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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Erfindungsgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, das sich für das High-Throughput-Screening eignet,
umfassend eine Autofokussierungseinrichtung mit einer entfalteten
optischen Hauptachse. Die Erfindung betrifft weiterhin auch eine
Autofokussierungsvorrichtung und ein Autofokussierungsverfahren,
die sich beim High-Throughput-Screening eignen.
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Beschreibung
des verwandten Stands der Technik
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Seit
vielen Jahren stehen Autofokussierungstechniken für Mikroskope
zur Verfügung.
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Die
meisten Autofokusverfahren fallen in zwei Kategorien: Positionserfassung
und Bildinhaltsanalyse. Bildinhalts-Autofokusfunktionen sind bereits für die Hellfeldmikroskopie
verglichen worden. Groen, Young und Ligthart (Groen FCA, Young IT, Ligthart
G: A comparison of different focus functions for use in autofocus
algorithms. Cytometry 6: 81–91, 1985)
verglichen 11 Autofokusfunktionen unter einem Hellfeld unter Verwendung
eines Elektronenmikroskopgitters und einer Metaphasenverbreitung,
und Vollath (Vollath D: Automatic Focusing by Correlative Methods.
J Microsc 147: 279–288,
1987) testete eine Autokorrelationsfunktion unter einem Hellfeld
unter Verwendung einer paralytischen Stahlprobe. Groen et al. folgerten,
daß drei
Autofokusfunktionen, d.h. zwei Gradientenfunktionen und die Intensitätsvarianz,
die beste Leistung aufwiesen. Seine wichtigste Beschränkung ist
die Geschwindigkeit, die von den Berechnungsleistungen abhängig ist.
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Bei
einer typischen Autofokussierbildinhaltstechnik wird eine Objektivlinse
in einer vorbestimmten Entfernung von der zu scannenden Probe plaziert,
und von dem Bild wird eine Aufnahme gemacht. Das durch das Mikroskop
erzeugte Bild wird dann in der Regel ausgewertet, um die Position
zu bestimmen, bei der die Oberfläche
des Objekts oder eine Ebene innerhalb des Objekts scharf ist. Die
Auswertung des Bilds beinhaltet in der Regel das Analysieren von
Charakteristiken des Bilds, wie etwa Entropie, räumliche Auflösung, Raumfrequenz,
Kontrast oder andere Charakteristiken. Die Analyse dieser Charakteristiken
erfordert ein erhebliches Ausmaß an
Computerverarbeitung. Nach dem Analysieren der Charakteristiken
wird die Entfernung zwischen die Objektivlinse und dem zu scannenden
Objekt variiert, und eine weitere Aufnahme wird angefertigt. Das
neue Bild wird dann ausgewertet, und der Prozeß wird mehrmals wiederholt,
bevor schließlich
ein fokussiertes Bild erhalten wird. Den Schritt des Analysierens
des Bilds zu wiederholen, kann dazu führen, daß die Fokussierungsoperation
unerwünscht lange
Zeit benötigt,
bevor das Mikroskop schließlich auf
die Objektoberfläche
fokussiert ist. Die Notwendigkeit einer verlängerten Verarbeitungszeit für die Autofokussierung
kann für
verschiedene Arten von Abbildungsoperationen besonders akut sein.
Wenn beispielsweise ein Objekt unter einem Mikroskop betrachtet
wird, müssen
die fokussierten Bedingungen aufrechterhalten werden, damit ein
ordnungsgemäß fokussiertes
Bild des Objekts beibehalten wird. Selbst wenn das Objekt anfänglich scharf
ist, kann das Objekt deshalb aufgrund einer Vielfalt externer Faktoren
wie etwa Wärmeeffekte
und Schwingungen unscharf werden, falls keine korrigierenden Schritte ergriffen
werden. Wenn zudem ein Objekt größer ist als
das Blickfeld des Mikroskops, kann das Mikroskop nur den Abschnitt
des Objekts fokussieren, der durch das Blickfeld des Mikroskops
betrachtet werden kann. Die Fokussierbedingungen müssen deshalb
regelmäßig geprüft und justiert werden,
um ein schwaches Bild des Objekts insgesamt beizubehalten.
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Angesichts
des Obengesagten gibt es eine Notwendigkeit eines verbesserten Autofokussierungssystem
und -verfahren für
ein Mikroskop, die schnelle und präzise Autofokussierungsoperationen durchführen und
gleichzeitig ein scharfes Bild beibehalten können.
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Aus
US-A-5,530,237 ist ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff von Anspruch
1 bekannt.
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Es
sind mehrere Autofokuspositionserfassungsverfahren und -vorrichtungen
bekannt, beispielsweise aus Offenlegungsschrift
DE 34 46 727 und
DE 33 28 821 . Diese deutschen Dokumente
offenbaren eine Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop, bei der Variationen
bei der von zwei separaten Lichtquellen kommenden Lichtintensität ein Signal zur
Fokusjustierung bereitstellen. Diese bekannten Autofokusverfahren
eignen sich insbesondere für
abzubildende flache Proben. Die Autofokussierungslichtstrahlen breiten
sich entlang einem im wesentlichen großen Teil aus, das mehrere optische
Elemente enthält,
wie mehrere Linsen und mindestens zwei Strahlteiler. Dieses große Teil
bewirkt bei der Autofokussierungsprozedur eine erhebliche Verzögerung. Die
vorliegende Erfindung betrifft ein vereinfachtes Autofokussystem,
durch das der Teil des Autofokussierens von Licht auf ein Minimum
reduziert wird. Die Ungewißheit
beim Übertragen
von Autofokustestergebnissen von einem Mikroskopverfahren auf ein
anderes führte
zu der vorliegenden Erfindung. Die Entwicklung der vorliegenden
Erfindung beinhaltete das Untersuchen der Autofokusleistung bei
der Mikroskopie von fluoreszierenden markierten biologischen Proben.
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KURZE DARSTELLUNG DER
ERFINDUNG
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Die
Vorteile und Aufgabe der Erfindung werden teilweise in der folgenden
Beschreibung dargelegt und ergeben sich teilweise aus der Beschreibung oder
können
durch die Ausübung
der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Vorteile und Aufgaben der
Erfindung werden mit Hilfe der Elemente und Kombinationen realisiert
und erreicht, die in den beigefügten
Ansprüchen
besonders hervorgehoben sind.
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Es
versteht sich, daß sowohl
die vorausgegangene allgemeine Beschreibung als auch die folgende
ausführliche
Beschreibung lediglich beispielhaft und erläuternd sind und die Erfindung,
wie beansprucht, nicht einschränken.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
beigefügten
Zeichnungen, die in diese Spezifikation integriert sind und einen
Teil dieser darstellen, veranschaulichen mehrere Ausführungsformen
der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung
der Grundlagen der Erfindung. In den Zeichnungen zeigen:
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1 die
Grundprinzipien eines optischen Systems zum Ausbilden eines Bilds
einer Objektebene gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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2 das
optische System von 1 mit scharfer und unscharfer
Objektebene;
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3A ein
Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem
Autofokussierungssystem gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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3B eine
Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems
von 3A;
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3C eine
graphische Darstellung der durch die Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 3B an verschiedenen
relativen Positionen zwischen einer tatsächlichen Bildebene und einer
gewünschten
Bildebene detektierten Lichtintensität;
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4A ein
Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem
Autofokussierungssystem gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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4B eine
Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems
von 4A;
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4C eine
graphische Darstellung der durch die Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 4B an
verschiedenen relativen Positionen zwischen einer tatsächlichen
Bildebene und einer gewünschten
Bildebene detektierten Lichtintensität;
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4D eine
Variation des Mikroskops von 4A mit
einem modifizierten Autofokussierungsdetektionssystem;
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5 ein
Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem
Autofokussierungssystem gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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6A, 6B und 6C eine
Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems
von 5 mit scharfer Objektebene, der zu weit von einer
Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise der zu nahe
an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
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7A, 7B und 7C die
Position von auf Dioden der Autofokussierungsdetektionseinrichtung
von 5 ausgebildeten Lichtpunkten mit scharfer Objektebene,
der zu weit von einer Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise
der zu nahe an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
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8A ein
Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem
Autofokussierungssystem gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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8B, 8C und 8D die
Position von auf Dioden der Autofokussierungsdetektionseinrichtung
von 8A ausgebildeten Lichtpunkten mit scharfer Objektebene,
der zu nahe von einer Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise
der zu weit an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
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9 ein
beispielhaftes Flußdiagramm
eines Verfahrens zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer
Objektebene, das in den Mikroskopen der 3–4 eingesetzt werden kann;
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10 ein
beispielhaftes Flußdiagramm
eines Verfahrens zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer
Objektebene, das in den Mikroskopen der 5–8 eingesetzt werden kann;
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11 eine
Seitenansicht eines Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung und
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12 eine
Seitenansicht des auf einem separaten Tisch von einem Scantisch
positionierten Mikroskops von 11.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
wird nun ausführlich
auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Bezug genommen, von denen Beispiele in den beiliegenden Zeichnungen
dargestellt sind. Wo immer möglich,
werden in den Zeichnungen die gleichen oder ähnliche Teile mit gleichen
Referenzzahlen bezeichnet.
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Als
von besonderer Wichtigkeit für
ein Mikroskop, das die Autofokussierungssysteme enthielten, wird
nun in einem ersten Fall erörtert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Mikroskop mit automatisch fokussierenden
Mitteln bereit, um das Mikroskop automatisch auf eine Ebene eines Objekts
wie etwa einer Probe zu fokussieren.
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Aus
Gründen
der Übersichtlichkeit
werden die Einzelheiten der Autofokussierungsvorrichtung und des
Autofokussierungssystems und des Mikroskops getrennt erörtert. Es
sind jedoch alle Merkmale enthalten.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung wird eine Autofokussierungsvorrichtung bereitgestellt,
die ein optisches System enthält,
die konfiguriert ist zum Ausbilden eines optischen Bilds einer zu
betrachtenden Probenebene, ein Autofokussierungsdetektionssystem
und ein Fokuskorrektionssystem. Das optische System kann eine Objektivlinse,
eine Beleuchtungsstrahlquelle zum Beleuchten der Probenebene mit
einem Beleuchtungsstrahl und eine Bildlinse wie etwa eine Sammellinse
zum Erzeugen eines Bilds der Probenebene enthalten. Das Autofokussierungsdetektionssystem
kann eine Autofokussierungslichtstrahlquelle zum Erzeugen eines
Autofokussierungslichtstrahls, einen Strahlteiler, der konfiguriert
ist zum Lenken des Autofokussierungslichtstrahls zu der Probenebene
und Bewirken, daß der
Autofokussierungslichtstrahl von der Probenoberfläche wegreflektiert
wird, enthalten.
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Das
Autofokussierungsdetektionssystem der vorliegenden Erfindung kann
weiterhin eine Detektionssystemlinse enthalten, die so konfiguriert
ist, daß sie
den zurückkehrenden
Autofokussierungslichtstrahl zu einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung
lenkt. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung bestimmt bevorzugt
das Ausmaß der
Verschiebung des Bilds der Probenoberfläche von einer gewünschten
fokussierten Referenzebene auf der Basis der detektierten Verschiebung
einer Bildebene des Autofokussierungslichtstrahls von einer vorbestimmten
Referenzebene in der Autofokussierungsdetektionseinrichtung. Das
Fokussierungskorrektursystem enthält bevorzugt einen Rückkopplungscontroller
und eine Fokusjustiereinrichtung zum automatischen Justieren der
Entfernung zwischen der Objektivlinse und der Probenebene, um das
Bild ordnungsgemäß im optischen
System zu fokussieren. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein
Verfahren zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Probenebene
in einem Mikroskop.
