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Spektralfluoreszenzmesser Die Erfindung bezieht sich auf Lumineszenzspektroskopie
und insbesondere auf Spektralfluoreszenzmesser zur Wellenlängenmessung der von Proben
emittierten Lumineszenzstrahlung einschließlich der Messung von Fluoreszenz- und
Phosphoreszenzstrahlung.
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Lumineszenzspektroskopie wird vielfach sowohl für qualitative als
auch quantitative analytische Messungen bei einer Vielzahl von Stoffen einschließlich
Drogen und anderer pharmazeutischer,
biochemischer und biologischer
Stoffe sowie organischer und anorganischer Substanzen angewendet. Beispielsweise
verwenden klinische Analysen Fluoreszenzverfahren zur Bestimmung von Steroide, Östrogenen,
Catechinaminen, Nucleinsäuren, Enzymen und Proteinen. Pharmazeutische Anwendungen
umfassen die Messung von Aspirin in Blut, Riboflavin und anderen Medizinen.
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Organische Stoffe können oftmals durch Fluoreszenzmessungen charakterisiert
werden und es gibt zahlreiche Anwendungen in verschiedenen Industriezweigen, beispielsweise
bei Tabak, Bier, Waschmittel, Druck, Ö1 und Insektiziden.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Spektralfluoreszenzmesser,
bei denen Licht aus einer Lichtquelle mit kontinuierlichem Spektrum durch einen
Erregungsmonochromator geleitet und zur Erregung einer Fluoreszenzprobe verwendet
wird. Das von der Probe emittierte Licht wird durch einen Emissionsmonochromator
geleitet und sodann gemessen. Durch Anwendung eines abtastenden Spektralfluoreszenzmessers,
bei dem die sowohl vom Erregungsmonochromator als auch Emissionsmonochromator durchgelassenen
Wellenlängen veränderlich sind, ist es möglich, sowohl Emissions- als auch Erregungsspektrum
zu untersuchen. Bei Emissionsspektren wird die Wellenlänge der Erregungsstrahlung
konstant gehalten und Messungen der emittierten Strahlung werden bei sich ändernden
Wellenlängen durchgeführt. Bei Erregungsspektren wird die Wellenlänge der gemessenen
Strahlung konstant gehalten, während die Wellenlänge der Erregungsstrahlung verändert
wird.
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Die Empfindlichkeit und Selektivität von Emissionsmessungen in der
Lumineszenzspektroskopie ist mehrere Größenordnungen höher als übliche Absorptionsspektroskopiemessungen.
Bei vorhandenen Geräten begrenzt der Nachweis mit Gleichspannungsmethoden die maximal
erzielbare Empfindlichkeit infolge von Schrotrauschen u.dgl. Ferner erlauben optische
Systeme mit Linsen und nicht-achromatischen Spiegeln zugleich mit der
Abwesenheit
jeglicher Einrichtungen zur Überwachung und Korrektur von Schwankungen in der Intensität
des Erregungsbündels (sowohl mit der Zeit als auch mit der Wellenlänge) keine Aufzeichnung
genauer Erregungs- und Emissionsspektren infolge der den Geräten innewohnenden Mängel.
Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ergibt eine außergewöhnliche Empfindlichkeit
und Selektivität und erzielt korrigierte Erregungsspektren und Emissionsspektren,
die bei Verwendung einer normalen Lichtquelle leicht korrigiert werden können. Die
hohe Empfindlichkeit des Geräts ermöglicht die Verwendung von niedrigen Lichtwerten
des Erregungsbündels, so daß eine Lichtzersetzung der Probe vermieden wird.
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Durch die Erfindung soll ein verbesserter empfindlicher Spektralfluoreszenzmesser
zur Messung von Emissions- und Erregungsspektren geschaffen werden.
