DE2535398A1 - Spektralfluoreszenzmesser - Google Patents

Spektralfluoreszenzmesser

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DE2535398A1
DE2535398A1 DE19752535398 DE2535398A DE2535398A1 DE 2535398 A1 DE2535398 A1 DE 2535398A1 DE 19752535398 DE19752535398 DE 19752535398 DE 2535398 A DE2535398 A DE 2535398A DE 2535398 A1 DE2535398 A1 DE 2535398A1
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radiation
photomultiplier
sample
wavelength
excitation
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Withdrawn
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DE19752535398
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Michael Anthony West
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Applied Photophysics Ltd
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Applied Photophysics Ltd
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Publication date
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    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N2021/6417Spectrofluorimetric devices

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Description

  • Spektralfluoreszenzmesser Die Erfindung bezieht sich auf Lumineszenzspektroskopie und insbesondere auf Spektralfluoreszenzmesser zur Wellenlängenmessung der von Proben emittierten Lumineszenzstrahlung einschließlich der Messung von Fluoreszenz- und Phosphoreszenzstrahlung.
  • Lumineszenzspektroskopie wird vielfach sowohl für qualitative als auch quantitative analytische Messungen bei einer Vielzahl von Stoffen einschließlich Drogen und anderer pharmazeutischer, biochemischer und biologischer Stoffe sowie organischer und anorganischer Substanzen angewendet. Beispielsweise verwenden klinische Analysen Fluoreszenzverfahren zur Bestimmung von Steroide, Östrogenen, Catechinaminen, Nucleinsäuren, Enzymen und Proteinen. Pharmazeutische Anwendungen umfassen die Messung von Aspirin in Blut, Riboflavin und anderen Medizinen.
  • Organische Stoffe können oftmals durch Fluoreszenzmessungen charakterisiert werden und es gibt zahlreiche Anwendungen in verschiedenen Industriezweigen, beispielsweise bei Tabak, Bier, Waschmittel, Druck, Ö1 und Insektiziden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Spektralfluoreszenzmesser, bei denen Licht aus einer Lichtquelle mit kontinuierlichem Spektrum durch einen Erregungsmonochromator geleitet und zur Erregung einer Fluoreszenzprobe verwendet wird. Das von der Probe emittierte Licht wird durch einen Emissionsmonochromator geleitet und sodann gemessen. Durch Anwendung eines abtastenden Spektralfluoreszenzmessers, bei dem die sowohl vom Erregungsmonochromator als auch Emissionsmonochromator durchgelassenen Wellenlängen veränderlich sind, ist es möglich, sowohl Emissions- als auch Erregungsspektrum zu untersuchen. Bei Emissionsspektren wird die Wellenlänge der Erregungsstrahlung konstant gehalten und Messungen der emittierten Strahlung werden bei sich ändernden Wellenlängen durchgeführt. Bei Erregungsspektren wird die Wellenlänge der gemessenen Strahlung konstant gehalten, während die Wellenlänge der Erregungsstrahlung verändert wird.
  • Die Empfindlichkeit und Selektivität von Emissionsmessungen in der Lumineszenzspektroskopie ist mehrere Größenordnungen höher als übliche Absorptionsspektroskopiemessungen. Bei vorhandenen Geräten begrenzt der Nachweis mit Gleichspannungsmethoden die maximal erzielbare Empfindlichkeit infolge von Schrotrauschen u.dgl. Ferner erlauben optische Systeme mit Linsen und nicht-achromatischen Spiegeln zugleich mit der Abwesenheit jeglicher Einrichtungen zur Überwachung und Korrektur von Schwankungen in der Intensität des Erregungsbündels (sowohl mit der Zeit als auch mit der Wellenlänge) keine Aufzeichnung genauer Erregungs- und Emissionsspektren infolge der den Geräten innewohnenden Mängel. Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ergibt eine außergewöhnliche Empfindlichkeit und Selektivität und erzielt korrigierte Erregungsspektren und Emissionsspektren, die bei Verwendung einer normalen Lichtquelle leicht korrigiert werden können. Die hohe Empfindlichkeit des Geräts ermöglicht die Verwendung von niedrigen Lichtwerten des Erregungsbündels, so daß eine Lichtzersetzung der Probe vermieden wird.
  • Durch die Erfindung soll ein verbesserter empfindlicher Spektralfluoreszenzmesser zur Messung von Emissions- und Erregungsspektren geschaffen werden.
