DE60116268T2

DE60116268T2 - Hochdurchsatzscreening-mikroskop mit autofokus-einrichtung

Info

Publication number: DE60116268T2
Application number: DE60116268T
Authority: DE
Inventors: Jan Marc LEBLANS; Arthur Philip VAN DONINCK
Original assignee: Tibotec BVBA
Current assignee: Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: PT1264205E; ATE314672T1; CA2400841A1; WO2001067154A2; NO20024302L; DE60116268D1; US20030142398A1; EP1264205B1; TW594045B; WO2001067154A3; JP2003526814A; AU779909B2; AU4069401A; US6974938B1; NO20024302D0; DK1264205T3; US7016110B2; ES2256207T3; EP1264205A2; NZ520525A

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, das sich für das High-Throughput-Screening eignet, umfassend eine Autofokussierungseinrichtung mit einer entfalteten optischen Hauptachse. Die Erfindung betrifft weiterhin auch eine Autofokussierungsvorrichtung und ein Autofokussierungsverfahren, die sich beim High-Throughput-Screening eignen.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Seit vielen Jahren stehen Autofokussierungstechniken für Mikroskope zur Verfügung.
Die meisten Autofokusverfahren fallen in zwei Kategorien: Positionserfassung und Bildinhaltsanalyse. Bildinhalts-Autofokusfunktionen sind bereits für die Hellfeldmikroskopie verglichen worden. Groen, Young und Ligthart (Groen FCA, Young IT, Ligthart G: A comparison of different focus functions for use in autofocus algorithms. Cytometry 6: 81–91, 1985) verglichen 11 Autofokusfunktionen unter einem Hellfeld unter Verwendung eines Elektronenmikroskopgitters und einer Metaphasenverbreitung, und Vollath (Vollath D: Automatic Focusing by Correlative Methods. J Microsc 147: 279–288, 1987) testete eine Autokorrelationsfunktion unter einem Hellfeld unter Verwendung einer paralytischen Stahlprobe. Groen et al. folgerten, daß drei Autofokusfunktionen, d.h. zwei Gradientenfunktionen und die Intensitätsvarianz, die beste Leistung aufwiesen. Seine wichtigste Beschränkung ist die Geschwindigkeit, die von den Berechnungsleistungen abhängig ist.
Bei einer typischen Autofokussierbildinhaltstechnik wird eine Objektivlinse in einer vorbestimmten Entfernung von der zu scannenden Probe plaziert, und von dem Bild wird eine Aufnahme gemacht. Das durch das Mikroskop erzeugte Bild wird dann in der Regel ausgewertet, um die Position zu bestimmen, bei der die Oberfläche des Objekts oder eine Ebene innerhalb des Objekts scharf ist. Die Auswertung des Bilds beinhaltet in der Regel das Analysieren von Charakteristiken des Bilds, wie etwa Entropie, räumliche Auflösung, Raumfrequenz, Kontrast oder andere Charakteristiken. Die Analyse dieser Charakteristiken erfordert ein erhebliches Ausmaß an Computerverarbeitung. Nach dem Analysieren der Charakteristiken wird die Entfernung zwischen die Objektivlinse und dem zu scannenden Objekt variiert, und eine weitere Aufnahme wird angefertigt. Das neue Bild wird dann ausgewertet, und der Prozeß wird mehrmals wiederholt, bevor schließlich ein fokussiertes Bild erhalten wird. Den Schritt des Analysierens des Bilds zu wiederholen, kann dazu führen, daß die Fokussierungsoperation unerwünscht lange Zeit benötigt, bevor das Mikroskop schließlich auf die Objektoberfläche fokussiert ist. Die Notwendigkeit einer verlängerten Verarbeitungszeit für die Autofokussierung kann für verschiedene Arten von Abbildungsoperationen besonders akut sein. Wenn beispielsweise ein Objekt unter einem Mikroskop betrachtet wird, müssen die fokussierten Bedingungen aufrechterhalten werden, damit ein ordnungsgemäß fokussiertes Bild des Objekts beibehalten wird. Selbst wenn das Objekt anfänglich scharf ist, kann das Objekt deshalb aufgrund einer Vielfalt externer Faktoren wie etwa Wärmeeffekte und Schwingungen unscharf werden, falls keine korrigierenden Schritte ergriffen werden. Wenn zudem ein Objekt größer ist als das Blickfeld des Mikroskops, kann das Mikroskop nur den Abschnitt des Objekts fokussieren, der durch das Blickfeld des Mikroskops betrachtet werden kann. Die Fokussierbedingungen müssen deshalb regelmäßig geprüft und justiert werden, um ein schwaches Bild des Objekts insgesamt beizubehalten.
Angesichts des Obengesagten gibt es eine Notwendigkeit eines verbesserten Autofokussierungssystem und -verfahren für ein Mikroskop, die schnelle und präzise Autofokussierungsoperationen durchführen und gleichzeitig ein scharfes Bild beibehalten können.
Aus US-A-5,530,237 ist ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 bekannt.
Es sind mehrere Autofokuspositionserfassungsverfahren und -vorrichtungen bekannt, beispielsweise aus Offenlegungsschrift DE 34 46 727 und DE 33 28 821 . Diese deutschen Dokumente offenbaren eine Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop, bei der Variationen bei der von zwei separaten Lichtquellen kommenden Lichtintensität ein Signal zur Fokusjustierung bereitstellen. Diese bekannten Autofokusverfahren eignen sich insbesondere für abzubildende flache Proben. Die Autofokussierungslichtstrahlen breiten sich entlang einem im wesentlichen großen Teil aus, das mehrere optische Elemente enthält, wie mehrere Linsen und mindestens zwei Strahlteiler. Dieses große Teil bewirkt bei der Autofokussierungsprozedur eine erhebliche Verzögerung. Die vorliegende Erfindung betrifft ein vereinfachtes Autofokussystem, durch das der Teil des Autofokussierens von Licht auf ein Minimum reduziert wird. Die Ungewißheit beim Übertragen von Autofokustestergebnissen von einem Mikroskopverfahren auf ein anderes führte zu der vorliegenden Erfindung. Die Entwicklung der vorliegenden Erfindung beinhaltete das Untersuchen der Autofokusleistung bei der Mikroskopie von fluoreszierenden markierten biologischen Proben.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Vorteile und Aufgabe der Erfindung werden teilweise in der folgenden Beschreibung dargelegt und ergeben sich teilweise aus der Beschreibung oder können durch die Ausübung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Vorteile und Aufgaben der Erfindung werden mit Hilfe der Elemente und Kombinationen realisiert und erreicht, die in den beigefügten Ansprüchen besonders hervorgehoben sind.
Es versteht sich, daß sowohl die vorausgegangene allgemeine Beschreibung als auch die folgende ausführliche Beschreibung lediglich beispielhaft und erläuternd sind und die Erfindung, wie beansprucht, nicht einschränken.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die beigefügten Zeichnungen, die in diese Spezifikation integriert sind und einen Teil dieser darstellen, veranschaulichen mehrere Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Grundlagen der Erfindung. In den Zeichnungen zeigen:
1 die Grundprinzipien eines optischen Systems zum Ausbilden eines Bilds einer Objektebene gemäß der vorliegenden Erfindung;
2 das optische System von 1 mit scharfer und unscharfer Objektebene;
3A ein Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem Autofokussierungssystem gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
3B eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems von 3A;
3C eine graphische Darstellung der durch die Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 3B an verschiedenen relativen Positionen zwischen einer tatsächlichen Bildebene und einer gewünschten Bildebene detektierten Lichtintensität;
4A ein Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem Autofokussierungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
4B eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems von 4A;
4C eine graphische Darstellung der durch die Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 4B an verschiedenen relativen Positionen zwischen einer tatsächlichen Bildebene und einer gewünschten Bildebene detektierten Lichtintensität;
4D eine Variation des Mikroskops von 4A mit einem modifizierten Autofokussierungsdetektionssystem;
5 ein Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem Autofokussierungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
6A, 6B und 6C eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung des Autofokussierungssystems von 5 mit scharfer Objektebene, der zu weit von einer Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise der zu nahe an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
7A, 7B und 7C die Position von auf Dioden der Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 5 ausgebildeten Lichtpunkten mit scharfer Objektebene, der zu weit von einer Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise der zu nahe an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
8A ein Mikroskop mit dem optischen System von 1 und einem Autofokussierungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
8B, 8C und 8D die Position von auf Dioden der Autofokussierungsdetektionseinrichtung von 8A ausgebildeten Lichtpunkten mit scharfer Objektebene, der zu nahe von einer Objektivlinse entfernten Objektebene beziehungsweise der zu weit an der Objektivlinse liegenden Objektebene;
9 ein beispielhaftes Flußdiagramm eines Verfahrens zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Objektebene, das in den Mikroskopen der 3–4 eingesetzt werden kann;
10 ein beispielhaftes Flußdiagramm eines Verfahrens zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Objektebene, das in den Mikroskopen der 5–8 eingesetzt werden kann;
11 eine Seitenansicht eines Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und
12 eine Seitenansicht des auf einem separaten Tisch von einem Scantisch positionierten Mikroskops von 11.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun ausführlich auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, von denen Beispiele in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt sind. Wo immer möglich, werden in den Zeichnungen die gleichen oder ähnliche Teile mit gleichen Referenzzahlen bezeichnet.
Als von besonderer Wichtigkeit für ein Mikroskop, das die Autofokussierungssysteme enthielten, wird nun in einem ersten Fall erörtert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Mikroskop mit automatisch fokussierenden Mitteln bereit, um das Mikroskop automatisch auf eine Ebene eines Objekts wie etwa einer Probe zu fokussieren.
Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden die Einzelheiten der Autofokussierungsvorrichtung und des Autofokussierungssystems und des Mikroskops getrennt erörtert. Es sind jedoch alle Merkmale enthalten.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Autofokussierungsvorrichtung bereitgestellt, die ein optisches System enthält, die konfiguriert ist zum Ausbilden eines optischen Bilds einer zu betrachtenden Probenebene, ein Autofokussierungsdetektionssystem und ein Fokuskorrektionssystem. Das optische System kann eine Objektivlinse, eine Beleuchtungsstrahlquelle zum Beleuchten der Probenebene mit einem Beleuchtungsstrahl und eine Bildlinse wie etwa eine Sammellinse zum Erzeugen eines Bilds der Probenebene enthalten. Das Autofokussierungsdetektionssystem kann eine Autofokussierungslichtstrahlquelle zum Erzeugen eines Autofokussierungslichtstrahls, einen Strahlteiler, der konfiguriert ist zum Lenken des Autofokussierungslichtstrahls zu der Probenebene und Bewirken, daß der Autofokussierungslichtstrahl von der Probenoberfläche wegreflektiert wird, enthalten.
Das Autofokussierungsdetektionssystem der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine Detektionssystemlinse enthalten, die so konfiguriert ist, daß sie den zurückkehrenden Autofokussierungslichtstrahl zu einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung lenkt. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung bestimmt bevorzugt das Ausmaß der Verschiebung des Bilds der Probenoberfläche von einer gewünschten fokussierten Referenzebene auf der Basis der detektierten Verschiebung einer Bildebene des Autofokussierungslichtstrahls von einer vorbestimmten Referenzebene in der Autofokussierungsdetektionseinrichtung. Das Fokussierungskorrektursystem enthält bevorzugt einen Rückkopplungscontroller und eine Fokusjustiereinrichtung zum automatischen Justieren der Entfernung zwischen der Objektivlinse und der Probenebene, um das Bild ordnungsgemäß im optischen System zu fokussieren. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Probenebene in einem Mikroskop.
Wenn sich bei einem Mikroskop die Probenebene nicht in der Brennweite von der Objektivlinse befindet, ist das resultierende Bild im Mikroskop unscharf. Die 1 und 2 beispielsweise veranschaulichen, wie es zu diesem Problem in einem optischen System zum Ausbilden eines optischen Bilds einer in einem Mikroskop zu beobachtenden Probe kommen kann. Das System der 1–2 ist nur zu Veranschaulichungszwecken gezeigt und enthält nicht das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung, das unten unter Bezugnahme auf die 3–8 ausführlicher beschrieben wird.