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Demgemäß schafft die Erfindung einen Spektralfluoreszenzmesser zur
Feststellung der Lumineszenzintensität bei verschiedenen, von einer untersuchten
Probe emittierten Wellenlängen, mit einer Probenstation, in der eine Probe an einer
vorbestimmen Stelle angeordnet werden kann, einer Blitz- oder pulsierenden Licht
quelle einschließlich einer Plasmaentladungslampe, zur Erzeugung einer Erregungsstrahlung
über einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich und zum Emittieren von Strahlung
mit intermittierenden Intensitätsspitzen bei einer gewünschten Frequenz, gekennzeichnet
durch einen Erregungsmonochromator, der zwischen der Lichtquelle und der Probenstation
angeordnet ist, zur Übertragung von Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge zur
Probe, ein erstes optisches System zum Fokussieren des aus dem Erregungsmonochromator
kommenden Lichts auf die Probenstation, eine Einrichtung im Strahlungsweg zwischen
dem Erregungsmonochromator und der Probenstation zum Leiten eines Bezugsstrahlungsbundels
auf einen Bezugsstrahlungsdetektor und somit zur Erzeugung eines Korrektursignals
für Schwankungen
der Lichtintensität der Lichtquelle, einen Emissionsmonochromator
zum Empfang der Lumineszenzstrahlung aus der untersuchten Probe über ein zweites
optisches System und zum Übertragen von Strahlung mit einer ausgewählten Wellenlänge
auf eine Detektoreinrichtung, wobei die beiden Monochromatoren jeweils durch einen
zugehörigen Schrittmotor einstellbar sind, um die Wellenlänge der von den Monochromatoren
durchgelassenen Strahlung zu verändern, die Detektoreinrichtung einen Photomultiplier
aufweist, der auf die vom Emissionsmonochromator durchgelassene Strahlung anspricht
und ein von der Intensität der Lumineszenzstrahlung bei der vom Emissionsmonochromator
durchgelassenen Wellenlänge abhängiges Signal erzeugt, und wobei das erste und zweite
optische System auf sphärische und chromatische Aberration korrigiert ist.
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Die Plasmaentladungslampe enthält Gas, durch das zur Erzeugung von
Blitzen oder Impulslicht eine Entladung stattfindet. Die Lampe wird normalerweise
durch die plötzliche Freigabe einer hohen elektrischen Energiespitze erregt, so
daß die Temperatur des Plasmas auf einen Wert erhöht wird, bei der starke Lichtblitze
mit einem im wesentlichen kontinuierlichen Spektrum erzeugt werden.
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Eine bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, daß das
erste und zweite optische System sphärische oder elliptische Spiegel umfaßt, so
daß die Verwendung von Linsen vermieden wird.
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Es sind Spektralfluoreszenzmesser bekannt, die Gleichspannungsmethoden
zum Nachweis benutzen, und die Empfindlichkeit und Selektivität wird dabei durch
aus den Gleichspannungsquellen stammendes Rauschen, wie Streulicht und Schrotrauschen,
begrenzt. Um dies zu vermeiden, verwendet der Spektralfluoreszenzmesser gemäß der
Erfindung vorzugsweise einen Einfangverstärker, einen Impulsspitzendetektor oder
eine Photonenz
åhleinr-ichtung in der Detektoreinrichtung. Bei einem
Einfangverstärker oder Impulsspitzendetektor ist ein Verstärker vorgesehen, der
Signale aus dem Photomultiplier nur bei der gewünschten Frequenz feststellt, bei
der Licht von der Lichtquelle emittiert wird. Auf diese Weise werden Streulichtsignale
mit unterschiedlicher Frequenz ausgeschaltet. Bei einer Photonenzähleinrichtung
können Anzeigen erhalten werden, wenn Licht von der Lichtquelle emittiert wird,
und während Perioden, in denen kein Licht von der Lichtquelle emittiert wird, so
daß auf diese Weise eine Dunkelzählung vorgenommen wird, die zur Erzielung einer
korrigierten Meßanzeige verwendet werden kann.
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Dies ist bei Fluoreszenzsignalen geringer Stärke erforderlich, die
in ihrer Größe mit der Dunkelzählung vergleichbar sind.