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Wenn
sich bei einem Mikroskop die Probenebene nicht in der Brennweite
von der Objektivlinse befindet, ist das resultierende Bild im Mikroskop
unscharf. Die 1 und 2 beispielsweise
veranschaulichen, wie es zu diesem Problem in einem optischen System
zum Ausbilden eines optischen Bilds einer in einem Mikroskop zu
beobachtenden Probe kommen kann. Das System der 1–2 ist
nur zu Veranschaulichungszwecken gezeigt und enthält nicht
das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung, das unten
unter Bezugnahme auf die 3–8 ausführlicher
beschrieben wird.
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Wie
hier verkörpert
und in den 1–2 gezeigt,
bildet das optische System 10 ein optisches Bild einer
im Mikroskop zu betrachtenden Probenebene 16. Das optische
System 10 enthält
einen Strahlteiler 12, eine Objektivlinse 14,
eine teilreflektierende Objektebene oder Probenebene 16,
eine Bildlinse 18, eine Bildebene 20 und eine
Quelle 25 für einen
Beleuchtungslichtstrahl 22. Bei dem in 1 gezeigten
Beispiel ist die Probenebene 16 der Probe in einer Entfernung
positioniert, die der Brennweite (f1) der Objektivlinse 14 entspricht.
Dadurch wird das resultierende Bild der Probe im Mikroskop von 1 ordnungsgemäß fokussiert.
Im Gegensatz dazu ist die Probenebene 16 in 2 an einer
Position angeordnet, die (um d1) von der Brennweite der Linse 14 abweicht,
und deshalb wird das resultierende Bild nicht ordnungsgemäß fokussiert.
In den 1 und 2 kann die teilreflektierende
Ebene 16 entweder dem Boden der Probenoberfläche oder
einer Ebene auf der Innenseite der Probe entsprechen. Alternativ kann
die Probenebene 16 dem Boden der Oberfläche entsprechen, auf der die
Probe plaziert ist. Zu Zwecken der nachfolgenden Erörterung
wird die zu fokussierende Ebene als die Probenebene 16 bezeichnet.
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Wie
in den 1 und 2 dargestellt erzeugt die Lichtquelle 25 einen
Beleuchtungslichtstrahl 22. Der Beleuchtungslichtstrahl 22 kann
eine beliebige Wellenlänge
aufweisen, die sich zum Beleuchten einer Probenebene in einem Mikroskop
eignet. Obwohl das gezeigte Beispiel veranschaulicht, daß der Beleuchtungslichtstrahl
kollimiert wird, ist es nicht notwendig, daß der Strahl kollimiert wird.
Der Strahl könnte
auch divergieren oder konvergieren. Zu Erörterungszwecken wird die Verwendung
eines kollimierten Lichtstrahls beschrieben. Bei der Lichtquelle 25 kann
es sich um eine beliebige herkömmliche Art
von Lichtquelle wie etwa eine Lampe oder einen Laser handeln. Obwohl
die 1 und 2 zeigen, daß sich die Lichtquelle neben
einem Strahlteiler 12 befindet, ist es auch durchführbar, die
Lichtquelle auf der linken Seite der Probenebene 16 in
den Figuren zu plazieren, um die Probenebene zu durchleuchten. Bei
einer derartigen Konfiguration wäre
der Strahlteiler 12 nicht erforderlich. Bei einer alternativen
Konfiguration kann die Probenebene Licht von sich aus ohne Notwendigkeit
für eine
spezifische Beleuchtungslichtquelle emittieren. Ein Beispiel dafür, wann es
dazu kommen kann, ist, wenn eine Probe eine lumineszente chemische
Reaktion erfährt.
Die spezifischen Arten von Lichtquellen und die bevorzugten Wellenlängen des
Beleuchtungslichtstrahls werden später unter Bezugnahme auf die
offenbarten Autofokussierungsdetektionssysteme der vorliegenden
Erfindung erörtert.
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Bei
den Beispielen der 1 und 2 wird der
Beleuchtungslichtstrahl 22 auf einen Strahlteiler 12 gelenkt.
Bei dem Strahlteiler 12 kann es sich um eine beliebige
Art herkömmlichen
Strahlteilers handeln, der sich für den Einsatz in der vorliegenden
Erfindung eignet. Der Strahlteiler 12 reflektiert den Beleuchtungslichtstrahl 22 in
Richtung der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16,
entlang der ersten optischen Achse 56 angeordnet. In 1 ist
die Probenebene 16 genau in der Brennebene der Objektivlinse 14 positioniert,
d.h. in der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14. Da
die Probenebene 16 genau um die Brennweite von der Objektivlinse 14 weg
positioniert ist, schneiden sich die Außengrenzen des Beleuchtungslichtstrahls 22 von
der Objektivlinse 14 in einem einzigen Punkt in der Probenebene 16,
wie in 1 gezeigt. Es wird gesagt, daß die Objektivlinse 14 in
der Probenebene 16 in einer derartigen Anordnung fokussiert
ist, wo der Lichtstrahl schneidet, um einen einzelnen Punkt auf
der Oberfläche
zu treffen, d.h., der Durchmesser des Lichtstrahls wird ein Minimum
sein.
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Der
Beleuchtungslichtstrahl 22, der die Ebene 16 trifft,
wird von der Ebene 16 weg und zurück zur Objektivlinse 14 reflektiert.
Während
der Beleuchtungslichtstrahl durch die Objektivlinse 14 hindurchtritt,
wird der Beleuchtungslichtstrahl zurück zu seiner ursprünglichen
Form kollimiert und auf den Strahlteiler 12 gelenkt. Der
Strahlteiler 12 ist so konfiguriert, daß der Beleuchtungslichtstrahl,
der entlang der ersten optischen Achse 56 zurückkehrt,
ohne irgendwelche störenden
Effekte durch den Strahlteiler 12 übertragen wird. Nach der Übertragung
durch den Strahlteiler 12 erreicht der kollimierte Lichtstrahl
die Bildlinse 18.
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Bei
der Bildlinse 18 kann es sich um eine beliebige einer Vielfalt
herkömmlicher
Linsen wie etwa eine Sammellinse zum Erzeugen eines Bilds einer Oberfläche handeln.
Wenngleich das Schemadiagramm von 1 nur eine
Bildlinse 18 zeigt, weist ein typisches Mikroskop, wie
in der Technik bekannt ist, eine Reihe von Übertragungsoptiken auf. Die Übertragungsoptiken
sind der Einfachheit halber nicht gezeigt. Bei der in 1 gezeigten
Konfiguration projiziert die Bildlinse 18 den Beleuchtungslichtstrahl
auf eine Bildebene 20, die in der Brennweite f2 von der
Bildlinse 18 weg positioniert ist. Eine Linse wie etwa
die Bildlinse 18 (oder die Objektivlinse 14) weist
eine vorbestimmte Brennweite (f) auf der Basis ihrer Vergrößerungsleistung
auf. Bei einem Beispiel einer Bildlinse, das sich mit der vorliegenden
Erfindung eignet, liegt die Brennweite zwischen 160 mm und 250 mm.
Die Brennweite der Bildlinse kann jedoch viel kleiner oder größer sein
als dieser Bereich.
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Die
Brennweite (f) entspricht der Entfernung von der Linse, in der ein
durch die Linse hindurchtretender kollimierter Lichtstrahl ordnungsgemäß fokussiert
wird, d.h. der Durchmesser des Lichtstrahls wird ein Minimum sein.
Beispielsweise weist die in 1 gezeigte
Objektivlinse 14 eine Brennweite von f1 auf. Deshalb wird
bei einer in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14 angeordneten
Probenebene 16 der kollimierte Beleuchtungslichtstrahl 22 von
Strahlteiler 12 auf die Probenebene fokussiert, wie in 1 gezeigt.
Weil sich die Probenebene 16 genau in der Brennweite f1
von der Objektivlinse 14 befindet, wird der reflektierte
Lichtstrahl von der Oberfläche
nicht wieder kollimiert, wenn er entlang der ersten optischen Achse 56 in
Richtung der Bildlinse 18 hindurchtritt. Der von der Bildlinse 18 (in 1 nach rechts
bewegend) gelenkte reflektierte Beleuchtungslichtstrahl wird dann
auf die Bildebene 20 fokussiert, die in der Brennweite
f2 (der Bildlinse 18) von der Bildlinse 18 weg
angeordnet ist. Wenn sich deshalb die Probenebene 16 in
der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 befindet, wird
deshalb das resultierende Bild von der Bildlinse 18 ordnungsgemäß fokussiert.
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In
der Regel ist jedoch die Probenebene 16 anfänglich nicht
genau in der Brennweite von der Objektivlinse 14 positioniert.
Selbst wenn die Probenebene anfänglich
in der gewünschten
Entfernung von der Objektivlinse positioniert ist, können externe
Faktoren wie etwa thermische Effekte oder Vibrationen eine Relativbewegung
zwischen der Probenebene und der Objektivlinse bewirken. Wenn sich
die Ebene 16 in einer anderen Position als der Brennweite
f1 von der Objektivlinse 14 weg befindet (d.h. von der
in 1 gezeigten Position aus nach links oder rechts bewegt),
fokussiert die Objektivlinse nicht auf die Probenebene. Beispielsweise
zeigt 2, daß die Probenebene 16 im
Vergleich zu der Entfernung in 1 sich in
einer größeren Entfernung
(f1 plus d1) von der Objektivlinse 14 weg befindet. In
dieser Position hat sich die Oberfläche der Probe um einen zusätzlichen
Weg d1 von der in 1 gezeigten Position weg bewegt.
Wenn sich die Probenebene nicht in der Brennweite f1 von der Objektivlinse
weg befindet, wird der Beleuchtungslichtstrahl von der Objektivlinse 14 auf
die gewünschte
Referenzebene 23 für
die Probe (in 2 gestrichelt gezeigt) fokussiert,
die f1 von der Objektivlinse 14 weg liegt, anstatt auf
die Probenebene 16. Die gewünschte Referenzebene 23 für die Probe
(in 2 gezeigt) ist genau in der Brennweite f1 von
der Objektivlinse 14 weg positioniert und entspricht deshalb
der Position, bei der der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls
von der Objektivlinse 14 ein Minimum ist.
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Der
Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls soll jedoch in der tatsächlichen
Ebene der Probenebene 16 (als durchgezogene Linie gezeigt) ein
Minimum sein, nicht an einer von der Probenebene beabstandeten Referenzebene 23.
Deshalb ist es schließlich
wünschenswert,
daß die
Probenebene 16 sich in der gewünschten Referenzebene 23 befindet, damit
es zu einer ordnungsgemäßen Fokussierung kommt.
Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erhalten einer derartigen
Fokussierung werden später beschrieben.
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In 2 befindet
sich die Probenebene 16 in einer zusätzlichen Entfernung d1 von
der (gestrichelt gezeigten) gewünschten
Referenzebene 23. Diese Bewegung d1 kann durch eine Vielzahl
von Faktoren verursacht werden. Wie in 2 zu sehen
befindet sich der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls in der
gewünschten
Referenzebene 23 auf einem Minimum und trifft somit auf
die Probenebene 16 an einer Position jenseits der Entfernung
f1 von der Objektivlinse 14. Der Beleuchtungsstrahl 22 wird
dann als reflektierter Lichtstrahl 24 von der Probenebene
weg reflektiert. Da der Beleuchtungslichtstrahl 22 nicht auf
die Probenebene 16 an einem einzelnen Punkt oder an einer
Position mit Mindestdurchmesser (wie in 1) auftrifft,
befinden sich die Außengrenzen des
reflektierten Lichtstrahls 24 außerhalb der Außengrenzen
des zur Probenebene 16 verlaufenden Beleuchtungslichtstrahls 22.
Wie in 2 gezeigt werden die reflektierten Lichtstrahlen 24 nach
dem Zurücklaufen
durch die Objektivlinse 14 nicht länger kollimiert.
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Die
reflektierten Lichtstrahlen 24 werden dann durch den Strahlteiler 12 entlang
der ersten optischen Achse 56 zur Bildlinse 18 übertragen.