Wie hier verkörpert und in den 1–2 gezeigt, bildet das optische System 10 ein optisches Bild einer im Mikroskop zu betrachtenden Probenebene 16. Das optische System 10 enthält einen Strahlteiler 12, eine Objektivlinse 14, eine teilreflektierende Objektebene oder Probenebene 16, eine Bildlinse 18, eine Bildebene 20 und eine Quelle 25 für einen Beleuchtungslichtstrahl 22. Bei dem in 1 gezeigten Beispiel ist die Probenebene 16 der Probe in einer Entfernung positioniert, die der Brennweite (f1) der Objektivlinse 14 entspricht. Dadurch wird das resultierende Bild der Probe im Mikroskop von 1 ordnungsgemäß fokussiert. Im Gegensatz dazu ist die Probenebene 16 in 2 an einer Position angeordnet, die (um d1) von der Brennweite der Linse 14 abweicht, und deshalb wird das resultierende Bild nicht ordnungsgemäß fokussiert. In den 1 und 2 kann die teilreflektierende Ebene 16 entweder dem Boden der Probenoberfläche oder einer Ebene auf der Innenseite der Probe entsprechen. Alternativ kann die Probenebene 16 dem Boden der Oberfläche entsprechen, auf der die Probe plaziert ist. Zu Zwecken der nachfolgenden Erörterung wird die zu fokussierende Ebene als die Probenebene 16 bezeichnet.
Wie in den 1 und 2 dargestellt erzeugt die Lichtquelle 25 einen Beleuchtungslichtstrahl 22. Der Beleuchtungslichtstrahl 22 kann eine beliebige Wellenlänge aufweisen, die sich zum Beleuchten einer Probenebene in einem Mikroskop eignet. Obwohl das gezeigte Beispiel veranschaulicht, daß der Beleuchtungslichtstrahl kollimiert wird, ist es nicht notwendig, daß der Strahl kollimiert wird. Der Strahl könnte auch divergieren oder konvergieren. Zu Erörterungszwecken wird die Verwendung eines kollimierten Lichtstrahls beschrieben. Bei der Lichtquelle 25 kann es sich um eine beliebige herkömmliche Art von Lichtquelle wie etwa eine Lampe oder einen Laser handeln. Obwohl die 1 und 2 zeigen, daß sich die Lichtquelle neben einem Strahlteiler 12 befindet, ist es auch durchführbar, die Lichtquelle auf der linken Seite der Probenebene 16 in den Figuren zu plazieren, um die Probenebene zu durchleuchten. Bei einer derartigen Konfiguration wäre der Strahlteiler 12 nicht erforderlich. Bei einer alternativen Konfiguration kann die Probenebene Licht von sich aus ohne Notwendigkeit für eine spezifische Beleuchtungslichtquelle emittieren. Ein Beispiel dafür, wann es dazu kommen kann, ist, wenn eine Probe eine lumineszente chemische Reaktion erfährt. Die spezifischen Arten von Lichtquellen und die bevorzugten Wellenlängen des Beleuchtungslichtstrahls werden später unter Bezugnahme auf die offenbarten Autofokussierungsdetektionssysteme der vorliegenden Erfindung erörtert.
Bei den Beispielen der 1 und 2 wird der Beleuchtungslichtstrahl 22 auf einen Strahlteiler 12 gelenkt. Bei dem Strahlteiler 12 kann es sich um eine beliebige Art herkömmlichen Strahlteilers handeln, der sich für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung eignet. Der Strahlteiler 12 reflektiert den Beleuchtungslichtstrahl 22 in Richtung der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16, entlang der ersten optischen Achse 56 angeordnet. In 1 ist die Probenebene 16 genau in der Brennebene der Objektivlinse 14 positioniert, d.h. in der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14. Da die Probenebene 16 genau um die Brennweite von der Objektivlinse 14 weg positioniert ist, schneiden sich die Außengrenzen des Beleuchtungslichtstrahls 22 von der Objektivlinse 14 in einem einzigen Punkt in der Probenebene 16, wie in 1 gezeigt. Es wird gesagt, daß die Objektivlinse 14 in der Probenebene 16 in einer derartigen Anordnung fokussiert ist, wo der Lichtstrahl schneidet, um einen einzelnen Punkt auf der Oberfläche zu treffen, d.h., der Durchmesser des Lichtstrahls wird ein Minimum sein.
Der Beleuchtungslichtstrahl 22, der die Ebene 16 trifft, wird von der Ebene 16 weg und zurück zur Objektivlinse 14 reflektiert. Während der Beleuchtungslichtstrahl durch die Objektivlinse 14 hindurchtritt, wird der Beleuchtungslichtstrahl zurück zu seiner ursprünglichen Form kollimiert und auf den Strahlteiler 12 gelenkt. Der Strahlteiler 12 ist so konfiguriert, daß der Beleuchtungslichtstrahl, der entlang der ersten optischen Achse 56 zurückkehrt, ohne irgendwelche störenden Effekte durch den Strahlteiler 12 übertragen wird. Nach der Übertragung durch den Strahlteiler 12 erreicht der kollimierte Lichtstrahl die Bildlinse 18.
Bei der Bildlinse 18 kann es sich um eine beliebige einer Vielfalt herkömmlicher Linsen wie etwa eine Sammellinse zum Erzeugen eines Bilds einer Oberfläche handeln. Wenngleich das Schemadiagramm von 1 nur eine Bildlinse 18 zeigt, weist ein typisches Mikroskop, wie in der Technik bekannt ist, eine Reihe von Übertragungsoptiken auf. Die Übertragungsoptiken sind der Einfachheit halber nicht gezeigt. Bei der in 1 gezeigten Konfiguration projiziert die Bildlinse 18 den Beleuchtungslichtstrahl auf eine Bildebene 20, die in der Brennweite f2 von der Bildlinse 18 weg positioniert ist. Eine Linse wie etwa die Bildlinse 18 (oder die Objektivlinse 14) weist eine vorbestimmte Brennweite (f) auf der Basis ihrer Vergrößerungsleistung auf. Bei einem Beispiel einer Bildlinse, das sich mit der vorliegenden Erfindung eignet, liegt die Brennweite zwischen 160 mm und 250 mm. Die Brennweite der Bildlinse kann jedoch viel kleiner oder größer sein als dieser Bereich.
Die Brennweite (f) entspricht der Entfernung von der Linse, in der ein durch die Linse hindurchtretender kollimierter Lichtstrahl ordnungsgemäß fokussiert wird, d.h. der Durchmesser des Lichtstrahls wird ein Minimum sein. Beispielsweise weist die in 1 gezeigte Objektivlinse 14 eine Brennweite von f1 auf. Deshalb wird bei einer in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14 angeordneten Probenebene 16 der kollimierte Beleuchtungslichtstrahl 22 von Strahlteiler 12 auf die Probenebene fokussiert, wie in 1 gezeigt. Weil sich die Probenebene 16 genau in der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 befindet, wird der reflektierte Lichtstrahl von der Oberfläche nicht wieder kollimiert, wenn er entlang der ersten optischen Achse 56 in Richtung der Bildlinse 18 hindurchtritt. Der von der Bildlinse 18 (in 1 nach rechts bewegend) gelenkte reflektierte Beleuchtungslichtstrahl wird dann auf die Bildebene 20 fokussiert, die in der Brennweite f2 (der Bildlinse 18) von der Bildlinse 18 weg angeordnet ist. Wenn sich deshalb die Probenebene 16 in der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 befindet, wird deshalb das resultierende Bild von der Bildlinse 18 ordnungsgemäß fokussiert.
In der Regel ist jedoch die Probenebene 16 anfänglich nicht genau in der Brennweite von der Objektivlinse 14 positioniert. Selbst wenn die Probenebene anfänglich in der gewünschten Entfernung von der Objektivlinse positioniert ist, können externe Faktoren wie etwa thermische Effekte oder Vibrationen eine Relativbewegung zwischen der Probenebene und der Objektivlinse bewirken. Wenn sich die Ebene 16 in einer anderen Position als der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 weg befindet (d.h. von der in 1 gezeigten Position aus nach links oder rechts bewegt), fokussiert die Objektivlinse nicht auf die Probenebene. Beispielsweise zeigt 2, daß die Probenebene 16 im Vergleich zu der Entfernung in 1 sich in einer größeren Entfernung (f1 plus d1) von der Objektivlinse 14 weg befindet. In dieser Position hat sich die Oberfläche der Probe um einen zusätzlichen Weg d1 von der in 1 gezeigten Position weg bewegt. Wenn sich die Probenebene nicht in der Brennweite f1 von der Objektivlinse weg befindet, wird der Beleuchtungslichtstrahl von der Objektivlinse 14 auf die gewünschte Referenzebene 23 für die Probe (in 2 gestrichelt gezeigt) fokussiert, die f1 von der Objektivlinse 14 weg liegt, anstatt auf die Probenebene 16. Die gewünschte Referenzebene 23 für die Probe (in 2 gezeigt) ist genau in der Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 weg positioniert und entspricht deshalb der Position, bei der der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls von der Objektivlinse 14 ein Minimum ist.
Der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls soll jedoch in der tatsächlichen Ebene der Probenebene 16 (als durchgezogene Linie gezeigt) ein Minimum sein, nicht an einer von der Probenebene beabstandeten Referenzebene 23. Deshalb ist es schließlich wünschenswert, daß die Probenebene 16 sich in der gewünschten Referenzebene 23 befindet, damit es zu einer ordnungsgemäßen Fokussierung kommt. Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erhalten einer derartigen Fokussierung werden später beschrieben.
In 2 befindet sich die Probenebene 16 in einer zusätzlichen Entfernung d1 von der (gestrichelt gezeigten) gewünschten Referenzebene 23. Diese Bewegung d1 kann durch eine Vielzahl von Faktoren verursacht werden. Wie in 2 zu sehen befindet sich der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls in der gewünschten Referenzebene 23 auf einem Minimum und trifft somit auf die Probenebene 16 an einer Position jenseits der Entfernung f1 von der Objektivlinse 14. Der Beleuchtungsstrahl 22 wird dann als reflektierter Lichtstrahl 24 von der Probenebene weg reflektiert. Da der Beleuchtungslichtstrahl 22 nicht auf die Probenebene 16 an einem einzelnen Punkt oder an einer Position mit Mindestdurchmesser (wie in 1) auftrifft, befinden sich die Außengrenzen des reflektierten Lichtstrahls 24 außerhalb der Außengrenzen des zur Probenebene 16 verlaufenden Beleuchtungslichtstrahls 22. Wie in 2 gezeigt werden die reflektierten Lichtstrahlen 24 nach dem Zurücklaufen durch die Objektivlinse 14 nicht länger kollimiert.
Die reflektierten Lichtstrahlen 24 werden dann durch den Strahlteiler 12 entlang der ersten optischen Achse 56 zur Bildlinse 18 übertragen. Weil die reflektierten Lichtstrahlen nicht kollimiert werden, projiziert die Bildlinse 18 dann die reflektierten Lichtstrahlen 24 so, daß sie sich in einer Bildebene 20 schneiden, die sich nicht in der ordnungsgemäßen Brennweite f2 von der Bildlinse 18 weg befindet. Die in der mit der Brennweite f2 von der Bildlinse entfernt angeordnete Ebene wird als die „gewünschte" Referenzebene für die Bildebene bezeichnet. Die Entfernung zwischen der gewünschten Referenzebene 26 für die Bildebene (gestrichelt gezeigt) und der tatsächlichen Position der Bildebene 20 (als durchgezogene Linie gezeigt) ist in 2 und in der gesamten Spezifikation als d2 dargestellt. Wenn die Probenebene, wie in 1 gezeigt, relativ zu der Objektivlinse ordnungsgemäß positioniert ist, ist die tatsächliche Position der Bildebene 20 identisch mit der gewünschten Referenzebene 26.