  • Demgemäß schafft die Erfindung einen Spektralfluoreszenzmesser zur Feststellung der Lumineszenzintensität bei verschiedenen, von einer untersuchten Probe emittierten Wellenlängen, mit einer Probenstation, in der eine Probe an einer vorbestimmen Stelle angeordnet werden kann, einer Blitz- oder pulsierenden Licht quelle einschließlich einer Plasmaentladungslampe, zur Erzeugung einer Erregungsstrahlung über einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich und zum Emittieren von Strahlung mit intermittierenden Intensitätsspitzen bei einer gewünschten Frequenz, gekennzeichnet durch einen Erregungsmonochromator, der zwischen der Lichtquelle und der Probenstation angeordnet ist, zur Übertragung von Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge zur Probe, ein erstes optisches System zum Fokussieren des aus dem Erregungsmonochromator kommenden Lichts auf die Probenstation, eine Einrichtung im Strahlungsweg zwischen dem Erregungsmonochromator und der Probenstation zum Leiten eines Bezugsstrahlungsbundels auf einen Bezugsstrahlungsdetektor und somit zur Erzeugung eines Korrektursignals für Schwankungen der Lichtintensität der Lichtquelle, einen Emissionsmonochromator zum Empfang der Lumineszenzstrahlung aus der untersuchten Probe über ein zweites optisches System und zum Übertragen von Strahlung mit einer ausgewählten Wellenlänge auf eine Detektoreinrichtung, wobei die beiden Monochromatoren jeweils durch einen zugehörigen Schrittmotor einstellbar sind, um die Wellenlänge der von den Monochromatoren durchgelassenen Strahlung zu verändern, die Detektoreinrichtung einen Photomultiplier aufweist, der auf die vom Emissionsmonochromator durchgelassene Strahlung anspricht und ein von der Intensität der Lumineszenzstrahlung bei der vom Emissionsmonochromator durchgelassenen Wellenlänge abhängiges Signal erzeugt, und wobei das erste und zweite optische System auf sphärische und chromatische Aberration korrigiert ist.
  • Die Plasmaentladungslampe enthält Gas, durch das zur Erzeugung von Blitzen oder Impulslicht eine Entladung stattfindet. Die Lampe wird normalerweise durch die plötzliche Freigabe einer hohen elektrischen Energiespitze erregt, so daß die Temperatur des Plasmas auf einen Wert erhöht wird, bei der starke Lichtblitze mit einem im wesentlichen kontinuierlichen Spektrum erzeugt werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, daß das erste und zweite optische System sphärische oder elliptische Spiegel umfaßt, so daß die Verwendung von Linsen vermieden wird.
  • Es sind Spektralfluoreszenzmesser bekannt, die Gleichspannungsmethoden zum Nachweis benutzen, und die Empfindlichkeit und Selektivität wird dabei durch aus den Gleichspannungsquellen stammendes Rauschen, wie Streulicht und Schrotrauschen, begrenzt. Um dies zu vermeiden, verwendet der Spektralfluoreszenzmesser gemäß der Erfindung vorzugsweise einen Einfangverstärker, einen Impulsspitzendetektor oder eine Photonenz åhleinr-ichtung in der Detektoreinrichtung. Bei einem Einfangverstärker oder Impulsspitzendetektor ist ein Verstärker vorgesehen, der Signale aus dem Photomultiplier nur bei der gewünschten Frequenz feststellt, bei der Licht von der Lichtquelle emittiert wird. Auf diese Weise werden Streulichtsignale mit unterschiedlicher Frequenz ausgeschaltet. Bei einer Photonenzähleinrichtung können Anzeigen erhalten werden, wenn Licht von der Lichtquelle emittiert wird, und während Perioden, in denen kein Licht von der Lichtquelle emittiert wird, so daß auf diese Weise eine Dunkelzählung vorgenommen wird, die zur Erzielung einer korrigierten Meßanzeige verwendet werden kann.
  • Dies ist bei Fluoreszenzsignalen geringer Stärke erforderlich, die in ihrer Größe mit der Dunkelzählung vergleichbar sind.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, daß der Bezugsstrahlungsdetektor einen Photomultiplier zum Empfang eines intermittierenden Signals aus dem auf die Probenstation gerichteten Strahlungsbündel aufweist. Die zwischen dem Erregungsmonochromator und der Probenstation angeordnete Einrichtung zum Leiten von Strahlung auf den Bezugsstrahlendetektor kann eine reflektierende Einrichtung zur Erzielung intermittierender Reflexion auf den Bezugsphotomultiplier aufweisen. Der Bezugsphotomultiplier kompensiert vorzugsweise Intensitätsänderungen des Erregungsbündels mit der Wellenlänge sowie mit der Zeit. Dies kann dadurch erreicht werden, daß der Bezugsphotomultiplier einen Wellenlängenumwandler, wie eine Lösung von Rhodamin B in Äthylenglycol, im Strahlungsweg zum Bezugsphotomultiplier aufweist, so daß bei Änderung der Wellenlänge der auf die Probe gerichteten Strahlung der Wellenlängenumwandler die Strahlung in eine feste Wellenlänge oder ein festes Spektrum umwandelt und dadurch der Bezugsphotomultiplier stets Strahlung der gleichen Wellenlänge empfängt.