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Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus,
daß der Bezugsstrahlungsdetektor einen Photomultiplier zum Empfang eines intermittierenden
Signals aus dem auf die Probenstation gerichteten Strahlungsbündel aufweist. Die
zwischen dem Erregungsmonochromator und der Probenstation angeordnete Einrichtung
zum Leiten von Strahlung auf den Bezugsstrahlendetektor kann eine reflektierende
Einrichtung zur Erzielung intermittierender Reflexion auf den Bezugsphotomultiplier
aufweisen. Der Bezugsphotomultiplier kompensiert vorzugsweise Intensitätsänderungen
des Erregungsbündels mit der Wellenlänge sowie mit der Zeit. Dies kann dadurch erreicht
werden, daß der Bezugsphotomultiplier einen Wellenlängenumwandler, wie eine Lösung
von Rhodamin B in Äthylenglycol, im Strahlungsweg zum Bezugsphotomultiplier aufweist,
so daß bei Änderung der Wellenlänge der auf die Probe gerichteten Strahlung der
Wellenlängenumwandler die Strahlung in eine feste Wellenlänge oder ein festes Spektrum
umwandelt und dadurch der Bezugsphotomultiplier stets Strahlung der gleichen Wellenlänge
empfängt.
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Vorzugsweise ist die Probenstation in einem Gehäuse angeordnet, 0
das über einen Bereich von mehr als 180 zugänglich ist, so
daß die
automatische Zuführung der Proben in die Station vereinfacht wird. Vorzugsweise
ist das Probenstationgehäuse so angeordnet, daß es an einer Seite des Spektralfluoreszenzmessers
vorsteht, so daß das Gehäuse auf drei Seiten zugänglich ist. So können Proben in
die Station eintreten und dieselbe verlassen, indem sie längs eines geraden Weges
durch zwei gegenüberliegende Seiten des Gehäuses laufen.
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Anhand der Figuren werden zwei Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen
Spektralfluoreszenzmessers näher erläutert.
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Es zeigt Fig. 1 ein Blockschaltbild einer ersten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Spektralfluoreszenzmessers; Fig. 2 eine vergrößerte schematische
Ansicht eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Anordnung; Fig. 3 eine vergrößerte schematische
Ansicht eines anderen Teils der in Fig. 1 gezeigten Anordnung; Fig. 4 schematisch
eine andere Anordnung eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung; Fig. 5A bis
5E verschiedene Kurvenformen, die auf der Arbeitsweise des in Fig. 1 gezeigten Spektralfluoreszenzmessers
beruhen; und Fig. 6 eine bevorzugte Anordnung eines Spektralfluoreszenzmessers gemäß
der Erfindung.
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Die in Fig. 1 gezeigte allgemeine Anordnung umfaßt eine Plasmaentladungs-Lichtquelle
11, die ein kontinuierliches Spektrum im Wellenlängenbereich vom 200 bis 1 000 Nanometer
erzeugt. Das aus der Lichtquelle kommende Licht wird intermittierend auf einen Erregungsmonochromator
12 gegeben, der durch einen Auslaßschlitz 13 ein Strahlungsbündel mit einer Wellenlänge
aussendet, die durch einen Schrittmotor 14 gesteuert wird, dessen Betrieb die vom
Monochromator 12 ausgesandte Wellenlänge einstellt. Die den Schlitz 13 verlassende
Strahlung verläuft längs eines Weges 15 zu einer Probenstation 16 in einem Probengehäuse
17. Die Strahlung wird auf dem Weg 15 durch zwei Spiegelflächen 18 und 19 durch
ein Fenster 20 in das Probengehäuse 17 reflektiert. Die Reflexionsfläche 18 ist
eben und der Spiegel 19 ist sphärisch oder elliptisch.
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Die Reflexionsflächen 18 und 19 bilden ein erstes optisches System
zur Fokussierung der vom Monochromator 12 längs des Weges 15 in die Probenstation
16 fallenden Strahlung. Auf dem Strahlungsweg 15 ist eine Einrichtung 21 zur intermittierenden
Reflexion eines Bezugsbündels 22 auf einen Bezugsphotomultiplier 23 angeordnet.
