ES2256207T3 - Un microscopio adecuado para una seleccion de alto rendimiento, que tiene un aparato de autoenfoque. - Google Patents

Abstract

Un microscopio adecuado para la selección de alto rendimiento, que comprende: - un sistema de obtención de imágenes para crear una imagen de un plano (216) de objeto utilizando un haz (52) luminoso de iluminación de una primera longitud de onda, que comprende una pluralidad de lentes (206) (210) (212) situadas a lo largo de un eje (202) óptico principal del microscopio, y un dispositivo (230) de salida óptico para crear una imagen del plano de objeto sobre el plano (232) de imagen; - un sistema para enfocar automáticamente dicha imagen en dicho microscopio, comprendiendo dicho sistema para enfocar automáticamente: - un haz (40) luminoso de autoenfoque de una segunda longitud de onda, dirigiéndose el haz luminoso de autoenfoque para reflejarse fuera del plano (16) de objeto; - un dispositivo (50) de detección de autoenfoque que comprende una lente (46) del sistema de detección para recibir el haz luminoso de autoenfoque reflejado y dirigir el haz luminoso de autoenfoque reflejado sobre una superficie (142) de detección; - una pluralidad de sensores (108, 110, 112, 114) luminosos adaptados para medir la intensidad luminosa del haz luminoso de autoenfoque reflejado en dicha superficie (142) de detección, en el que se determina la distancia que la imagen del plano (216) de objeto se desplaza desde una superficie (23) de referencia de foco deseada comparando las intensidades medidas por la pluralidad de sensores; caracterizado porque el sistema de obtención de imágenes comprende además: - un brazo (213) de sonda que soporta la pluralidad de lentes, extendiéndose dicho brazo de sonda generalmente a lo largo del eje (202) óptico principal; y - una fase (240) de exploración y un soporte (219) sobre el que se sitúa un objeto con el plano (216) de objeto que se va a examinar, en el que el plano (216) de objeto se extiende sustancialmente a lo largo de un plano focal que se observa a través del microscopio; y en el que el plano (216) de objeto es sustancialmente paralelo al eje (202) óptico principal.

Description

Un microscopio adecuado para una selección de alto rendimiento, que tiene un aparato de autoenfoque.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un microscopio adecuado para la selección de alto rendimiento que comprende un aparato de autoenfoque que tiene un eje óptico principal, desplegado. Además, la invención se refiere también a un aparato de autoenfoque y a un método de autoenfoque útil en la selección de alto rendimiento.

Descripción de la técnica relacionada

Se ha dispuesto de técnicas de autoenfoque para microscopios durante muchos años.

La mayor parte de los métodos de autoenfoque se clasifican en dos categorías: detección de la posición y análisis del contenido de imágenes. Las funciones de autoenfoque de contenido de imágenes se han comparado previamente para la microscopía de campo claro. Groen, Young y Ligthart (Groen FCA, Young IT, Ligthart G: A comparison of different focus functions for use in autofocus algorithms, Cytometry 6:81-91, 1985) compararon once funciones de autoenfoque en campo claro utilizando una rejilla de microscopio electrónico y una extensión de metafase, y Vollath (Vollath D: Automatic Focusing by Correlative Methods, J Microsc 147:279-288, 1987) probó una función de autocorrelación en campo claro utilizando una muestra de acero paralizada. Groen y otros concluyeron que tres funciones de auntoenfoque, es decir dos funciones de gradiente y la varianza de la intensidad, funcionaron mejor. Su limitación más importante es la velocidad, que depende de las realizaciones de cálculos.

En una técnica de contenido de imágenes de autoenfoque habitual, se coloca una lente objetivo a una distancia predeterminada desde la muestra que se va a explorar y se toma una imagen del objeto. La imagen creada por el microscopio se evalúa entonces normalmente para determinar la posición en la que la superficie del objeto, o un plano dentro del objeto, está enfocado. La evaluación de la imagen normalmente supone analizar características de la imagen tales como entropía, resolución espacial, frecuencia espacial, contraste u otras características. El análisis de estas características requiere una cantidad considerable de tratamiento informático. Una vez que se analizan las características, se varía la distancia entre la lente objetivo y el objeto que se va a explorar y se toma otra imagen. Entonces, se evalúa la nueva imagen y se repite el proceso varias veces antes de que se obtenga finalmente una imagen enfocada. Repetir la etapa de analizar la imagen puede hacer que la operación de enfocado lleve un tiempo indeseablemente prolongado antes de que finalmente el microscopio se enfoque sobre la superficie del objeto. La necesidad de un tiempo de tratamiento aumentado para el autoenfoque puede ser particularmente aguda para diversos tipos de operaciones de obtención de imágenes. Por ejemplo, cuando se observa un objeto bajo un microscopio, se deben mantener las condiciones enfocadas, con el fin de mantener una imagen apropiadamente enfocada del objeto. Por tanto, incluso si el objeto está inicialmente enfocado, el objeto puede llegar a estar gradualmente desenfocado debido a una variedad de factores externos tales como efectos térmicos y vibración, si no se toman etapas correctoras. Además, cuando un objeto es mayor que el campo de visión del microscopio, el microscopio sólo puede enfocar la parte del objeto que se puede observar a través del campo de visión del microscopio. Por tanto, las condiciones de enfoque se deben comprobar y ajustar regularmente, con el fin de mantener una imagen nítida del objeto completo.