Weil die reflektierten Lichtstrahlen nicht kollimiert werden, projiziert
die Bildlinse 18 dann die reflektierten Lichtstrahlen 24 so,
daß sie
sich in einer Bildebene 20 schneiden, die sich nicht in
der ordnungsgemäßen Brennweite
f2 von der Bildlinse 18 weg befindet. Die in der mit der
Brennweite f2 von der Bildlinse entfernt angeordnete Ebene wird
als die „gewünschte" Referenzebene für die Bildebene
bezeichnet. Die Entfernung zwischen der gewünschten Referenzebene 26 für die Bildebene
(gestrichelt gezeigt) und der tatsächlichen Position der Bildebene 20 (als
durchgezogene Linie gezeigt) ist in 2 und in
der gesamten Spezifikation als d2 dargestellt. Wenn die Probenebene,
wie in 1 gezeigt, relativ zu der Objektivlinse ordnungsgemäß positioniert
ist, ist die tatsächliche
Position der Bildebene 20 identisch mit der gewünschten
Referenzebene 26.
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Eine
Bildformungseinrichtung wie etwa ein ladungsgekoppeltes Bauelement
(CCD) oder eine Kamera kann in der gewünschten Referenzebene 26 des
optischen Systems 10 positioniert sein. Alternativ kann
ein Okular zum Betrachten des Bilds in der gewünschten Referenzebene 26 positioniert
sein, so daß das
Auge eines Betrachters auf die gewünschte Referenzebene 26 ausgerichtet
ist. Um das optische Instrument ordnungsgemäß zu fokussieren, ist es deshalb
wünschenswert,
daß der
reflektierte Strahl 24 so gelenkt wird, daß sich die
Strahlen an einem Punkt in der gewünschten Referenzebene 26 schneiden
(wie in 1 gezeigt). Für das in 2 gezeigte System
gibt es, wenn die Probenebene 16 um d1 von der ordnungsgemäß fokussierten
Position verschoben ist (eine Brennweite f1 von der Objektivlinse), eine
entsprechende Verschiebung d2 der Bildebene 20 von der
gewünschten
Referenzebene 26 des Mikroskops. Deshalb wird das entsprechende
Bild unscharf sein, weil es sich nicht in der ordnungsgemäßen Brennweite
f2 von der Bildlinse 18 befindet.
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Mit
den Prinzipien der vorliegenden Erfindung vereinbare Autofokussierungssysteme
sorgen für
eine schnelle und präzise
automatische Fokussierung auf die Probenebene. Das Autofokussierungssystem
enthält
ein Autofokussierungsdetektionssystem zum direkten Bestimmen der
Verschiebung der tatsächlichen
Bildebene von der gewünschten
Referenzebene der Bildebene des optischen Systems. Die Verschiebung
entspricht allgemein dem Grad, wie das Bild unscharf ist. Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung entfällt die Notwendigkeit einer
zeitraubenden Auswertung der Charakteristiken mehrerer Bilder durch
das direkte Bestimmen der Entfernung, um die das Bild außer Fokus
ist. Infolgedessen kann das Mikroskop schnell und effizient justiert
werden, so daß das
Bild ordnungsgemäß fokussiert
ist. Das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung enthält weiterhin
ein Fokussierungskorrektursystem zum Justieren der Entfernung zwischen
der Objektivlinse und der Probenebene, so daß das Mikroskop schnell auf
die Probenebene fokussiert wird.
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Ein
erstes Beispiel einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
zum automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine
Probenebene ist in den 3A, 3B und 3C gezeigt.
Wie hier verkörpert
und in den 3A–3C gezeigt
enthält
die Vorrichtung 30 zum automatischen Fokussieren eines
optischen Instruments auf eine Probenebene das optische System 10 zum
Ausbilden eines Bilds (zuvor in den 1–2 beschrieben),
ein Autofokussierungsdetektionssystem 32 und ein Fokussierungskorrektursystem 34.
Wie in den 3A–3C gezeigt
enthält
die Vorrichtung 30 ein optisches System 10 zum
Ausbilden eines optischen Bilds einer zu betrachtenden Probe. Das
optische System 10 enthält
einen Strahlteiler 12, eine Objektivlinse 14,
eine Bildlinse 18, eine Bildebene 20 und eine
Beleuchtungslichtquelle 25 im wesentlichen wie zuvor in
der obigen Erörterung
für die 1–2 beschrieben.
Die Prinzipien des optischen Systems 10 in 3A–3C arbeiten
gemäß den gleichen
Prinzipien wie zuvor für
die 1–2 beschrieben.
Die Komponenten des optischen Systems 10 werden unten bezüglich des Autofokussierungsdetektions systems 32 und
des Fokussierungskorrektursystems 34 ausführlicher
beschrieben.
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Wie
hier verkörpert
und in den 3A–3C gezeigt
wird ein Autofokussierungsdetektionssystem 32 bereitgestellt,
das eine Lichtquelle 39 zum Erzeugen von Autofokussierungslichtstrahlen 40,
einen ersten Autofokussierungsstrahlteiler 42 und einen
zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 enthält. Das
Autofokussierungssystem 32 enthält weiterhin ein Detektionslinsensystem 46 zum Lenken
und Zurückschicken
eines Autofokussierungslichtstrahls und einer Detektionseinrichtung 50 zum
Bestimmen des Grads der Verschiebung des Bilds von einer gewünschten
fokussierten Referenzebene. Die Detektionseinrichtung 50 kann
eine beliebige einer Reihe von Einrichtungen sein, wie etwa jene,
die in 3A–3C und
den anderen Ausführungsformen
der Erfindung gezeigt sind.
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Wie
in den 3A–3B verkörpert und gezeigt
erzeugt die Lichtquelle 39 einen Autofokussierungslichtstrahl 40,
der im Autofokussierungsdetektionssystem 32 verwendet wird.
Bei der Lichtquelle 39 kann es sich um eine beliebige geeignete
Lichtquelle wie etwa eine Lampe oder einen Laser handeln. Falls
ein Laser gewählt
wird, kann ein Diodenlaser oder ein HeNe-Laser für die Lichtquelle 39 verwendet
werden, obwohl mit der vorliegenden Erfindung eine beliebige Anzahl
anderer Laserarten ebenfalls verwendet werden kann. Obwohl der Autofokussierungslichtstrahl 40 in 3A als
kollimiert gezeigt ist, könnte
der Autofokussierungslichtstrahl zudem alternativ entweder konvergierend
oder divergierend sein. Der Strahl ist als kollimiert gezeigt, um
die Erörterung
zu vereinfachen.
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Bei
dem in 3A gezeigten Beispiel weist der
Autofokussierungslichtstrahl eine Wellenlänge λa auf. Die Wellenlänge für den Autofokussierungslichtstrahl
ist bevorzugt so ausgewählt,
daß sie
von der Wellen länge
des Beleuchtungslichtstrahls 52 verschieden ist. In den
meisten Fällen
wird bevorzugt, daß der
Autofokussierungslichtstrahl eine längere Wellenlänge als
der Beleuchtungslichtstrahl aufweist. Zu Zwecken der folgenden Beschreibung
werden die Lichtquellen und Strahlen bezüglich Fluoreszenzabbildungsspektroskopie
beschrieben, obwohl sich die vorliegende Erfindung für eine große Anzahl anderer
Anwendungen zusätzlich
zur Fluoreszenzabbildungsspektroskopie eignet. Bei der Fluoreszenzabbildung
weist der Beleuchtungslichtstrahl 52 eine Anregungswellenlänge von λe auf und
wird verwendet, um auf eine Weise ähnlich der bezüglich 1 erörterten
das Bild in dem optischen System 10 zu erzeugen. Die Wellenlängen des
Autofokussierungslichtstrahls 40 und des Beleuchtungslichtstrahls 52 sind
so ausgewählt,
daß sie
voneinander verschieden sind, damit der Autofokussierungslichtstrahl 40 den
zum Erzeugen des Bilds verwendeten Beleuchtungsstrahl 52 nicht
stört oder
mit ihm interferiert.
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Bei
einem Mikroskop, das Fluoreszenzabbildung verwendet, wird die Wellenlänge des
Beleuchtungslichtstrahls 52 so ausgewählt, daß sie so schmal wie möglich ist
und innerhalb des Absorptionsbandes der untersuchten fluoreszierenden
Probe liegt. Wenn der Beleuchtungslichtstrahl die Oberfläche trifft,
wird ein Fluoreszenzlichtstrahl mit einer Wellenlänge λf erzeugt.
Bevorzugt ist die Wellenlänge
des Fluoreszenzstrahls von der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls
verschieden. Die Differenz zwischen den Wellenlängen kann bei einem Beispiel möglicherweise
nur 50 nm betragen, bevorzugt 10 nm oder weniger. Kein Licht des
Anregungsstrahls sollte in die Bildlinse 18 eintreten dürfen. Deshalb
ist bei dem in 3A gezeigten Beispiel der Strahlteiler 12 so
konfiguriert, daß er
alles Licht mit einer Wellenlänge λe blockiert
und gleichzeitig gestattet, daß Licht der
Fluoreszenzwellenlänge λf dort hindurch übertragen
wird.
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Wie
oben erörtert
sollten die Autofokussierungslichtstrahlen so ausgewählt werden,
daß sie eine
Wellenlänge
(λa) aufweisen,
die von der Anregungswellenlänge
(λe) und
der Fluoreszenzwellenlänge
(λf) verschieden
ist. Nur zur Veranschaulichung wird ein bestimmtes Beispiel gezeigt.
In dem Fall einer Probe, die eine Wellenlänge von etwa 510 nm absorbiert
und bei etwa 550 nm fluoresziert, kann der Anregungsstrahl so ausgewählt werden,
daß er ein
Ar+-Ionenlaser mit einer Wellenlänge von
514 nm ist. Die Wellenlänge
des Autofokussierungslichtstrahls kann so ausgewählt werden, daß sie über etwa
600 nm liegt. Dieses eine Beispiel der Wellenlängen ist nur zur Veranschaulichung
und schränkt die
vorliegende Erfindung nicht ein. Indem verschiedene Wellenlängen verwendet
werden, kann das vorliegende System gleichzeitig den Grad bestimmen, den
das System außer
Fokus ist, und das Bild der Oberfläche erzeugen. Die Fähigkeit,
beide dieser Prozesse gleichzeitig auszuführen, vergrößert die Geschwindigkeit und
Effizienz der Autofokussierungsvorrichtung.
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Bei
dem in den 3A–3C gezeigten Beispiel
erzeugt die Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 den Autofokussierungslichtstrahl 40 und projiziert
ihn in einer ersten Richtung parallel zur ersten optischen Achse 56.
Der Autofokussierungslichtstrahl 40 trifft auf den ersten
Strahlteiler 42 des Autofokussierungsdetektionssystems
und wird entlang einer zweiten optischen Achse 64 zum zweiten Strahlteiler 44 des
Autofokussierungssystems reflektiert. Alternativ könnte die
Vorrichtung so konfiguriert sein, daß die Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 den
Autofokussierungslichtstrahl 40 direkt auf den zweiten
Strahlteiler 44 erzeugt, ohne daß der erste Strahlteiler 42 benötigt wird.
Bei einer weiteren möglichen
Konfiguration könnte
die Lichtquelle 39 für
den Autofokussierungsstrahl den Autofokussierungslichtstrahl 40 direkt
zu der Objektivlinse 16 erzeugen.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Strahlteiler 42, 44 können von
einer beliebigen, in der Technik bekannten herkömmlichen Art sein. Beispielsweise
können
die Strahlteiler 42, 44 teilreflektierende herkömmliche
Strahlteiler sein. Der Strahlteiler 44 ist bevorzugt so
konfiguriert, daß er den
ganzen Beleuchtungslichtstrahl der Wellenlängen λe und λf durchläßt und dabei die Autofokussierungslichtstrahlen
der Wellenlänge λa reflektiert.
Bei einem Beispiel ist der Strahlteiler 42 bevorzugt so konfiguriert,
daß er
einen polarisierenden Strahlteiler und eine Viertelwellenplatte
verwendet. Wie in 3A gezeigt wird der Autofokussierungslichtstrahl 40 beim
Auftreffen auf den zweiten Strahlteiler 44 entlang der
ersten optischen Achse 56 zu der Objektivlinse 14 reflektiert.