Ein Wellenlängenumwandler 24 ist im Weg des reflektierten Bündels unmittelbar vor
dem Photomultiplier 23 vorgesehen. Die von der Probe 16 emittierte Fluoreszenz wird
senkrecht zur Richtung der auf die Probe 16 einfallenden Strahlung gemessen. Das
emittierte Bündel 25 verläßt das Gehäuse 17 durch ein Fenster 26 und wird durch
ein zweites optisches System, das einen sphärischen Spiegel 27 und die rückwärtige
Reflexionsfläche 28 des Spiegels 18 umfaßt, auf den Einlaßschlitz 29 eines Emissionsmonochromators
30 reflektiert. Der Emissionsmonochromator 30 ist allgemein gleich aufgebaut wie
der Erregungsmonochromator 12 und seine Wellenlängendurchlässigkeit ist durch einen
Schrittmotor 31 einstellbar. Das den Emissionsmonochromator verlassende Licht wird.
auf einen Signalphotomultiplier 32 gegeben, der in einem gekühlten Gehäuse angeordnet
ist. Das Ausgangssignal des
Photomultipliers wird auf eine Steueranordnung
33 gegeben, die außerdem ein Signal vom Bezugsphotomultiplier 23 empfängt und Steuersignale
an die Schrittmotorm 14 und 31 gibt. Das endgültige Ausgangssignal wird auf eine
Anzeigeanordnung 34 gegeben, die mit der Steueranordnung 33 verbunden ist. Die Lichtquelle
40 wird durch eine getrennte Steueranordnung 35 gesteuert. Das Probengehäuse 17
ist an einer Ecke des Spektralfluoreszenzmessers angeordnet, der auf einem allgemein
rechteckigen Tisch ausgebildet ist. Auf diese Weise ist die Probenstation 16 von
zwei Seiten des Gehäuses 17 zugänglich, so daß ein Zugang über einen Bereich von
mehr als 1800 möglich ist. Daher kann ein Drehtisch 36 vorgesehen werden, der durch
zwei benachbarte Seiten des Gehäuses 17 verläuft und eine automatische Eingabe und
Ausgabe einer Probenfolge in die bzw. aus der Probenstation 16 ermöglicht. So ist
ein automatischer Betrieb möglich.
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Im folgenden werden die Einzelteile ausführlicher besprochen.
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Die Lichtquelle 11 kann eine periodisch aufleuchtende Blitzlampe oder
eine modulierte oder pulsierende Lichtquelle sein, vorausgesetzt, daß die Modulationsbreite
größer als 50% ist.
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Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird eine Kapillarplasma-Blitzlampe
40 verwendet. Fig. 2 zeigt die Lichtquelle 11 im einzelnen. Diese Lichtquelle wird
vorzugsweise im Hinblick auf Spitzenintensität, Spektralverteilung und geometrische
Abmessungen gewählt. Die Lampe wird mit Blitzen hoher Stromdichte betrieben und
dadurch wird das spektrale Emissionsmaximum zu kürzeren Wellenlängen verschoben.
Die Lichtquelle 11 muß Strahlung intermittierend mit einer gewünschten Frequenz
emittieren. Bei dem beschriebenen Beispiel ist ein Zerhacker 41 vor dem Einlaßschlitz
42 in den Erregungsmonochromator 12 vorgesehen. In diesem besonderen Fall weist
der Zerhacker 41 eine Schwingflügelanordnung auf, die eine vollständige Modulation
bei irgendeiner festen Frequenz zwischen 1 und 150 Hz ergibt. Diese Frequenz wird
mit derjenigen der repetierenden
Blitzlampe 40 synchronisiert,
so daß der Blitz aus der Lampe 40 während einer Durchlässigkeitsperiode des Zerhackers
41 auftritt. Die Durchlässigkeitskurve des Zerhackers 41 ist in Fig. 5A gezeigt
und das Auftreten der Blitze in der Lichtquelle 40 ist in Fig. 5B gezeigt.