En vista de lo anterior, existe una necesidad de un sistema y método de autoenfoque mejorado para un microscopio que pueda realizar operaciones de autoenfoque rápidas y precisas mientras mantiene una imagen nítida.

El documento US-A-5530237 describe un microscopio según el preámbulo de la reivindicación 1.

Se conocen varios métodos y aparatos de detección de la posición de autoenfoque, por ejemplo, por la Offenlegungsschrift (publicación de divulgación) DE 3446727 y DE 3328821. Estos documentos alemanes describen un dispositivo de autoenfoque para un microscopio en el que variaciones en la intensidad de la luz que se originan a partir de dos fuentes luminosas separadas proporcionan una señal para el ajuste del foco. Estos métodos de autoenfoque conocidos son en particular útiles para muestras planas de las que se van a obtener imágenes. Los haces luminosos de autoenfoque se desplazan a lo largo de una parte sustancialmente grande que incluye varios elementos ópticos, tales como una pluralidad de lentes y al menos dos divisores de haz. Esta parte grande produce un retraso sustancial en el procedimiento de autoenfoque. La presente invención se refiere a un sistema de autoenfoque más simplificado mediante el cual se minimiza parte de la luz de autoenfoque. La incertidumbre al aplicar los resultados de la prueba de enfoque de un método de microscopio a otro condujo a la presente invención. El desarrollo de la presente invención incluyó explorar el rendimiento de autoenfoque en microscopía de muestras biológicas teñidas fluorescentes.

Sumario de la invención

Las ventajas y los fines de la invención se expondrán en parte en la descripción que sigue y en parte serán obvios a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica de la invención. Las ventajas y fines de la invención se realizarán y alcanzarán por medio de los elementos y combinaciones señalados particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos que se acompañan, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. En los dibujos:

la figura 1 ilustra los principios básicos de un sistema óptico para formar una imagen de un plano de objeto según la presente invención;

la figura 2 ilustra el sistema óptico de la figura 1 con el plano de objeto enfocado y desenfocado;

la figura 3A ilustra un microscopio con el sistema óptico de la figura 1 y un sistema de autoenfoque según una realización de la presente invención;

la figura 3B ilustra un dispositivo de detección de autoenfoque del sistema de autoenfoque de la figura 3A;

la figura 3C es una gráfica de la intensidad luminosa detectada por el dispositivo de detección de autoenfoque de la figura 3B en diversas posiciones relativas entre un plano de imagen real y un plano de imagen deseado;

la figura 4A ilustra un microscopio con el sistema óptico de la figura 1 y un sistema de autoenfoque según otra realización de la presente invención;

la figura 4B ilustra un dispositivo de detección de autoenfoque del sistema de autoenfoque de la figura 4A;

la figura 4C es una gráfica de la intensidad luminosa detectada por el dispositivo de detección de autoenfoque de la figura 4B en diversas posiciones relativas entre un plano de imagen real y un plano de imagen deseado;

la figura 4D ilustra una variación del microscopio de la figura 4A con un sistema de detección de autoenfoque modificado;

la figura 5 ilustra un microscopio con el sistema óptico de la figura 1 y un sistema de autoenfoque según otra realización de la presente invención;

las figuras 6A, 6B y 6C ilustran un dispositivo de detección de autoenfoque del sistema de autoenfoque de la figura 5 con el plano de objeto enfocado, el plano de objeto demasiado lejos de una lente objetivo y el plano de objeto demasiado cerca de la lente objetivo, respectivamente;

las figuras 7A, 7B y 7C ilustran la posición de los puntos luminosos formados en los diodos del dispositivo de detección de autoenfoque de la figura 5 con el plano de objeto enfocado, el plano de objeto demasiado lejos de la lente objetivo y el plano de objeto demasiado cerca de la lente objetivo, respectivamente;

la figura 8A ilustra un microscopio con el sistema óptico de la figura 1 y un sistema de autoenfoque según otra realización de la presente invención;

las figuras 8B, 8C y 8D ilustran la posición de los puntos luminosos formados en los diodos del dispositivo de detección de autoenfoque de la figura 8A con el plano de objeto enfocado, el plano de objeto demasiado lejos de la lente objetivo y el plano de objeto demasiado cerca de la lente objetivo, respectivamente;

la figura 9 es un diagrama de flujo a modo de ejemplo de un método de enfoque automático de una imagen de un plano de objeto que se puede utilizar en los microscopios de las figuras 3-4;

la figura 10 es un diagrama de flujo a modo de ejemplo de un método de enfoque automático de una imagen de un plano de objeto que se puede utilizar en los microscopios de las figuras 5-8;

la figura 11 es una vista lateral de un microscopio según otra realización de la presente invención; y

la figura 12 es una vista lateral del microscopio de la figura 11 situado en una mesa separada de una fase de exploración.