  • Vorzugsweise ist die Probenstation in einem Gehäuse angeordnet, 0 das über einen Bereich von mehr als 180 zugänglich ist, so daß die automatische Zuführung der Proben in die Station vereinfacht wird. Vorzugsweise ist das Probenstationgehäuse so angeordnet, daß es an einer Seite des Spektralfluoreszenzmessers vorsteht, so daß das Gehäuse auf drei Seiten zugänglich ist. So können Proben in die Station eintreten und dieselbe verlassen, indem sie längs eines geraden Weges durch zwei gegenüberliegende Seiten des Gehäuses laufen.
  • Anhand der Figuren werden zwei Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Spektralfluoreszenzmessers näher erläutert.
  • Es zeigt Fig. 1 ein Blockschaltbild einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Spektralfluoreszenzmessers; Fig. 2 eine vergrößerte schematische Ansicht eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Anordnung; Fig. 3 eine vergrößerte schematische Ansicht eines anderen Teils der in Fig. 1 gezeigten Anordnung; Fig. 4 schematisch eine andere Anordnung eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung; Fig. 5A bis 5E verschiedene Kurvenformen, die auf der Arbeitsweise des in Fig. 1 gezeigten Spektralfluoreszenzmessers beruhen; und Fig. 6 eine bevorzugte Anordnung eines Spektralfluoreszenzmessers gemäß der Erfindung.
  • Die in Fig. 1 gezeigte allgemeine Anordnung umfaßt eine Plasmaentladungs-Lichtquelle 11, die ein kontinuierliches Spektrum im Wellenlängenbereich vom 200 bis 1 000 Nanometer erzeugt. Das aus der Lichtquelle kommende Licht wird intermittierend auf einen Erregungsmonochromator 12 gegeben, der durch einen Auslaßschlitz 13 ein Strahlungsbündel mit einer Wellenlänge aussendet, die durch einen Schrittmotor 14 gesteuert wird, dessen Betrieb die vom Monochromator 12 ausgesandte Wellenlänge einstellt. Die den Schlitz 13 verlassende Strahlung verläuft längs eines Weges 15 zu einer Probenstation 16 in einem Probengehäuse 17. Die Strahlung wird auf dem Weg 15 durch zwei Spiegelflächen 18 und 19 durch ein Fenster 20 in das Probengehäuse 17 reflektiert. Die Reflexionsfläche 18 ist eben und der Spiegel 19 ist sphärisch oder elliptisch.
  • Die Reflexionsflächen 18 und 19 bilden ein erstes optisches System zur Fokussierung der vom Monochromator 12 längs des Weges 15 in die Probenstation 16 fallenden Strahlung. Auf dem Strahlungsweg 15 ist eine Einrichtung 21 zur intermittierenden Reflexion eines Bezugsbündels 22 auf einen Bezugsphotomultiplier 23 angeordnet. Ein Wellenlängenumwandler 24 ist im Weg des reflektierten Bündels unmittelbar vor dem Photomultiplier 23 vorgesehen. Die von der Probe 16 emittierte Fluoreszenz wird senkrecht zur Richtung der auf die Probe 16 einfallenden Strahlung gemessen. Das emittierte Bündel 25 verläßt das Gehäuse 17 durch ein Fenster 26 und wird durch ein zweites optisches System, das einen sphärischen Spiegel 27 und die rückwärtige Reflexionsfläche 28 des Spiegels 18 umfaßt, auf den Einlaßschlitz 29 eines Emissionsmonochromators 30 reflektiert. Der Emissionsmonochromator 30 ist allgemein gleich aufgebaut wie der Erregungsmonochromator 12 und seine Wellenlängendurchlässigkeit ist durch einen Schrittmotor 31 einstellbar. Das den Emissionsmonochromator verlassende Licht wird. auf einen Signalphotomultiplier 32 gegeben, der in einem gekühlten Gehäuse angeordnet ist. Das Ausgangssignal des Photomultipliers wird auf eine Steueranordnung 33 gegeben, die außerdem ein Signal vom Bezugsphotomultiplier 23 empfängt und Steuersignale an die Schrittmotorm 14 und 31 gibt. Das endgültige Ausgangssignal wird auf eine Anzeigeanordnung 34 gegeben, die mit der Steueranordnung 33 verbunden ist. Die Lichtquelle 40 wird durch eine getrennte Steueranordnung 35 gesteuert. Das Probengehäuse 17 ist an einer Ecke des Spektralfluoreszenzmessers angeordnet, der auf einem allgemein rechteckigen Tisch ausgebildet ist. Auf diese Weise ist die Probenstation 16 von zwei Seiten des Gehäuses 17 zugänglich, so daß ein Zugang über einen Bereich von mehr als 1800 möglich ist. Daher kann ein Drehtisch 36 vorgesehen werden, der durch zwei benachbarte Seiten des Gehäuses 17 verläuft und eine automatische Eingabe und Ausgabe einer Probenfolge in die bzw. aus der Probenstation 16 ermöglicht. So ist ein automatischer Betrieb möglich.