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Es ist notwendig, soviel Licht wie möglich aus der Lichtquelle 11
zu sammeln und das in Fig. 2 gezeigte optische System ist der Einlaßoptik des Monochromators
12 angepaßt. Die Lichtfangleistung eines Monochromators ist definiert als die Schlitzhöhe
des Monochromators geteilt durch das Produkt der f2-Zahl und der Dispersion. Bei
diesem Ausführungsbeispiel besteht jeder der Monochromatoren 12 und 30 aus einem
symmetrischen Czerny-Turner-Monochromator mit einem Öffnungsverhältnis von f/4 und
einer Brennweite von 200 mm. Solche Monochromatoren sind bekannt und die Stellungen
der Gitter und Spiegel innerhalb des Monochromators sind fest, so daß Streulicht
auf einem niedrigen Wert gehalten sowie Astigmatismus und Koma minimal gemacht werden.
Das für die Lichtquelle 11 in Fig. 2 gezeigte optische System besteht aus einem
sphärischen Spiegel 43 hinter der Lampe 40 und zwei weiteren sphärischen Spiegeln
44 und 45, welche sich längs des Strahlungsweges durch die zwei Quarzlinsen 46 und
47 erstrecken. Das Licht aus der Quarzlinse 47 wird zum Zerhacker 41 geleitet. Ein
solches optisches System sammelt Licht über einen großen Raumwinkel und ist an den
Einlaßschlitz des Monochromators 12 angepaßt. Der Monochromator hat eine Wellenlängenantriebseinrichtung,
die durch den Schrittmotor 14 betätigt wird. Der Schrittmotor stellt einen Nocken
innerhalb des Monochromators zur Änderung der Stellungen der Gitter innerhalb des
Monochromators und somit zur Änderung der Wellenlängendurchlässigkeit ein. Die Wellenlängengenauigkeit
beträgt etwa plus oder minus 1 Nanometer. Ein Sinusstabantrieb kann am Monochromator
angebracht sein, um die Wellenlängengenauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern.
Der Monochromator ist ferner mit einer Skala versehen, die eine
digitale
Anzeige der Wellenlängendurchlässigkeit des Monochromators gibt. Diese ist in Fig.
1 nicht dargestellt, besteht jedoch aus einem Potentiometer, das mit dem mit dem
Schrittmotor verbundenen Wellenlängenantrieb verbunden ist, wobei die Anzeige auf
einem Digitalvoltmeter abgelesen wird.
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Bei der dargestellten Ausführungsform entspricht jeder Schritt des
Schrittmotors 14 einer Wellenlängenänderung von 0,25 Nanometer und die Abtastgeschwindigkeit
des Monochromators kann von 0,01 Nanometer pro Sekunde auf 200 Nanometer pro Sekunde
in beiden Richtungen eingestellt werden. Für den Emissionsmonochromator 30 und den
Schrittmotor 31 gilt allgemein das gleiche, was oben für den Monochromator 12 beschrieben
wurde.
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Die Anordnung des Bezugsphotomultipliers 23 ist ausführlicher in Fig.
3 gezeigt. Die Blitzlampe 40 zeigt eine Schwankung der Lichtintensität von Blitz
zu Blitz und es muß eine Art von Abgleicheinrichtung in der Meßanordnung zum Kompensieren
dieser Änderung vorgesehen werden. Ferner ist es notwendig, Intensitätsänderungen
bei Änderung der vom Erregungsmonochromator 12 übertragenen Wellenlängen zu korrigieren.
Dies wird bei der vorliegenden Ausführungsform durch die Verwendung des Bezugsphotomultipliers
23 erreicht, welcher ein Signal auf die Steueranordnung 33 zum Kompensieren dieser
Schwankungen gibt. Das Erregungsbündel 15 wird zu einem Spiegelzerhacker 21 gegeben.
In diesem Fall rotiert der Spiegel an einem Flügel im Weg des Bündels 15, so daß
Erregungslicht abwechselnd die Probe und den Bezugsphotomultiplier bestrahlt. Das
reflektierte Bündel 22 geht durch einen Wellenlängenumwandler 24, der in diesem
Fall Rhodaminfarbstoff enthält, der alles Licht vom Ultravioletten bis etwa 600
Nanometer absorbiert und dasselbe in eine Fluoreszenzstrahlung mit einem Maximum
bei etwa 650 Nanometer umwandelt, die auf den Bezugsphotomultiplier 23 gegeben wird.
