromfluss eine niedrige Leistung und damit auch eine niedrige Intensität bedingt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die zuvor beschriebenen Möglichkeiten zur Steuerung einer steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle beschränkt. Somit können unterschiedliche Intensitäten der Probenstrahlung nachgeahmt werden, indem die Intensität und somit auch die auf den Detektor auftreffende Bestrahlungsstärke E der Kalibrierstrahlung durch Steuerung der zumindest ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle variiert, d.h. erhöht oder vermindert werden. Dies ermöglicht eine Kalibrierung des optischen Messsystems für unterschiedliche Intensitäten, wie sie beispielsweise bei Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessungen auftreten. Es wird auch ermöglicht, verschiedene Messmodi zu kalibrieren, welche eine unterschiedliche elektrotechnische Verarbeitung der Detektorsignale vorsehen. Typische Messmodi des Detektors können beispielsweise ein AC-, DC-Betrieb, ein integrierendes Verfahren und ein Photon-Counting sein.
Der Kalibrierfaktor I_E,V2/I_E,V1 ist abhängig von der Bestrahlungsstärke E der auf den optischen Detektor auftreffenden Kalibrierstrahlung und somit von der Intensität der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle. Um das optische Messsystem für unterschiedliche Bestrahlungsstärken E bzw. Intensitäten der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle kalibrieren zu können, können die Verfahrensschritte a) bis d) mehrfach bei unterschiedlichen Intensitäten der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle durchlaufen werden. Die Intensität der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle kann dabei vorzugsweise stufenweise erhöht werden. Diese Wiederholung der Verfahrensschritte a) bis d) kann dabei solange durchgeführt werden, bis das optische Messsystem für im Wesentlichen alle Verstärkungswerte V des optischen Detektors kalibriert ist.
Der optische Detektor kann ein durch die auf ihn auftreffende Bestrahlungsstärke E verursachtes Detektoreingangssignal nicht nur in ein Detektorausgangssignal I umwandeln, sondern das Detektoreingangssignal bei dieser Umwandlung auch verstärken. Hierfür weist der optische Detektor eine Mehrzahl an Verstärkungswerten V auf, welche sich kontinuierlich oder stufenartig aneinanderreihen. Mit diesen Verstärkungswerten V kann das Detektoreingangssignal I verstärkt werden. Weist das Detektoreingangssignal eine nur geringe Signalstärke auf, so würde es ohne eine derartige Verstärkung möglicherweise zu keinem oder einem zu niedrigen Detektorausgangssignal I führen. Somit verringert der Verstärkungswert V des optischen Detektors eine Nachweisgrenze für die Probenstrahlung. Ein in dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie in dem erfindungsgemäßen optischen Messsystem verwendeter optischer Detektor ist dabei solcherart ausgebildet, dass das Detektorausgangssignal I im Wesentlichen mit zunehmendem Verstärkungswert V ansteigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren sowie das erfindungsgemäße optische Messsystem haben gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Kalibrierverfahren und optischen Messsystemen den Vorteil, dass kein wesentliches oder zusätzliches Bauvolumen benötigt wird und die Kalibrierung jederzeit und automatisch durchgeführt werden kann. Grund hierfür ist, dass das erfindungsgemäße optische Messsystem bereits im Auslieferungszeitpunkt zum Kunden alle für das Kalibrierverfahren notwendigen Bauteile, d.h. die zumindest erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle sowie den Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement aufweist. Somit müssen weder bestehende Bauteile des optischen Messsystems, wie beispielsweise eine Messstrahlungsquelle für die Kalibrierung ausgebaut, noch zusätzliche Sonderapparaturen an das optische Messsystem angebaut werden. Ein Benutzer kann beispielsweise direkt nach dem Einschalten des optischen Messsystems das Verfahren zu dessen automatischer Kalibrierung starten, um dadurch seine nachfolgende Messung sowie die daraus resultierenden Messergebnisse zu optimieren. Zudem kann das Verfahren zum automatischen Kalibrieren des optischen Messsystems auch zwischen Messungen durchgeführt werden.
Des Weiteren wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gesteigerte Messgenauigkeit erreicht. Dies liegt daran, dass die automatische Kalibrierung des optischen Messsystems mit zumindest der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle durchgeführt wird, welche eine gegenüber der ebenfalls im optischen Messsystem angeordneten Messstrahlungsquelle höhere Variabilität der Bestrahlungsstärke aufweist. Trotz eines geringeren Abstandes zum optischen Detektor ermöglicht der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement eine Leitung der Kalibrierstrahlung über den Detektionslichtweg zum optischen Detektor. Somit gelangen die Kalibrierstrahlung und die von einer Probe emittierte Probenstrahlung unabhängig voneinander über im Wesentlichen denselben Detektionslichtweg zum optischen Detektor. Da bereits alle für das Kalibrierverfahren notwendigen Bauteile im optischen Messsystem integriert sind und die Kalibrierung automatisch erfolgen kann, kann zudem auf ein zusätzliches Eingreifen von Bedienpersonal verzichtet werden.
Unter der zuvor beschriebenen Voraussetzung einer linearen Abhängigkeit zwischen dem Detektorausgangssignal I und der Intensität der Kalibrierstrahlung, kann der in Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelte Kalibrierfaktor I_E,V2/I_E,V1 mit jedem weiteren Detektorausgangssignal I_E,V1, welches bei einem Verstärkungswert V₁ bestimmt wurde, multipliziert werden, um ein kalibriertes Detektorausgangssignal I_E,kal zu erhalten, das mit den Detektorausgangssignalen I_E,V2, welches bei einer Verstärkung V₂ ermittelt wurden, vergleichbar ist. Somit können das kalibrierte Detektorausgangssignal I_E,kal und das Detektorausgangssignal I_E,V2 als Messwerte in einer gemeinsamen Messskala dargestellt werden. Dies erleichtert die Auswertung der Detektorausgangssignale bzw. Messwerte und erhöht deren Genauigkeit.
Der optische Detektor gibt das kalibrierte Detektorausgangssignal I_E,kal vorzugsweise in der relativen Einheit RFU (sog. „Relative Fluorescence Units“) aus. Das kalibrierte Detektorausgangssignal I_E,kal weist in diesem Fall einen Wert im Bereich der natürlichen Zahlen von Null bis mehrstellige Millionen RFU auf. Die Messskala mit relativer RFU-Einheit ist detektorspezifisch und muss zum Vergleich mit den Messwerten eines anderen optischen Messgeräts zunächst in eine physikalische Messgröße mit einer absoluten SI-Einheit umgerechnet werden. Eine mögliche, absolute SI-Einheit ist beispielsweise eine Konzentration, welche in mol pro Liter (mol/l) angegeben ist. In einem weiteren Verfahrensschritt f) kann daher vorzugsweise die Messskala mit einer relativen RFU-Einheit in eine Messskala mit einer absoluten SI-Einheit umgewandelt werden: Hierfür kann die aus dem Stand der Technik bekannte Verdünnungsreihe von Fluoreszein verwendet werden. Diese stellt ein populärer Standard dar, dessen Konzentration mit den kalibrierten Detektorausgangssignalen I_E,kal in RFU-Einheiten mittels einer entsprechenden Messreihe korreliert wird. Die Fluoreszein-Konzentration kann die RFU-Einheit daher gänzlich ersetzen und als weitläufig verbreiteter Standard für jeden Gerätetyp vergleichbare Werte liefern. Als Benennung für die Messskala bietet sich das sogenannte „Fluoreszein-Äquivalent“ (fluorescein equivalent, FE) in Einheiten der Konzentration, wie beispielsweise mol pro Liter (M=mol/I) oder nmol pro Liter (nM=nmol/l) an. Anstelle einer Fluoreszein-Verdünnungsreihe kann auch eine Verdünnungsreihe mit einem anderen lumineszierenden Stoff verwendet werden.