  • Im folgenden werden die Einzelteile ausführlicher besprochen.
  • Die Lichtquelle 11 kann eine periodisch aufleuchtende Blitzlampe oder eine modulierte oder pulsierende Lichtquelle sein, vorausgesetzt, daß die Modulationsbreite größer als 50% ist.
  • Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird eine Kapillarplasma-Blitzlampe 40 verwendet. Fig. 2 zeigt die Lichtquelle 11 im einzelnen. Diese Lichtquelle wird vorzugsweise im Hinblick auf Spitzenintensität, Spektralverteilung und geometrische Abmessungen gewählt. Die Lampe wird mit Blitzen hoher Stromdichte betrieben und dadurch wird das spektrale Emissionsmaximum zu kürzeren Wellenlängen verschoben. Die Lichtquelle 11 muß Strahlung intermittierend mit einer gewünschten Frequenz emittieren. Bei dem beschriebenen Beispiel ist ein Zerhacker 41 vor dem Einlaßschlitz 42 in den Erregungsmonochromator 12 vorgesehen. In diesem besonderen Fall weist der Zerhacker 41 eine Schwingflügelanordnung auf, die eine vollständige Modulation bei irgendeiner festen Frequenz zwischen 1 und 150 Hz ergibt. Diese Frequenz wird mit derjenigen der repetierenden Blitzlampe 40 synchronisiert, so daß der Blitz aus der Lampe 40 während einer Durchlässigkeitsperiode des Zerhackers 41 auftritt. Die Durchlässigkeitskurve des Zerhackers 41 ist in Fig. 5A gezeigt und das Auftreten der Blitze in der Lichtquelle 40 ist in Fig. 5B gezeigt.
  • Es ist notwendig, soviel Licht wie möglich aus der Lichtquelle 11 zu sammeln und das in Fig. 2 gezeigte optische System ist der Einlaßoptik des Monochromators 12 angepaßt. Die Lichtfangleistung eines Monochromators ist definiert als die Schlitzhöhe des Monochromators geteilt durch das Produkt der f2-Zahl und der Dispersion. Bei diesem Ausführungsbeispiel besteht jeder der Monochromatoren 12 und 30 aus einem symmetrischen Czerny-Turner-Monochromator mit einem Öffnungsverhältnis von f/4 und einer Brennweite von 200 mm. Solche Monochromatoren sind bekannt und die Stellungen der Gitter und Spiegel innerhalb des Monochromators sind fest, so daß Streulicht auf einem niedrigen Wert gehalten sowie Astigmatismus und Koma minimal gemacht werden. Das für die Lichtquelle 11 in Fig. 2 gezeigte optische System besteht aus einem sphärischen Spiegel 43 hinter der Lampe 40 und zwei weiteren sphärischen Spiegeln 44 und 45, welche sich längs des Strahlungsweges durch die zwei Quarzlinsen 46 und 47 erstrecken. Das Licht aus der Quarzlinse 47 wird zum Zerhacker 41 geleitet. Ein solches optisches System sammelt Licht über einen großen Raumwinkel und ist an den Einlaßschlitz des Monochromators 12 angepaßt. Der Monochromator hat eine Wellenlängenantriebseinrichtung, die durch den Schrittmotor 14 betätigt wird. Der Schrittmotor stellt einen Nocken innerhalb des Monochromators zur Änderung der Stellungen der Gitter innerhalb des Monochromators und somit zur Änderung der Wellenlängendurchlässigkeit ein. Die Wellenlängengenauigkeit beträgt etwa plus oder minus 1 Nanometer. Ein Sinusstabantrieb kann am Monochromator angebracht sein, um die Wellenlängengenauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Der Monochromator ist ferner mit einer Skala versehen, die eine digitale Anzeige der Wellenlängendurchlässigkeit des Monochromators gibt. Diese ist in Fig. 1 nicht dargestellt, besteht jedoch aus einem Potentiometer, das mit dem mit dem Schrittmotor verbundenen Wellenlängenantrieb verbunden ist, wobei die Anzeige auf einem Digitalvoltmeter abgelesen wird.