Eine Bildformungseinrichtung wie etwa ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder eine Kamera kann in der gewünschten Referenzebene 26 des optischen Systems 10 positioniert sein. Alternativ kann ein Okular zum Betrachten des Bilds in der gewünschten Referenzebene 26 positioniert sein, so daß das Auge eines Betrachters auf die gewünschte Referenzebene 26 ausgerichtet ist. Um das optische Instrument ordnungsgemäß zu fokussieren, ist es deshalb wünschenswert, daß der reflektierte Strahl 24 so gelenkt wird, daß sich die Strahlen an einem Punkt in der gewünschten Referenzebene 26 schneiden (wie in 1 gezeigt). Für das in 2 gezeigte System gibt es, wenn die Probenebene 16 um d1 von der ordnungsgemäß fokussierten Position verschoben ist (eine Brennweite f1 von der Objektivlinse), eine entsprechende Verschiebung d2 der Bildebene 20 von der gewünschten Referenzebene 26 des Mikroskops. Deshalb wird das entsprechende Bild unscharf sein, weil es sich nicht in der ordnungsgemäßen Brennweite f2 von der Bildlinse 18 befindet.
Mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung vereinbare Autofokussierungssysteme sorgen für eine schnelle und präzise automatische Fokussierung auf die Probenebene. Das Autofokussierungssystem enthält ein Autofokussierungsdetektionssystem zum direkten Bestimmen der Verschiebung der tatsächlichen Bildebene von der gewünschten Referenzebene der Bildebene des optischen Systems. Die Verschiebung entspricht allgemein dem Grad, wie das Bild unscharf ist. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung entfällt die Notwendigkeit einer zeitraubenden Auswertung der Charakteristiken mehrerer Bilder durch das direkte Bestimmen der Entfernung, um die das Bild außer Fokus ist. Infolgedessen kann das Mikroskop schnell und effizient justiert werden, so daß das Bild ordnungsgemäß fokussiert ist. Das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung enthält weiterhin ein Fokussierungskorrektursystem zum Justieren der Entfernung zwischen der Objektivlinse und der Probenebene, so daß das Mikroskop schnell auf die Probenebene fokussiert wird.
Ein erstes Beispiel einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zum automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine Probenebene ist in den 3A, 3B und 3C gezeigt. Wie hier verkörpert und in den 3A–3C gezeigt enthält die Vorrichtung 30 zum automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine Probenebene das optische System 10 zum Ausbilden eines Bilds (zuvor in den 1–2 beschrieben), ein Autofokussierungsdetektionssystem 32 und ein Fokussierungskorrektursystem 34. Wie in den 3A–3C gezeigt enthält die Vorrichtung 30 ein optisches System 10 zum Ausbilden eines optischen Bilds einer zu betrachtenden Probe. Das optische System 10 enthält einen Strahlteiler 12, eine Objektivlinse 14, eine Bildlinse 18, eine Bildebene 20 und eine Beleuchtungslichtquelle 25 im wesentlichen wie zuvor in der obigen Erörterung für die 1–2 beschrieben. Die Prinzipien des optischen Systems 10 in 3A–3C arbeiten gemäß den gleichen Prinzipien wie zuvor für die 1–2 beschrieben. Die Komponenten des optischen Systems 10 werden unten bezüglich des Autofokussierungsdetektions systems 32 und des Fokussierungskorrektursystems 34 ausführlicher beschrieben.
Wie hier verkörpert und in den 3A–3C gezeigt wird ein Autofokussierungsdetektionssystem 32 bereitgestellt, das eine Lichtquelle 39 zum Erzeugen von Autofokussierungslichtstrahlen 40, einen ersten Autofokussierungsstrahlteiler 42 und einen zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 enthält. Das Autofokussierungssystem 32 enthält weiterhin ein Detektionslinsensystem 46 zum Lenken und Zurückschicken eines Autofokussierungslichtstrahls und einer Detektionseinrichtung 50 zum Bestimmen des Grads der Verschiebung des Bilds von einer gewünschten fokussierten Referenzebene. Die Detektionseinrichtung 50 kann eine beliebige einer Reihe von Einrichtungen sein, wie etwa jene, die in 3A–3C und den anderen Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind.
Wie in den 3A–3B verkörpert und gezeigt erzeugt die Lichtquelle 39 einen Autofokussierungslichtstrahl 40, der im Autofokussierungsdetektionssystem 32 verwendet wird. Bei der Lichtquelle 39 kann es sich um eine beliebige geeignete Lichtquelle wie etwa eine Lampe oder einen Laser handeln. Falls ein Laser gewählt wird, kann ein Diodenlaser oder ein HeNe-Laser für die Lichtquelle 39 verwendet werden, obwohl mit der vorliegenden Erfindung eine beliebige Anzahl anderer Laserarten ebenfalls verwendet werden kann. Obwohl der Autofokussierungslichtstrahl 40 in 3A als kollimiert gezeigt ist, könnte der Autofokussierungslichtstrahl zudem alternativ entweder konvergierend oder divergierend sein. Der Strahl ist als kollimiert gezeigt, um die Erörterung zu vereinfachen.
Bei dem in 3A gezeigten Beispiel weist der Autofokussierungslichtstrahl eine Wellenlänge λa auf. Die Wellenlänge für den Autofokussierungslichtstrahl ist bevorzugt so ausgewählt, daß sie von der Wellen länge des Beleuchtungslichtstrahls 52 verschieden ist. In den meisten Fällen wird bevorzugt, daß der Autofokussierungslichtstrahl eine längere Wellenlänge als der Beleuchtungslichtstrahl aufweist. Zu Zwecken der folgenden Beschreibung werden die Lichtquellen und Strahlen bezüglich Fluoreszenzabbildungsspektroskopie beschrieben, obwohl sich die vorliegende Erfindung für eine große Anzahl anderer Anwendungen zusätzlich zur Fluoreszenzabbildungsspektroskopie eignet. Bei der Fluoreszenzabbildung weist der Beleuchtungslichtstrahl 52 eine Anregungswellenlänge von λe auf und wird verwendet, um auf eine Weise ähnlich der bezüglich 1 erörterten das Bild in dem optischen System 10 zu erzeugen. Die Wellenlängen des Autofokussierungslichtstrahls 40 und des Beleuchtungslichtstrahls 52 sind so ausgewählt, daß sie voneinander verschieden sind, damit der Autofokussierungslichtstrahl 40 den zum Erzeugen des Bilds verwendeten Beleuchtungsstrahl 52 nicht stört oder mit ihm interferiert.
Bei einem Mikroskop, das Fluoreszenzabbildung verwendet, wird die Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls 52 so ausgewählt, daß sie so schmal wie möglich ist und innerhalb des Absorptionsbandes der untersuchten fluoreszierenden Probe liegt. Wenn der Beleuchtungslichtstrahl die Oberfläche trifft, wird ein Fluoreszenzlichtstrahl mit einer Wellenlänge λf erzeugt. Bevorzugt ist die Wellenlänge des Fluoreszenzstrahls von der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls verschieden. Die Differenz zwischen den Wellenlängen kann bei einem Beispiel möglicherweise nur 50 nm betragen, bevorzugt 10 nm oder weniger. Kein Licht des Anregungsstrahls sollte in die Bildlinse 18 eintreten dürfen. Deshalb ist bei dem in 3A gezeigten Beispiel der Strahlteiler 12 so konfiguriert, daß er alles Licht mit einer Wellenlänge λe blockiert und gleichzeitig gestattet, daß Licht der Fluoreszenzwellenlänge λf dort hindurch übertragen wird.
Wie oben erörtert sollten die Autofokussierungslichtstrahlen so ausgewählt werden, daß sie eine Wellenlänge (λa) aufweisen, die von der Anregungswellenlänge (λe) und der Fluoreszenzwellenlänge (λf) verschieden ist. Nur zur Veranschaulichung wird ein bestimmtes Beispiel gezeigt. In dem Fall einer Probe, die eine Wellenlänge von etwa 510 nm absorbiert und bei etwa 550 nm fluoresziert, kann der Anregungsstrahl so ausgewählt werden, daß er ein Ar⁺-Ionenlaser mit einer Wellenlänge von 514 nm ist. Die Wellenlänge des Autofokussierungslichtstrahls kann so ausgewählt werden, daß sie über etwa 600 nm liegt. Dieses eine Beispiel der Wellenlängen ist nur zur Veranschaulichung und schränkt die vorliegende Erfindung nicht ein. Indem verschiedene Wellenlängen verwendet werden, kann das vorliegende System gleichzeitig den Grad bestimmen, den das System außer Fokus ist, und das Bild der Oberfläche erzeugen. Die Fähigkeit, beide dieser Prozesse gleichzeitig auszuführen, vergrößert die Geschwindigkeit und Effizienz der Autofokussierungsvorrichtung.
Bei dem in den 3A–3C gezeigten Beispiel erzeugt die Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 den Autofokussierungslichtstrahl 40 und projiziert ihn in einer ersten Richtung parallel zur ersten optischen Achse 56. Der Autofokussierungslichtstrahl 40 trifft auf den ersten Strahlteiler 42 des Autofokussierungsdetektionssystems und wird entlang einer zweiten optischen Achse 64 zum zweiten Strahlteiler 44 des Autofokussierungssystems reflektiert. Alternativ könnte die Vorrichtung so konfiguriert sein, daß die Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 den Autofokussierungslichtstrahl 40 direkt auf den zweiten Strahlteiler 44 erzeugt, ohne daß der erste Strahlteiler 42 benötigt wird. Bei einer weiteren möglichen Konfiguration könnte die Lichtquelle 39 für den Autofokussierungsstrahl den Autofokussierungslichtstrahl 40 direkt zu der Objektivlinse 16 erzeugen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Strahlteiler 42, 44 können von einer beliebigen, in der Technik bekannten herkömmlichen Art sein. Beispielsweise können die Strahlteiler 42, 44 teilreflektierende herkömmliche Strahlteiler sein. Der Strahlteiler 44 ist bevorzugt so konfiguriert, daß er den ganzen Beleuchtungslichtstrahl der Wellenlängen λe und λf durchläßt und dabei die Autofokussierungslichtstrahlen der Wellenlänge λa reflektiert. Bei einem Beispiel ist der Strahlteiler 42 bevorzugt so konfiguriert, daß er einen polarisierenden Strahlteiler und eine Viertelwellenplatte verwendet. Wie in 3A gezeigt wird der Autofokussierungslichtstrahl 40 beim Auftreffen auf den zweiten Strahlteiler 44 entlang der ersten optischen Achse 56 zu der Objektivlinse 14 reflektiert. Der Strahlteiler 44 ist so konfiguriert, daß er den Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa reflektiert. Wenn die Strahlen gleichzeitig eingesetzt werden, gestattet der Strahlteiler 44 auch, daß der reflektierte Beleuchtungslichtstrahl 52 wie oben beschrieben dort hindurch verläuft.
Der Autofokussierungslichtstrahl läuft entlang einer ersten optischen Achse 56 zur Objektivlinse 14. Die Objektivlinse 14 kann eine beliebige Art von Mikroskopobjektivlinse sein. Die Objektivlinse 14 weist eine Brennweite f1 auf, die eine Funktion der Vergrößerungsleistung der Objektivlinse ist. Bei den meisten Anwendungen liegt die effektive Brennweite f1 in der Regel im Bereich zwischen 40 mm und 1 mm. Objektivlinsen mit Brennweiten außerhalb dieses Bereichs eignen sich jedoch ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung. Die Objektivlinse 14 lenkt den Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa auf die in einer Brennweite f1 von der Objektivlinse angeordnete Probenebene 16. Bei der in 3A gezeigten Ausführungsform liegt die Probenebene 16 in der Brennweite f1 von der Objektivlinse weg, weshalb das resultierende Bild der Probenebene aufgrund der Eigenschaften des optischen Systems (einschließlich derer der Bildlinse 18) ordnungsgemäß fokussiert wird.
Der Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektivlinse 14 wird dann zumindest teilweise von der Probenebene 16 weg reflektiert und zurück zur Objektivlinse 14 gelenkt. Der reflektierende Autofokussierungslichtstrahl mit einer Wellenlänge λa wird dann von der Objektivlinse 14 entlang der ersten optischen Achse 56 zum zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 gelenkt. Der zweite Autofokussierungsstrahlteiler 44 reflektiert den Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa zu dem ersten Autofokussierungsstrahlteiler 42 (in einer Abwärtsrichtung entlang der zweiten optischen Achse 64 in 3A). Der erste Autofokussierungsstrahlteiler 42 gestattet, daß der von dem zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 reflektierte Autofokussierungslichtstrahl ohne jegliche störenden Effekte durchgelassen wird. Der Autofokussierungslichtstrahl 40 wird dadurch zu der Detektionssystemlinse 46 und der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 50 übertragen. Das Verfahren und die Vorrichtung zum Detektieren des Grades, um den das Bild außer Fokus ist, wird unten ausführlicher erörtert.