Der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement sind in einer ersten vorteilhaften Ausgestaltung des optischen Messsystems in den Detektionslichtweg einführbar und wieder herausführbar. Diese reversibel durchführbare Bewegung des Strahlungsleiters oder des Strahlungsumlenkelements kann dabei händisch oder automatisch erfolgen. Hierfür können der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement in einer entsprechenden Halterung angeordnet werden. Sofern sich der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement in ihrem in den Detektionslichtweg eingeführten Zustand befinden, kann eine von der ersten Kalibrierstrahlungsquelle ausgestrahlte Kalibrierstrahlung in den Strahlungsleiter eingekoppelt und in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors geleitet werden.
Es liegt hierbei im Rahmen der Erfindung, dass der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement auch dauerhaft im Detektionslichtweg angeordnet sein können. In diesem Fall sind der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement vorzugsweise solcherart im Detektionslichtweg angeordnet, dass der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement die zum optischen Detektor gelangende Probenstrahlung während einer Probenmessung kaum oder gar nicht behindern. Hierdurch kann die Anzahl an notwendigen Bauteilen des optischen Messsystems weiter reduziert werden.
Eine weitere vorteilhafte Weiterbildung des optischen Messsystems sieht vor, dass dieses zumindest einen beweglichen Shutter zum reversiblen Verschließen des Detektionslichtwegs aufweist. Der bewegliche Shutter ist ein Verschlusselement, welches in den Detektionslichtweg einführbar und wieder herausführbar ist. In seinem in den Detektionslichtweg eingeführten Zustand blockiert der Shutter im Wesentlichen alle von der Probenposition zum optischen Detektor über den Detektionslichtweg gelangende Probenstrahlung. Somit kann nur die von der ersten Kalibrierstrahlungsquelle ausgestrahlte Kalibrierstrahlung zum optischen Detektor gelangen. Das bedeutet, dass während der Kalibrierung keine unerwünschte Probenstrahlung oder sonstige Strahlung aus dem Detektionslichtweg auf den optischen Detektor treffen kann, welche zu einer fehlerhaften Kalibrierung des optischen Detektors führen könnte. Der bewegliche Shutter kann vorzugsweise als rotierbare Scheibe ausgebildet sein, welche an einer motorbetriebenen Drehachse befestigt ist. Alternative Ausgestaltungen sind mit Aktoren, Drehmagneten und linearen Schiebern realisierbar.
Eine weitere vorteilhafte Weiterbildung des optischen Messsystems sieht vor, dass der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement in den Shutter integriert ist. Somit kann der Strahlungsleiter oder das Strahlungsumlenkelement gemeinsam mit dem Shutter in den Detektionslichtweg eingeführt und wieder herausgeführt werden. Im Fall dieser Weiterbildung kann auf eine zusätzliche Halterung für den beweglichen Strahlungsleiter oder das bewegliche Strahlungsumlenkelement verzichtet werden. Dies wirkt sich positiv auf das Bauvolumen des optischen Messsystems aus.
Um die von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle ausgestrahlten Kalibrierstrahlung aus einem größeren Raumwinkel aufnehmen zu können und Strahlungsverluste zu vermeiden, sieht eine weitere vorteilhafte Weiterbildung des optischen Messsystems vor, dass der Strahlungsleiter eine Strahlungseinkoppelfläche sowie eine Strahlungsaustrittsfläche umfasst. Die Strahlungseinkoppelfläche weist in dieser vorteilhaften Weiterbildung eine raue und/oder gewölbte Oberfläche auf. Im Gegensatz hierzu kann die Strahlungsaustrittsfläche vorzugsweise eine glatte Oberfläche aufweisen und ermöglicht einen im Wesentlichen vertikal gerichteten Austritt der Kalibrierstrahlung. Vorzugsweise hat der Strahlungsleiter an der Strahlungseinkoppelfläche einen größeren Querschnitt als an der Strahlungsaustrittsfläche, so dass Strahlung von der Strahlungseinkoppelfläche zur Strahlungsaustrittsfläche fokussiert wird. Dies hat den Vorteil, dass die erste Kalibrierstrahlungsquelle nicht direkt in Verlängerung einer Längsachse des Strahlungsleiters angeordnet sein muss, sondern auch versetzt zur Verlängerung dieser Längsachse angeordnet sein kann, ohne dass es hierbei zu wesentlichen Strahlungsverlusten der Kalibrierstrahlung der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle kommt. Die Strahlungseinkoppelfläche kann vorzugsweise in einem Winkel von im Wesentlichen 90° gegenüber der Strahlungsaustrittsfläche geneigt sein. In diesem Fall verlässt die Kalibrierstrahlung den Strahlungsleiter um im Wesentlichen 90° versetzt wieder. Hierfür weist der Strahlungsleiter in dieser bevorzugten Weiterbildung eine interne 45° Fläche auf, an welcher eine Totalreflektion oder Spiegelung der Kalibrierstrahlung stattfinden kann, wodurch die Kalibrierstrahlung umgelenkt wird. In diesem Fall dient der Strahlungsleiter nicht nur zur reinen Strahlungsleitung, sondern auch zur Strahlungsumlenkung.
In einer ersten vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor dem Schritt a) ein weiterer Schritt x) durchgeführt, in welchem ein von einer Probenposition zu dem optischen Detektor führender Detektionslichtweg des optischen Messsystems mittels eines beweglichen Shutters reversibel geschlossen wird. Wie bereits zuvor erwähnt, kann nach dem Schließen des Detektionslichtwegs mittels des Shutters im Wesentlichen keine Probenstrahlung mehr von der Probe zum optischen Detektor gelangen, insbesondere auch keine Lumineszenz, die auch ohne Anregungslicht von der Probe kommt. Dies geschieht dadurch, dass der Shutter entweder händisch oder automatisch in den Detektionslichtweg eingeführt wird. Nach Beendigung des erfindungsgemäßen Kalibrierverfahrens kann der Shutter wieder aus dem Detektionslichtweg herausgeführt und eine Messung der von der Probe emittierten Probenstrahlung gestartet oder fortgesetzt werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass in Schritt a) die Kalibrierstrahlung von einer zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle zu dem optischen Detektor geleitet wird, wobei die Bestrahlungsstärke E durch einen ersten Neutraldichtefilter, welcher zwischen dem Strahlungsleiter oder dem Strahlungsumlenkelement und der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle angeordnet ist, abgeschwächt wird.
In einer hierzu komplementären, vorteilhaften Weiterbildung umfasst das optische Messsystem eine zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle, wobei zwischen der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und dem Strahlungsleiter oder dem Strahlungsumlenkelement ein erster Neutraldichtefilter angeordnet ist, der eine optische Dichte im Bereich von 0,1 bis 6,0, bevorzugt 1,0 bis 3,0, besonders bevorzugt 3,0 aufweist.