  • Bei der dargestellten Ausführungsform entspricht jeder Schritt des Schrittmotors 14 einer Wellenlängenänderung von 0,25 Nanometer und die Abtastgeschwindigkeit des Monochromators kann von 0,01 Nanometer pro Sekunde auf 200 Nanometer pro Sekunde in beiden Richtungen eingestellt werden. Für den Emissionsmonochromator 30 und den Schrittmotor 31 gilt allgemein das gleiche, was oben für den Monochromator 12 beschrieben wurde.
  • Die Anordnung des Bezugsphotomultipliers 23 ist ausführlicher in Fig. 3 gezeigt. Die Blitzlampe 40 zeigt eine Schwankung der Lichtintensität von Blitz zu Blitz und es muß eine Art von Abgleicheinrichtung in der Meßanordnung zum Kompensieren dieser Änderung vorgesehen werden. Ferner ist es notwendig, Intensitätsänderungen bei Änderung der vom Erregungsmonochromator 12 übertragenen Wellenlängen zu korrigieren. Dies wird bei der vorliegenden Ausführungsform durch die Verwendung des Bezugsphotomultipliers 23 erreicht, welcher ein Signal auf die Steueranordnung 33 zum Kompensieren dieser Schwankungen gibt. Das Erregungsbündel 15 wird zu einem Spiegelzerhacker 21 gegeben. In diesem Fall rotiert der Spiegel an einem Flügel im Weg des Bündels 15, so daß Erregungslicht abwechselnd die Probe und den Bezugsphotomultiplier bestrahlt. Das reflektierte Bündel 22 geht durch einen Wellenlängenumwandler 24, der in diesem Fall Rhodaminfarbstoff enthält, der alles Licht vom Ultravioletten bis etwa 600 Nanometer absorbiert und dasselbe in eine Fluoreszenzstrahlung mit einem Maximum bei etwa 650 Nanometer umwandelt, die auf den Bezugsphotomultiplier 23 gegeben wird. Auf diese Weise ist das Ausgangssignal des Photomultipliers 23 unabhängig von der Wellenlänge des Erregungsbündels 15 zwischen etwa 200 und 600 Nanometer. Der Betrieb des Spiegels 21 ist in Kurvenform in Fig. 5C dargestellt. In gleicher Weise ist das Ausgangssignal des Bezugsphotomultipliers 23 in Kurvenform in Fig. 5E dargestellt.
  • Es ist wesentlich, daß der Bezugsphotomultiplier 23 das Erregungsbündel abtastet, bevor das Bündel die Probenstation 16 erreicht. Wenn dies nicht der Fall ist, dann besteht die Gefahr daß der Bezugsphotomultiplier eine falsche Anzeige infolge des Abtastens der Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzstrahlung aus der Probe ergibt. Eine andere Anordnung zur Erzeugung des Bezugsbündels 22 ist in Fig. 4 gezeigt. In diesem Fall geht das den Auslaßschlitz 13 des Monochromators 12 verlassende Erregungsbündel durch eine Mittelöffnung in einem sphärischen Spiegel 50 auf einen konvexen sphärischen Spiegel 51. Das Licht wird auf die konkave Reflexionsfläche des Spiegels 50 zurückreflektiert und wird wiederum zur Probenstation 16 reflektiert. Bei dieser Anordnung wird die senkrecht längs des Weges 25 emittierte Fluoreszenzstrahiung durch einen sphärischen Spiegel 52 auf den Einlaßschlitz 29 des Emissionsmonochromators fokussiert. In diesem besonderen Fall ist ein Lichtleitf aserrohr 53 hinter dem Spiegel 51 angeordnet, um Bezugsbündel zum Einleiten in den Bezugsphotomultiplier 23 zu erzeugen, der in Fig. 4 nicht gezeigt ist. Ein Teil des Erregungsbündels wird durch eine Quarzplatte 54 auf das Rohr 53 reflektiert.
  • Wie oben erläutert, ist das Gehäuse 17 an einer Ecke der rechteckigen Anordnung angeordnet, wodurch die Probenstation 16 von zwei offenen Seiten des Gehäuses zugänglich ist und dadurch eine automatische Handhabung durch Verwendung eines Drehtischs 36 ermöglicht wird. Das Gehäuse ist auch groß genug, um auch die Verwendung von Zubehörteilen, wie Dewargefäßen, im Gehäuse zu ermöglichen. In Fig. 1 ist zwar die Anordnung des Gehäuses 17 an der Ecke gezeigt, es ist jedoch auch möglich, das Gehäuse an irgendeinem anderen vorstehenden Teil der Vorrichtung anzuordnen, so daß ein Zugang über einen Bereich von mehr als 1800 möglich ist, und eine bevorzugte Anordnung wird unten anhand von Fig. 6 beschrieben.