Wie bereits erörtert enthält das optischen System zum Erzeugen eines Bildes die Quelle des Beleuchtungslichtstrahls zum Beleuchten der Probenebene. Bei einem Fluoreszenzabbildungssystem weist der Beleuchtungslichtstrahl eine Wellenlänge λe auf, um die Fluoreszenz der Probenebene zu erzeugen. Wie in dem Beispiel von 3A gezeigt reflektiert der Strahlteiler 12 des optischen Systems die Beleuchtungslichtquelle 52 entlang der ersten optischen Achse 56 zur Probenebene 16. Der zweite Autofokussierungsstrahlteiler 44 ist so konfiguriert, daß er die Übertragung des Beleuchtungslichtstrahls der Wellenlänge λe durch ihn hindurch zur Objektivlinse 14 gestattet. Die Objektivlinse 14 lenkt dann den Beleuchtungslichtstrahl zu einem Punkt in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14. Der Beleuchtungslichtstrahl ist so konfiguriert, daß er bei einer Referenzebene entsprechend der Brennweite f1 von der Objektivlinse schneidet. Weil die Probenebene sich f1 von der Objektivlinse entfernt befindet, trifft in 3A der Beleuchtungslichtstrahl einen einzelnen Punkt in der Probenebene und wird wegreflektiert, wie in 3A gezeigt. Während der Beleuchtungslichtstrahl von der Probenebene wegreflektiert wird, wird er in einen beleuchteten Fluoreszenzstrahl (bei dem Fluoreszenzabbildungsbeispiel) wie etwa einen Fluoreszenzlichtstrahl mit einer Wellenlänge λf konvertiert. Diese Wellenlänge ist bevorzugt ausreichend verschieden von der Autofokussierungswellenlänge, so daß zwischen dem beleuchteten Strahl und dem Autofokussierungslichtstrahl keine Interferenz entsteht.
Der fluoreszierende Lichtstrahl von der Probenebene 16 weist eine Wellenlänge λf auf und läuft durch die Objektivlinse hindurch (während sie sich in 3A nach rechts bewegt). Bei dem in 3A gezeigten Beispiel wird der Fluoreszenzlichtstrahl kollimiert, während er durch die Objektivlinse hindurchtritt, und zu dem zweiten Autofokussierungsstrahlteiler 44 gelenkt. Der zweite Autofokussierungsstrahlteiler 44 ist so konfiguriert, daß er den Durchtritt des Fluoreszenzlichtstrahls gestattet. Der Fluoreszenzlichtstrahl tritt dann entlang der ersten optischen Achse 56 durch den Strahlteiler 12 des Bildsystems hindurch. Die Bildlinse 18 fokussiert dann den Fluoreszenzlichtstrahl auf eine Bildebene 20 in einer Brennweite f2 von der Bildlinse, wo das Bild entsteht. Bei dem in 3A gezeigten Beispiel ist die Bildebene 20 koplanar zu der gewünschten Referenzebene 26, auf der das ordnungsgemäß fokussierte Bild entsteht, weil die Probenebene 16 genau in der Brennweite f1 von der Objektivlinse plaziert ist. Wie bereits erörtert entspricht die gewünschte Referenzebene in der Regel einer Oberfläche, auf der eine Bilddetektierungseinrichtung wie etwa eine CCD-Kamera oder ein Okular zum direkten Betrachten des Bilds enthalten kann.
Wie bereits erläutert enthält die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum direkten Bestimmen des Grades, in dem das Bild außer Fokus ist, ohne daß die Analyse der Charakteristiken mehrerer Bilder erforderlich wäre. Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmen direkt die Verschiebung des Bilds von seiner ordnungsgemäß fokussierten Position und justiert dann das optische System so, daß ein scharfes Bild erhalten wird. Das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung enthält eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung zum direkten Bestimmen des Grades, um den das Bild außer Fokus ist, und enthält ein Fokussierungskorrektursystem.
Die Vorrichtung kann eine von verschiedenen unterschiedlichen Arten von Autofokussierungsdetektionseinrichtungen enthalten. 3A zeigt eine Vorrichtung mit einer besonderen Art von Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 50 des in 3A gezeigten Beispiels enthält eine Iris 60, die in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 positioniert ist. Die Brennweite f3 der Detektionssystemlinse 46 ist eine Funktion der Größe und Vergrößerung der Detektionssystemlinse 46. Die Iris 60 kann eine beliebige Art von flacher Platte oder anderer Struktur mit einer Apertur sein, um den Durchtritt von Licht dort hindurch zu gestatten.
Wenn die Probenebene 16 an der ordnungsgemäßen Fokussierungsposition (Entfernung f1 von der Objektivlinse 14) positioniert ist, gestattet die Iris, daß der Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa (in 3B als durchgehende Linie gezeigt) von der Detektionssystemlinse 46 ohne Störung durch die Iris zu einem Lichtdetektor 62 hindurchtritt. Die Detektionssystemlinse 46 weist bevorzugt eine Brennweite f3 auf, die sich eignet, so daß der Autofokussierungslichtstrahl klein genug ist, um durch die Iris hindurchzutreten, wenn die Oberfläche scharf ist. Der Autofokussierungslichtstrahl wird kleiner, wenn die Brennweite größer gemacht wird. Das Autofokussierungssystem ist jedoch kompakt und robust mit kleineren Brennweiten. Die Auswahl der Brennweite der Detektionssystemlinse ist deshalb ein Kompromiß dieser Überlegungen. Bei einer typischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Detektionssystemlinse 46 eine Brennweite zwischen 50 mm und 200 mm auf. Die Brennweite kann jedoch entsprechend den Abmessungen und anderen Charakteristiken größer oder kleiner sein als dieser Bereich. Bei der in 3A gezeigten Ausführungsform ist der Lichtdetektor 62 bezüglich der Detektionssystemlinse 46 entlang der zweiten optischen Achse 64 auf der gegenüberliegenden Seite der Iris 60 positioniert.
Während des Autofokussierens tritt der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch die Iris 60 hindurch und wird mit maximaler Intensität zu dem Detektor übertragen, wenn die Probenebene 16 in der Entfernung f1 von der Objektivlinse positioniert ist. Bei dieser Position wird ein Bild in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 erzeugt. Das Bild wird somit direkt auf die Iris 60 erzeugt, wie in den durchgezogenen Linien von 3B gezeigt. Die Intensität des vom Lichtdetektor 62 gemessenen Lichts ist somit auf ihrem Spitzenwert, weil der Autofokussierungslichtstrahl 40 im wesentlichen durch die Apertur der Iris 60 hindurchtritt. Bei dieser Position wird bestimmt, daß die Probenebene durch das optische System 10 ordnungsgemäß fokussiert wird.
Wenn die Probenebene 16 von der in 3A gezeigten Position wegbewegt wird, verläuft der Autofokussierungslichtstrahl 40 von der (in 3B gestrichelt gezeigten) Detektionssystemlinse 46 nicht direkt ohne störende Effekte durch die Iris. Der Strahl schneidet an einem Punkt „X", der in einer Entfernung d3 von der Iris positioniert ist. Für eine gegebene Verschiebung d1 der Probenebene 16 von der gewünschten Referenzebene (beispielsweise der Referenzebene 23 in einer Entfernung f1 von der Objektivlinse 14, wie in 1–2 gezeigt) gibt es somit eine entsprechende Verschiebung d3 der Detektionsbildebene 66 aus der Ebene der Iris 60, wie am besten in 3B gezeigt. Wenn sich die Detektionsbildebene 66 in einer Entfernung von der Iris befindet, ist die Intensität des vom Lichtdetektor gemessenen Lichts geringer, weil nicht der ganze Autofokussierungslichtstrahl durch die Irisapertur hindurchtritt.
3C zeigt zwei graphische Darstellungen, die das zum Berechnen von d3 durch den Lichtdetektor 60 verwendete Verfahren darstellen. Die obere graphische Darstellung (mit i bezeichnet) veranschaulicht die vom Detektor gemessene Intensität des Lichts (I) über der Funktion der Verschiebungsentfernung d3. Die untere graphische Darstellung (mit ii bezeichnet) veranschaulicht die Ableitung der vom Detektor gemessenen Intensität des Lichts (I) über der Verschiebungsentfernung d3. Wie durch die graphischen Darstellungen in 3C gezeigt wird das von dem Lichtdetektor gemessene Licht sein Maximum aufweisen, wenn die Entfernung d3 Null ist. Durch die Messungen des Lichtdetektors 62 wird die Verschiebungsentfernung d2 auf der Basis der Intensität des durch die Iris hindurchtretenden Lichtstrahls bestimmt.
In der Ausführungsform der 3A und 3B kann es möglicherweise schwierig sein, zwischen einem negativen und positiven d3 zu unterscheiden (d.h. einem entweder über oder unter der Iris in 3A–3C fokussierten Strahl), weshalb bevorzugt wird, daß das System moduliert wird, um dieses potentielle Problem zu lösen. Folglich moduliert das Autofokussierungsdetektionssystem des in 3A–3C gezeigten Beispiels bevorzugt die Entfernung d1 mit einer kleinen Amplitude. Die Modulation führt zu einer Änderung in der Intensität des Lichts, die proportional ist zu der Ableitung der Intensität (I). Der Abstand zwischen der Probenebene 16 und der Objektivlinse 14 wird bevorzugt so justiert, daß die Änderung der Intensität Null ist, wie in der unteren graphischen Darstellung von 3C gezeigt. Der Wert für d3 wird dann an einen Rückkopplungscontroller zurückgeschickt, wie unten beschrieben wird.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß das Autofokussierungsdetektionssystem die Autofokussierung auf der Basis des berechneten Werts für die Verschiebung d2 der Bildebene 20 von der gewünschten Bildebene 26 durchführt (siehe 1–2). Das Autofokussierungsdetektionssystem mißt den Wert für d3 direkt. Das optische System 10 und das Autofokussierungssystem 50 können so konfiguriert sein, daß eine Messung für d3 direkt in einen Wert für d2 konvertiert werden kann. Das heißt, der Wert für d2 kann so gesetzt werden, daß er in direkter Beziehung zu d3 steht. Beispielsweise können die Linsen des Abbildungssystems und des Autofokussierungssystems so positioniert sein, daß d2 gleich d3 ist. Alternativ können die Linsen so positioniert sein, daß der Wert von d2 proportional zum Wert von d3 ist. Bei einer weiteren möglichen Konfiguration sind die Linsen so positioniert, daß der Wert für d2 durch eine empirische Berechnung auf der Basis von d3 direkt berechnet werden kann. Bei einer weiteren möglichen Konfiguration kann der Wert für d2 auf der Basis einer Menge von Datenpunkten oder einer Karte bestimmt werden. Bei jeder dieser Optionen ist der gemessene Wert für d3 repräsentativ für den Wert für d2. Deshalb kann das Autofokussierungssystem 50 den Grad, um den die Bildebene 20 außer Fokus ist, detektieren, ohne daß die tatsächlichen Charakteristiken des auf der Bildoberfläche ausgebildeten Bilds analysiert werden müssen. Dies verbessert die Geschwindigkeit und Effizienz der Autofokussierungsoperation der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren und die Struktur zum Fokussieren der Objektivlinse auf die Probenebene infolge der obigen Messung wird unten ausführlicher beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält die Vorrichtung ein Fokussierungskorrektursystem 34. Wie hierin verkörpert und in 3A gezeigt enthält das Fokussierungskorrektursystem 34 einen Rückkopplungscontroller 70 und eine Fokusjustiereinrichtung 72. Der Rückkopplungscontroller 70 kann, wie in der Technik bekannt ist, ein analoger oder digitaler Rückkopplungscontroller sein. Der Rückkopplungscontroller 70 empfängt ein Signal von dem Lichtdetektor 62 entsprechend der Verschiebungsentfernung d3 und erzeugt eine Rückkopplungsspannung, die dann an eine Fokusjustiereinrichtung 72 gesendet wird.