Der Strahlteiler 44 ist so konfiguriert, daß er den
Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa reflektiert. Wenn die Strahlen
gleichzeitig eingesetzt werden, gestattet der Strahlteiler 44 auch,
daß der
reflektierte Beleuchtungslichtstrahl 52 wie oben beschrieben
dort hindurch verläuft.
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Der
Autofokussierungslichtstrahl läuft
entlang einer ersten optischen Achse 56 zur Objektivlinse 14.
Die Objektivlinse 14 kann eine beliebige Art von Mikroskopobjektivlinse
sein. Die Objektivlinse 14 weist eine Brennweite f1 auf,
die eine Funktion der Vergrößerungsleistung
der Objektivlinse ist. Bei den meisten Anwendungen liegt die effektive
Brennweite f1 in der Regel im Bereich zwischen 40 mm und 1 mm. Objektivlinsen
mit Brennweiten außerhalb
dieses Bereichs eignen sich jedoch ebenfalls mit der vorliegenden
Erfindung. Die Objektivlinse 14 lenkt den Autofokussierungslichtstrahl
der Wellenlänge λa auf die
in einer Brennweite f1 von der Objektivlinse angeordnete Probenebene 16.
Bei der in 3A gezeigten Ausführungsform
liegt die Probenebene 16 in der Brennweite f1 von der Objektivlinse
weg, weshalb das resultierende Bild der Probenebene aufgrund der Eigenschaften
des optischen Systems (einschließlich derer der Bildlinse 18)
ordnungsgemäß fokussiert wird.
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Der
Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektivlinse 14 wird
dann zumindest teilweise von der Probenebene 16 weg reflektiert
und zurück
zur Objektivlinse 14 gelenkt. Der reflektierende Autofokussierungslichtstrahl
mit einer Wellenlänge λa wird dann
von der Objektivlinse 14 entlang der ersten optischen Achse 56 zum
zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 gelenkt. Der zweite
Autofokussierungsstrahlteiler 44 reflektiert den Autofokussierungslichtstrahl
der Wellenlänge λa zu dem
ersten Autofokussierungsstrahlteiler 42 (in einer Abwärtsrichtung
entlang der zweiten optischen Achse 64 in 3A).
Der erste Autofokussierungsstrahlteiler 42 gestattet, daß der von
dem zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 reflektierte
Autofokussierungslichtstrahl ohne jegliche störenden Effekte durchgelassen
wird. Der Autofokussierungslichtstrahl 40 wird dadurch
zu der Detektionssystemlinse 46 und der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 50 übertragen.
Das Verfahren und die Vorrichtung zum Detektieren des Grades, um
den das Bild außer
Fokus ist, wird unten ausführlicher
erörtert.
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Wie
bereits erörtert
enthält
das optischen System zum Erzeugen eines Bildes die Quelle des Beleuchtungslichtstrahls
zum Beleuchten der Probenebene. Bei einem Fluoreszenzabbildungssystem weist
der Beleuchtungslichtstrahl eine Wellenlänge λe auf, um die Fluoreszenz der
Probenebene zu erzeugen. Wie in dem Beispiel von 3A gezeigt
reflektiert der Strahlteiler 12 des optischen Systems die Beleuchtungslichtquelle 52 entlang
der ersten optischen Achse 56 zur Probenebene 16.
Der zweite Autofokussierungsstrahlteiler 44 ist so konfiguriert,
daß er
die Übertragung
des Beleuchtungslichtstrahls der Wellenlänge λe durch ihn hindurch zur Objektivlinse 14 gestattet.
Die Objektivlinse 14 lenkt dann den Beleuchtungslichtstrahl
zu einem Punkt in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14.
Der Beleuchtungslichtstrahl ist so konfiguriert, daß er bei
einer Referenzebene entsprechend der Brennweite f1 von der Objektivlinse
schneidet. Weil die Probenebene sich f1 von der Objektivlinse entfernt
befindet, trifft in 3A der Beleuchtungslichtstrahl
einen einzelnen Punkt in der Probenebene und wird wegreflektiert,
wie in 3A gezeigt. Während der
Beleuchtungslichtstrahl von der Probenebene wegreflektiert wird,
wird er in einen beleuchteten Fluoreszenzstrahl (bei dem Fluoreszenzabbildungsbeispiel)
wie etwa einen Fluoreszenzlichtstrahl mit einer Wellenlänge λf konvertiert.
Diese Wellenlänge
ist bevorzugt ausreichend verschieden von der Autofokussierungswellenlänge, so
daß zwischen
dem beleuchteten Strahl und dem Autofokussierungslichtstrahl keine
Interferenz entsteht.
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Der
fluoreszierende Lichtstrahl von der Probenebene 16 weist
eine Wellenlänge λf auf und
läuft durch
die Objektivlinse hindurch (während
sie sich in 3A nach rechts bewegt). Bei
dem in 3A gezeigten Beispiel wird der
Fluoreszenzlichtstrahl kollimiert, während er durch die Objektivlinse
hindurchtritt, und zu dem zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 gelenkt.
Der zweite Autofokussierungsstrahlteiler 44 ist so konfiguriert,
daß er
den Durchtritt des Fluoreszenzlichtstrahls gestattet. Der Fluoreszenzlichtstrahl
tritt dann entlang der ersten optischen Achse 56 durch
den Strahlteiler 12 des Bildsystems hindurch. Die Bildlinse 18 fokussiert
dann den Fluoreszenzlichtstrahl auf eine Bildebene 20 in
einer Brennweite f2 von der Bildlinse, wo das Bild entsteht. Bei
dem in 3A gezeigten Beispiel ist die
Bildebene 20 koplanar zu der gewünschten Referenzebene 26,
auf der das ordnungsgemäß fokussierte
Bild entsteht, weil die Probenebene 16 genau in der Brennweite
f1 von der Objektivlinse plaziert ist. Wie bereits erörtert entspricht
die gewünschte
Referenzebene in der Regel einer Oberfläche, auf der eine Bilddetektierungseinrichtung
wie etwa eine CCD-Kamera oder ein Okular zum direkten Betrachten
des Bilds enthalten kann.
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Wie
bereits erläutert
enthält
die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum
direkten Bestimmen des Grades, in dem das Bild außer Fokus
ist, ohne daß die
Analyse der Charakteristiken mehrerer Bilder erforderlich wäre. Die
Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmen
direkt die Verschiebung des Bilds von seiner ordnungsgemäß fokussierten
Position und justiert dann das optische System so, daß ein scharfes
Bild erhalten wird. Das Autofokussierungssystem der vorliegenden
Erfindung enthält
eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung zum direkten Bestimmen
des Grades, um den das Bild außer
Fokus ist, und enthält ein
Fokussierungskorrektursystem.
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Die
Vorrichtung kann eine von verschiedenen unterschiedlichen Arten
von Autofokussierungsdetektionseinrichtungen enthalten. 3A zeigt
eine Vorrichtung mit einer besonderen Art von Autofokussierungsdetektionseinrichtung
gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 50 des
in 3A gezeigten Beispiels enthält eine Iris 60, die
in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 positioniert
ist. Die Brennweite f3 der Detektionssystemlinse 46 ist
eine Funktion der Größe und Vergrößerung der
Detektionssystemlinse 46. Die Iris 60 kann eine
beliebige Art von flacher Platte oder anderer Struktur mit einer Apertur
sein, um den Durchtritt von Licht dort hindurch zu gestatten.
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Wenn
die Probenebene 16 an der ordnungsgemäßen Fokussierungsposition (Entfernung
f1 von der Objektivlinse 14) positioniert ist, gestattet
die Iris, daß der
Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa (in 3B als
durchgehende Linie gezeigt) von der Detektionssystemlinse 46 ohne
Störung
durch die Iris zu einem Lichtdetektor 62 hindurchtritt.
Die Detektionssystemlinse 46 weist bevorzugt eine Brennweite
f3 auf, die sich eignet, so daß der
Autofokussierungslichtstrahl klein genug ist, um durch die Iris
hindurchzutreten, wenn die Oberfläche scharf ist. Der Autofokussierungslichtstrahl
wird kleiner, wenn die Brennweite größer gemacht wird. Das Autofokussierungssystem
ist jedoch kompakt und robust mit kleineren Brennweiten. Die Auswahl
der Brennweite der Detektionssystemlinse ist deshalb ein Kompromiß dieser Überlegungen.
Bei einer typischen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung weist die Detektionssystemlinse 46 eine
Brennweite zwischen 50 mm und 200 mm auf. Die Brennweite kann jedoch entsprechend
den Abmessungen und anderen Charakteristiken größer oder kleiner sein als dieser
Bereich. Bei der in 3A gezeigten Ausführungsform ist
der Lichtdetektor 62 bezüglich der Detektionssystemlinse 46 entlang
der zweiten optischen Achse 64 auf der gegenüberliegenden
Seite der Iris 60 positioniert.
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Während des
Autofokussierens tritt der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch
die Iris 60 hindurch und wird mit maximaler Intensität zu dem
Detektor übertragen,
wenn die Probenebene 16 in der Entfernung f1 von der Objektivlinse
positioniert ist. Bei dieser Position wird ein Bild in der Brennweite
f3 von der Detektionssystemlinse 46 erzeugt. Das Bild wird
somit direkt auf die Iris 60 erzeugt, wie in den durchgezogenen
Linien von 3B gezeigt. Die Intensität des vom
Lichtdetektor 62 gemessenen Lichts ist somit auf ihrem
Spitzenwert, weil der Autofokussierungslichtstrahl 40 im
wesentlichen durch die Apertur der Iris 60 hindurchtritt.
Bei dieser Position wird bestimmt, daß die Probenebene durch das
optische System 10 ordnungsgemäß fokussiert wird.
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Wenn
die Probenebene 16 von der in 3A gezeigten
Position wegbewegt wird, verläuft der
Autofokussierungslichtstrahl 40 von der (in 3B gestrichelt
gezeigten) Detektionssystemlinse 46 nicht direkt ohne störende Effekte
durch die Iris. Der Strahl schneidet an einem Punkt „X", der in einer Entfernung
d3 von der Iris positioniert ist. Für eine gegebene Verschiebung
d1 der Probenebene 16 von der gewünschten Referenzebene (beispielsweise
der Referenzebene 23 in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14,
wie in 1–2 gezeigt)
gibt es somit eine entsprechende Verschiebung d3 der Detektionsbildebene 66 aus
der Ebene der Iris 60, wie am besten in 3B gezeigt.
Wenn sich die Detektionsbildebene 66 in einer Entfernung
von der Iris befindet, ist die Intensität des vom Lichtdetektor gemessenen Lichts
geringer, weil nicht der ganze Autofokussierungslichtstrahl durch
die Irisapertur hindurchtritt.
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3C zeigt
zwei graphische Darstellungen, die das zum Berechnen von d3 durch
den Lichtdetektor 60 verwendete Verfahren darstellen. Die
obere graphische Darstellung (mit i bezeichnet) veranschaulicht
die vom Detektor gemessene Intensität des Lichts (I) über der
Funktion der Verschiebungsentfernung d3. Die untere graphische Darstellung (mit
ii bezeichnet) veranschaulicht die Ableitung der vom Detektor gemessenen
Intensität
des Lichts (I) über
der Verschiebungsentfernung d3. Wie durch die graphischen Darstellungen
in 3C gezeigt wird das von dem Lichtdetektor gemessene
Licht sein Maximum aufweisen, wenn die Entfernung d3 Null ist. Durch
die Messungen des Lichtdetektors 62 wird die Verschiebungsentfernung
d2 auf der Basis der Intensität
des durch die Iris hindurchtretenden Lichtstrahls bestimmt.