  • Wie aus Fig. 1 ersichtlich, wird das Erregungsbündel auf die Probenstation 16 durch ein erstes optisches'System fokussiert, das die Spiegel 18 und 19 umfaßt, und die emittierte Strahlung wird durch ein zweites optisches System gesammelt, das aus den Spiegeln 27 und 28 besteht. Sowohl das erste als auch das zweite optische System besteht aus Spiegeln und nicht aus Linsen, und zwar werden sphärische oder elliptische Spiegel zur Erzielung der Fokussierung verwendet. Auf diese Weise sind das erste und zweite optische System achromatisch und Koma-korrigiert. Mit anderen Worten, sie sind auf sphärische und chromatische Aberration korrigiert. Dies ergibt eine größere Arbeitsgenauigkeit, wenn der Spektralfluoreszenzmesser mit sich ändernder Wellenlänge in dem ersten und zweiten optischen System gemäß Fig. 1 arbeitet.
  • Das aus dem Emissionsmonochromator 30 kommende Licht wird auf den Photomultiplier 32 gegeben. Die Photomultiplier 23 und 32 sind vorzugsweise Längsröhren, aber in einigen Fällen können auch Röhren mit seitlichen Fenstern verwendet werden.
  • Beide Photomultiplier werden durch eine nicht gezeigte geregelte und stabilisierte Spannungsquelle betrieben.
  • Die Steueranordnung 33 umfaßt entweder eine Einfangverstärkeranordnung, einen Impulsspitzendetektor oder eine Photonenzähleinrichtung zur Messung des Ausgangssignals des Photomultipliers 32. Ein Impulsspitzendetektor ist eine bekannte Art von Synchrondetektor, der zur Unterscheidung von Wellenformen vom Rauschen dient. All diese Einrichtungen vermeiden die Schwierigkeiten des Nachweises schwacher Signale infolge von Streulicht oder Photomultiplier-Dunkelstrom. Bei Verwendung eines Einfangverstärkers oder Impulsspitzendetektors spricht der Verstärker nur auf solche Signale an, die aus der Impulslichtquelle mit der Zerhackerfrequenz des Zerhackers 41 stammen.
  • Diese Signale allein werden in ein Gleithspannungssignal umgewandelt. Die Ausgangskurvenform des Photomultipliers 32 ist in Fig. 5D dargestellt. Aus dieser Kurve ist ersichtlich, daß eine Fläche B den Dunkelstrom des Photomultipliers darstellt, auch wenn keine Erregungsstrahlung auf die Probe gerichtet wird. Wenn die Probe bestrahlt wird, wird das Ausgangssignal des Photomultipliers 32 durch die kombinierte Fläche F+B dargestellt, wobei F auf der Fluoreszenzstrahlung und B auf dem Dunkel strom beruht. Obwohl die Frequenzdiskriminatoreinrichtung einen genauen Nachweis der Fläche F+B ermöglicht, ist es nicht möglich, zwischen der Fläche F und der Fläche B zu unterscheiden. Das Ausgangssignal des Bezugsphotomultipliers 23 wird durch die Fläche C in Fig. 5E wiedergegeben und die Steuereinrichtung 33 erzeugt ein Ausgangssignal, das dem Betrag F+B geteilt durch C entspricht.
  • Ein verbesserter Nachweis kann durch eine Photonenzähleinrichtung erreicht werden. Eine solche Einrichtung ergibt ein besseres Signal-Rauschverhältnis, wobei die nachzuweisenden Signale im Rauschen untergegangen sein können. Bei einer solchen Einrichtung werden einzelne Stromimpulse von der Photomultiplierkathode verstärkt, festgestellt und gezählt. Der Zählbetrag ist ein Maß für die Menge, in der Photonen auf die Photokathode auftreffen. Dies ist insbesondere nützlich, wenn die Strahlung, wie es bei der Fluoreszenz der Fall ist, häufig so geringe Intensität hat, daß es schwierig ist, durch andere Verfahren zuverlässige Messungen zu erzielen. Bei Anwendung des Zählverfahrens kann das Photonenzählen für jede der Flächen B, C und F+B gemäß den Fig. 5D und 5E durchgeführt werden. Das Photonenzählen wird auch durchgeführt, wenn das Erregungsbündel nicht auf die Probe fällt, so daß eine der Fläche B entsprechende Photonenzählung erhalten wird. Auf diese Weise kann die Steuereinrichtung 33 so ausgebildet werden, daß sie die Zählung für die Fläche B von der für die Fläche A -erhaltenen Zählung abzieht und dadurch die Menge (F+B)-B erhält. Wie bei der Einfangverstärkung ist es sodann erforderlich, das Verhältnis dieses Signals zu der vom Bezugsphotomultiplier abgeleiteten Fläche C zu bilden, um Änderungen der Lichtintensität der Lichtquelle zu kompensieren.
  • Eine bevorzugte Anordnung des Spektralfluoreszenzmessers ist in Fig. 6 dargestellt.