Die Fokusjustiereinrichtung 72 kann eine von mehreren verschiedenen Arten sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform justiert die Fokusjustiereinrichtung 72 die Position der Objektivlinse 14 relativ zur Probenebene 16. Bei einer weiteren Ausführungsform justiert die Fokusjustiereinrichtung 72 die Position der Probenebene 16 relativ zur Objektivlinse 14. Jede Art von Einrichtung (die Position der Objektivlinse justierend oder die Position der Probenebene justierend) ist so ausgelegt, daß das optische System so positioniert wird, daß die Probenebene schnell scharf gestellt werden kann und von der Probenebene ein scharfes Bild angefertigt werden kann. Eine typische Einrichtung, um diese Art kleiner Verschiebungen zu vermitteln, ist ein Piezopositionierer. Bei dem in 3A gezeigten Beispiel modifiziert die Fokusjustiereinrichtung 72 die Position der Objektivlinse 14 derart, daß sie sich in der gewünschten Brennweite f1 von der Probenebene 16 befindet. Infolgedessen wird die Bildebene 20 des optischen Systems so in Fokus versetzt, daß sich die Werte für d2 und d3 Null annähern. Wenn das Autofokussierungsdetektionssystem 50 für d3 einen Wert berechnet, der über einem vorbestimmten Schwellwert liegt, kann das Fokussierungskorrektursystem 34 wieder betätigt werden, bis die Probenebene in Fokus versetzt ist. Diese Operation wird in einer kürzeren Zeitdauer durchgeführt, da das vorliegende System nicht die Charakteristiken des Bilds analysiert, wie dies in anderen Systemen passiert.
Eine weitere Ausführungsform einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den 4A, 4B und 4C gezeigt. Die in 4A und 4B gezeigte Struktur ist ähnlich dem Beispiel von 3A und 3B mit Ausnahme der Positionierung der Iris. Die folgende Erörterung konzentriert sich auf die Struktur und das Verfahren, das anders ist als bereits bezüglich der 3A und 3B beschrieben. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 78 des in den 4A–4C gezeigten Beispiels enthält eine Iris 80 und einen Lichtdetektor 84. Bei der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 78 der 4A–4C wird die Iris 80 in einer Entfernung, die nicht der Brennweite f3 entspricht, von der Detektionssystemlinse 46 plaziert. Das heißt, die Iris ist von der Referenzebene 82 (in 4A gestrichelt gezeigt) beabstandet, die sich in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 befindet. Wie in 4B ersichtlich, ist die Autofokussierungseinrichtung so ausgelegt, daß die Iris 80 parallel zu der Referenzebene 82 und durch einen Abstand d3 getrennt plaziert wird.
Wie in 4B gezeigt ist die Iris 80 in einer Entfernung von f2 minus der Entfernung d3 von der Detektionssystemlinse 46 positioniert. Im allgemeinen wird bei dem System der 4A–4C, wenn der Lichtdetektor 84 eine gewisse vorbestimmte Intensität mißt, die Oberfläche der Probe scharf sein. Falls es jedoch Fluktuationen beim Reflexionsvermögen der Oberfläche gibt, oder falls die Leistung der Lichtquellen fluktuiert, kann die von dem Lichtdetektor gemessene Intensität auch fluktuieren, obwohl die Probenebene immer noch scharf ist. Die Genauigkeit des Autofokusdetektionssystems kann somit durch die Stabilität der Lichtquellen und die Gleichförmigkeit des Reflexionsvermögens der Probenebene begrenzt sein. Selbst wenn es Fluktuationen bei der Stabilität der Lichtquellen oder beim Oberflächenreflexionsvermögen gibt, wird das Verhältnis zwischen der vom Detektor gemessenen Lichtleistung und der Lichtquellenleistung von diesen Fluktuationen nicht beeinflußt.
Um bleibige potentielle Probleme zu minimieren, die auf diese Fluktuationen zurückgehen, kann das Autofokussierungssystem des zweiten Beispiels weiterhin einen dritten Autofokussierungsstrahlteiler 90 und einen zweiten Lichtdetektor 92 enthalten, wie in 4B gezeigt. Wie in 4D gezeigt ist der dritte Autofokussierungsstrahlteiler 90 zwischen der Detektionssystemlinse 46 und der Iris 80 entlang der zweiten optischen Achse 64 positioniert. Der zweite Lichtdetektor 92 ist versetzt von der zweiten optischen Achse 64 positioniert, wie beispielsweise in 4B gezeigt. Der zweite Lichtdetektor 92 könnte auch an anderen Orten angeordnet sein.
Der dritte Autofokussierungsstrahlteiler 90 ist so konfiguriert, daß er einen gewissen Prozentsatz der Autofokussierungslichtstrahlintensität zum zweiten Lichtdetektor 92 abtrennt, beispielsweise 50%. Die Intensität (I2) des zu dem zweiten Lichtdetektor 92 abgetrennten Lichts ist proportional zu der von der Ebene 16 reflektierten Gesamtintensität. Die übrigen 50% des Lichts gehen zur Iris 80. Ein Bruchteil dieser übrigen 50%, der zu der Iris 80 geht, wird vom ersten Lichtdetektor 84 detektiert. Das Verhältnis der vom ersten Lichtdetektor 84 detektierten Lichtintensität (I1) zu der vom zweiten Lichtdetektor 92 detektierten Lichtintensität (I2) wird dann direkt zum Berechnen des Werts d3 verwendet. Über diese Anordnung werden Fluktuationen bei der Intensität der Lichtstrahlen und dem Reflexionsvermögen der Probenebene berücksichtigt. Alternativ könnte die Iris durch ein Diodenarray ersetzt werden, das dort positioniert ist, wo in 4A und 4B die Iris gezeigt ist. Das Autofokussierungsdetektionssystem 32 enthält ein Fokussierungskorrektursystem 34 ähnlich den für die 3A–3C beschriebenen.
Eine weitere Ausführungsform einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den 5–7 gezeigt. Die folgende Erörterung konzentriert sich auf die Struktur und das Verfahren, das anders ist als bereits bezüglich 3A und 3B beschrieben. Die Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98 der 5–7 enthält ein Prisma oder eine Linse, um den zurückkehrenden Autofokussierungslichtstrahl der Wellenlänge λa zu Punkten auf einer Oberfläche abzulenken, die sich in eine Entfernung f3 von der Detektionssystemlinse befinden. Wie in den 5–7 gezeigt ist zwischen der Detektionssystemlinse 46 und einer Detektionsoberfläche 102 ein Prisma 100 vorgesehen. Das Prisma 100 lenkt den zurückkehrenden Autofokussierungslichtstrahl auf die Detektionsoberfläche 102 ab, die sich in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 befindet. Die in 5 gezeigte Brennweite f3 entspricht der Brennweite der Kombination aus der Detektionssystemlinse 46 und dem Prisma 100. Die Auswahl der Brennweite f3 wird unten erörtert.
Das Autofokussierungsdetektionssystem 98 enthält weiterhin Diodenpaare. Diodenpaare wie etwa 104 und 106 können auf beiden Seiten der optischen Achse 64 auf der Detektionsoberfläche 102 positioniert sein, wie in 5 gezeigt. Bei dem in den 5–7 gezeigten Beispiel enthält das erste Diodenpaar 104 eine erste Diode 108 und eine zweite Diode 110, und das zweite Diodenpaar 106 enthält eine dritte Diode 112 und eine vierte Diode 114. In den 5–7 sind das die erste und zweite Diode 108 und 110 enthaltende Diodenpaar 104 auf der linken Seite der zweiten optischen Achse 64 positioniert, wie in 5 gezeigt, und das die dritte und vierte Diode 112 und 114 enthaltende zweite Diodenpaar 106 sind auf einer rechten Seite der zweiten optischen Achse 64 positioniert.
Die 5, 6A und 7A veranschaulichen Aspekte der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98, wenn die Probenebene 16 in der Brennweite f1 von der Objektivlinse liegt, so daß das resultierende Bild der Bildebene 20 scharf ist. Wenn die Probenebene 16 für das Fokussieren ordnungsgemäß liegt, wird der in Richtung auf die Detektionssystemlinse 46 gerichtete Autofokussierungslichtstrahl in der Regel kollimiert, wie in 6A gezeigt. Die Detektionssystemlinse 46 projiziert dann den Autofokussierungslichtstrahl zum Prisma 100 wie etwa dem in 5 und 6A gezeigten. Bei dem gezeigten Beispiel wird der Autofokussierungslichtstrahl von dem Prisma 100 in einen ersten Lichtstrahl 118 und einen zweiten Lichtstrahl 120 aufgeteilt.
Wenn die Ebene 16 zum Fokussieren ordnungsgemäß positioniert ist, wird der erste Lichtstrahl 118 genau auf die in der Brennweite f3 von der Detektionssystemlinse 46 liegende Detektionsoberfläche 102 fokussieren, wie in 5 und 6A gezeigt. Der erste Lichtstrahl 118 wird einen ersten Lichtfleck 122 in der Mitte zwischen der ersten Diode 108 und der zweiten Diode 110 erzeugen, wie am besten in der Vorderansicht der Dioden in 7A gezeigt. Der zweite Lichtstrahl 120 erzeugt einen zweiten Lichtstrahl 124 in der Mitte zwischen der dritten Diode 112 und der vierten Diode 114, wie am besten in 7A gezeigt. Die Lichtflecken auf den Dioden werden relativ klein sein, da jeder Lichtstrahl an der Detektionsoberfläche 102 ein Minimum ist. Die Probenebene wird ordnungsgemäß fokussiert sein, wenn die Lichtflecken wie in 7A gezeigt erzeugt werden.
6B und 7B veranschaulichen Aspekte des Detektionssystems, wenn die Probenebene 16 weiter weg als die Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 liegt. Wenn die Probenebene 16 zu weit weg von der Objektivlinse liegt, wird der zurückkehrende Autofokussierungslichtstrahl in der Regel nicht-kollimiert sein (wie in 6B gezeigt). Die Detektionssystemlinse 46 projiziert dann den Autofokussierungslichtstrahl zu dem Prisma, wo der Strahl in den ersten und zweiten Lichtstrahl 118 beziehungsweise 120 aufgeteilt wird. Bei der in 6B gezeigten Ausführungsform weist der ersten Lichtstrahl 118 einen kleinsten Durchmesser auf und bildet eine (gestrichelt gezeigte) Bildebene 130 an einem Punkt y1, der in einer Entfernung d3 von der Detektionsoberfläche 102 liegt (auch als die gewünschte Bildebene bezeichnet). Weil der erste Lichtstrahl 118 an der Detektionsoberfläche 102 keinen kleinsten Durchmesser aufweist, ist der auf den Dioden ausgebildete Lichtfleck 122 relativ größer als der in 7A gezeigte Lichtfleck. Wie in 6B und 7B gezeigt weist der zweite Lichtstrahl 120 einen kleinsten Durchmesser bei der Bildebene 130 an einem Punkt y2 auf, der in der Entfernung d3 von der Detektionsoberfläche 102 liegt. Wie in 7B gezeigt bewegen sich die Lichtflecke 122 und 124 relativ zu den Lichtflecken von 7A nach innen.
Wenn die Probenebene wie oben beschrieben zu weit weg von der Objektivlinse liegt, werden die Lichtflecken 122 und 124 in erster Linie auf der zweiten Diode 110 beziehungsweise der dritten Diode 112 ausgebildet, wie am besten in 7B gezeigt. Das Autofokussierungsdetektionssystem mißt den Intensitätswert an jeder der Dioden und bestimmt den Verschiebungswert d3 des Autofokussierungslichtstrahls von der Referenzoberfläche 102. Der Rückkopplungscontroller 70 sendet dann ein Rückkopplungsspannungssignal an das Fokuskorrektursystem 72, um den Abstand zwischen der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16 zu justieren, wie oben erörtert. Die Ebene 16 wird ordnungsgemäß fokussiert sein, wenn die Summe der an der ersten und vierten Diode gemessenen Intensität gleich der Summe der an der zweiten und dritten Diode gemessenen Intensität ist.