Die erste sowie die zweite Kalibrierstrahlungsquelle können entweder einzeln oder gemeinsam eingeschaltet werden. Weiterhin kann deren Intensität unabhängig voneinander variiert werden. Durch den Einbau einer zweiten Kalibrierstrahlungsquelle in das optische Messsystem wird der Intensitätsbereich und damit der Bestrahlungsstärkenbereich, welcher von den beiden Kalibrierstrahlungsquellen abgedeckt wird, erweitert. Aufgrund der rauen und/oder gewölbten Oberfläche der Strahlungseinkoppelfläche und der möglichen geringfügigen Fokussierung der Strahlung entlang des Strahlungsleiters kann auch die Kalibrierstrahlung der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle in den Strahlungsleiter eingekoppelt und in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors geleitet werden. Somit können die beiden Kalibrierstrahlungsquellen im Wesentlichen nebeneinander angeordnet werden, ohne dass es beim Einkoppeln ihrer Kalibrierstrahlung in den Strahlungsleiter zu wesentlichen Strahlungsverlusten kommt. Durch den Neutraldichtefilter wird die von der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle abgestrahlte Kalibrierstrahlung in Abhängigkeit von der optischen Dichte des Neutraldichtefilters abgeschwächt. Somit ist die Erweiterung des Intensitätsbereichs auch abhängig von der optischen Dichte des Neutraldichtefilters.
Durch die Verwendung einer ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle, einer zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle sowie des Neutraldichtefilters können Probenstrahlungen unterschiedlicher Intensitäten nachgeahmt werden. Soll das optische Messsystem beispielsweise für eine Lumineszenzmessung kalibriert werden, so reicht die Bestrahlungsstärke E der Kalibrierstrahlung der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle aus, welche durch den Neutraldichtefilter abgeschwächt wurde, um eine Probenstrahlung bei einer Lumineszenzmessung nachzuahmen. Eine bevorzugte Ausgestaltung sieht vor, dass der Neutraldichtefilter mit einer optischen Dichte von 3,0 zwischen dem Strahlungsleiter und der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle angeordnet sein kann. In diesem Fall kann der Neutraldichtefilter eine Durchlässigkeit für die Kalibrierstrahlung der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle von im Wesentlichen 0,1 % aufweisen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt a) die Kalibrierstrahlung einer dritten, zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle gleichartigen steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle zu dem optischen Detektor geleitet. In einer hierzu komplementären, vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen optischen Messsystems weist das optische Messsystem eine dritte, zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle gleichartige steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle auf. Aufgrund der rauen und/oder gewölbten Oberfläche der Strahlungseinkoppelfläche und der möglichen geringfügigen Fokussierung der Strahlung entlang des Strahlungsleiters kann auch die Kalibrierstrahlung der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle in den Strahlungsleiter eingekoppelt und in den Detektionslichtweg in Richtung des optischen Detektors geleitet werden. Somit können die drei Kalibrierstrahlungsquellen im Wesentlichen nebeneinander angeordnet werden, ohne dass es beim Einkoppeln ihrer Kalibrierstrahlung in den Strahlungsleiter zu wesentlichen Strahlungsverlusten kommt. Zwischen der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und der Strahlungseinkoppelfläche des Strahlungsleiters ist kein Neutraldichtefilter angeordnet. Sind sowohl die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle als auch die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle gleichartig ausgebildet, so können diese zum einen den Intensitätsbereich, welcher von den Kalibrierstrahlungsquellen abgedeckt wird, verbreitern und zum anderen für eine Linearitätskorrektur des optischen Detektors verwendet werden.
Damit auch eine Linearitätskorrektur des optischen Detektors für eine durch den Neutraldichtefilter abgeschwächten Kalibrierstrahlung durchgeführt werden kann, sieht eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens vor, dass in Schritt a) die Kalibrierstrahlung von einer vierten, zur zweiten Kalibrierstrahlungsquelle gleichartigen Kalibrierstrahlungsquelle zu dem optischen Detektor geleitet wird, wobei die Bestrahlungsstärke E durch zumindest einen Neutraldichtefilter, welcher zwischen dem Strahlungsleiter oder dem Strahlungsumlenkelement und der vierten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle angeordnet ist, abgeschwächt wird. In einer hierzu komplementären, vorteilhaften Weiterbildung umfasst das optische Messsystems eine vierte, zur zweiten Kalibrierstrahlungsquelle gleichartige steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle, wobei zwischen der vierten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und dem Strahlungsleiter oder dem Strahlungsumlenkelement ein zweiter Neutraldichtefilter angeordnet ist, der eine optische Dichte im Bereich von 0,1 bis 6,0, bevorzugt 1,0 bis 3,0, besonders bevorzugt 3,0 aufweist. Das bedeutet, dass das optische Messsystem in dieser vorteilhaften Weiterbildung paarweise zwei Kalibrierstrahlungsquellen mit Neutraldichtefilter und zwei Kalibrierstrahlungsquellen ohne Neutraldichtefilter aufweist. Aufgrund der rauen und/oder gewölbten Oberfläche der Strahlungseinkoppelfläche und der möglichen geringfügigen Fokussierung der Strahlung entlang des Strahlungsleiters liegen alle vier Kalibrierstrahlungsquellen immer noch im Gesichtsfeld des Strahlungsleiters, sodass deren Kalibrierstrahlung ohne wesentliche Strahlungsverluste in den Strahlungsleiter eingekoppelt und in den Detektionslichtweg in Richtung des Detektors geleitet werden kann.
Werden im optischen Messsystem mehrere Proben nacheinander analysiert bzw. untersucht, welche sich in der Intensität ihrer Probenstrahlung unterscheiden, so muss die jeweilige auf den optischen Detektor auftreffende Bestrahlungsstärke E bei unterschiedlichen Verstärkungswerten V vom optischen Detektor in ein Detektorausgangssignal I_E,V umgewandelt werden. Ein identischer Verstärkungswert V würde bei sehr niedrigen oder sehr hohen Bestrahlungsstärken E zu keinem oder einem verfälschten Detektorausgangssignal I_E,V führen. Um jedoch alle diese Detektorausgangssignale I_E,V der Proben in einer gemeinsamen Messskala anzeigen zu können, sieht eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens vor, dass die Verfahrensschritte a) bis d) bei einer Mehrzahl an Bestrahlungsstärken E und einer Mehrzahl an Verstärkungswerten V wiederholt werden, um eine Kalibrierkennfeld zu ermitteln. Dieses Kalibrierkennfeld stellt eine dreidimensionale Darstellung der Kalibrierfaktoren I_E,V2/I_E,V1 als Funktion unterschiedlicher Detektorausgangssignale I sowie unterschiedlichen Verstärkungswerten V des optischen Detektors dar. Anhand des Kalibrierkennfelds kann jedes bei einem bestimmten Verstärkungswert V gemessene Detektorausgangssignal I_E,V solcherart normiert werden, dass es mit allen weiteren Detektorausgangssignalen I_E,V in einer gemeinsamen Messskala angezeigt werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen optischen Messsystems ist der Strahlungsleiter aus Glas, Kunststoff, einem Hohlleiter oder einem transparenten, kristallinen Materialausgebildet ist.