  • Die verwendeten Bestandteile sind allgemein die gleichen, wie sie oben mit Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben wurden, und gleiche Teile sind mit dem gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 1 versehen. Licht aus einer Plasmaentladungs-Blitzlarnpe 40, die einen Teil einer der in Fig. 2 gezeigten ähnlichen Lichtquelle darstellt, geht über einen Planspiegel 60 und einen Zerhacker 41 in den Erregungsmonochromator 12. Licht aus dem Monochromator 12 geht über eine Einrichtung 21, die einen Teil des Lichts durch den Wellenlängenumwandler 24 zum Bezugsphotomultiplier 23 reflektiert, zu einem ersten gekrümmten Spiegel 61. Das Licht wird vom Spiegel 61 zu einem zweiten gekrümmten Spiegel 62 reflektiert, der das Licht zur Probenstation 16 reflektiert, die in einem Probengehäuse li angeordnet ist. Die von der Probe emittierte Lumineszenzstrahlung wird von einem dritten gekrümmten s;R empfangen, der das Licht auf einen vierten gekrümmten Spiegel 64 reflektiert.
  • Das vom Spiegel 64 reflektierte Licht geht zum Emissionsmonochromator 30. Beide Monochromatoren 12 und 30 werden durch Schrittmotoren 14 bzw. 31 eingestellt, wie oben beschrieben.
  • Das aus dem Monochromator 30-kommende Licht wird vom Photomultiplier 32 empfangen, wie oben beschrieben. Der Photomultiplier 32 sowie die Schrittmotoren und der Bezugsphotoll wr 23 sind mit einer nicht gezeigten Steuereinrichtung gekoppelt, die ähnlich der mit Bezugnahme auf Fig. 1 beschriebenen ausgebildet ist. Bei der in Fig. 6 gezeigten Ausführungsform ist die Anordnung auf einem rechteckigen Tisch 65 angebracht, wobei die Monochromatoren 12 und 30 an den zwei Ecken der Vorderseite des Tisches 65 angeordnet sind. Dadurch ist ein einfacher Zugang zu den Monochromatoren zur Steuerung ihrer Arbeitsweise möglich. Die optischen Wege zwischen den Spiegeln 61 und 64 bzw. den Monochromatoren 12 und 30 verlaufen parallel zur Vorderkante 66 des Tischs 65. Die Spiegel 61, 62, 63 und 64 können sphärisch oder elliptisch sein und jeder ist so angeordnet, daß das einfallende Licht einen Einfallswinkel von nicht mehr als 300 besitzt. So bilden die Spiegel 61, 62, 63 und 64 optische Systeme, die gegen sphärische und chromatische Abarration korrigiert sind. Das Probengehäuse 17 ist so angeordnet, daß es nach vorne aus dem Tisch 65 in der Mitte längs der Vorderkante 66 vorsteht. So ist Zugang zur Probenstation 16 noch verbessert, indem er auf drei Seiten des Gehäuses 17 möglich ist. Die Proben werden auf einer automatischen Fördereinrichtung parallel zur Kante 66 gefördert, treten in das Gehäuse 17 auf einer Seite ein und verlassen dasselbe durch die entgegengesetzte Seite.
  • Die oben beschriebenen Spektralfluoreszenzmesser sind besonders empfindlich und für die Messung von Stoffen geeignet, bei denen das Produkt der optischen Dichte bei der erregenden Wellenlänge und der Fluoreszenzausbeute kleiner als 10 9 ist.
  • Beispielsweise können karzinogene Stoffe, wie Dibenzanthracen, bestimmt werden, wenn sie in Konzentrationen von weniger als 10 1OMO1 vorhanden sind. Die Geräte sind natürlich in der Lage, viel höhere Konzentrationen von Fluoreszenzträgern zu messen als diese.
  • Die Erfindung ist nicht auf die Einzelheiten der geschilderten Ausführungsbeispiele eingeschränkt. So ist zwar die Lichtquelle 11 mit einem getrennten Zerhacker 41 zur Erzielung der gewünschten vorbestimmten Frequenz der Lichtquelle dargestellt. In gewissen Fällen kann es jedoch zweckmäßig sein, die Lampe 40 mit einer vorbestimmten Frequenz zu betätigen und die Notwendigkeit eines getrennten Zerhackers 41 zu vermeiden.