Descripción de las realizaciones preferidas

Ahora se hará referencia en detalle a las presentes realizaciones preferidas de la invención, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, los mismos números de referencia se utilizarán en los dibujos para referirse a las mismas piezas o similares.

En cuanto a la importancia específica para un microscopio, se tratarán en primer lugar los sistemas de autoenfoque.

La presente invención proporciona un microscopio que tiene un medio de enfoque automático para enfocar automáticamente el microscopio sobre un plano de un objeto tal como una muestra.

Por motivos de claridad, se tratarán por separado los detalles del aparato y sistema de autoenfoque y del microscopio. Sin embargo, se incluyen todas las características.

Según una realización de la invención, se proporciona un aparato de autoenfoque que incluye un sistema óptico configurado para formar una imagen óptica de un plano de muestra que se va a observar, un sistema de detección de autoenfoque y un sistema de corrección del foco. El sistema óptico puede incluir una lente objetivo, una fuente de haces de iluminación para iluminar el plano de muestra con un haz de iluminación, y una lente de imagen, tal como una lente convergente, para crear una imagen del plano de muestra. El sistema de detección de autoenfoque puede incluir una fuente de haces luminosos de autoenfoque para generar un haz luminoso de autoenfoque, un divisor de haz configurado para dirigir el haz luminoso de autoenfoque hasta el plano de muestra y hacer que el haz luminoso de autoenfoque se refleje fuera de la superficie de la muestra.

El sistema de detección de autoenfoque de la presente invención puede incluir además lentes del sistema de detección configuradas para dirigir el haz luminoso de autoenfoque de retorno hasta un dispositivo de detección de autoenfoque. El dispositivo de detección de autoenfoque determina preferiblemente la cantidad de desplazamiento de la imagen de la superficie de la muestra desde un plano de referencia enfocado deseado basado en el desplazamiento detectado de un plano de imagen del haz luminoso de autoenfoque desde un plano de referencia predeterminado en el dispositivo de detección de autoenfoque. El sistema de corrección de enfoque incluye preferiblemente un controlador de retroalimentación y un dispositivo de ajuste del foco para ajustar automáticamente la distancia entre la lente objetivo y el plano de muestra, con el fin de enfocar apropiadamente la imagen en el sistema óptico. La presente invención también se refiere a un método de enfoque automático de una imagen de un plano de muestra en un microscopio.

En un microscopio, cuando el plano de muestra no está localizado en la distancia focal desde la lente objetivo, la imagen resultante en el microscopio estará desenfocada. Las figuras 1 y 2, por ejemplo, ilustran cómo puede surgir este problema en un sistema óptico para formar una imagen óptica de una muestra que se va a observar en un microscopio. El sistema de las figuras 1-2 se muestra con fines de ilustración solamente, y no incluye el sistema de autoenfoque de la presente invención que se describirá en mayor detalle más adelante con referencia a las figuras 3-8.

Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en las figuras 1-2, el sistema 10 óptico forma una imagen óptica de un plano 16 de muestra que se va a observar en el microscopio. El sistema 10 óptico incluye un divisor 12 de haz, una lente 14 objetivo, un plano de objeto que se refleja parcialmente o plano 16 de muestra, una lente 18 de imagen, un plano 20 de imagen y una fuente 25 de un haz 22 luminoso de iluminación. En el ejemplo mostrado en la figura 1, el plano 16 de muestra de la muestra se sitúa a una distancia que corresponde a la distancia (f1) focal de la lente 14 objetivo. Como resultado de ello, en el microscopio de la figura 1, la imagen resultante de la muestra está enfocada apropiadamente. Por el contrario, el plano 16 de muestra en la figura 2 se sitúa en una posición que se desvía (en d1) de la distancia focal de la lente 14 y, por tanto, la imagen resultante no está enfocada apropiadamente. En las figuras 1 y 2, el plano 16 que se refleja parcialmente puede corresponder a la parte inferior de la superficie de la muestra o un plano en el interior de la muestra. Alternativamente, el plano 16 de muestra puede corresponder a la parte inferior de la superficie en la que se coloca la muestra. Para los fines de la discusión de más adelante, el plano que se va a enfocar se denominará plano 16 de muestra.