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In
der Ausführungsform
der 3A und 3B kann
es möglicherweise
schwierig sein, zwischen einem negativen und positiven d3 zu unterscheiden
(d.h. einem entweder über
oder unter der Iris in 3A–3C fokussierten
Strahl), weshalb bevorzugt wird, daß das System moduliert wird,
um dieses potentielle Problem zu lösen. Folglich moduliert das
Autofokussierungsdetektionssystem des in 3A–3C gezeigten
Beispiels bevorzugt die Entfernung d1 mit einer kleinen Amplitude.
Die Modulation führt
zu einer Änderung
in der Intensität
des Lichts, die proportional ist zu der Ableitung der Intensität (I). Der
Abstand zwischen der Probenebene 16 und der Objektivlinse 14 wird
bevorzugt so justiert, daß die Änderung
der Intensität
Null ist, wie in der unteren graphischen Darstellung von 3C gezeigt. Der
Wert für
d3 wird dann an einen Rückkopplungscontroller
zurückgeschickt,
wie unten beschrieben wird.
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Ein
wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß das Autofokussierungsdetektionssystem
die Autofokussierung auf der Basis des berechneten Werts für die Verschiebung
d2 der Bildebene 20 von der gewünschten Bildebene 26 durchführt (siehe 1–2).
Das Autofokussierungsdetektionssystem mißt den Wert für d3 direkt.
Das optische System 10 und das Autofokussierungssystem 50 können so
konfiguriert sein, daß eine
Messung für
d3 direkt in einen Wert für
d2 konvertiert werden kann. Das heißt, der Wert für d2 kann
so gesetzt werden, daß er
in direkter Beziehung zu d3 steht. Beispielsweise können die
Linsen des Abbildungssystems und des Autofokussierungssystems so
positioniert sein, daß d2
gleich d3 ist. Alternativ können die
Linsen so positioniert sein, daß der
Wert von d2 proportional zum Wert von d3 ist. Bei einer weiteren möglichen
Konfiguration sind die Linsen so positioniert, daß der Wert
für d2
durch eine empirische Berechnung auf der Basis von d3 direkt berechnet
werden kann. Bei einer weiteren möglichen Konfiguration kann
der Wert für
d2 auf der Basis einer Menge von Datenpunkten oder einer Karte bestimmt
werden. Bei jeder dieser Optionen ist der gemessene Wert für d3 repräsentativ
für den
Wert für
d2. Deshalb kann das Autofokussierungssystem 50 den Grad,
um den die Bildebene 20 außer Fokus ist, detektieren, ohne
daß die
tatsächlichen
Charakteristiken des auf der Bildoberfläche ausgebildeten Bilds analysiert werden
müssen.
Dies verbessert die Geschwindigkeit und Effizienz der Autofokussierungsoperation der
vorliegenden Erfindung. Das Verfahren und die Struktur zum Fokussieren
der Objektivlinse auf die Probenebene infolge der obigen Messung
wird unten ausführlicher
beschrieben.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält die
Vorrichtung ein Fokussierungskorrektursystem 34. Wie hierin
verkörpert
und in 3A gezeigt enthält das Fokussierungskorrektursystem 34 einen Rückkopplungscontroller 70 und
eine Fokusjustiereinrichtung 72. Der Rückkopplungscontroller 70 kann,
wie in der Technik bekannt ist, ein analoger oder digitaler Rückkopplungscontroller
sein. Der Rückkopplungscontroller 70 empfängt ein
Signal von dem Lichtdetektor 62 entsprechend der Verschiebungsentfernung
d3 und erzeugt eine Rückkopplungsspannung,
die dann an eine Fokusjustiereinrichtung 72 gesendet wird.
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Die
Fokusjustiereinrichtung 72 kann eine von mehreren verschiedenen
Arten sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform justiert die Fokusjustiereinrichtung 72 die
Position der Objektivlinse 14 relativ zur Probenebene 16.
Bei einer weiteren Ausführungsform
justiert die Fokusjustiereinrichtung 72 die Position der
Probenebene 16 relativ zur Objektivlinse 14. Jede
Art von Einrichtung (die Position der Objektivlinse justierend oder
die Position der Probenebene justierend) ist so ausgelegt, daß das optische
System so positioniert wird, daß die
Probenebene schnell scharf gestellt werden kann und von der Probenebene
ein scharfes Bild angefertigt werden kann. Eine typische Einrichtung,
um diese Art kleiner Verschiebungen zu vermitteln, ist ein Piezopositionierer.
Bei dem in 3A gezeigten Beispiel modifiziert
die Fokusjustiereinrichtung 72 die Position der Objektivlinse 14 derart,
daß sie
sich in der gewünschten
Brennweite f1 von der Probenebene 16 befindet. Infolgedessen
wird die Bildebene 20 des optischen Systems so in Fokus
versetzt, daß sich
die Werte für
d2 und d3 Null annähern.
Wenn das Autofokussierungsdetektionssystem 50 für d3 einen
Wert berechnet, der über einem
vorbestimmten Schwellwert liegt, kann das Fokussierungskorrektursystem 34 wieder
betätigt werden,
bis die Probenebene in Fokus versetzt ist. Diese Operation wird
in einer kürzeren
Zeitdauer durchgeführt,
da das vorliegende System nicht die Charakteristiken des Bilds analysiert,
wie dies in anderen Systemen passiert.
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Eine
weitere Ausführungsform
einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
ist in den 4A, 4B und 4C gezeigt.
Die in 4A und 4B gezeigte Struktur
ist ähnlich
dem Beispiel von 3A und 3B mit
Ausnahme der Positionierung der Iris. Die folgende Erörterung
konzentriert sich auf die Struktur und das Verfahren, das anders
ist als bereits bezüglich
der 3A und 3B beschrieben.
Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 78 des in den 4A–4C gezeigten
Beispiels enthält
eine Iris 80 und einen Lichtdetektor 84. Bei der
Autofokussierungsdetektionseinrichtung 78 der 4A–4C wird
die Iris 80 in einer Entfernung, die nicht der Brennweite
f3 entspricht, von der Detektionssystemlinse 46 plaziert.
Das heißt,
die Iris ist von der Referenzebene 82 (in 4A gestrichelt
gezeigt) beabstandet, die sich in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 befindet.
Wie in 4B ersichtlich, ist die Autofokussierungseinrichtung
so ausgelegt, daß die
Iris 80 parallel zu der Referenzebene 82 und durch
einen Abstand d3 getrennt plaziert wird.
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Wie
in 4B gezeigt ist die Iris 80 in einer Entfernung
von f2 minus der Entfernung d3 von der Detektionssystemlinse 46 positioniert.
Im allgemeinen wird bei dem System der 4A–4C,
wenn der Lichtdetektor 84 eine gewisse vorbestimmte Intensität mißt, die
Oberfläche
der Probe scharf sein. Falls es jedoch Fluktuationen beim Reflexionsvermögen der
Oberfläche
gibt, oder falls die Leistung der Lichtquellen fluktuiert, kann
die von dem Lichtdetektor gemessene Intensität auch fluktuieren, obwohl
die Probenebene immer noch scharf ist. Die Genauigkeit des Autofokusdetektionssystems
kann somit durch die Stabilität
der Lichtquellen und die Gleichförmigkeit
des Reflexionsvermögens
der Probenebene begrenzt sein. Selbst wenn es Fluktuationen bei
der Stabilität
der Lichtquellen oder beim Oberflächenreflexionsvermögen gibt,
wird das Verhältnis
zwischen der vom Detektor gemessenen Lichtleistung und der Lichtquellenleistung
von diesen Fluktuationen nicht beeinflußt.
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Um
bleibige potentielle Probleme zu minimieren, die auf diese Fluktuationen
zurückgehen, kann
das Autofokussierungssystem des zweiten Beispiels weiterhin einen
dritten Autofokussierungsstrahlteiler 90 und einen zweiten
Lichtdetektor 92 enthalten, wie in 4B gezeigt.
Wie in 4D gezeigt ist der dritte Autofokussierungsstrahlteiler 90 zwischen
der Detektionssystemlinse 46 und der Iris 80 entlang
der zweiten optischen Achse 64 positioniert. Der zweite
Lichtdetektor 92 ist versetzt von der zweiten optischen
Achse 64 positioniert, wie beispielsweise in 4B gezeigt.
Der zweite Lichtdetektor 92 könnte auch an anderen Orten
angeordnet sein.
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Der
dritte Autofokussierungsstrahlteiler 90 ist so konfiguriert,
daß er
einen gewissen Prozentsatz der Autofokussierungslichtstrahlintensität zum zweiten
Lichtdetektor 92 abtrennt, beispielsweise 50%. Die Intensität (I2) des
zu dem zweiten Lichtdetektor 92 abgetrennten Lichts ist
proportional zu der von der Ebene 16 reflektierten Gesamtintensität. Die übrigen 50%
des Lichts gehen zur Iris 80. Ein Bruchteil dieser übrigen 50%,
der zu der Iris 80 geht, wird vom ersten Lichtdetektor 84 detektiert.
Das Verhältnis
der vom ersten Lichtdetektor 84 detektierten Lichtintensität (I1) zu
der vom zweiten Lichtdetektor 92 detektierten Lichtintensität (I2) wird
dann direkt zum Berechnen des Werts d3 verwendet. Über diese
Anordnung werden Fluktuationen bei der Intensität der Lichtstrahlen und dem
Reflexionsvermögen
der Probenebene berücksichtigt.
Alternativ könnte
die Iris durch ein Diodenarray ersetzt werden, das dort positioniert
ist, wo in 4A und 4B die
Iris gezeigt ist. Das Autofokussierungsdetektionssystem 32 enthält ein Fokussierungskorrektursystem 34 ähnlich den
für die 3A–3C beschriebenen.
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Eine
weitere Ausführungsform
einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
ist in den 5–7 gezeigt.
Die folgende Erörterung
konzentriert sich auf die Struktur und das Verfahren, das anders
ist als bereits bezüglich 3A und 3B beschrieben.
Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98 der 5–7 enthält
ein Prisma oder eine Linse, um den zurückkehrenden Autofokussierungslichtstrahl
der Wellenlänge λa zu Punkten
auf einer Oberfläche
abzulenken, die sich in eine Entfernung f3 von der Detektionssystemlinse
befinden. Wie in den 5–7 gezeigt
ist zwischen der Detektionssystemlinse 46 und einer Detektionsoberfläche 102 ein
Prisma 100 vorgesehen. Das Prisma 100 lenkt den
zurückkehrenden
Autofokussierungslichtstrahl auf die Detektionsoberfläche 102 ab,
die sich in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 befindet.
Die in 5 gezeigte Brennweite f3 entspricht der Brennweite
der Kombination aus der Detektionssystemlinse 46 und dem Prisma 100.
Die Auswahl der Brennweite f3 wird unten erörtert.
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Das
Autofokussierungsdetektionssystem 98 enthält weiterhin
Diodenpaare. Diodenpaare wie etwa 104 und 106 können auf
beiden Seiten der optischen Achse 64 auf der Detektionsoberfläche 102 positioniert
sein, wie in 5 gezeigt. Bei dem in den 5–7 gezeigten Beispiel enthält das erste
Diodenpaar 104 eine erste Diode 108 und eine zweite
Diode 110, und das zweite Diodenpaar 106 enthält eine
dritte Diode 112 und eine vierte Diode 114. In
den 5–7 sind das die erste und zweite Diode 108 und 110 enthaltende
Diodenpaar 104 auf der linken Seite der zweiten optischen
Achse 64 positioniert, wie in 5 gezeigt,
und das die dritte und vierte Diode 112 und 114 enthaltende
zweite Diodenpaar 106 sind auf einer rechten Seite der
zweiten optischen Achse 64 positioniert.
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Die 5, 6A und 7A veranschaulichen
Aspekte der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98,
wenn die Probenebene 16 in der Brennweite f1 von der Objektivlinse
liegt, so daß das
resultierende Bild der Bildebene 20 scharf ist. Wenn die Probenebene 16 für das Fokussieren
ordnungsgemäß liegt,
wird der in Richtung auf die Detektionssystemlinse 46 gerichtete
Autofokussierungslichtstrahl in der Regel kollimiert, wie in 6A gezeigt.