Auf diese Weise ist das Ausgangssignal des
Photomultipliers 23
unabhängig von der Wellenlänge des Erregungsbündels 15 zwischen etwa 200 und 600
Nanometer. Der Betrieb des Spiegels 21 ist in Kurvenform in Fig. 5C dargestellt.
In gleicher Weise ist das Ausgangssignal des Bezugsphotomultipliers 23 in Kurvenform
in Fig. 5E dargestellt.
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Es ist wesentlich, daß der Bezugsphotomultiplier 23 das Erregungsbündel
abtastet, bevor das Bündel die Probenstation 16 erreicht. Wenn dies nicht der Fall
ist, dann besteht die Gefahr daß der Bezugsphotomultiplier eine falsche Anzeige
infolge des Abtastens der Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzstrahlung aus der Probe
ergibt. Eine andere Anordnung zur Erzeugung des Bezugsbündels 22 ist in Fig. 4 gezeigt.
In diesem Fall geht das den Auslaßschlitz 13 des Monochromators 12 verlassende Erregungsbündel
durch eine Mittelöffnung in einem sphärischen Spiegel 50 auf einen konvexen sphärischen
Spiegel 51. Das Licht wird auf die konkave Reflexionsfläche des Spiegels 50 zurückreflektiert
und wird wiederum zur Probenstation 16 reflektiert. Bei dieser Anordnung wird die
senkrecht längs des Weges 25 emittierte Fluoreszenzstrahiung durch einen sphärischen
Spiegel 52 auf den Einlaßschlitz 29 des Emissionsmonochromators fokussiert. In diesem
besonderen Fall ist ein Lichtleitf aserrohr 53 hinter dem Spiegel 51 angeordnet,
um Bezugsbündel zum Einleiten in den Bezugsphotomultiplier 23 zu erzeugen, der in
Fig. 4 nicht gezeigt ist. Ein Teil des Erregungsbündels wird durch eine Quarzplatte
54 auf das Rohr 53 reflektiert.
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Wie oben erläutert, ist das Gehäuse 17 an einer Ecke der rechteckigen
Anordnung angeordnet, wodurch die Probenstation 16 von zwei offenen Seiten des Gehäuses
zugänglich ist und dadurch eine automatische Handhabung durch Verwendung eines Drehtischs
36 ermöglicht wird. Das Gehäuse ist auch groß genug, um auch die Verwendung von
Zubehörteilen, wie Dewargefäßen, im Gehäuse zu ermöglichen. In Fig. 1 ist zwar die
Anordnung des Gehäuses 17 an der Ecke gezeigt, es ist jedoch auch möglich,
das
Gehäuse an irgendeinem anderen vorstehenden Teil der Vorrichtung anzuordnen, so
daß ein Zugang über einen Bereich von mehr als 1800 möglich ist, und eine bevorzugte
Anordnung wird unten anhand von Fig. 6 beschrieben.
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Wie aus Fig. 1 ersichtlich, wird das Erregungsbündel auf die Probenstation
16 durch ein erstes optisches'System fokussiert, das die Spiegel 18 und 19 umfaßt,
und die emittierte Strahlung wird durch ein zweites optisches System gesammelt,
das aus den Spiegeln 27 und 28 besteht. Sowohl das erste als auch das zweite optische
System besteht aus Spiegeln und nicht aus Linsen, und zwar werden sphärische oder
elliptische Spiegel zur Erzielung der Fokussierung verwendet. Auf diese Weise sind
das erste und zweite optische System achromatisch und Koma-korrigiert. Mit anderen
Worten, sie sind auf sphärische und chromatische Aberration korrigiert. Dies ergibt
eine größere Arbeitsgenauigkeit, wenn der Spektralfluoreszenzmesser mit sich ändernder
Wellenlänge in dem ersten und zweiten optischen System gemäß Fig. 1 arbeitet.
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Das aus dem Emissionsmonochromator 30 kommende Licht wird auf den
Photomultiplier 32 gegeben. Die Photomultiplier 23 und 32 sind vorzugsweise Längsröhren,
aber in einigen Fällen können auch Röhren mit seitlichen Fenstern verwendet werden.