Eine weitere vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemäßen optischen Messsystems sieht vor, dass der optische Detektor ein Photomultiplier, eine Mikrokanalplatte (multi channel plate, MCP),Silizium Photomultiplier (SiPM), Multi-Pixel Photon Counter (MPPC), eine Photodiode oder eine Avalanche-Photodiode ist.
Die steuerbaren Kalibrierstrahlungsquellen sind in einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen optischen Messsystems Leuchtdioden, insbesondere RGB-Leuchtdioden. Leuchtdioden weisen eine hohe Stabilität, der von ihnen abgestrahlten Lichtintensität auf. Hierdurch kann eine gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Kalibrierverfahren verbesserte Kalibriergenauigkeit erreicht werden. Bei einer RGB-Leuchtdiode handelt es sich um eine kombinierte Anordnung von drei Leuchtdioden, wobei eine erste Leuchtdiode rotes Licht, eine zweite Leuchtdiode grünes Licht und eine dritte Leuchtdiode blaues Licht abstrahlt. Durch die Verwendung einer RGB-Leuchtdiode können zusätzlich auch spektrale Einflüsse auf das Detektorausgangssignal I ermittelt und gegebenenfalls korrigiert werden.
Wie bereits zuvor erwähnt, kann nur unter der Voraussetzung einer linearen Abhängigkeit des Detektorausgangssignals I von der Intensität der Kalibrierstrahlungsquellen bzw. der auf den optischen Detektor auftreffenden Bestrahlungsstärke E der in Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelte Kalibrierfaktor I_E,V2/I_E,V1 mit einem Detektorausgangssignal I_E,V1, welches bei einer Verstärkung V₁ gemessen wurde, multipliziert werden, um ein kalibriertes Detektorausgangssignal I_E,kal zu erhalten, das mit weiteren Detektorausgangssignalen I_E,V2, welche bei einer Verstärkung V₂ gemessen wurden, vergleichbar ist. Zur Überprüfung und/oder Korrektur der Linearität des Detektorausgangssignals I von der Intensität der Kalibrierstrahlungsquellen bzw. der auf den optischen Detektor auftreffenden Bestrahlungsstärke E sieht eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens vor, dass vor dem Schritt a) ein weiterer Schritt y) durchgeführt wird, in welchem eine Linearitätskorrektur des optischen Detektors vorgenommen wird. Diese Linearitätskorrektur weist die folgenden Schritte auf:

y.i) Leiten der Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle mittels des Strahlungsleiters oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor und Bestimmen eines ersten Detektorausgangssignals I₁ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle;
y.ii) Leiten der Kalibrierstrahlung von der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle mittels des Strahlungsleiters oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor und Bestimmen eines zweiten Detektorausgangssignals I₂ für die Kalibrierstrahlung der dritten Kalibrierstrahlungsquelle;
y.iii) Leiten der Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle mittels des Strahlungsleiters oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor und Bestimmen eines Summen-Detektorausgangssignals I₃ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle und der dritten Kalibrierstrahlungsquelle;
y.iv) Ermitteln eines Linearitätsfaktors anhand einer Abweichung des Summen-Detektorausgangssignals I₃ von der errechneten Summe aus dem ersten Detektorausgangssignal I₁ und dem zweiten Detektorausgangssignal I₂.

Der ermittelte Linearitätsfaktor k hängt von der Intensität bzw. Bestrahlungsstärke des Detektoreingangssignals ab. Eine entsprechende Korrekturkurve k(Intensität) kann somit durch eine Mehrzahl von Messungen bei unterschiedlichen Eingangsintensitäten der ersten und der dritten Kalibrierstrahlungsquelle gemessen werden, wobei numerisch die betreffenden Gleichungssysteme I₁ + I₂ = k(Intensität) I₃ ausgewertet werden. Mit der Korrekturkurve kann für jedes weitere Detektorausgangssignal eine Linearitätskorrektur durchgeführt werden, um ein linearitätskorrigiertes Detektorausgangssignal I_Lin zu erhalten. Dies erleichtert die Auswertung der Detektorausgangssignale bzw. Messwerte und erhöht deren Genauigkeit.
Weist das optische Messsystem einen beweglichen Shutter auf, welcher in einem Verfahrensschritt x) in den Detektionslichtweg reversibel einführbar ist, um den Detektionslichtweg zu verschließen, so wird der Verfahrensschritt y) vorzugsweise zwischen den Verfahrensschritten x) und a) durchgeführt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle und die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle wechselseitig, periodisch wiederholt an- und ausgeschalten werden. Dieses wechselseitige, periodisch wiederholte An- und Ausschalten bei unterschiedlichen Frequenzen sowie bei gleichzeitiger Intensitätsmodulation der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle durchgeführt wird. Beispielsweise können mittels eines Funktionsgenerators die Kalibrierstrahlungsquellen mit einer Sägezahlfunktion betrieben werden. Durch das wechselseitige, periodisch wiederholte An- und Ausschalten der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle bei unterschiedlichen Frequenzen sowie bei gleichzeitiger Intensitätsmodulation der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle treffen im Sinne einer mathematischen Schwebung alle Zustände der ein- oder ausgeschalteten Kalibrierstrahlungsquelle aufeinander. Hierdurch können eine Mehrzahl an Linearitätsfaktoren für unterschiedliche Intensitäten der Kalibrierstrahlungsquellen zeitkontinuierlich ermittelt werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass das Bestimmen des ersten Detektorausgangssignals I₁, des zweiten Detektorausgangssignals I₂ und des Summen-Detektorausgangssignals I₃ bei unterschiedlichen Verstärkungswerten des optischen Detektors durchgeführt wird. Dies ermöglicht eine zeitkontinuierliche Ermittlung einer Mehrzahl an Linearitätsfaktoren für unterschiedliche Verstärkungswerte des optischen Detektors.
Anhand der beigefügten Zeichnungen werden ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäß ausgestalteten optischen Messsystems sowie ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems näher beschrieben und erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Schnittdarstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen optischen Messsystems in Seitenansicht;
2 eine schematische Schnittdarstellung eines Details des ersten Ausführungsbeispiels aus 1 in Draufsicht;
3 eine schematische Schnittdarstellung eines weiteren Details des ersten Ausführungsbeispiels aus 1 in Seitenansicht;
4 eine schematische Schnittdarstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen optischen Messsystems in Draufsicht; und
5 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

1 zeigt eine schematische Schnittdarstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen optischen Messsystems 1 in Seitenansicht. Dieses optische Messsystem 1 umfasst einen optischen Detektor 2, einen von einer Probenposition zu dem optischen Detektor 2 führenden Detektionslichtweg 3, eine erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 und eine zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 sowie zumindest einen beweglichen Shutter 6. Die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 ist in 1 aufgrund der Darstellung des optischen Messsystems 1 in Seitenansicht nicht erkennbar. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist das optische Messsystem 1 als Mikroplatten-Lesegerät ausgebildet.
Der bewegliche Shutter 6 ist mit einer Drehachse 7 verbunden, welche dazu dient, den Shutter 6 in den Detektionslichtweg 3 einzuführen und wieder herauszuführen. Die Drehachse 7 ist mit einem Motor 8 verbunden, sodass diese Bewegung des Shutters 6 automatisiert erfolgen kann. Wie in 1 dargestellt ist, blockiert der Shutter 6 in seinem in den Detektionslichtweg 3 eingeführten Zustand den Detektionslichtweg 3 solcherart, dass keine von einer Probe im Bereich der Probenposition abgestrahlte Probenstrahlung zum optischen Detektor 2 gelangen kann.