Tal como se ilustra en las figuras 1 y 2, la fuente 25 luminosa genera un haz 22 luminoso de iluminación. El haz 22 luminoso de iluminación puede ser de cualquier longitud de onda que sea adecuada para iluminar un plano de muestra en un microscopio. Aunque el ejemplo mostrado ilustra el haz luminoso de iluminación estando colimado, no es necesario que el haz esté colimado. El haz también podría ser divergente o convergente. Por el bien de la discusión, se describirá el uso de un haz luminoso colimado. La fuente 25 luminosa puede ser cualquier tipo convencional de fuente luminosa tal como una lámpara o láser. Aunque las figuras 1 y 2 muestran la fuente luminosa estando localizada adyacente a un divisor 12 de haz, también es factible colocar la fuente luminosa en el lado izquierdo del plano 16 de muestra en las figuras, con el fin de transiluminar el plano de muestra. En tal configuración, el divisor 12 de haz no sería necesario. En una configuración alternativa, el plano de muestra puede emitir luz por sí mismo sin la necesidad de una fuente luminosa de iluminación específica. Un ejemplo de cuándo esto se puede producir es cuando una muestra experimenta una reacción química luminiscente. Los tipos específicos de fuentes luminosas y las longitudes de onda preferidas del haz luminoso de iluminación se tratarán más adelante con referencia a los sistemas de detección de autoenfoque descritos de la presente invención.

En los ejemplos de las figuras 1 y 2, el haz 22 luminoso de iluminación se dirige hacia un divisor 12 de haz. El divisor 12 de haz puede ser cualquier tipo de divisor de haz convencional adecuado para uso en la presente invención. El divisor 12 de haz refleja el haz 22 luminoso de iluminación hacia la lente 14 objetivo y el plano 16 de muestra localizado a lo largo del primer eje 56 óptico. En la figura 1, el plano 16 de muestra se sitúa exactamente en el plano focal de la lente 14 objetivo, es decir a la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo. Debido a que el plano 16 de muestra se sitúa exactamente a la distancia focal alejado de la lente 14 objetivo, los límites externos del haz 22 luminoso de iluminación desde la lente 14 objetivo se cortarán en un único punto sobre el plano 16 de muestra, tal como se muestra en la figura 1. La lente 14 objetivo se dice que está enfocada sobre el plano 16 de muestra en tal disposición en la que se corta el haz luminoso para chocar en un único punto sobre la superficie, es decir, el diámetro del haz luminoso será mínimo.

El haz 22 luminoso de iluminación que choca contra el plano 16 se refleja fuera del plano 16 y de vuelta a la lente 14 objetivo. Como el haz luminoso de iluminación pasa a través de la lente 14 objetivo, el haz luminoso de iluminación se colima de vuelta a su forma original y se dirige hacia el divisor 12 de haz. El divisor 12 de haz está configurado de modo que el haz luminoso de iluminación que vuelve a lo largo del primer eje 56 óptico se transmita a través del divisor 12 de haz sin ningún efecto perturbador. Después de transmitirse a través del divisor 12 de haz, el haz luminoso colimado alcanza la lente 18 de imagen.

La lente 18 de imagen puede ser cualquiera de una variedad de lentes convencionales, tales como una lente convergente, para crear una imagen de una superficie. Aunque el esquema de la figura 1 sólo muestra una lente 18 de imagen, un microscopio normal tendrá una serie de elementos ópticos de retransmisión tal como se conoce en la técnica. Los elementos ópticos de retransmisión no se muestran con fines de simplicidad. En la configuración mostrada en la figura 1, la lente 18 de imagen proyecta el haz luminoso de iluminación sobre un plano 20 de imagen situado a la distancia f2 focal desde la lente 18 de imagen. Una lente tal como la lente 18 de imagen (o la lente 14 objetivo) tiene una distancia (f) focal predeterminada basada en su poder de aumento. En un ejemplo de una lente de imagen adecuada con la presente invención, la distancia focal está entre 160 mm y 250 mm. Sin embargo, la distancia focal de la lente de imagen puede ser mucho menor o mayor que este intervalo.

La distancia (f) focal corresponde a la distancia desde la lente a la que se enfocará apropiadamente el haz luminoso colimado que pasa a través de la lente, es decir, el diámetro del haz luminoso estará en un mínimo. Por ejemplo, la lente 14 objetivo mostrada en la figura 1 tiene una distancia focal de f1. Por tanto, un plano 16 de muestra localizado a una distancia f1 desde la lente 14 objetivo tendrá el haz 22 luminoso de iluminación colimado procedente del divisor 12 de haz enfocado sobre el plano de muestra, tal como se muestra en la figura 1. Debido a que el plano 16 de muestra se localiza exactamente a la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo, el haz luminoso reflejado desde la superficie se volverá a colimar según pasa de vuelta a través de la lente 14 objetivo a lo largo del primer eje 56 óptico hacia la lente 18 de imagen. El haz luminoso de iluminación reflejado dirigido por la lente 18 de imagen (moviéndose hacia la derecha en la figura 1) se enfocará entonces sobre el plano 20 de imagen a la distancia f2 focal (de la lente 18 de imagen) desde la lente 18 de imagen. Por tanto, cuando el plano 16 de muestra está a la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo, la imagen resultante de la lente 18 de imagen estará enfocada apropiadamente.