Claims (11)

  1. Patentansprüche
    (r l.)Spektralfluoreszenzmesser zur Feststellung der Lumineszenzintensität bei verschiedenen, von einer untersuchten Probe emittierten Wellenlängen, mit einer Probenstation, in dereine Probe an einer vorbestimmten Stelle angeordnet werden kann, einer Blitz- oder pulsierenden Lichtquelle einschließlich einer Plasmaentladungslampe, zur Erzeugung einer Erregungsstrahlung über einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich und zum Emittieren von Strahlung mit intermittierenden Intensitätsspitzen bei einer gewünschten Frequenz, gekennzeichnet durch einen Erregungsmonochromator (12), der zwischen der Lichtquelle (11) und der Probenstation (16) angeordnet ist, zur Übertragung von Strahlung einer ausgewählten Wellenlänge zur Probe, ein erstes optisches System (18, 19) zum Fokussieren des aus dem Erregungsmonochromator kommenden Lichts auf die Probenstation, eine Einrichtung (21) im Strahlungsweg zwischen dem Erregungsmonochromator und der Probenstation zum Leiten eines Bezugsstrahlungsbündels auf einen Bezugsstrahlungsdetektor (23) und somit zur Erzeugung eines Korrektursignals für Schwankungen der Lichtintensität der Lichtquelle, einen Emissionsmonochromator (30) zum Empfang der Lumineszenzstrahlung aus der untersuchten Probe über ein zweites optisches System (27, 28) und zum Übertragen von Strahlung mit einer ausgewählten Wellenlänge auf eine Detektoreinrichtung (32), wobei die beiden Monochromatoren (12, 30) jeweils durch einen zugehörigen Schrittmotor (14, 31) einstellbar sind, um die Wellenlänge der von den Monochromatoren durchgelassenen Strahlung zu verändern, die Detektoreinrichtung einen Photomultiplier (32) aufweist, der auf die vom Emissionsmonochromator durchgelassene Strahlung anspricht und ein von der Intensität der Lumineszenzstrahlung bei der vom Emissionsmonochromator durchgelassenen Wellenlänge abhängiges Signal erzeugt, und wobei das erste und zweite optische System (18, 19, 27, 28) auf sphärische und chromatische Aberration korrigiert ist.
  2. 2. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und zweite optische System sphärische oder elliptische Spiegel (19, 27) umfaßt, so daß die Verwendung von Linsen vermieden wird.
  3. 3. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtung (33) einen Einfangverstärker zum Nachweis von Signalen aus dem Photomultiplier nur bei der gewünschten Frequenz, mit der Licht von der Lichtquelle emittiert wird, aufweist.
  4. 4. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtung (33) einen Impulsspitzendetektor zum Nachweis von Signalen aus dem Photomultiplier nur bei der gewünschten Frequenz, mit der Licht von der Lichtquelle emittiert wird, aufweist.
  5. 5. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtung (33) eine Photonenzähleinrichtung aufweist.
  6. 6. Spektralfluoreszenzmesser nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bezugsstrahlungsdetektor einen Photomultiplier (23) zum Empfang eines intermittierenden Signals aus dem auf die Probenstation gerichteten Strahlungsbündel aufweist.
  7. 7. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Bezugsphotomultiplier (23) Änderungen der Intensität des Erregungsbündels mit der Wellenlänge sowie mit der Zeit kompensiert.
  8. 8. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Bezugsphotomultiplier (23) einen Wellenlängenumwandler (24) im Strahlungsweg zum Bezugsphotomultiplier aufweist, so daß bei Änderung der Wellenlänge der auf die Probe gerichteten Strahlung der Wellenlängenumwandler (24) die Strahlung in eine feste Wellenlänge oder ein festes Spektrum umwandelt und dadurch der Bezugsphotomultiplier (23) stets Strahlung der gleichen Wellenlänge empfängt.
  9. 9. Spektralfluoreszenzmesser nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zwischen dem Erregungsmonochromator (12) und der Probenstation (16) angeordnete Einrichtung (21) zum Leiten von Strahlung auf den Bezugsstrahlendetektor eine reflektierende Einrichtung (21) zur Erzeugung intermittierender Reflexion auf den Bezugsphotomultiplier aufweist.
  10. 10. Spektralfluoreszenzmesser nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenstation (16) in einem Gehäuse (17) angeordnet ist, das über mehr als eine Seite des Gehäuses zugänglich ist.
  11. 11. Spektralfluoreszenzmesser nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse (17) so angeordnet ist, daß es an einem Rand oder einer Seite des Spektralfluoreszenzmessers vorsteht, so daß das Gehäuse auf drei Seiten zugänglich ist.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2922788A1 (de) * 1978-06-05 1979-12-06 Hitachi Ltd Verfahren zur aufnahme von fluoreszenzspektren und fluoreszenzspektrometer
DE3038908A1 (de) * 1980-10-15 1982-05-27 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur lumineszenzspektroskopischen bestimmung von auftraegen und auftragsprofilen
DE3539977A1 (de) * 1984-11-12 1986-05-22 Hitachi, Ltd., Tokio/Tokyo Spektrofluorophotometer

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