Der Shutter 6 weist einen integrierten bzw. eingebauten Strahlungsleiter 9 auf. Hierfür ist der Strahlungsleiter 9 in einer hierfür vorgesehenen Einfassung 10 im Shutter 6 angeordnet bzw. fixiert. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist der Strahlungsleiter 9 aus Kunststoff ausgebildet. Der Strahlungsleiter 9 ist im bzw. am Shutter 6 solcherart angeordnet, dass er im geschlossenen Zustand des Shutters 6 die von den beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 ausgestrahlte Kalibrierstrahlung in den Detektionslichtweg 3 in Richtung des Detektors 2 leiten kann.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 in Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 angeordnet. Zum Einkoppeln der von den beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 ausgestrahlten Kalibrierstrahlung und Leiten in den Detektionslichtweg 3 in Richtung des Detektors 2 weist der Strahlungsleiter 9 auf einer der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 zugewandten Seite eine Strahlungseinkoppelfläche 91, auf einer dem optischen Detektor 2 zugewandten Seite eine Strahlungsaustrittsfläche 92 sowie einen die Strahlungseinkoppelfläche 91 und die Strahlungsaustrittsfläche 92 miteinander verbindenden zylindrischen Körper 93 auf. Eine Lichtabgabefläche 41 der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 ist im Wesentlichen parallel zu der Strahlungseinkoppelfläche 91 des Strahlungsleiters 9 angeordnet.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist die Strahlungsaustrittsfläche 92 in einem Winkel von 90° gegenüber der Strahlungseinkoppelfläche 91 geneigt. Dadurch verlässt die in den Strahlungsleiter 9 eingekoppelte Kalibrierstrahlung den Strahlungsleiter 9 um im Wesentlichen 90° versetzt wieder. Für diese Umlenkung der Kalibrierstrahlung weist der Strahlungsleiter eine interne 45°-Fläche 94 auf, an welcher eine Totalreflektion der Kalibrierstrahlung stattfinden kann. Diese Ausbildung des Strahlungsleiters 9 ermöglicht, dass die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 im Wesentlichen solcherart im optischen Messsystem 1 angeordnet werden kann, dass die von ihr ausgestrahlte Kalibrierstrahlung im Strahlungsleiter 9 zunächst senkrecht zum Detektionslichtweg 3 geführt und dann in Richtung des optischen Detektors 2 umgelenkt werden kann.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind sowohl die erste steuerbare Kalibierstrahlungsquelle 4 als auch die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 als Leuchtdioden ausgebildet. Beide Kalibierstrahlungsquellen 4, 5 sind auf einer Leiterplatte 11 angeordnet bzw. fixiert, welche sowohl die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 als auch die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 mit Strom versorgt. Die Leistung sowie die daraus resultierende Intensität der Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 können jedoch unabhängig voneinander gesteuert werden. Die Leiterplatte 11 und somit auch die beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 sind in einen Rahmen 12 eingefasst, welcher ein seitliches Abstrahlen der beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 verhindert. Hierdurch wird eine unerwünschte, diffuse Streustrahlung im optischen Messsystem 1 verringert und dadurch die Messgenauigkeit des optischen Detektors 2 verbessert. Zudem wird die Leiterplatte 11 und somit auch die beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 gegen ein Verrutschen gesichert.
Im Detektionslichtweg 3 ist zwischen der Strahlungsaustrittsfläche 92 des Strahlungsleiters 9 und dem optischen Detektor 2 eine plankonvexe optische Linse 13 angeordnet. Eine planare Seite 131 der plankonvexen optischen Linse 13 zeigt hierbei in Richtung des optischen Detektors 2, während eine gewölbte Seite 132 der plankonvexen optischen Linse 13 in Richtung der Strahlungsaustrittsfläche 92 orientiert ist. Diese plankonvexe optische Linse 13 dient dazu, die vom Strahlungsleiter 9 in den Detektionslichtweg 3 in Richtung des Detektors 2 geleitete Kalibrierstrahlung auf eine aktive Sensorfläche 21 des optischen Detektors 2 zu fokussieren. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel handelt es sich bei dem optischen Detektor 2 um einen Photomultiplier.
Der Detektionslichtweg 3, die erste sowie die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4, 5, der bewegliche Shutter 6, die Drehachse 7 des Shutters 6, der Motor 8 für die Drehachse 7 des Shutters 6, der im Shutter 6 integrierte Strahlungsleiter 9, die Leiterplatte 11, der Rahmen 12 sowie die plankonvexe optische Linse 13 sind in einem Gehäuseblock 14 eingefasst, welcher verhindert, dass eine Umgebungsstrahlung das Detektorausgangssignal des Detektors 2 verfälscht. Der optische Detektor 2 befindet sich außerhalb des Gehäuseblocks 14 und ist an diesen angeschlossen.
2 zeigt eine schematische Schnittdarstellung eines Details des Ausführungsbeispiels aus 1 in Draufsicht. In dieser 2 wird nochmals deutlich, dass die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 solcherart im optischen Messsystem 1 angeordnet ist, dass sie sich im in den Detektionslichtweg 3 eingeführten Zustand des Shutters 6 in Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 befindet. Die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 ist seitlich zur Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 versetzt und benachbart zur ersten steuerbaren Kalibierstrahlungsquelle 4 angeordnet. Zwischen der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 5 und dem Strahlungsleiter 9 ist ein Neutraldichtefilter 15 angeordnet. Dieser Neutraldichtefilter 15 dient dazu, die von der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 5 im Bereich ihrer Lichtabgabefläche 51 ausgestrahlte Kalibrierstrahlung abzuschwächen. Aufgrund des Neutraldichtefilters 15 wird der Intensitätsbereich, welcher von der Kalibrierstrahlung der beiden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 abgedeckt wird, verringert. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel weist der Neutraldichtefilter 15 eine optische Dichte von 3,0 auf und verringert dadurch die Intensität der von der zweiten Kalibrierstrahlungsquelle 5 abgestrahlten Kalibrierstrahlung auf 0,1 %. Beide Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5 können entweder einzeln oder gemeinsam eingeschaltet werden. Wird beispielsweise nur die zweite Kalibrierstrahlungsquelle 5 eingeschaltet, so kann die von ihr ausgestrahlte Kalibrierstrahlung bei der Kalibrierung des optischen Messsystems 1 zur Nachahmung einer biolumineszenten Probenstrahlung verwendet werden. Wird hingegen nur die erste Kalibrierstrahlungsquelle 4 eingeschaltet, deren Intensität nicht durch einen Neutraldichtefilter verringert wird, so kann die von ihr ausgestrahlte Kalibrierstrahlung bei der Kalibrierung des optischen Messsystems 1 zur Nachahmung einer fluoreszenten Probenstrahlung verwendet werden.
Die Leiterplatte 11, auf welcher sowohl die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 als auch die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 angeordnet sind, ist mit einem elektronischen Steuergerät 16 über eine entsprechende elektrische Verkabelung 17 verbunden. Diese elektronische Steuerungseinheit 16 dient dazu, die Intensität der ersten und der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4, 5 zu variieren, d.h. zu erhöhen oder zu verringern. Die Intensität der Kalibrierstrahlung ist dabei proportional zu der auf den optischen Detektor 2 auftreffenden Bestrahlungsstärke E.