Normalmente, sin embargo, el plano 16 de muestra no está situado inicialmente exactamente a la distancia focal desde la lente 14 objetivo. Incluso si el plano de muestra está situado inicialmente a la distancia deseada desde la lente objetivo, factores externos tales como efectos térmicos o vibraciones pueden producir el movimiento relativo entre el plano de muestra y la lente objetivo. Cuando el plano 16 está situado en una posición distinta a la distancia f1 focal alejado de la lente 14 objetivo (es decir, movido a la izquierda o a la derecha de la posición mostrada en la figura 1), la lente objetivo no enfocará sobre el plano de muestra. Por ejemplo, la figura 2 muestra el plano 16 de muestra estando localizado a una distancia mayor (f1 más d1) de la lente 14 objetivo comparada con la distancia en la figura 1. En esta nueva posición, la superficie de la muestra se ha movido una distancia d1 adicional desde la posición mostrada en la figura 1. Cuando el plano de muestra no se localiza a la distancia f1 focal desde la lente objetivo, el haz luminoso de iluminación estará enfocado por la lente 14 objetivo en el plano 23 de referencia deseado para la muestra (mostrado en líneas discontinuas en la figura 2) localizado a f1 desde la lente 14 objetivo, en lugar de sobre el plano 16 de muestra. El plano 23 de referencia deseado para la muestra (mostrado en la figura 2) se sitúa exactamente a la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo, y por tanto, corresponde a la posición en la que el diámetro del haz luminoso de iluminación desde la lente 14 objetivo está en un mínimo.

Sin embargo, se desea que el diámetro del haz luminoso de iluminación esté en un mínimo en el plano real del plano 16 de muestra (mostrado como una línea continua), no en un plano 23 de referencia separado del plano de muestra. Por tanto, se desea en última instancia que el plano 16 de muestra esté situado en el plano 23 de referencia deseado con el fin de que se produzca un enfoque apropiado. Posteriormente, se describirán un método y aparato para obtener tal enfoque.

En la figura 2, el plano 16 de muestra se localiza a una distancia d1 adicional del plano 23 de referencia deseado (mostrado en líneas discontinuas). Este movimiento de d1 puede estar producido por una variedad de factores. Tal como se observa en la figura 2, el diámetro del haz luminoso de iluminación está en un mínimo en el plano 23 de referencia deseado y por tanto, choca con el plano 16 de muestra en una posición más allá de la distancia f1 desde la lente 14 objetivo. El haz 22 de iluminación se reflejará entonces fuera del plano de muestra como haz 24 luminoso reflejado. Dado que el haz 22 luminoso de iluminación no choca con el plano 16 de muestra en un único punto o posición de diámetro mínimo (como lo hace en la figura 1), los límites externos del haz 24 luminoso reflejado estarán fuera de los límites externos del haz 22 luminoso de iluminación que va hacia el plano 16 de muestra. Tal como se muestra en la figura 2, tras pasar de nuevo a través de la lente 14 objetivo, los haces 24 luminosos reflejados ya no estarán colimados.

Los haces 24 luminosos reflejados se transmitirán entonces a través del divisor 12 de haz hacia la lente 18 de imagen a lo largo del primer eje 56 óptico. Como los haces luminosos reflejados no están colimados, la lente 18 de imagen proyectará entonces los haces 24 luminosos reflejados de modo que se corten con un plano 20 de imagen que no está a la distancia f2 focal apropiada desde la lente 18 de imagen. El plano localizado a la distancia f2 focal desde la lente 18 de imagen se denomina como el plano de referencia "deseado" para el plano de imagen. La distancia entre el plano 26 de referencia deseado para el plano de imagen (mostrado en líneas discontinuas) y la posición real del plano 20 de imagen (mostrado como una línea continua) se representa como d2 en la figura 2 y en toda la memoria descriptiva. Tal como se muestra en la figura 1, cuando el plano de muestra está situado apropiadamente con respecto a la lente objetivo, la posición real del plano 20 de imagen es idéntica al plano 26 de referencia deseado.