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Beide Photomultiplier werden durch eine nicht gezeigte geregelte und
stabilisierte Spannungsquelle betrieben.
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Die Steueranordnung 33 umfaßt entweder eine Einfangverstärkeranordnung,
einen Impulsspitzendetektor oder eine Photonenzähleinrichtung zur Messung des Ausgangssignals
des Photomultipliers 32. Ein Impulsspitzendetektor ist eine bekannte Art von Synchrondetektor,
der zur Unterscheidung von Wellenformen vom Rauschen dient. All diese Einrichtungen
vermeiden die Schwierigkeiten des Nachweises schwacher Signale infolge von
Streulicht
oder Photomultiplier-Dunkelstrom. Bei Verwendung eines Einfangverstärkers oder Impulsspitzendetektors
spricht der Verstärker nur auf solche Signale an, die aus der Impulslichtquelle
mit der Zerhackerfrequenz des Zerhackers 41 stammen.
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Diese Signale allein werden in ein Gleithspannungssignal umgewandelt.
Die Ausgangskurvenform des Photomultipliers 32 ist in Fig. 5D dargestellt. Aus dieser
Kurve ist ersichtlich, daß eine Fläche B den Dunkelstrom des Photomultipliers darstellt,
auch wenn keine Erregungsstrahlung auf die Probe gerichtet wird. Wenn die Probe
bestrahlt wird, wird das Ausgangssignal des Photomultipliers 32 durch die kombinierte
Fläche F+B dargestellt, wobei F auf der Fluoreszenzstrahlung und B auf dem Dunkel
strom beruht. Obwohl die Frequenzdiskriminatoreinrichtung einen genauen Nachweis
der Fläche F+B ermöglicht, ist es nicht möglich, zwischen der Fläche F und der Fläche
B zu unterscheiden. Das Ausgangssignal des Bezugsphotomultipliers 23 wird durch
die Fläche C in Fig. 5E wiedergegeben und die Steuereinrichtung 33 erzeugt ein Ausgangssignal,
das dem Betrag F+B geteilt durch C entspricht.
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Ein verbesserter Nachweis kann durch eine Photonenzähleinrichtung
erreicht werden. Eine solche Einrichtung ergibt ein besseres Signal-Rauschverhältnis,
wobei die nachzuweisenden Signale im Rauschen untergegangen sein können. Bei einer
solchen Einrichtung werden einzelne Stromimpulse von der Photomultiplierkathode
verstärkt, festgestellt und gezählt. Der Zählbetrag ist ein Maß für die Menge, in
der Photonen auf die Photokathode auftreffen. Dies ist insbesondere nützlich, wenn
die Strahlung, wie es bei der Fluoreszenz der Fall ist, häufig so geringe Intensität
hat, daß es schwierig ist, durch andere Verfahren zuverlässige Messungen zu erzielen.
Bei Anwendung des Zählverfahrens kann das Photonenzählen für jede der Flächen B,
C und F+B gemäß den Fig. 5D und 5E durchgeführt werden. Das Photonenzählen wird
auch durchgeführt, wenn das Erregungsbündel nicht auf die Probe fällt, so daß eine
der Fläche B entsprechende
Photonenzählung erhalten wird. Auf diese
Weise kann die Steuereinrichtung 33 so ausgebildet werden, daß sie die Zählung für
die Fläche B von der für die Fläche A -erhaltenen Zählung abzieht und dadurch die
Menge (F+B)-B erhält. Wie bei der Einfangverstärkung ist es sodann erforderlich,
das Verhältnis dieses Signals zu der vom Bezugsphotomultiplier abgeleiteten Fläche
C zu bilden, um Änderungen der Lichtintensität der Lichtquelle zu kompensieren.
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Eine bevorzugte Anordnung des Spektralfluoreszenzmessers ist in Fig.
6 dargestellt.