Die 6C und 7C veranschaulichen Aspekte der Autofokussierungsdetektionseinrichtung 98, wenn die Ebene 16 in einer geringeren Entfernung als die Brennweite f1 von der Objektivlinse 14 liegt. Wenn die Oberfläche zu nahe an der Objektivlinse liegt, wird der zurückkehrende Autofokussierungslichtstrahl ebenfalls in der Regel nicht-kollimiert sein (wie in 6C gezeigt). Bei der in 6C gezeigten Ausführungsform weist der erste Lichtstrahl 118 einen kleinsten Durchmesser auf und bildet eine Bildebene 132 an einem Punkt z1, der in einem Abstand d3 hinter der Detektionsoberfläche 102 liegt (gewünschte Bildebene). Der auf den Dioden ausgebildete Lichtfleck 122 ist relativ größer als der in 7A gezeigte Lichtfleck, da der Lichtstrahl 118 noch nicht einen kleinsten Durchmesser aufweist, wenn er auf die Detektionsoberfläche 102 auftrifft. Der zweite Lichtstrahl 120 schneidet und bildet eine Bildebene an einem Punkt z2, die ebenfalls in dem Abstand d3 hinter der Detektionsoberfläche 102 liegt, wie in 7C gezeigt. Wie in 7C gezeigt bewegen sich die Lichtflecken 122 und 124 von der zweiten optischen Achse 64 relativ zu den Lichtflecken von 7A nach außen. Die Lichtflecken 122 und 124 werden in erster Linie auf der ersten Diode 108 beziehungsweise der zweiten Diode 114 ausgebildet, wie am besten in 7C gezeigt.
Bei der oben erörterten Anordnung sollte die Brennweite der Detektionssystemlinse 46 und des Prismas 100 so ausgewählt sein, daß die Lichtflecken 122 und 124 von den Dioden detektiert werden können. Die Lichtflecken sollten eine geeignete Größe aufweisen, so daß die Diodenpaare präzise Ablesungen der Lichtintensität vornehmen können. Bei einer typischen Diodenanordnung lassen sich die Lichtflecken detektieren, wenn sie eine Größe von etwa 10 μm aufweisen. Diodenarrays mit einer Pixelgröße von etwa 5 μm sind bekannt. Bei Anwendungen mit fragmentierten Diodenanordnungen wie etwa in 5–7 (und 8) gezeigt, können Strahlverschiebungen in der Größenordnung von 0,1 μm gemessen werden. Dies entspricht einer Genauigkeit der Brennweite f1 und einem Positionieren der Probenebene mit weniger als 1,0 μm bei einem Beispiel des Autofokussierungssystems.
Das Fokussierungskorrektursystem 34 der 5–7 arbeitet wie bereits beschrieben, um das optische System schnell auf die Probenebene 16 zu fokussieren und ein scharfes Bild zu erhalten.
Eine weitere Ausführungsform einer Autofokussierungsdetektionseinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den 8A–8D gezeigt. Bei diesem Beispiel enthält das Autofokussierungsdetektionssystem 108 eine Detektionssystemlinse, die der bereits beschriebenen ähnlich ist, sowie eine Zylinderlinse und eine Vierer-Fotodiode. Wie hierin verkörpert und in 8A–8D gezeigt wird eine Zylinderlinse 140 zwischen der Detektionslinse 46 und einer Detektionsoberfläche 142 mit einer Vierer-Fotodiode 144 plaziert. Die Detektionsoberfläche 142 liegt bevorzugt genau in der Brennweite f3 der Detektionssystemlinse 46. Wie in 8B dargestellt enthält die Vierer-Fotodiode 144 ein erstes, zweites, drittes und viertes Diodensegment 146, 148, 150 beziehungsweise 152. Die Detektionssystemlinse 46 und die Zylinderlinse 140 projizieren den Autofokussierungslichtstrahl auf die Detektionsoberfläche 142, um auf der auf der Detektionsoberfläche 142 liegenden Viererdiode 144 einen Lichtfleck 154 auszubilden.
Die Viererdiode 144 bestimmt die Verschiebung d3 des Bildes relativ zur Detektionsoberfläche 142 durch Messen der Lichtintensität an jedem der vier Diodensegmente 146, 148, 150 und 152. Die Zylinderlinse 140 ändert die Gestalt eines Lichtflecks 154 in Abhängigkeit von der Position der Probenebene relativ zur Objektivlinse. 8B veranschaulicht die Position des Lichtflecks 154, wenn die Probenebene 16 ordnungsgemäß in der Entfernung f1 von der Objektivlinse 14 positioniert ist. Der Lichtfleck wird im wesentlichen in der Mitte der vier Dioden liegen. 8C veranschaulicht die Position des Lichtflecks, wenn die Probenebene 16 in einer Entfernung von der Objektivlinse 14 positioniert ist, die kleiner ist als die Brennweite f1. Der Lichtfleck wird ellipsenförmig sein, wobei der größte Teil des Lichtflecks auf dem zweiten Diodensegment 148 und dem dritten Diodensegment 150 liegt, wie in 8C gezeigt. Auf der Basis der gemessenen Intensität der Diodensegmente berechnet der Rückkopplungscontroller 70 die Entfernung d3 des Bildes relativ zur Detektionsoberfläche 142.
8D veranschaulicht die Position des Lichtflecks, wenn die Probenebene in einer Entfernung von der Objektivlinse 14 positioniert ist, die größer ist als die Brennweite f1. Der Lichtfleck wird ellipsenförmig sein, wobei der größte Teil des Lichtflecks auf dem ersten Diodensegment 146 und dem vierten Diodensegment 152 liegt.
Bei diesem Beispiel erzeugt der Rückkopplungscontroller 70 ein Signal, das an die Fokusjustiereinrichtung geschickt werden soll, um den Abstand zwischen der Objektivlinse 14 und der Probenebene 16 auf eine weise zu steuern, ähnlich der für die ersten drei Beispiele beschriebenen.
Das Autofokussierungssystem der vorliegenden Erfindung eignet sich für einen großen Bereich von Anwendungen zusätzlich zu den oben beschriebenen Beispielen. Die Auswahl und die Anordnung der Lichtquellen hängt von der Art von Mikroskopie ab, die gewählt wird. Obgleich das oben beschriebene Autofokussierungssystem in erster Linie bezüglich Fluoreszenzmikroskopie erörtert wird, eignet sich die vorliegende Erfindung auch für andere Arten von Mikroskopie wie etwa Durchlichtbeleuchtungs- und Lumineszenzabbildungsmikroskopie.
Bei der Durchlichtbeleuchtungsmikroskopie tritt die Beleuchtungsquelle auf eine in der Technik bekannte Weise von der linken Seite der Probenebene ein. Der Strahlteiler 12, wie in den Figuren gezeigt, wird nicht länger benötigt. Bei der Beleuchtungsquelle kann es sich um eine Lampe mit einem breiten Spektrum (d.h. sichtbaren Spektrum), eine durch einen engen Bandpaßfilter gefilterten Lampe oder einen Laserstrahl handeln. Bei einem Durchlichtbeleuchtungssystem kann es wünschenswert sein, zwischen Strahlteiler 44 und Bildlinse 18 in 3A entsprechende Filter hinzuzufügen. Dies hilft zu verhindern, daß irgendein Teil des Autofokussierungslichtstrahls durch den Strahlteiler 44 austritt. Wenn als Anregungsstrahl sichtbares Licht gewählt wird, kann der Lichtstrahl des Autofokussierungssystems im Infrarotbereich gewählt werden. Bei einem Beispiel mit einem schmalen Anregungsspektrum um 550 nm kann für das Autofokussierungssystem ein Lichtstrahl von etwa 633 nm verwendet werden. Diese Werte sind nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben.
Bei der Lumineszenzabbildungsmikroskopie emittiert das Objekt Licht, ohne daß ein Anregungsstrahl erforderlich wäre. Wie bereits beschrieben wird ein Strahlteiler wie etwa der Strahlteiler 12 in 3A nicht länger benötigt. Die Wellenlänge des Autofokussierungslichtstrahls wird bevorzugt so gewählt, daß sie weit genug weg liegt von der Lumineszenzwellenlänge der Probenebene. Bei einer derartigen Anordnung kann Umgebungslicht die Beleuchtung der Oberfläche unterstützen. Das Objekt selbst kann bei Lumineszenzabbildungsmikroskopie als die Quelle der Beleuchtung bezeichnet werden.
Wie oben erörtert wird als Beleuchtungslichtquelle in der Regel eine Lampe oder ein Laser verwendet. Falls eine Lampe gewählt wird, werden Filter hinzugefügt, um das für die Anwendung erforderliche Spektrum auszuwählen. Falls ein Laser gewählt wird, hängt die Art des Lasers von der für die spezifische Anwendung benötigten Wellenlänge und Leistung ab. Zu Lasern, die sich besonders für die vorliegende Erfindung eignen, zählen beispielsweise Ar⁺- und Kr⁺-Laser. Diese Laser können in der Regel Licht mit mehreren diskreten Wellenlängen über das Spektrum hinweg emittieren und sind für den Einsatz bei einer großen Zahl von Anwendungen sehr vielseitig. Auch andere Arten von Lasersystemen wie etwa OPO-Systeme (Optical Parametric Oscillator) eignet sich für die vorliegende Erfindung.
Bei allen oben beschriebenen Autofokussierungstechniken kann die Probenebene entweder auf der äußeren Oberfläche der Probe oder auf einer Ebene auf der Innenseite der Probe liegen. Bei einer für die vorliegende Erfindung geeigneten Technik wird die Probenoberfläche als Referenz verwendet und der auf die Probe gerichtete Lichtstrahl wird um ein bestimmtes Ausmaß versetzt, um auf einer Ebene in der Probe zu scannen (oder zu fokussieren). Diese Technik eignet sich insbesondere zum Fokussieren auf die Innenseite einer Zelle.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Objektebene in einem Mikroskop bereitgestellt. Allgemein zählen zu Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen: Erzeugen eines Autofokussierungslichtstrahls; Lenken des Autofokussierungslichtstrahls gegen die zu untersuchende Objektebene und Reflektieren des Autofokussierungslichtstrahls von der Objektebene weg. Der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl wird dann zu einem Detektionssystem gelenkt, wo mindestens ein Lichtdetektor oder Sensor des Detektionssystems den reflektierten Autofokussierungslichtstrahl erfaßt. Danach wird das Ausmaß der Verschiebung der Bildebene des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls von einer gewünschten Referenzebene auf der Basis des erfaßten Autofokussierungslichtstrahls bestimmt. Mit diesen Informationen kann auf die Objektebene fokussiert werden, um ein ordnungsgemäß fokussiertes Bild zu erzeugen.
Bei Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen, kann der Schritt des Erfassens das Übertragen des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls zumindest teilweise durch eine Apertur einer Iris und das Messen der Lichtintensität des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls, der durch die Apertur übertragen wird, mit dem Lichtdetektor oder Sensor des Detektionssystems beinhalten. Alternativ kann bei Verfahren, die mit den Prinzipien der Erfindung übereinstimmen, der Schritt des Bestimmens das Vergleichen der Lichtintensitäten des von mehreren der Lichtdetektoren oder Sensoren detektierten reflektierten Autofokussierungslichtstrahls beinhalten.
Anhand eines nicht-einschränkenden Beispiels veranschaulicht 9 ein Verfahren, das mit den Aspekten der Erfindung übereinstimmt, zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Objektebene in einem Mikroskop. Die Ausführungsform von 9 kann mit den Autofokussierungssystemen und -merkmalen implementiert werden, die in Verbindung mit 3–4 erörtert sind. Wie in 9 dargestellt wird ein Autofokussierungslichtstrahl bei Schritt 300 erzeugt. Beispielsweise kann der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch eine Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 erzeugt werden, wie in 3–4 gezeigt. Als nächstes wird bei Schritt 310 der Autofokussierungslichtstrahl zu einer Objektebene wie etwa der Objektebene 16 in den 3–4 gelenkt. Danach wird in Schritt 320 der Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektebene wegreflektiert und zu einem Ablenksystem wie etwa dem Ablenksystem 32 in 3A gelenkt. Der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl wird dann in Schritt 330 durch eine Iris des Detektionssystems übertragen. Beispielsweise wird in 3A der Autofokussierungslichtstrahl 40 durch die Iris 60 übertragen.