Die Detektionssystemlinse 46 projiziert dann den Autofokussierungslichtstrahl
zum Prisma 100 wie etwa dem in 5 und 6A gezeigten.
Bei dem gezeigten Beispiel wird der Autofokussierungslichtstrahl
von dem Prisma 100 in einen ersten Lichtstrahl 118 und einen
zweiten Lichtstrahl 120 aufgeteilt.
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Wenn
die Ebene 16 zum Fokussieren ordnungsgemäß positioniert
ist, wird der erste Lichtstrahl 118 genau auf die in der
Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 liegende
Detektionsoberfläche 102 fokussieren, wie
in 5 und 6A gezeigt. Der erste Lichtstrahl 118 wird
einen ersten Lichtfleck 122 in der Mitte zwischen der ersten
Diode 108 und der zweiten Diode 110 erzeugen,
wie am besten in der Vorderansicht der Dioden in 7A gezeigt.
Der zweite Lichtstrahl 120 erzeugt einen zweiten Lichtstrahl 124 in
der Mitte zwischen der dritten Diode 112 und der vierten
Diode 114, wie am besten in 7A gezeigt.
Die Lichtflecken auf den Dioden werden relativ klein sein, da jeder
Lichtstrahl an der Detektionsoberfläche 102 ein Minimum
ist. Die Probenebene wird ordnungsgemäß fokussiert sein, wenn die
Lichtflecken wie in 7A gezeigt erzeugt werden.
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6B und 7B veranschaulichen
Aspekte des Detektionssystems, wenn die Probenebene 16 weiter
weg als die Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 liegt.
Wenn die Probenebene 16 zu weit weg von der Objektivlinse
liegt, wird der zurückkehrende
Autofokussierungslichtstrahl in der Regel nicht-kollimiert sein
(wie in 6B gezeigt). Die Detektionssystemlinse 46 projiziert
dann den Autofokussierungslichtstrahl zu dem Prisma, wo der Strahl in
den ersten und zweiten Lichtstrahl 118 beziehungsweise 120 aufgeteilt
wird. Bei der in 6B gezeigten Ausführungsform
weist der ersten Lichtstrahl 118 einen kleinsten Durchmesser
auf und bildet eine (gestrichelt gezeigte) Bildebene 130 an
einem Punkt y1, der in einer Entfernung d3 von der Detektionsoberfläche 102 liegt
(auch als die gewünschte
Bildebene bezeichnet). Weil der erste Lichtstrahl 118 an
der Detektionsoberfläche 102 keinen
kleinsten Durchmesser aufweist, ist der auf den Dioden ausgebildete Lichtfleck 122 relativ
größer als
der in 7A gezeigte Lichtfleck. Wie
in 6B und 7B gezeigt weist
der zweite Lichtstrahl 120 einen kleinsten Durchmesser
bei der Bildebene 130 an einem Punkt y2 auf, der in der
Entfernung d3 von der Detektionsoberfläche 102 liegt. Wie
in 7B gezeigt bewegen sich die Lichtflecke 122 und 124 relativ
zu den Lichtflecken von 7A nach
innen.
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Wenn
die Probenebene wie oben beschrieben zu weit weg von der Objektivlinse
liegt, werden die Lichtflecken 122 und 124 in
erster Linie auf der zweiten Diode 110 beziehungsweise
der dritten Diode 112 ausgebildet, wie am besten in 7B gezeigt.
Das Autofokussierungsdetektionssystem mißt den Intensitätswert an
jeder der Dioden und bestimmt den Verschiebungswert d3 des Autofokussierungslichtstrahls
von der Referenzoberfläche 102.
Der Rückkopplungscontroller 70 sendet
dann ein Rückkopplungsspannungssignal
an das Fokuskorrektursystem 72, um den Abstand zwischen
der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16 zu
justieren, wie oben erörtert.
Die Ebene 16 wird ordnungsgemäß fokussiert sein, wenn die
Summe der an der ersten und vierten Diode gemessenen Intensität gleich
der Summe der an der zweiten und dritten Diode gemessenen Intensität ist.
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Die 6C und 7C veranschaulichen Aspekte
der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98, wenn die
Ebene 16 in einer geringeren Entfernung als die Brennweite
f1 von der Objektivlinse 14 liegt. Wenn die Oberfläche zu nahe
an der Objektivlinse liegt, wird der zurückkehrende Autofokussierungslichtstrahl
ebenfalls in der Regel nicht-kollimiert sein (wie in 6C gezeigt).
Bei der in 6C gezeigten Ausführungsform
weist der erste Lichtstrahl 118 einen kleinsten Durchmesser
auf und bildet eine Bildebene 132 an einem Punkt z1, der
in einem Abstand d3 hinter der Detektionsoberfläche 102 liegt (gewünschte Bildebene).
Der auf den Dioden ausgebildete Lichtfleck 122 ist relativ
größer als
der in 7A gezeigte Lichtfleck, da der
Lichtstrahl 118 noch nicht einen kleinsten Durchmesser
aufweist, wenn er auf die Detektionsoberfläche 102 auftrifft. Der
zweite Lichtstrahl 120 schneidet und bildet eine Bildebene
an einem Punkt z2, die ebenfalls in dem Abstand d3 hinter der Detektionsoberfläche 102 liegt, wie
in 7C gezeigt. Wie in 7C gezeigt
bewegen sich die Lichtflecken 122 und 124 von
der zweiten optischen Achse 64 relativ zu den Lichtflecken von 7A nach
außen.
Die Lichtflecken 122 und 124 werden in erster
Linie auf der ersten Diode 108 beziehungsweise der zweiten
Diode 114 ausgebildet, wie am besten in 7C gezeigt.
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Bei
der oben erörterten
Anordnung sollte die Brennweite der Detektionssystemlinse 46 und
des Prismas 100 so ausgewählt sein, daß die Lichtflecken 122 und 124 von
den Dioden detektiert werden können.
Die Lichtflecken sollten eine geeignete Größe aufweisen, so daß die Diodenpaare
präzise
Ablesungen der Lichtintensität
vornehmen können.
Bei einer typischen Diodenanordnung lassen sich die Lichtflecken
detektieren, wenn sie eine Größe von etwa
10 μm aufweisen.
Diodenarrays mit einer Pixelgröße von etwa
5 μm sind
bekannt. Bei Anwendungen mit fragmentierten Diodenanordnungen wie
etwa in 5–7 (und 8) gezeigt, können Strahlverschiebungen in
der Größenordnung
von 0,1 μm
gemessen werden. Dies entspricht einer Genauigkeit der Brennweite
f1 und einem Positionieren der Probenebene mit weniger als 1,0 μm bei einem
Beispiel des Autofokussierungssystems.
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Das
Fokussierungskorrektursystem 34 der 5–7 arbeitet wie bereits beschrieben, um
das optische System schnell auf die Probenebene 16 zu fokussieren
und ein scharfes Bild zu erhalten.
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Eine
weitere Ausführungsform
einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
ist in den 8A–8D gezeigt. Bei
diesem Beispiel enthält
das Autofokussierungsdetektionssystem 108 eine Detektionssystemlinse, die
der bereits beschriebenen ähnlich
ist, sowie eine Zylinderlinse und eine Vierer-Fotodiode. Wie hierin verkörpert und
in 8A–8D gezeigt
wird eine Zylinderlinse 140 zwischen der Detektionslinse 46 und
einer Detektionsoberfläche 142 mit
einer Vierer-Fotodiode 144 plaziert. Die Detektionsoberfläche 142 liegt
bevorzugt genau in der Brennweite f3 der Detektionssystemlinse 46.
Wie in 8B dargestellt enthält die Vierer-Fotodiode 144 ein
erstes, zweites, drittes und viertes Diodensegment 146, 148, 150 beziehungsweise 152.
Die Detektionssystemlinse 46 und die Zylinderlinse 140 projizieren
den Autofokussierungslichtstrahl auf die Detektionsoberfläche 142, um
auf der auf der Detektionsoberfläche 142 liegenden
Viererdiode 144 einen Lichtfleck 154 auszubilden.
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Die
Viererdiode 144 bestimmt die Verschiebung d3 des Bildes
relativ zur Detektionsoberfläche 142 durch
Messen der Lichtintensität
an jedem der vier Diodensegmente 146, 148, 150 und 152.
Die Zylinderlinse 140 ändert
die Gestalt eines Lichtflecks 154 in Abhängigkeit
von der Position der Probenebene relativ zur Objektivlinse. 8B veranschaulicht die
Position des Lichtflecks 154, wenn die Probenebene 16 ordnungsgemäß in der
Entfernung f1 von der Objektivlinse 14 positioniert ist.
Der Lichtfleck wird im wesentlichen in der Mitte der vier Dioden
liegen. 8C veranschaulicht die Position
des Lichtflecks, wenn die Probenebene 16 in einer Entfernung von
der Objektivlinse 14 positioniert ist, die kleiner ist als
die Brennweite f1. Der Lichtfleck wird ellipsenförmig sein, wobei der größte Teil
des Lichtflecks auf dem zweiten Diodensegment 148 und dem
dritten Diodensegment 150 liegt, wie in 8C gezeigt.
Auf der Basis der gemessenen Intensität der Diodensegmente berechnet
der Rückkopplungscontroller 70 die Entfernung
d3 des Bildes relativ zur Detektionsoberfläche 142.
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8D veranschaulicht
die Position des Lichtflecks, wenn die Probenebene in einer Entfernung
von der Objektivlinse 14 positioniert ist, die größer ist
als die Brennweite f1. Der Lichtfleck wird ellipsenförmig sein,
wobei der größte Teil
des Lichtflecks auf dem ersten Diodensegment 146 und dem
vierten Diodensegment 152 liegt.
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Bei
diesem Beispiel erzeugt der Rückkopplungscontroller 70 ein
Signal, das an die Fokusjustiereinrichtung geschickt werden soll,
um den Abstand zwischen der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16 auf
eine weise zu steuern, ähnlich
der für
die ersten drei Beispiele beschriebenen.
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Das
Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung eignet sich für einen
großen
Bereich von Anwendungen zusätzlich
zu den oben beschriebenen Beispielen. Die Auswahl und die Anordnung der
Lichtquellen hängt
von der Art von Mikroskopie ab, die gewählt wird. Obgleich das oben
beschriebene Autofokussierungssystem in erster Linie bezüglich Fluoreszenzmikroskopie
erörtert
wird, eignet sich die vorliegende Erfindung auch für andere
Arten von Mikroskopie wie etwa Durchlichtbeleuchtungs- und Lumineszenzabbildungsmikroskopie.
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Bei
der Durchlichtbeleuchtungsmikroskopie tritt die Beleuchtungsquelle
auf eine in der Technik bekannte Weise von der linken Seite der
Probenebene ein. Der Strahlteiler 12, wie in den Figuren
gezeigt, wird nicht länger
benötigt.
Bei der Beleuchtungsquelle kann es sich um eine Lampe mit einem
breiten Spektrum (d.h. sichtbaren Spektrum), eine durch einen engen
Bandpaßfilter
gefilterten Lampe oder einen Laserstrahl handeln. Bei einem Durchlichtbeleuchtungssystem
kann es wünschenswert
sein, zwischen Strahlteiler 44 und Bildlinse 18 in 3A entsprechende
Filter hinzuzufügen.
Dies hilft zu verhindern, daß irgendein
Teil des Autofokussierungslichtstrahls durch den Strahlteiler 44 austritt.
Wenn als Anregungsstrahl sichtbares Licht gewählt wird, kann der Lichtstrahl
des Autofokussierungssystems im Infrarotbereich gewählt werden.
Bei einem Beispiel mit einem schmalen Anregungsspektrum um 550 nm kann
für das Autofokussierungssystem
ein Lichtstrahl von etwa 633 nm verwendet werden. Diese Werte sind
nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben.