3 zeigt eine schematische Schnittdarstellung eines weiteren Details des Ausführungsbeispiels aus 1 in Seitenansicht. Damit sowohl das von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 als auch von der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 5, welche seitlich zur Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 versetzt und benachbart zur ersten steuerbaren Kalibierstrahlungsquelle 4 angeordnet ist, in den Strahlungsleiter 9 eingekoppelt und in den Detektionslichtweg 3 in Richtung des optischen Detektors 2 geleitet werden kann, weist die Strahlungseinkoppelfläche 91 auf einer den beiden Strahlungsquellen 4, 5 zugewandten Seite eine raue Oberfläche auf. Die raue Oberfläche bewirkt eine Einkopplung der auf die Strahlungseinkoppelfläche 91 treffenden Strahlung aus größeren Winkeln. Durch die raue Oberfläche der Strahlungseinkoppelfläche 91 wird der Raumwinkel, in welchem vom Strahlungsleiter 9 die Kalibrierstrahlung aufgenommen werden kann, erweitert. Das bedeutet, dass nicht nur die von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 vertikal abgestrahlte Kalibrierstrahlung vom Strahlungsleiter 9 aufgenommen werden kann, sondern auch die von der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 5 abgestrahlte Kalibrierstrahlung.
4 zeigt eine schematische Schnittdarstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen optischen Messsystems 1 in Draufsicht. Dieses zweite Ausführungsbeispiel unterscheidet sich vom ersten Ausführungsbeispiel dadurch, dass es eine dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 aufweist. Diese dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 ist seitlich versetzt zur Verlängerung zur Längsachse des Strahlungsleiters 9 und benachbart zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle 5 angeordnet. Das bedeutet, dass die erste, zweite und dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4, 5, 18 solcherart auf der Leiterplatte 11 nebeneinander angeordnet sind, dass ihre Lichtabgabeflächen 41, 51, 181 in Richtung des Strahlungsleiters 9 orientiert sind. Im vorliegenden zweiten Ausführungsbeispiel ist die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 ebenfalls als Leuchtdiode ausgebildet. Somit sind alle drei Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5, 18 gleichartig. Die Leistung sowie die daraus resultierende Intensität der Kalibrierstrahlungsquellen 4, 5, 18 können unabhängig voneinander gesteuert werden. Werden sowohl die erste als auch die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4, 18 gleichzeitig angeschaltet bzw. aktiviert, so summiert sich die Intensität der von ihnen abgestrahlte Kalibrierstrahlung auf. Somit kann der Intensitätsbereich, der von den Kalibrierstrahlungsquellen zu Nachahmung einer Probenstrahlung abgegebenen Kalibrierstrahlung deutlich gesteigert werden. Weiterhin kann mit der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 sowie der dritten Kalibrierstrahlungsquelle 18 eine Linearitätskorrektur und/oder eine Linearitätsprüfung des optischen Detektors 2 durchgeführt werden.
5 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches unter anderem mit dem zuvor beschriebenen zweiten Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen optischen Messsystems 1 durchgeführt werden kann.
In einem Verfahrensschritt x) wird der Detektionslichtweg 3 des optischen Messsystems 1 mittels des beweglichen Shutters 6 geschlossen. In anderen Worten bedeutet dies, dass der bewegliche Shutter 6 mittels der Drehachse 7, welche vom Motor 8 betrieben wird, automatisiert in seinen in den Detektionslichtweg 3 eingeführten Zustand überführt wird. Aufgrund dessen befindet sich die erste steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle des in dem Shutter 6 integrierten Strahlungsleiters 9 in der Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9. Die zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 5 ist seitlich zur Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 versetzt und benachbart zur ersten steuerbaren Kalibierstrahlungsquelle 4 angeordnet. Zur Nachahmung des Intensitätsbereichs einer Fluoreszenzmessung ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens nur die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 aktiviert. Das bedeutet, dass nur die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 eine Kalibrierstrahlung ausstrahlt.
In einem Verfahrensschritt a) wird die Kalibrierstrahlung der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 zu dem optischen Detektor 2 mittels des Strahlungsleiters 9 geleitet. Die dabei auf den optischen Detektor 2 auftreffende Kalibrierstrahlung weist eine Bestrahlungsstärke E auf, welche abhängig von der Intensität und damit von der Leistung der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 ist. Die auf den optischen Detektor 2 auftreffende Bestrahlungsstärke E bewirkt ein Detektoreingangssignal im optischen Detektor 2. Da es sich bei dem optischen Detektor 2 dieses Ausführungsbeispiels um einen Photomultiplier handelt, stellt das Detektoreingangssignal ein Maß für die Zahl an Primärelektronen dar, welche durch die auf eine Photokathode des Photomultipliers auftreffendenden Photonen herausgelöst werden.
In einem darauffolgenden Verfahrensschritt b) wird ein erstes Detektorausgangssignal I_E,V1 in Abhängigkeit von einem ersten Verstärkungswert V₁ des optischen Detektors bestimmt.
In einem weiteren Verfahrensschritt c) wird ein zweites Detektorausgangssignal I_E,V2 in Abhängigkeit von einem zweiten Verstärkungswert V₂ des optischen Detektors bestimmt. Das bedeutet, dass zwischen den Verfahrensschritten b) und c) der Verstärkungswert V von V₁ zu V₂ gewechselt wird.
Daraufhin wird in einem Verfahrensschritt d) anhand des ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 und des zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 ein erster Kalibrierfaktors I_E,V2/I_E,V1, welcher der Quotient des ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 und des zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 darstellt, ermittelt.
Unter der Voraussetzung einer linearen Abhängigkeit des Detektorausgangssignals I von Intensität der ersten Kalibrierstrahlungsquelle bzw. der auf dem optischen Detektor auftreffenden Bestrahlungsstärke E, kann der in Verfahrensschritt d) ermittelte Kalibrierfaktor I_E,V1/I_E,V2 mit jedem weiteren Detektorausgangssignal I_E,V2 bei einer Verstärkung V₂ multipliziert werden, um ein kalibriertes Detektorausgangssignal I_E,kal zu erhalten, das mit den Detektorausgangssignalen I_E,V1 bei einer Verstärkung V₁ vergleichbar ist. Somit können das kalibrierte Detektorausgangssignal I_E,kal und das Detektorausgangssignal I_E,V2 als Messwerte in einer gemeinsamen Messskala dargestellt werden. Dies ermöglicht eine gemeinsame Auswertung der Detektorausgangssignale I bzw. Messwerte.
Die zuvor beschriebenen Verfahrensschritte a) bis d) werden daraufhin bei einer Mehrzahl an Bestrahlungsstärken E und einer Mehrzahl an Verstärkungswerten V wiederholt, um ein Kalibrierkennfeld zu ermitteln. Dieses Kalibrierkennfeld stellt eine dreidimensionale Darstellung der Kalibrierfaktoren I_E,V2/I_E,V1 als Funktion unterschiedlicher Detektorausgangssignale I_E,V sowie unterschiedlichen Verstärkungswerten V des optischen Detektors dar. Anhand des Kalibrierkennfelds kann jedes bei einem bestimmten Verstärkungswert V gemessene Detektorausgangssignal I_E,V solcherart normiert werden, dass es mit allen weiteren Detektorausgangssignalen I_E,V in einer gemeinsamen Messskala angezeigt werden kann, auch wenn die Verstärkung geringfügig von der Bestrahlungsstärken E abhängt, weil beispielsweise der Detektor bei höheren Intensitäten in einen Sättigungsbereich kommt, in dem die Verstärkung sinkt.