Wie weiter in 9 gezeigt wird der Autofokussierungslichtstrahl nach seinem Übertragen durch die Iris des Detektionssystems bei Schritt 340 mit einem Lichtdetektor oder Sensor des Detektionssystems erfaßt. Um diesen Schritt zu implementieren, kann ein Lichtdetektor ausgewählt werden, wie etwa ein beliebiger der Vielzahl von in den 3–4 gezeigten Arten. Außerdem kann zum Implementieren von Schritt 330 eine Iris wie die in 3–4 gezeigte vorgesehen sein. Beispielsweise wird bei der Ausführungsform von 3A der Lichtdetektor 62 neben der Apertur der Iris 60 positioniert, und die Iris wird ungefähr in der Brennweite von der Detektionssystemlinse positioniert. Alternativ kann, wie in 4A gezeigt, die Iris 80 so positioniert werden, daß sie von der Brennweite von der Detektionssystemlinse 46 verschoben ist und ein Lichtdetektor 84 neben der Apertur der Iris positioniert ist.
Nach dem Erfassen der Lichtintensität des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls wird das Ausmaß der Verschiebung einer Bildebene von einer gewünschten Referenzebene bestimmt, wie in Schritt 350 von 9 dargestellt. Wieder kann mit den Merkmalen und Techniken, die oben bezüglich der 3–4 beschrieben sind, das Ausmaß der Verschiebung der Bildebene auf der Basis der erfaßten Lichtintensität des Autofokussierungslichtstrahls bestimmt werden. In Schritt 360 wird dann mit der bestimmten Verschiebung der Bildebene auf die Objektebene fokussiert, um ein ordnungsgemäß fokussiertes Bild zu erzeugen. Dazu können der Rückkopplungscontroller 70 und die Fokusjustiereinrichtung 72 der 3–4 verwendet werden, um den Abstand zwischen der Objektivlinse und der Proben- oder Objektebene zu justieren.
10 veranschaulicht ein weiteres Verfahren zum automatischen Fokussieren eines Bilds einer Objektebene in einem Mikroskop. Das Verfahren von 10 kann mit den oben bezüglich der 5–8 erörterten Autofokussierungssystemen und -merkmalen implementiert werden. Bei dem in 10 dargestellten Verfahren wird ein Autofokussierungslichtstrahl bei Schritt 400 erzeugt. Beispielsweise wird der Autofokussierungslichtstrahl 40 von einer Autofokussierungslichtstrahlquelle 39 erzeugt, wie in 5–8 gezeigt. In Schritt 410 wird der Autofokussierungslichtstrahl dann zu einer Objektebene wie etwa der Objektebene 16 gelenkt. Danach wird in Schritt 420 der Autofokussierungslichtstrahl 40 von der Objektebene weg reflektiert und auf ein Ablenksystem gerichtet. Wie bei Schritt 430 in 10 gezeigt wird dann bewirkt, daß der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl von mehreren Lichtdetektoren oder Sensoren erfaßt wird. Zum Implementieren der Schritte 420 und 430 kann eine Anordnung von Sensoren vorgesehen werden, wie in einer beliebigen der Ausführungsformen der 5–8 gezeigt. Beispielsweise kann in den 5–7 der reflektierte Autofokussierungslichtstrahl von einem Prisma 100 in zwei getrennte Lichtstrahlen 118 und 120 aufgeteilt werden, wobei die Lichtstrahlen von Paaren von Lichtdioden 104 und 106 detektiert werden. Alternativ kann, wie in 8A–8C gezeigt, der Autofokussierungslichtstrahl durch eine Zylinderlinse 140 übertragen und von einer Vierer-Fotodiode 144 erfaßt werden.
Wie weiter in 10 gezeigt werden nach dem Erfassen des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls mit den Sensoren die von den mehreren Sensoren erfaßten Lichtintensitätswerte bei Schritt 440 verglichen. Beispielsweise werden in 5–7 die Werte der von jeder der vier Dioden 108, 110, 112 und 114 erfaßten Lichtintensität verglichen. Alternativ werden, wie in 8A–8C gezeigt, die Werte der von jeder der vier Diodensegmente 146, 148, 150 und 152 erfaßten Lichtintensität verglichen. Nachdem die Lichtintensitätswerte verglichen sind, wird bei Schritt 450 das Ausmaß der Verschiebung einer Bildebene von einer gewünschten Referenzebene bestimmt. Zum Implementieren dieses Schritts können die oben bezüglich der 5–8 beschriebenen Merkmale und Techniken verwendet werden, um das Ausmaß der Verschiebung der Bildebene auf der Basis der verglichenen Werte der Sensoren zu bestimmen. Bei Schritt 460 wird mit der bestimmten Verschiebung der Bildebene dann auf die Objektebene fokussiert, um ein ordnungsgemäß fokussiertes Bild zu erzeugen. Zu diesem Zweck können der Rückkopplungscontroller 70 und die Fokusjustiereinrichtung 72 der 5–8 dazu verwendet werden, den Abstand zwischen der Objektivlinse und der Objektebene zu justieren.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ergibt sich aus der oben beschriebenen Vorrichtung. An den Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch andere Variationen vorgenommen werden.
Dieses Autofokusverfahren betrifft insbesondere Autofokusverfahren und -vorrichtungen, die sich zum Detektieren, Charakterisieren und Quantifizieren von in einem Fluid suspendierter teilchenförmiger Materie eignen. Insbesondere stellt die Erfindung ein Autofokussystem bereit zum Detektieren von Teilchen, insbesondere Zellen, die in einem Fluid, insbesondere einem biologischen Fluid, suspendiert sind. Genauer gesagt stellt die Erfindung eine Autofokusplattform zum Abbilden eines Assays auf der Basis der Affinitätsbindung bereit.
Die Entdeckung neuer Arzneimittel wird begrenzt durch den Durchsatz der Assays, die verwendet werden, um Verbindungen zu screenen, die möglicherweise gewünschte Effekte besitzen könnten. Insbesondere erfordert das Screening der größten Anzahl verschiedener Verbindungen, die mit jedem Screen assoziierten Zeit- und Arbeitsanforderungen zu reduzieren. In vielen Fällen sind Reaktionsvolumina sehr klein, um die kleinen Mengen der Testverbindungen zu berücksichtigen, die zur Verfügung stehen. Das Mikroskopscreening derartiger kleiner Probenvolumina führt zu mit unscharfen Bildern assoziierten fehlerhaften Ergebnissen. Da diese Bilder im allgemeinen die einzigen Meßergebnisse sind, wird daran eine weitere Untersuchung wie etwa Computerberechnungen vorgenommen.
Bei High-Throughput-Screening-Tests, ist die Geschwindigkeit, um einen Autofokus zu erhalten und beizubehalten, ein wichtiger Faktor. Bei vielen Ausführungsformen sind die Proben in standardmäßigen Mikrotiterplatten mit mehreren Vertiefungen enthalten, wobei jede Platte ein Array von Vertiefungen enthält, wie etwa solchen mit 96, 384, 1536 oder höheren Anzahlen an Vertiefungen. Zur Kompatibilität mit gegenwärtigen automatisierten Lade- und Roboterhandlingsystemen werden standardmäßige 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten verwendet, die 86 mm mal 129 mm groß sind bei Vertiefungen mit einem Durchmesser von 6 mm und einer Teilung von 9 mm. Andere bekannte Mikroplatten sind in der Regel 20 mm mal 30 mm groß mit Zellenorten, die eine Abmessung von etwa 100 bis 200 Mikrometer und eine Teilung von etwa 500 Mikrometer aufweisen. Beide Ausdrücke „Vertiefung" und „Mikrovertiefung" beziehen sich üblicherweise auf einen spezifischen Ort in einem Array beliebiger Konstruktion, an dem Zellen haften und innerhalb dessen die Zellen abgebildet werden.
Auf Wunsch des Benutzers können Softwareprozeduren bereitgestellt werden, um Bewegungen in einer Z-Achse durch eine Reihe unterschiedlicher Positionen zu erhalten, erfaßt ein Bild an jeder Position und findet das Maximum eines berechneten Fokus, das den Kontrast jedes Bilds schätzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein verbessertes Mikroskop, das eine Autofokussierungvorrichtung zum Betrachten einer Probenebene umfaßt. Die Autofokussierungsvorrichtung, wie in Kombination mit 1–10 erläutert, kann innerhalb oder außerhalb des Mikroskopgehäuses enthalten sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Mikroskop mehrere entlang einer optischen Hauptachse positionierte Linsen, einen Sondenarm, der die mehreren Linsen trägt, einen Träger, auf dem eine zu untersuchende Probenebene plaziert wird, und eine optische Ausgabeeinrichtung zum Erzeugen eines Bilds der Probenebene auf einer Bildebene. Bei der gezeigten Ausführungsform ist die optische Hauptachse entfaltet und verläuft im wesentlichen entlang einer einzelnen Ebene. Wie hierin verkörpert und in den 11–12 gezeigt enthält das Mikroskop 200 einen Sondenarm 213. Eine Reihe von Linsen und andere optische Einrichtungen sind entlang der optischen Hauptachse 202 positioniert. Bei dem in 11 gezeigten Beispiel enthält die Reihe von Linsen ein Emissionsfilter 204, eine Tubuslinse 206, einen Beleuchtungseintritt 208, eine Übertragungslinse 210 und eine mit Corpuslinse 212. Entlang der optischen Hauptachse im Sondenarm 213 kann eine beliebige Vielfalt optischer Einrichtungen positioniert sein.
Bei dem in 11 gezeigten Beispiel ist ein einfacher reflektierender Spiegel 214 in Richtung des Endes des Sondenarms am nächsten bei dem zu scannenden Objekt positioniert. Die Oberfläche des Spiegels 214 ist relativ zu der optischen Hauptachse 202 so abgewinkelt, daß die Lichtstrahlen entlang der optischen Hauptachse 202 zu einer Objektivlinse 220 und auf die Objektebene 216 reflektiert werden können. Bei dem in 11 gezeigten Beispiel ist der Spiegel 214 beispielsweise unter 45 Grad abgewinkelt, so daß das Licht von der Objektebene zurück zum Spiegel und entlang der optischen Hauptachse 202 reflektiert wird, um ein Bild auszubilden. Die Probe oder das Objekt, die oder das untersucht werden soll, kann direkt auf einer scannenden Oberfläche 221 entsprechend der Objektebene 216 plaziert sein. Die Objektoberfläche kann der Oberfläche des tatsächlichen Objekts oder einer Ebene innerhalb des Objekts entsprechen. Da diese Objekte oder Proben eine erhebliche Tiefe aufweisen können, kann die Geschwindigkeit des Autofokus durch ein Volumenbild weiter erhöht werden. Ein derartiges Volumenbild kann man erhalten, indem man ein Bildobjekt bei jeder Bildebene von mehreren Bildebenen betrachtet, wobei jede Bildebene vertikal bezüglich jeder anderen Bildebene verschoben ist. Alternativ kann die Objektoberfläche der scannenden Oberfläche 221 entsprechen, auf der die Probe plaziert wird. Die Proben (oder Objekte) können in Probenhalteeinrichtungen wie etwa einer oder mehreren, in 11 und 12 gezeigten Mikrotiterplatten 218 plaziert sein. Die Mikrotiterplatten 218 und die Proben werden von einem Träger 219 getragen wie in 12 gezeigt. Der Träger 219 ist an einem Scantisch 240 montiert und starr befestigt, der an einem ersten Tisch 242 angebracht ist. Der Träger 219 hält die Proben so, daß sie physisch von dem Mikroskop isoliert sind, und zwar aus Gründen, die unten erörtert werden. Die scannende Oberfläche 221 kann einen Tisch umfassen, der in einer X-, X-Y- oder X-Y-Z-Bewegung bewegt werden kann.