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Bei
der Lumineszenzabbildungsmikroskopie emittiert das Objekt Licht,
ohne daß ein
Anregungsstrahl erforderlich wäre.
Wie bereits beschrieben wird ein Strahlteiler wie etwa der Strahlteiler 12 in 3A nicht
länger
benötigt.
Die Wellenlänge
des Autofokussierungslichtstrahls wird bevorzugt so gewählt, daß sie weit
genug weg liegt von der Lumineszenzwellenlänge der Probenebene. Bei einer
derartigen Anordnung kann Umgebungslicht die Beleuchtung der Oberfläche unterstützen. Das
Objekt selbst kann bei Lumineszenzabbildungsmikroskopie als die Quelle
der Beleuchtung bezeichnet werden.
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Wie
oben erörtert
wird als Beleuchtungslichtquelle in der Regel eine Lampe oder ein
Laser verwendet. Falls eine Lampe gewählt wird, werden Filter hinzugefügt, um das
für die
Anwendung erforderliche Spektrum auszuwählen. Falls ein Laser gewählt wird, hängt die
Art des Lasers von der für
die spezifische Anwendung benötigten
Wellenlänge
und Leistung ab. Zu Lasern, die sich besonders für die vorliegende Erfindung
eignen, zählen
beispielsweise Ar+- und Kr+-Laser.
Diese Laser können
in der Regel Licht mit mehreren diskreten Wellenlängen über das
Spektrum hinweg emittieren und sind für den Einsatz bei einer großen Zahl
von Anwendungen sehr vielseitig. Auch andere Arten von Lasersystemen
wie etwa OPO-Systeme (Optical Parametric Oscillator) eignet sich
für die
vorliegende Erfindung.
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Bei
allen oben beschriebenen Autofokussierungstechniken kann die Probenebene
entweder auf der äußeren Oberfläche der
Probe oder auf einer Ebene auf der Innenseite der Probe liegen.
Bei einer für
die vorliegende Erfindung geeigneten Technik wird die Probenoberfläche als
Referenz verwendet und der auf die Probe gerichtete Lichtstrahl
wird um ein bestimmtes Ausmaß versetzt,
um auf einer Ebene in der Probe zu scannen (oder zu fokussieren). Diese
Technik eignet sich insbesondere zum Fokussieren auf die Innenseite
einer Zelle.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum automatischen
Fokussieren eines Bilds einer Objektebene in einem Mikroskop bereitgestellt.
Allgemein zählen
zu Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen: Erzeugen
eines Autofokussierungslichtstrahls; Lenken des Autofokussierungslichtstrahls
gegen die zu untersuchende Objektebene und Reflektieren des Autofokussierungslichtstrahls
von der Objektebene weg. Der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl wird
dann zu einem Detektionssystem gelenkt, wo mindestens ein Lichtdetektor
oder Sensor des Detektionssystems den reflektierten Autofokussierungslichtstrahl
erfaßt.
Danach wird das Ausmaß der
Verschiebung der Bildebene des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls
von einer gewünschten
Referenzebene auf der Basis des erfaßten Autofokussierungslichtstrahls
bestimmt. Mit diesen Informationen kann auf die Objektebene fokussiert
werden, um ein ordnungsgemäß fokussiertes
Bild zu erzeugen.
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Bei
Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen, kann der Schritt
des Erfassens das Übertragen
des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls zumindest teilweise
durch eine Apertur einer Iris und das Messen der Lichtintensität des reflektierten
Autofokussierungslichtstrahls, der durch die Apertur übertragen
wird, mit dem Lichtdetektor oder Sensor des Detektionssystems beinhalten.
Alternativ kann bei Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen,
der Schritt des Bestimmens das Vergleichen der Lichtintensitäten des
von mehreren der Lichtdetektoren oder Sensoren detektierten reflektierten
Autofokussierungslichtstrahls beinhalten.
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Anhand
eines nicht-einschränkenden
Beispiels veranschaulicht 9 ein Verfahren,
das mit den Aspekten der Erfindung übereinstimmt, zum automatischen
Fokussieren eines Bilds einer Objektebene in einem Mikroskop. Die
Ausführungsform
von 9 kann mit den Autofokussierungssystemen und -merkmalen
implementiert werden, die in Verbindung mit 3–4 erörtert
sind. Wie in 9 dargestellt wird ein Autofokussierungslichtstrahl
bei Schritt 300 erzeugt. Beispielsweise kann der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch
eine Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 erzeugt werden,
wie in 3–4 gezeigt.
Als nächstes
wird bei Schritt 310 der Autofokussierungslichtstrahl zu
einer Objektebene wie etwa der Objektebene 16 in den 3–4 gelenkt. Danach wird in Schritt 320 der
Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektebene wegreflektiert
und zu einem Ablenksystem wie etwa dem Ablenksystem 32 in 3A gelenkt.
Der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl wird dann in Schritt 330 durch
eine Iris des Detektionssystems übertragen.
Beispielsweise wird in 3A der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch die
Iris 60 übertragen.
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Wie
weiter in 9 gezeigt wird der Autofokussierungslichtstrahl
nach seinem Übertragen durch
die Iris des Detektionssystems bei Schritt 340 mit einem
Lichtdetektor oder Sensor des Detektionssystems erfaßt. Um diesen
Schritt zu implementieren, kann ein Lichtdetektor ausgewählt werden,
wie etwa ein beliebiger der Vielzahl von in den 3–4 gezeigten Arten. Außerdem kann zum Implementieren
von Schritt 330 eine Iris wie die in 3–4 gezeigte vorgesehen sein. Beispielsweise
wird bei der Ausführungsform
von 3A der Lichtdetektor 62 neben der Apertur
der Iris 60 positioniert, und die Iris wird ungefähr in der
Brennweite von der Detektionssystemlinse positioniert. Alternativ
kann, wie in 4A gezeigt, die Iris 80 so
positioniert werden, daß sie
von der Brennweite von der Detektionssystemlinse 46 verschoben
ist und ein Lichtdetektor 84 neben der Apertur der Iris
positioniert ist.
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Nach
dem Erfassen der Lichtintensität
des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls wird das Ausmaß der Verschiebung
einer Bildebene von einer gewünschten
Referenzebene bestimmt, wie in Schritt 350 von 9 dargestellt.
Wieder kann mit den Merkmalen und Techniken, die oben bezüglich der 3–4 beschrieben sind, das Ausmaß der Verschiebung
der Bildebene auf der Basis der erfaßten Lichtintensität des Autofokussierungslichtstrahls
bestimmt werden. In Schritt 360 wird dann mit der bestimmten
Verschiebung der Bildebene auf die Objektebene fokussiert, um ein
ordnungsgemäß fokussiertes
Bild zu erzeugen. Dazu können
der Rückkopplungscontroller 70 und
die Fokusjustiereinrichtung 72 der 3–4 verwendet werden, um den Abstand zwischen
der Objektivlinse und der Proben- oder Objektebene zu justieren.
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10 veranschaulicht
ein weiteres Verfahren zum automatischen Fokussieren eines Bilds
einer Objektebene in einem Mikroskop. Das Verfahren von 10 kann
mit den oben bezüglich
der 5–8 erörterten
Autofokussierungssystemen und -merkmalen implementiert werden. Bei
dem in 10 dargestellten Verfahren wird
ein Autofokussierungslichtstrahl bei Schritt 400 erzeugt.
Beispielsweise wird der Autofokussierungslichtstrahl 40 von
einer Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 erzeugt, wie
in 5–8 gezeigt. In Schritt 410 wird
der Autofokussierungslichtstrahl dann zu einer Objektebene wie etwa
der Objektebene 16 gelenkt. Danach wird in Schritt 420 der
Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektebene weg
reflektiert und auf ein Ablenksystem gerichtet. Wie bei Schritt 430 in 10 gezeigt
wird dann bewirkt, daß der
reflektierte Autofokussierungslichtstrahl von mehreren Lichtdetektoren
oder Sensoren erfaßt
wird. Zum Implementieren der Schritte 420 und 430 kann
eine Anordnung von Sensoren vorgesehen werden, wie in einer beliebigen
der Ausführungsformen
der 5–8 gezeigt. Beispielsweise kann in den 5–7 der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl
von einem Prisma 100 in zwei getrennte Lichtstrahlen 118 und 120 aufgeteilt
werden, wobei die Lichtstrahlen von Paaren von Lichtdioden 104 und 106 detektiert
werden. Alternativ kann, wie in 8A–8C gezeigt,
der Autofokussierungslichtstrahl durch eine Zylinderlinse 140 übertragen
und von einer Vierer-Fotodiode 144 erfaßt werden.
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Wie
weiter in 10 gezeigt werden nach dem Erfassen
des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls mit den Sensoren
die von den mehreren Sensoren erfaßten Lichtintensitätswerte
bei Schritt 440 verglichen. Beispielsweise werden in 5–7 die Werte der von jeder der vier Dioden 108, 110, 112 und 114 erfaßten Lichtintensität verglichen.
Alternativ werden, wie in 8A–8C gezeigt,
die Werte der von jeder der vier Diodensegmente 146, 148, 150 und 152 erfaßten Lichtintensität verglichen.
Nachdem die Lichtintensitätswerte
verglichen sind, wird bei Schritt 450 das Ausmaß der Verschiebung
einer Bildebene von einer gewünschten
Referenzebene bestimmt. Zum Implementieren dieses Schritts können die
oben bezüglich
der 5–8 beschriebenen Merkmale und Techniken
verwendet werden, um das Ausmaß der
Verschiebung der Bildebene auf der Basis der verglichenen Werte
der Sensoren zu bestimmen. Bei Schritt 460 wird mit der
bestimmten Verschiebung der Bildebene dann auf die Objektebene fokussiert,
um ein ordnungsgemäß fokussiertes
Bild zu erzeugen. Zu diesem Zweck können der Rückkopplungscontroller 70 und
die Fokusjustiereinrichtung 72 der 5–8 dazu verwendet werden, den Abstand zwischen
der Objektivlinse und der Objektebene zu justieren.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
ergibt sich aus der oben beschriebenen Vorrichtung. An den Verfahren
der vorliegenden Erfindung können auch
andere Variationen vorgenommen werden.
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Dieses
Autofokusverfahren betrifft insbesondere Autofokusverfahren und
-vorrichtungen, die sich zum Detektieren, Charakterisieren und Quantifizieren
von in einem Fluid suspendierter teilchenförmiger Materie eignen. Insbesondere
stellt die Erfindung ein Autofokussystem bereit zum Detektieren
von Teilchen, insbesondere Zellen, die in einem Fluid, insbesondere
einem biologischen Fluid, suspendiert sind. Genauer gesagt stellt
die Erfindung eine Autofokusplattform zum Abbilden eines Assays
auf der Basis der Affinitätsbindung
bereit.
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Die
Entdeckung neuer Arzneimittel wird begrenzt durch den Durchsatz
der Assays, die verwendet werden, um Verbindungen zu screenen, die
möglicherweise
gewünschte
Effekte besitzen könnten. Insbesondere
erfordert das Screening der größten Anzahl
verschiedener Verbindungen, die mit jedem Screen assoziierten Zeit- und Arbeitsanforderungen zu
reduzieren. In vielen Fällen
sind Reaktionsvolumina sehr klein, um die kleinen Mengen der Testverbindungen
zu berücksichtigen,
die zur Verfügung
stehen. Das Mikroskopscreening derartiger kleiner Probenvolumina
führt zu
mit unscharfen Bildern assoziierten fehlerhaften Ergebnissen. Da
diese Bilder im allgemeinen die einzigen Meßergebnisse sind, wird daran
eine weitere Untersuchung wie etwa Computerberechnungen vorgenommen.
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Bei
High-Throughput-Screening-Tests, ist die Geschwindigkeit, um einen
Autofokus zu erhalten und beizubehalten, ein wichtiger Faktor. Bei
vielen Ausführungsformen
sind die Proben in standardmäßigen Mikrotiterplatten
mit mehreren Vertiefungen enthalten, wobei jede Platte ein Array
von Vertiefungen enthält, wie
etwa solchen mit 96, 384, 1536 oder höheren Anzahlen an Vertiefungen.