Gibt es den Verdacht einer mangelnden linearen Abhängigkeit des Detektorausgangssignals I von der Intensität der steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle, so ist es erforderlich, zwischen dem Verfahrensschritt x) und dem Verfahrensschritt a) in einem Verfahrensschritt y) eine zusätzliche Linearitätskorrektur des optischen Detektors durchzuführen.
Zur Durchführung des Linearitätsabgleichs und der Linearitätskorrektur weist das optische Messsystem 1 - wie in 4 dargestellt - die dritte Kalibrierstrahlungsquelle 18 auf, welche in Verlängerung der Längsachse des Strahlungsleiters 9 sowie seitlich benachbart zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 angeordnet ist. Auch die dritte Kalibrierstrahlungsquelle 18 weist keinen Filter zwischen ihr und dem Strahlungsleiter 9 auf. Die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 und die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 sind als gleichartige Leuchtdioden ausgebildet.
Zunächst werden in einem Verfahrensschritt y.i) die Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 mittels des Strahlungsleiters 9 zu dem optischen Detektor 2 geleitet und ein erstes Detektorausgangssignal I₁ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 bestimmt. Hierfür wird die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 mit einem elektrischen Strom bei einem ersten Stromwert eingeschaltet. Der Stromwert, bei welchem die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 betrieben wird, bedingt die Intensität der von der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 ausgestrahlten Kalibrierstrahlung. Vor einem zweiten Verfahrensschritt y.ii) wird die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 wieder ausgeschaltet.
In dem zweiten Verfahrensschritt y.ii) wird die Kalibrierstrahlung von der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 mittels des Strahlungsleiters 9 zu dem optischen Detektor 2 geleitet und ein zweites Detektorausgangssignal I₂ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 18 bestimmt. Hierfür wird die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 mit einem elektrischen Strom bei einem zweiten Stromwert eingeschaltet.
In einem darauffolgenden Verfahrensschritt y.iii) wird die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 mit dem ersten Stromwert sowie die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 mit dem zweiten Stromwert betrieben. Die Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 und von der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 werden mittels des Strahlungsleiters 9 zu dem optischen Detektor 2 geleitet und ein Summen-Detektorausgangssignal I₃ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten Kalibrierstrahlungsquelle 18 bestimmt.
Somit werden in den Verfahrensschritten y.i), y.ii) und y.iii) ein erstes Detektorausgangssignals I₁ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4, ein zweites Detektorausgangssignals I₂ für die Kalibrierstrahlung der dritten Kalibrierstrahlungsquelle 18 sowie ein Summen-Detektorausgangssignal I₃ bestimmt, bei dem die erste ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 und die dritte Kalibrierstrahlungsquelle 18 gleichzeitig betrieben werden und somit die Summe der Lichtintensitäten der Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten Kalibrierstrahlungsquelle 18 am Detektoreingang anliegen.
Idealtypisch wird erwartet, dass die beiden zusammen strahlenden Kalibrierstrahlungsquellen 4, 18 die Summe der beiden Einzelergebnisse I₁ und I₂ aus den Verfahrensschritten y.i) und y.ii) ergeben. Damit kann das experimentell ermittelte Summen-Detektorausgangssignal I₃ aus Schritt y.iii) mit der theoretischen bzw. berechneten Summe I₁+I₂ aus dem ersten Detektorausgangssignal I₁ und dem zweiten Detektorausgangssignal I₂ verglichen werden. Weicht das experimentell ermittelte Summen-Detektorausgangssignal I₃ von der berechneten Summe I₁+I₂ ab, so wird in einem Verfahrensschritt y.iv) ein Linearitätsfaktor k anhand einer Abweichung des Summen-Detektorausgangssignals I₃ von der berechneten Summe aus dem ersten Detektorausgangssignal I₁ und dem zweiten Detektorausgangssignal I₂ ermittelt. Mit diesem Linearitätsfaktor k kann dann das Summen-Detektorausgangssignal I₃ korrigiert werden, wobei folgender Zusammenhang I₁+I₂=k I₃ besteht.
Der Linearitätsfaktor k ist intensitätsabhängig und gilt nur bei dem zugehörigen gemessenen Summen-Detektorausgangssignal I₃. Das bedeutet, es müssen alle Eingangsintensitäten durchgemessen werden, um die Korrekturfunktion k(Intensität) zu ermitteln. So sind also die Verfahrensschritte y.i) bis y.iv) bei einer Vielzahl an Intensitäten der beiden Kalibrierstrahlungsquellen durchzuführen. Auf diese Weise entsteht eine Linearitätskorrekturkurve k(Intensität) die verschiedentlich numerisch ausgewertet werden kann. Diese Auswertung erlaubt sowohl Aussagen über die Linearität des optischen Detektors (2) als auch die Verwendung als Linearitätskorrektur für zukünftige Messungen von Proben. Um die Verfahrensschritte y.i) bis y.iv) sinnvoll bei einer Vielzahl an Intensitäten zu wiederholen, wird die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 4 sowie die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle 18 wechselseitig bzw. abwechselnd sowie periodisch wiederholt an- und ausgeschalten. Dieses wechselseitige, periodisch wiederholte An- und Ausschalten der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 wird bei unterschiedlichen Frequenzen sowie bei gleichzeitiger Intensitätsmodulation der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 durchgeführt. Durch das wechselseitige, periodisch wiederholte An- und Ausschalten der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 bei unterschiedlichen Frequenzen sowie bei gleichzeitiger Intensitätsmodulation der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 4 und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle 18 treffen im Sinne einer mathematischen Schwebung alle Zustände der ein- oder ausgeschalteten Kalibrierstrahlungsquelle aufeinander. So kann durch zeitkontinuierliche Messung erreicht werden, dass alle Intensitäten beider Kalibrierlichtquellen in allen Kombinationen durchlaufen werden. So sind hinreichend viele Messwerte ermittelbar, die eine statistisch robuste Auswertung der Linearitätskorrekturkurve k(Intensität) ergibt.