Un dispositivo de formación de imágenes tal como un dispositivo de carga acoplada (CCD) o una cámara se puede situar en el plano 26 de referencia deseado del sistema 10 óptico. Alternativamente, se puede situar un ocular para observar la imagen en el plano 26 de referencia deseado de modo que el ojo del observador se alinee con el plano 26 de referencia deseado. Por tanto, con el fin de enfocar apropiadamente el instrumento óptico, es deseable que el haz 24 reflejado se dirija de modo que los haces se corten en un punto sobre el plano 26 de referencia deseado (tal como se muestra en la figura 1). Para el sistema mostrado en la figura 2, en el que el plano 16 de muestra está desplazado en d1 desde la posición enfocada apropiadamente (una distancia f1 focal desde la lente objetivo) habrá un desplazamiento d2 correspondiente del plano 20 de imagen desde el plano 26 de referencia deseado del microscopio. Por tanto, la imagen correspondiente estará desenfocada porque no está a la distancia f2 focal apropiada desde la lente 18 de imagen.

Los sistemas de autoenfoque coherentes con los principios de la presente invención proporcionan un enfoque automático rápido y preciso sobre el plano de muestra. El sistema de autoenfoque incluye un sistema de detección de autoenfoque para determinar directamente el desplazamiento del plano de imagen real desde el plano de referencia deseado del plano de imagen del sistema óptico. El desplazamiento corresponde generalmente a la cantidad que la imagen está desenfocada. Según un aspecto de la presente invención, se elimina la necesidad de una evaluación que lleva mucho tiempo de las características de una pluralidad de imágenes, determinando directamente la distancia que la imagen está desenfocada. Como resultado, el microscopio se puede ajustar rápida y eficazmente de modo que la imagen está enfocada apropiadamente. El sistema de autoenfoque de la presente invención incluye además un sistema de corrección de enfoque para ajustar la distancia entre la lente objetivo y el plano de muestra, de modo que el microscopio se enfoca rápidamente sobre el plano de muestra.

Un primer ejemplo de un aparato según la presente invención para enfocar automáticamente un instrumento óptico sobre un plano de muestra se muestra en las figuras 3A, 3B y 3C. Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en las figuras 3A-3C, el aparato 30 para enfocar automáticamente un instrumento óptico sobre un plano de muestra incluye el sistema 10 óptico para formar una imagen (descrito previamente en las figuras 1-2), un sistema 32 de detección de autoenfoque y un sistema 34 de corrección de enfoque. Tal como se muestra en las figuras 3A-3C, el aparato 30 incluye un sistema 10 óptico para formar una imagen óptica de una muestra que va a observarse. El sistema 10 óptico incluye un divisor 12 de haz, una lente 14 objetivo, una lente 18 de imagen, un plano 20 de imagen y una fuente 25 luminosa de iluminación sustancialmente tal como se describió previamente en la discusión anterior para las figuras 1-2. Los principios del sistema 10 óptico en las figuras 3A-3C funcionan bajo los mismos principios descritos previamente para las figuras 1-2. Los componentes del sistema 10 óptico se describirán en mayor detalle más adelante con relación al sistema 32 de detección de autoenfoque y el sistema 34 de corrección de enfoque.

Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en las figuras 3A-3C, se proporciona un sistema 32 de detección de autoenfoque que incluye una fuente 39 luminosa para generar haces 40 luminosos de autoenfoque, un primer divisor 42 de haz de autoenfoque y un segundo divisor 44 de haz de autoenfoque. El sistema 32 de autoenfoque incluye además una lente 46 del sistema de detección para dirigir y devolver un haz luminoso de autoenfoque y un dispositivo 50 de detección para determinar la cantidad de desplazamiento de la imagen desde un plano de referencia enfocado deseado. El dispositivo 50 de detección puede ser cualquiera de varios dispositivos tales como los mostrados en las figuras 3A-3C y las demás realizaciones de la invención.

Tal como se realiza y se muestra en las figuras 3A-3B, una fuente 39 luminosa genera un haz 40 luminoso de autoenfoque utilizado en el sistema 32 de detección de autoenfoque. La fuente 39 luminosa puede ser cualquier fuente luminosa adecuada tal como una lámpara o láser. Si se selecciona un láser, se puede utilizar un láser de diodo de HeNe para las fuentes 39 luminosas, aunque también se puede utilizar cualquiera de varios otros tipos de láser con la presente invención. Además, aunque el haz 40 luminoso de autoenfoque se muestra como estando colimado en la figura 3A, el haz luminoso de autoenfoque podría ser alternativamente o bien convergente o bien divergente. El haz se muestra como colimado con el fin de simplificar la discusión.