Zur Kompatibilität
mit gegenwärtigen
automatisierten Lade- und Roboterhandlingsystemen werden standardmäßige 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten
verwendet, die 86 mm mal 129 mm groß sind bei Vertiefungen mit
einem Durchmesser von 6 mm und einer Teilung von 9 mm. Andere bekannte
Mikroplatten sind in der Regel 20 mm mal 30 mm groß mit Zellenorten,
die eine Abmessung von etwa 100 bis 200 Mikrometer und eine Teilung
von etwa 500 Mikrometer aufweisen. Beide Ausdrücke „Vertiefung" und „Mikrovertiefung" beziehen sich üblicherweise
auf einen spezifischen Ort in einem Array beliebiger Konstruktion,
an dem Zellen haften und innerhalb dessen die Zellen abgebildet werden.
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Auf
Wunsch des Benutzers können
Softwareprozeduren bereitgestellt werden, um Bewegungen in einer
Z-Achse durch eine Reihe unterschiedlicher Positionen zu erhalten,
erfaßt
ein Bild an jeder Position und findet das Maximum eines berechneten Fokus,
das den Kontrast jedes Bilds schätzt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein verbessertes Mikroskop,
das eine Autofokussierungvorrichtung zum Betrachten einer Probenebene
umfaßt.
Die Autofokussierungsvorrichtung, wie in Kombination mit 1–10 erläutert, kann
innerhalb oder außerhalb
des Mikroskopgehäuses
enthalten sein. Gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält
das Mikroskop mehrere entlang einer optischen Hauptachse positionierte
Linsen, einen Sondenarm, der die mehreren Linsen trägt, einen
Träger,
auf dem eine zu untersuchende Probenebene plaziert wird, und eine optische
Ausgabeeinrichtung zum Erzeugen eines Bilds der Probenebene auf
einer Bildebene. Bei der gezeigten Ausführungsform ist die optische
Hauptachse entfaltet und verläuft
im wesentlichen entlang einer einzelnen Ebene. Wie hierin verkörpert und
in den 11–12 gezeigt
enthält
das Mikroskop 200 einen Sondenarm 213. Eine Reihe
von Linsen und andere optische Einrichtungen sind entlang der optischen
Hauptachse 202 positioniert. Bei dem in 11 gezeigten
Beispiel enthält
die Reihe von Linsen ein Emissionsfilter 204, eine Tubuslinse 206,
einen Beleuchtungseintritt 208, eine Übertragungslinse 210 und
eine mit Corpuslinse 212. Entlang der optischen Hauptachse
im Sondenarm 213 kann eine beliebige Vielfalt optischer
Einrichtungen positioniert sein.
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Bei
dem in 11 gezeigten Beispiel ist ein einfacher
reflektierender Spiegel 214 in Richtung des Endes des Sondenarms
am nächsten
bei dem zu scannenden Objekt positioniert. Die Oberfläche des Spiegels 214 ist
relativ zu der optischen Hauptachse 202 so abgewinkelt,
daß die
Lichtstrahlen entlang der optischen Hauptachse 202 zu einer
Objektivlinse 220 und auf die Objektebene 216 reflektiert
werden können.
Bei dem in 11 gezeigten Beispiel ist der Spiegel 214 beispielsweise
unter 45 Grad abgewinkelt, so daß das Licht von der Objektebene
zurück zum
Spiegel und entlang der optischen Hauptachse 202 reflektiert
wird, um ein Bild auszubilden. Die Probe oder das Objekt, die oder
das untersucht werden soll, kann direkt auf einer scannenden Oberfläche 221 entsprechend
der Objektebene 216 plaziert sein. Die Objektoberfläche kann
der Oberfläche
des tatsächlichen
Objekts oder einer Ebene innerhalb des Objekts entsprechen. Da diese
Objekte oder Proben eine erhebliche Tiefe aufweisen können, kann
die Geschwindigkeit des Autofokus durch ein Volumenbild weiter erhöht werden.
Ein derartiges Volumenbild kann man erhalten, indem man ein Bildobjekt
bei jeder Bildebene von mehreren Bildebenen betrachtet, wobei jede
Bildebene vertikal bezüglich
jeder anderen Bildebene verschoben ist. Alternativ kann die Objektoberfläche der
scannenden Oberfläche 221 entsprechen,
auf der die Probe plaziert wird. Die Proben (oder Objekte) können in
Probenhalteeinrichtungen wie etwa einer oder mehreren, in 11 und 12 gezeigten Mikrotiterplatten 218 plaziert
sein. Die Mikrotiterplatten 218 und die Proben werden von
einem Träger 219 getragen
wie in 12 gezeigt. Der Träger 219 ist
an einem Scantisch 240 montiert und starr befestigt, der
an einem ersten Tisch 242 angebracht ist. Der Träger 219 hält die Proben
so, daß sie
physisch von dem Mikroskop isoliert sind, und zwar aus Gründen, die
unten erörtert
werden. Die scannende Oberfläche 221 kann
einen Tisch umfassen, der in einer X-, X-Y- oder X-Y-Z-Bewegung
bewegt werden kann.
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Das
Mikroskop der in 11 gezeigten Ausführungsform
enthält
weiterhin einen zweiten einfachen reflektierenden Spiegel 222 am
ganz links gelegenen Abschnitt der optischen Hauptachse 202 des Sondenarms 213.
Das von dem zweiten einfachen reflektierenden Spiegel weg reflektierte
Licht wird zu einem ersten Videoausgang 230 und einer ersten
Videobrennebene 232 gelenkt. Das Mikroskop enthält auch
einen zweiten Videoausgang 234 und eine Okularbaugruppe 236 mit
einer Bildebene 238. Wie in der Technik bekannt ist, kann
die Bildebene entweder eine Position sein, wo das Auge eines Betrachters plaziert
wird, oder ein Platz, wo eine Kamera oder eine Bilddetektierungseinrichtung
positioniert ist.
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Das
Mikroskop ist bevorzugt so konfiguriert, daß der Sondenarm 213 eine
längliche
Gestalt aufweist, wie in 11–12 gezeigt.
Bewerkstelligt wird dies, indem der Sondenarm so entworfen wird, daß die optische
Hauptachse 202 entfaltet ist. Die längliche Gestalt und die entfaltete
Hauptachse besonders wünschenswert,
um das Übertragen
von Schwingungen von schwingungserzeugenden Strukturen neben dem
Sondenarm aus Gründen
auf ein Minimum zu reduzieren, die unten erörtert werden. Die zweite Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung eignet sich auch für Mikroskopeinrichtungen, die
das Bild des Objekts scannen. Während
des Scannens erzeugen Scanmotoren in der Regel unerwünschte Schwingungen.
Wenn der Scantisch mit den Scanmotoren auf oder an dem Sondenarm
des Mikroskops plaziert ist, werden Schwingungen von den Motoren
in der Regel auf das Mikroskop übertragen,
was zu Bildern niedriger Qualität
führt.
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Das
längliche
Design des Mikroskops gestattet das Montieren des Mikroskops auf
einem separaten Tisch von dem Tisch, auf den ein Scantisch montiert
ist. Beispielhaft kann, wie in 12 gezeigt,
der Scantisch 240 für
ein Mikroskop auf den ersten Tisch 242 plaziert sein, und
das Mikroskop 200 kann auf einem separaten Tisch 244 plaziert
sein. Der erste Tisch 242 kann eine schwere oder robuste
Tischstruktur sein, und der Scantisch 240 kann starr an
der Oberfläche
des ersten Tischs befestigt oder fixiert sein. Wie weiterhin in 12 gezeigt,
können
die Mikrotiterplatten 218 über die Trägerstruktur 219 an dem
Scantisch 240 so getragen sein, daß die Platten physisch von
dem Sondenarm 213 des Mikroskops isoliert sind. Auf diese
Weise werden Schwingungen von dem Scantisch 240 nicht auf
das Mikroskop 200 übertragen.
Weil ein Mangel an Schwingungen am Mikroskop vorliegt, ist es deshalb
leichter, entweder durch manuelle oder automatische Prozesse ein scharfes
Bild der Probe zu erhalten.
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In
dem in 11–12 gezeigten
Beispiel ist die optische Hauptachse 202 des Mikroskops
so konfiguriert, daß sie
parallel zur Objektebene 216 verläuft. Durch diese Konfiguration
zusammen mit dem länglichen
Sondenarm kann der Betrachter in einer substantiellen Entfernung
von den Proben positioniert werden, die betrachtet werden. Dies
kann besonders dann wünschenswert
sein, wenn man es mit Proben zu tun hat, die toxische Chemikalien
beinhalten, oder wenn die Proben in einem isolierten Raum oder einer
isolierten Kammer plaziert werden müssen, die von dem Bereich entfernt
ist, in dem sich der Betrachter befindet. Zudem kann die Optik geändert werden,
ohne daß der
isolierte Raum oder die isolierte Kammer betreten werden muß. Infolgedessen
gestattet das verbesserte Mikroskop der vorliegenden Erfindung die
Mikroskopie für
einen größeren Bereich
von Probenarten.
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Der
längliche
Sondenarm und das Mikroskop von 11–12 weist
auch andere Vorzüge
auf. Beispielsweise gestattet der längere Sondenarm das Scannen
größerer Objekte
mit dem Mikroskop. Der längere
Sondenarm gestattet auch, mehrere Objekte zugleich zu scannen, ohne
den Scantisch zu entladen und wiederzubeladen. Zudem gestattet der
längere
Sondenarm, daß die
Optik zugänglicher
ist. Wegen des Designs ist es auch leichter, in den Sondenarm des
Instruments zusätzliche
Optik zu integrieren. Der längere
Sondenarm gestattet auch das Aufnehmen zusätzlicher Hilfsmittel wie etwa
des Autofokussystems der ersten Ausführungsform der Erfindung.
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Für den Fachmann
ist offensichtlich, daß verschiedene
Modifikationen und Variationen an den offenbarten Ausführungsformen
vorgenommen werden können
hinsichtlich einer Vorrichtung zum automatischen Fokussieren eines
optischen Instruments auf eine Objektebene, eines Verfahrens zum
automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine Objektebene
und eines Mikroskops zum Fokussieren auf eine Objektebene, Verwendung
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und bei der Konstruktion
dieser Vorrichtung, ohne von dem Schutzbereich oder Gedanken der
Erfindung abzuweichen. Die Merkmale und Aspekte der offenbarten
Ausführungsformen
können
kombiniert, modifiziert oder substituiert werden, um zusätzliche
Vorteile und Merkmale bereitzustellen.
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Während Merkmale
der Erfindung unter Bezugnahme auf Autofokussierungs- und Beleuchtungslichtstrahlen
offenbart werden, die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, um Simultanbetrieb zu
gestatten, ist es beispielsweise natürlich auch möglich, Lichtstrahlen
auszuwählen,
die die gleiche oder eine ähnliche
Wellenlänge
aufweisen. In einem derartigen Fall können die Merkmale der Erfindung
in einem asynchronen Modus implementiert werden, in dem der Autofokussierungslichtstrahl
zu einem anderen Zeitpunkt von dem des Beleuchtungslichtstrahls erzeugt
und angewendet wird. Es ist auch möglich, die Lichtstrahlen und
Merkmale der Erfindung in einem asynchronen Modus ungeachtet der
Wellenlängen
der Lichtstrahlen zu implementieren (d.h. ungeachtet davon, ob der
Autofokussierungslichtstrahl und der Beleuchtungslichtstrahl die
gleiche oder andere Wellenlängen
aufweisen).
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Weitere
Ausführungsformen
der Erfindung ergeben sich dem Fachmann bei Betrachtung der Spezifikation
und der Ausübung
der hier offenbarten Erfindung. Die Spezifikation und Beispiele
sollen nur als beispielhaft angesehen werden, wobei der wahre Schutzbereich
der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben wird.