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Die verwendeten Bestandteile sind allgemein die gleichen, wie sie
oben mit Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurden, und gleiche Teile sind mit dem
gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 1 versehen. Licht aus einer Plasmaentladungs-Blitzlarnpe
40, die einen Teil einer der in Fig. 2 gezeigten ähnlichen Lichtquelle darstellt,
geht über einen Planspiegel 60 und einen Zerhacker 41 in den Erregungsmonochromator
12. Licht aus dem Monochromator 12 geht über eine Einrichtung 21, die einen Teil
des Lichts durch den Wellenlängenumwandler 24 zum Bezugsphotomultiplier 23 reflektiert,
zu einem ersten gekrümmten Spiegel 61. Das Licht wird vom Spiegel 61 zu einem zweiten
gekrümmten Spiegel 62 reflektiert, der das Licht zur Probenstation 16 reflektiert,
die in einem Probengehäuse li angeordnet ist. Die von der Probe emittierte Lumineszenzstrahlung
wird von einem dritten gekrümmten s;R empfangen, der das Licht auf einen vierten
gekrümmten Spiegel 64 reflektiert.
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Das vom Spiegel 64 reflektierte Licht geht zum Emissionsmonochromator
30. Beide Monochromatoren 12 und 30 werden durch Schrittmotoren 14 bzw. 31 eingestellt,
wie oben beschrieben.
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Das aus dem Monochromator 30-kommende Licht wird vom Photomultiplier
32 empfangen, wie oben beschrieben. Der Photomultiplier 32 sowie die Schrittmotoren
und der Bezugsphotoll wr 23 sind mit einer nicht gezeigten Steuereinrichtung gekoppelt,
die
ähnlich der mit Bezugnahme auf Fig. 1 beschriebenen ausgebildet ist. Bei der in
Fig. 6 gezeigten Ausführungsform ist die Anordnung auf einem rechteckigen Tisch
65 angebracht, wobei die Monochromatoren 12 und 30 an den zwei Ecken der Vorderseite
des Tisches 65 angeordnet sind. Dadurch ist ein einfacher Zugang zu den Monochromatoren
zur Steuerung ihrer Arbeitsweise möglich. Die optischen Wege zwischen den Spiegeln
61 und 64 bzw. den Monochromatoren 12 und 30 verlaufen parallel zur Vorderkante
66 des Tischs 65. Die Spiegel 61, 62, 63 und 64 können sphärisch oder elliptisch
sein und jeder ist so angeordnet, daß das einfallende Licht einen Einfallswinkel
von nicht mehr als 300 besitzt. So bilden die Spiegel 61, 62, 63 und 64 optische
Systeme, die gegen sphärische und chromatische Abarration korrigiert sind. Das Probengehäuse
17 ist so angeordnet, daß es nach vorne aus dem Tisch 65 in der Mitte längs der
Vorderkante 66 vorsteht. So ist Zugang zur Probenstation 16 noch verbessert, indem
er auf drei Seiten des Gehäuses 17 möglich ist. Die Proben werden auf einer automatischen
Fördereinrichtung parallel zur Kante 66 gefördert, treten in das Gehäuse 17 auf
einer Seite ein und verlassen dasselbe durch die entgegengesetzte Seite.
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Die oben beschriebenen Spektralfluoreszenzmesser sind besonders empfindlich
und für die Messung von Stoffen geeignet, bei denen das Produkt der optischen Dichte
bei der erregenden Wellenlänge und der Fluoreszenzausbeute kleiner als 10 9 ist.
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Beispielsweise können karzinogene Stoffe, wie Dibenzanthracen, bestimmt
werden, wenn sie in Konzentrationen von weniger als 10 1OMO1 vorhanden sind. Die
Geräte sind natürlich in der Lage, viel höhere Konzentrationen von Fluoreszenzträgern
zu messen als diese.
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Die Erfindung ist nicht auf die Einzelheiten der geschilderten Ausführungsbeispiele
eingeschränkt. So ist zwar die Lichtquelle 11 mit einem getrennten Zerhacker 41
zur Erzielung
der gewünschten vorbestimmten Frequenz der Lichtquelle
dargestellt. In gewissen Fällen kann es jedoch zweckmäßig sein, die Lampe 40 mit
einer vorbestimmten Frequenz zu betätigen und die Notwendigkeit eines getrennten
Zerhackers 41 zu vermeiden.