En el ejemplo mostrado en la figura 3A, el haz luminoso de autoenfoque tiene una longitud de onda de \lambdaa. la longitud de onda para el haz luminoso de autoenfoque se selecciona preferiblemente para que sea diferente de la longitud de onda del haz 52 luminoso de iluminación. En la mayoría de casos, se prefiere que el haz luminoso de autoenfoque tenga una longitud de onda mayor que el haz luminoso de iluminación. Para los fines de la descripción de más adelante, las fuentes y haces luminosos ser describirán con relación a la espectroscopía de obtención de imágenes de fluorescencia, aunque la presente invención es adecuada con un gran número de otras aplicaciones además de la espectroscopía de obtención de imágenes de fluorescencia. En la obtención de imágenes de fluorescencia, el haz 52 luminoso de iluminación tiene una longitud de onda de excitación de \lambdae y se utiliza para generar la imagen en el sistema 10 óptico, de una manera similar a la tratada con respecto a la figura 1. Las longitudes de onda del haz 40 luminoso de autoenfoque y el haz 52 luminoso de iluminación se seleccionan para que sean diferentes entre sí de modo que el haz 40 luminoso de autoenfoque no perturbe ni interfiera con el haz 52 de iluminación utilizado para crear la imagen.

En un microscopio que utiliza obtención de imágenes de fluorescencia, la longitud de onda del haz 52 luminoso de iluminación se selecciona preferiblemente para que sea lo más estrecha posible y dentro de la banda de absorción de la muestra fluorescente en estudio. A medida que el haz luminoso de iluminación choca contra la superficie, se crea un haz luminoso fluorescente que tiene una longitud de onda \lambdaf. Preferiblemente, la longitud de onda del haz fluorescente es diferente de la longitud de onda del haz luminoso de iluminación. La diferencia entre las longitudes de onda, en un ejemplo, puede ser de tan sólo 50 nm, preferiblemente de 10 nm o inferior. No se debe permitir que entre ninguna luz del haz de excitación en la lente 18 de imagen. Por tanto, en el ejemplo mostrado en la figura 3A, el divisor 12 de haz está configurado para bloquear toda luz con una longitud de onda \lambdae, mientras que permite que se transmita a su través la luz de la longitud de onda de fluorescencia \lambdaf.

Tal como se trató anteriormente, los haces luminosos de autoenfoque se deben seleccionar para que tengan una longitud de onda (\lambdaa) diferente de la longitud de onda de excitación (\lambdae) y la longitud de onda de fluorescencia (\lambdaf). Se mostrará un ejemplo particular con fines de ilustración solamente. En el caso de una muestra que absorbe una longitud de onda de aproximadamente 510 nm y fluoresce a aproximadamente 550 nm, el haz de excitación se puede seleccionar para que sea un láser de ion Ar^{+} con una longitud de onda de 514 nm. La longitud de onda del haz luminoso de autoenfoque se puede seleccionar para que sea superior a aproximadamente 600 nm. Este ejemplo de las longitudes de onda es con fines de ilustración solamente, y no limita la presente invención. Utilizando diferentes longitudes de onda, el presente sistema es capaz de determinar simultáneamente la cantidad en que el sistema está desenfocado y crear la imagen de la superficie. La capacidad para realizar ambos de estos procesos simultáneamente potencia la velocidad y eficacia del aparato de autoenfoque.

En el ejemplo mostrado en las figuras 3A-3C, la fuente 39 del haz luminoso de autoenfoque genera y proyecta el haz 40 luminoso de autoenfoque en una primera dirección paralela al primer eje 56 óptico. El haz 40 luminoso de autoenfoque choca contra el primer divisor 42 de haz del sistema de detección de autoenfoque y se refleja a lo largo de un segundo eje 64 óptico hasta el segundo divisor 44 de haz del sistema de autoenfoque. Alternativamente, el aparato se podría configurar de modo que la fuente 39 del haz luminoso de autoenfoque generase el haz 40 luminoso de autoenfoque directamente sobre el segundo divisor 44 de haz, sin necesidad del primer divisor 42 de haz. En otra configuración posible, la fuente 39 luminosa para el haz de autoenfoque podría generar el haz 40 luminoso de autoenfoque directamente hasta la lente 16 objetivo.

Los divisores 42, 44 de haz utilizados en la presente invención pueden ser de cualquier tipo convencional conocido en la técnica. Por ejemplo, los divisores 42, 44 de haz pueden ser divisores de haz que reflejan parcialmente convencionales. El divisor 44 de haz está configurado preferiblemente para transmitir todo el haz luminoso de iluminación de longitudes de onda \lambdae y \lambdaf mientras que refleja los haces luminosos de autoenfoque de longitud de onda \lambdaa. En un ejemplo, el divisor 42 de haz está configurado preferiblemente para utilizar un divisor de haz de polarización y una placa de longitud de onda de 1/4. Tal como se muestra en la figura 3A, tras chocar con el segundo divisor 44 de haz, el haz 40 luminoso de autoenfoque se refleja hacia la lente 14 objetivo a lo largo del primer eje 56 óptico. El divisor 44 de haz está configurado para reflejar el haz luminoso de autoenfoque de longitud de onda \lambdaa. Si los haces se hacen funcionar simultáneamente, el divisor 44 de haz también permite que el haz 52 luminoso de iluminación reflejado pase a su través tal como se describió previamente.