Claims

Verfahren zum automatischen Kalibrieren eines optischen Messsystems (1), insbesondere eines Mikroplatten-Lesegeräts, welches zumindest einen optischen Detektor (2), zumindest eine erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (4), eine Messstrahlungsquelle sowie zumindest einen Strahlungsleiter (9) oder ein Strahlungsumlenkelement aufweist, mit den folgenden Schritten: a) Leiten einer Kalibrierstrahlung von der zumindest ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4) zu dem optischen Detektor (2) mittels des Strahlungsleiters (9) oder des Strahlungsumlenkelements, wobei die auf den optischen Detektor (2) auftreffende Kalibrierstrahlung eine Bestrahlungsstärke E aufweist; b) Bestimmen eines ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 bei einem ersten Verstärkungswert V₁ des optischen Detektors (2); c) Bestimmen eines zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 bei einem zweiten Verstärkungswert V₂ des optischen Detektors (2); d) Ermitteln eines ersten Kalibrierfaktors I_E,V2/I_E,V1 anhand des Verhältnisses des ersten Detektorausgangssignals I_E,V1 und des zweiten Detektorausgangssignals I_E,V2 zueinander.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem vor dem Schritt a) ein weiterer Schritt x) durchgeführt wird, in welchem ein von einer Probenposition zu dem optischen Detektor (2) führender Detektionslichtweg (3) des optischen Messsystems (1) mittels eines beweglichen Shutters (6) reversibel geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem in Schritt a) die Kalibrierstrahlung auch von einer zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (5) zu dem optischen Detektor (2) geleitet wird, wobei die Bestrahlungsstärke E durch einen ersten Neutraldichtefilter (15), welcher zwischen dem Strahlungsleiter (9) oder dem Strahlungsumlenkelement und der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (5) angeordnet ist, abgeschwächt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem in Schritt a) die Kalibrierstrahlung auch von einer dritten, zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle (4) gleichartigen steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (18) zu dem optischen Detektor (2) geleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem in Schritt a) die Kalibrierstrahlung auch von einer vierten, zur zweiten Kalibrierstrahlungsquelle (5) gleichartigen steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle zu dem optischen Detektor (2) geleitet wird, wobei die Bestrahlungsstärke E durch einen zweiten Neutraldichtefilter, welcher zwischen dem Strahlungsleiter (9) oder dem Strahlungsumlenkelement und der vierten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle angeordnet ist, abgeschwächt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welchem die Schritte a) bis d) bei einer Mehrzahl an Bestrahlungsstärken E und einer Mehrzahl an Verstärkungswerten V wiederholt werden, um ein Kalibrierkennfeld zu ermitteln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei welchem vor dem Schritt a) ein weiterer Schritt y) durchgeführt wird, in welchem eine Linearitätskorrektur des optischen Detektors (2) bei einem festgelegten Verstärkungswert (V) vorgenommen wird, wobei die Linearitätskorrektur die folgenden Schritte aufweist: y.i) Leiten der Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4) mittels des Strahlungsleiters (9) oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor (2) und Bestimmen eines ersten Detektorausgangssignals I₁ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle (4); y.ii) Leiten der Kalibrierstrahlung von der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (18) mittels des Strahlungsleiters (9) oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor (2) und Bestimmen eines zweiten Detektorausgangssignals I₂ für die Kalibrierstrahlung der dritten Kalibrierstrahlungsquelle (18); y.iii) Leiten der Kalibrierstrahlung von der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4) und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (18) mittels des Strahlungsleiters (9) oder dem Strahlungsumlenkelement zu dem optischen Detektor (2) und Bestimmen eines Summen-Detektorausgangssignals I₃ für die Kalibrierstrahlung der ersten Kalibrierstrahlungsquelle (4) und der dritten Kalibrierstrahlungsquelle (18); y.iv) Ermitteln eines Linearitätsfaktors k anhand einer Abweichung des Summen-Detektorausgangssignals I₃ von der berechneten Summe aus dem ersten Detektorausgangssignal I₁ und dem zweiten Detektorausgangssignal I₂.
Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die erste steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (4) und die dritte steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (18) wechselseitig, periodisch wiederholt an- und ausgeschalten werden, wobei das wechselseitige, periodisch wiederholte An- und Ausschalten bei unterschiedlichen Frequenzen sowie bei gleichzeitiger Intensitätsmodulation der ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4) und der dritten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (18) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei welchem das Bestimmen des ersten Detektorausgangssignals I₁, des zweiten Detektorausgangssignals I₂ und der Summe aus dem ersten Detektorausgangssignal I₁ und dem zweiten Detektorausgangssignal I₂ bei unterschiedlichen Verstärkungswerten (V) des optischen Detektors (2) durchgeführt wird.
Optisches Messsystem (1), insbesondere ein Mikroplatten-Lesegerät, das zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorangegangenen Ansprüche geeignet ist, mit einem optischen Detektor (2), einem von einer Probenposition zu dem optischen Detektor (2) führenden Detektionslichtweg (3), zumindest einer ersten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (4), einer Messstrahlungsquelle sowie zumindest einem Strahlungsleiter (9) oder Strahlungsumlenkelement zur Leitung der von der zumindest ersten Kalibrierstrahlungsquelle (4) ausgestrahlten Kalibrierstrahlung in den Detektionslichtweg (3) in Richtung des optischen Detektors (2).
Optisches Messsystem (1) nach Anspruch 10, bei welchem der Strahlungsleiter (9) oder das Strahlungsumlenkelement in den Detektionslichtweg (3) einführbar und wieder herausführbar ist.
Optisches Messsystem (1) nach Anspruch 10 oder 11, welches zumindest einen beweglichen Shutter (6) zum reversiblen Verschließen des Detektionslichtwegs (3) aufweist.
Optisches Messsystem (1) nach Anspruch 12, bei welchem der Strahlungsleiter (9) oder das Strahlungsumlenkelement in den Shutter (6) integriert ist.
Optisches Messsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei welchem der Strahlungsleiter (9) eine Strahlungseinkoppelfläche (91) sowie eine Strahlungsaustrittsfläche (92) umfasst, wobei die Strahlungseinkoppelfläche (91) eine raue und/oder gewölbte Oberfläche aufweist und vorzugsweise in einem Winkel von im Wesentlichen 90° gegenüber der Strahlungsaustrittsfläche (92) geneigt ist.
Optisches Messsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 14, welches eine zweite steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (5) aufweist, wobei zwischen der zweiten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle (5) und dem Strahlungsleiter (9) oder dem Strahlungsumlenkelement ein erster Neutraldichtefilter (15) angeordnet ist, der eine optische Dichte im Bereich von 0,1 bis 6,0, bevorzugt 1,0 bis 3,0, besonders bevorzugt 3,0 aufweist.
Optisches Messsystem (1) nach Anspruch 15, welches eine dritte, zur ersten Kalibrierstrahlungsquelle (4) gleichartige steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle (18) aufweist.
Optisches Messsystem (1) nach Anspruch 16, welches eine vierte, zur zweiten Kalibrierstrahlungsquelle (5) gleichartige steuerbare Kalibrierstrahlungsquelle umfasst, wobei zwischen der vierten steuerbaren Kalibrierstrahlungsquelle und dem Strahlungsleiter (9) oder dem Strahlungsumlenkelement ein zweiter Neutraldichtefilter angeordnet ist, der eine optische Dichte im Bereich von 0,1 bis 6,0, bevorzugt 1,0 bis 3,0, besonders bevorzugt 3,0 aufweist.
Optisches Messsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 17, bei welchem der Strahlungsleiter (9) aus Glas, Kunststoff, einem Hohlleiter oder einem transparenten, kristallinen Material ausgebildet ist.
Optisches Messsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 18, bei welchem der optische Detektor (2) ein Photomultiplier, eine Mikrokanalplatte, ein Silizium-Photomultiplier, ein Multi-Pixel Photon Counter, eine Photodiode oder eine Avalanche-Photodiode ist.
Optisches Messsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 19, bei welchem die steuerbaren Kalibrierstrahlungsquellen (4,5,18) Leuchtdioden, insbesondere RGB-Leuchtdioden sind.