Das Mikroskop der in 11 gezeigten Ausführungsform enthält weiterhin einen zweiten einfachen reflektierenden Spiegel 222 am ganz links gelegenen Abschnitt der optischen Hauptachse 202 des Sondenarms 213. Das von dem zweiten einfachen reflektierenden Spiegel weg reflektierte Licht wird zu einem ersten Videoausgang 230 und einer ersten Videobrennebene 232 gelenkt. Das Mikroskop enthält auch einen zweiten Videoausgang 234 und eine Okularbaugruppe 236 mit einer Bildebene 238. Wie in der Technik bekannt ist, kann die Bildebene entweder eine Position sein, wo das Auge eines Betrachters plaziert wird, oder ein Platz, wo eine Kamera oder eine Bilddetektierungseinrichtung positioniert ist.
Das Mikroskop ist bevorzugt so konfiguriert, daß der Sondenarm 213 eine längliche Gestalt aufweist, wie in 11–12 gezeigt. Bewerkstelligt wird dies, indem der Sondenarm so entworfen wird, daß die optische Hauptachse 202 entfaltet ist. Die längliche Gestalt und die entfaltete Hauptachse besonders wünschenswert, um das Übertragen von Schwingungen von schwingungserzeugenden Strukturen neben dem Sondenarm aus Gründen auf ein Minimum zu reduzieren, die unten erörtert werden. Die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich auch für Mikroskopeinrichtungen, die das Bild des Objekts scannen. Während des Scannens erzeugen Scanmotoren in der Regel unerwünschte Schwingungen. Wenn der Scantisch mit den Scanmotoren auf oder an dem Sondenarm des Mikroskops plaziert ist, werden Schwingungen von den Motoren in der Regel auf das Mikroskop übertragen, was zu Bildern niedriger Qualität führt.
Das längliche Design des Mikroskops gestattet das Montieren des Mikroskops auf einem separaten Tisch von dem Tisch, auf den ein Scantisch montiert ist. Beispielhaft kann, wie in 12 gezeigt, der Scantisch 240 für ein Mikroskop auf den ersten Tisch 242 plaziert sein, und das Mikroskop 200 kann auf einem separaten Tisch 244 plaziert sein. Der erste Tisch 242 kann eine schwere oder robuste Tischstruktur sein, und der Scantisch 240 kann starr an der Oberfläche des ersten Tischs befestigt oder fixiert sein. Wie weiterhin in 12 gezeigt, können die Mikrotiterplatten 218 über die Trägerstruktur 219 an dem Scantisch 240 so getragen sein, daß die Platten physisch von dem Sondenarm 213 des Mikroskops isoliert sind. Auf diese Weise werden Schwingungen von dem Scantisch 240 nicht auf das Mikroskop 200 übertragen. Weil ein Mangel an Schwingungen am Mikroskop vorliegt, ist es deshalb leichter, entweder durch manuelle oder automatische Prozesse ein scharfes Bild der Probe zu erhalten.
In dem in 11–12 gezeigten Beispiel ist die optische Hauptachse 202 des Mikroskops so konfiguriert, daß sie parallel zur Objektebene 216 verläuft. Durch diese Konfiguration zusammen mit dem länglichen Sondenarm kann der Betrachter in einer substantiellen Entfernung von den Proben positioniert werden, die betrachtet werden. Dies kann besonders dann wünschenswert sein, wenn man es mit Proben zu tun hat, die toxische Chemikalien beinhalten, oder wenn die Proben in einem isolierten Raum oder einer isolierten Kammer plaziert werden müssen, die von dem Bereich entfernt ist, in dem sich der Betrachter befindet. Zudem kann die Optik geändert werden, ohne daß der isolierte Raum oder die isolierte Kammer betreten werden muß. Infolgedessen gestattet das verbesserte Mikroskop der vorliegenden Erfindung die Mikroskopie für einen größeren Bereich von Probenarten.
Der längliche Sondenarm und das Mikroskop von 11–12 weist auch andere Vorzüge auf. Beispielsweise gestattet der längere Sondenarm das Scannen größerer Objekte mit dem Mikroskop. Der längere Sondenarm gestattet auch, mehrere Objekte zugleich zu scannen, ohne den Scantisch zu entladen und wiederzubeladen. Zudem gestattet der längere Sondenarm, daß die Optik zugänglicher ist. Wegen des Designs ist es auch leichter, in den Sondenarm des Instruments zusätzliche Optik zu integrieren. Der längere Sondenarm gestattet auch das Aufnehmen zusätzlicher Hilfsmittel wie etwa des Autofokussystems der ersten Ausführungsform der Erfindung.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen und Variationen an den offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können hinsichtlich einer Vorrichtung zum automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine Objektebene, eines Verfahrens zum automatischen Fokussieren eines optischen Instruments auf eine Objektebene und eines Mikroskops zum Fokussieren auf eine Objektebene, Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und bei der Konstruktion dieser Vorrichtung, ohne von dem Schutzbereich oder Gedanken der Erfindung abzuweichen. Die Merkmale und Aspekte der offenbarten Ausführungsformen können kombiniert, modifiziert oder substituiert werden, um zusätzliche Vorteile und Merkmale bereitzustellen.
Während Merkmale der Erfindung unter Bezugnahme auf Autofokussierungs- und Beleuchtungslichtstrahlen offenbart werden, die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, um Simultanbetrieb zu gestatten, ist es beispielsweise natürlich auch möglich, Lichtstrahlen auszuwählen, die die gleiche oder eine ähnliche Wellenlänge aufweisen. In einem derartigen Fall können die Merkmale der Erfindung in einem asynchronen Modus implementiert werden, in dem der Autofokussierungslichtstrahl zu einem anderen Zeitpunkt von dem des Beleuchtungslichtstrahls erzeugt und angewendet wird. Es ist auch möglich, die Lichtstrahlen und Merkmale der Erfindung in einem asynchronen Modus ungeachtet der Wellenlängen der Lichtstrahlen zu implementieren (d.h. ungeachtet davon, ob der Autofokussierungslichtstrahl und der Beleuchtungslichtstrahl die gleiche oder andere Wellenlängen aufweisen).
Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich dem Fachmann bei Betrachtung der Spezifikation und der Ausübung der hier offenbarten Erfindung. Die Spezifikation und Beispiele sollen nur als beispielhaft angesehen werden, wobei der wahre Schutzbereich der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben wird.

Claims

Mikroskop, das sich für das High-Throughput-Screening eignet, umfassend: ein Abbildungssystem zum Erzeugen eines Bilds einer Objektebene (216) unter Verwendung eines Beleuchtungslichtstrahls (52) einer ersten Wellenlänge, umfassend mehrere Linsen (206), (210), (212), entlang einer optischen Hauptachse (202) des Mikroskops positioniert, und eine optische Ausgabeeinrichtung (230) zum Erzeugen eines Bilds der Objektebene auf der Bildebene (232); ein System zum automatischen Fokussieren des Bilds in dem Mikroskop, wobei das System zum automatischen Fokussieren folgendes umfaßt: einen Autofokussierungslichtstrahl (40) einer zweiten Wellenlänge, wobei der Autofokussierungslichtstrahl so gelenkt wird, daß er von der Objektebene (16) wegreflektiert wird; eine Autofokussierungsdetektionseinrichtung (50) mit einer Detektionssystemlinse (46) zum Empfangen des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls und Lenken des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls auf eine Detektionsoberfläche (142); mehrere Lichtsensoren (108, 110, 112, 114), die dafür ausgelegt sind, die Lichtintensität des reflektierten Autofokussierungslichtstrahls an der Detektionsoberfläche (142) zu messen, wobei der Weg, um den das Bild der Objektebene (216) von einer gewünschten Fokusreferenzoberfläche (23) verschoben wird, bestimmt wird durch Vergleichen der von den mehreren Sensoren gemessenen Intensitäten; dadurch gekennzeichnet, daß das Abbildungssystem weiterhin folgendes umfaßt: einen Sondenarm (213), der die mehreren Linsen trägt, wobei sich der Sondenarm im allgemeinen entlang der optischen Hauptachse (202) erstreckt; einen Scantisch (240) und einen Träger (219), auf dem ein Objekt mit der zu untersuchenden Objektebene (216) plaziert wird, wobei sich die Objektebene (216) im wesentlichen entlang einer Fokusebene erstreckt, die durch das Mikroskop beobachtet wird, und wobei die Objektebene (216) im wesentlichen parallel zur optischen Hauptachse (202) verläuft.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei der Scantisch (240) und der Träger (219) auf einem getrennten Tisch (242) als dem Tisch (244) des Sondenarms (213) des Mikroskops positioniert sind, so daß der Sondenarm (213) von von dem Scantisch (240) erzeugten Schwingungen im wesentlichen isoliert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–2, wobei der Sondenarm (213) zwischen dem zu untersuchenden Objekt und dem Scantisch (240) positioniert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der Sondenarm (213) im wesentlichen länglich ist, so daß die optische Ausgabeeinrichtung (230) von dem zu untersuchenden Objekt entfernt positioniert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Objekt in einer Probenhalteeinrichtung (218) wie etwa einer oder mehr als einer Mikrotiterplatten plaziert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Autofokussierungsdetektionseinrichtung (50) weiterhin ein zwischen der Detektionssystemlinse (46) und den mehreren Lichtsensoren (108, 110, 112, 114) positioniertes Prisma (100) umfaßt, wobei das Prisma (100) so konfiguriert ist, daß es den Autofokussierungsstrahl in mindestens zwei getrennte Strahlen (118), (120) unterteilt, wobei die mehreren Lichtsensoren mindestens zwei Sensorpaare (104, 106) umfassen, wobei das erste Sensorpaar (104) im wesentlichen auf einen ersten Lichtstrahl (118) von dem Prisma ausgerichtet ist, wobei das zweite Sensorpaar (106) im wesentlichen auf einen zweiten Lichtstrahl (120) von dem Prisma ausgerichtet ist, wobei die Sensorpaare die Intensität des Lichtstrahls messen, der auf jedes Sensorpaar auftrifft.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Abbildungssystem weiterhin eine Objektivlinse (14) umfaßt und wobei die Autofokussierungsdetektionseinrichtung weiterhin eine zwischen der Detektionssystemlinse (46) und den mehreren Lichtsensoren (108, 110, 112, 114) positionierte Zylinderlinse (140) umfaßt, wobei die Zylinderlinse (140) so konfiguriert ist, daß sie die Gestalt eines Lichtflecks auf den mehreren Dioden (108, 110, 112, 114) ändert, wenn sich die Entfernung zwischen der Objektebene (16) und der Objektlinse (14) des Abbildungssystems ändert.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–7, wobei die mehreren Lichtsensoren eine Vierer-Fotodiode (144) mit vier getrennten Diodensegmenten (146), (148), (150), (152) umfassen.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das System zum automatischen Fokussieren weiterhin einen Rückkopplungscontroller (70) und eine Fokusjustiereinrichtung (72) zum automatischen Justieren der Entfernung zwischen der Objektivlinse (14) und der Objektebene (16) auf der Basis des von den Lichtsensoren erfaßten reflektierten Autofokussierungslichtstrahls zum ordnungsgemäßen Fokussieren des Bilds in dem Abbildungssystem umfaßt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–9, wobei die Fokusjustierungseinrichtung (72) so konfiguriert ist, daß sie die Position der Objektivlinse (14) justiert, um das Abbildungssystem ordnungsgemäß auf die Objektebene (16) zu fokussieren.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–10, weiterhin mit einer zweiten optischen Achse (64), wobei die zweite optische Achse zwischen der Brennebene und der optischen Hauptachse (202) positioniert ist, wobei die zweite optische Achse im wesentlichen senkrecht zur optischen Hauptachse verläuft.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–11, weiterhin mit einer zwischen der optischen Hauptachse (202) und der Bildebene in der optischen Ausgabeeinrichtung positionierten dritten optischen Achse, wobei die dritte optische Achse unter einem Winkel relativ zur optischen Hauptachse konfiguriert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1–12, wobei der Beleuchtungslichtstrahl (52) und der Autofokussierungslichtstrahl (40) so gewählt sind, daß sie verschiedene Wellenlängen aufweisen, so daß die Lichtstrahlen einander nicht stören.