El haz luminoso de autoenfoque se desplaza hasta la lente 14 objetivo a lo largo de un primer eje 56 óptico. La lente 14 objetivo puede ser cualquier tipo de lente objetivo para microscopio. La lente 14 objetivo tiene una distancia f1 focal, que es una función del poder de aumento de la lente objetivo. Para la mayoría de aplicaciones, la distancia f1 focal efectiva oscilará normalmente entre 40 mm y 1 mm. Sin embargo, las lentes objetivo con distancias focales fuera de este intervalo también son adecuadas con la presente invención. La lente 14 objetivo dirige el haz luminoso de autoenfoque de longitud de onda \lambdaa sobre el plano 16 de muestra localizado a una distancia f1 focal desde la lente objetivo. En la realización mostrada en la figura 3A, el plano 16 de muestra se localiza a la distancia f1 focal alejado de la lente objetivo, por tanto, la imagen resultante del plano de muestra estará enfocada apropiadamente debido a las propiedades del sistema óptico (incluyendo las de la lente 18 de imagen).

El haz 40 luminoso de autoenfoque desde la lente 14 objetivo se refleja entonces al menos parcialmente fuera del plano 16 de muestra y de dirige de nuevo a la lente 14 objetivo. El haz luminoso de autoenfoque reflejado con una longitud de onda \lambdaa se dirige entonces por la lente 14 objetivo a lo largo del primer eje 56 óptico hasta el segundo divisor 44 de haz de autoenfoque. El segundo divisor 44 de haz de autoenfoque refleja el haz luminoso de autoenfoque de longitud de onda \lambdaa hacia el primer divisor 42 de haz de autoenfoque (en un sentido descendente a lo largo del segundo eje 64 óptico en la figura 3A). El primer divisor 42 de haz de autoenfoque permite que el haz luminoso de autoenfoque se refleje desde el segundo divisor 44 de haz de autoenfoque para transmitirse a través sin ningún efecto perturbador. El haz 40 luminoso de autoenfoque se transmite así hasta la lente 46 del sistema de detección y el dispositivo 50 de detección de autoenfoque. El método y aparato para detectar la cantidad en que la imagen está desenfocada se tratará más adelante en mayor detalle.

Tal como se trató previamente, el sistema óptico para crear una imagen incluye la fuente del haz luminoso de iluminación para iluminar el plano de muestra. En un sistema de obtención de imágenes de fluorescencia, el haz luminoso de iluminación tiene una longitud de onda \lambdae para generar la fluorescencia del plano de muestra. Tal como se muestra en el ejemplo de la figura 3A, el divisor 12 de haz del sistema óptico refleja el haz 52 luminoso de iluminación hacia el plano 16 de muestra a lo largo del primer eje 56 óptico. El segundo divisor 44 de haz de autoenfoque está configurado para permitir que el haz luminoso de iluminación de longitud de onda \lambdae se transmita a través de él hasta la lente 14 objetivo. La lente 14 objetivo dirige entonces el haz luminoso de iluminación hasta un punto a una distancia f1 desde la lente 14 objetivo. El haz luminoso de iluminación se configura para que corte en un plano de referencia correspondiente a la distancia f1 focal desde la lente objetivo. En la figura 3A, dado que el plano de muestra está localizado en f1 desde la lente objetivo, el haz luminoso de iluminación chocará contra un único punto sobre el plano de muestra y se reflejará fuera tal como se muestra en la figura 3A. Dado que el haz luminoso de iluminación se refleja fuera del plano de muestra, se convierte en un haz fluorescente iluminado (en un ejemplo de obtención de imágenes de fluorescencia), teniendo tal haz luminoso fluorescente una longitud de onda de \lambdaf. Esta longitud de onda es preferiblemente diferente de manera suficiente de la longitud de onda de autoenfoque, de tal manera que no se produzca interferencia entre el haz iluminado y el haz luminoso de autoenfoque.

El haz luminoso fluorescente desde el plano 16 de muestra tiene una longitud de onda \lambdaf y pasa a través de la lente objetivo (según se mueve hacia la derecha en la figura 3A). En el ejemplo mostrado en la figura 3A, el haz luminoso fluorescente se colima según pasa a través de la lente objetivo y se dirige hacia el segundo divisor 44 de haz de autoenfoque. El segundo divisor 44 de haz de autoenfoque está configurado para permitir que el haz luminoso fluorescente pase a su través. El haz luminoso fluorescente pasa entonces a través del divisor 12 de haz del sistema de imagen a lo largo del primer eje 56 óptico. La lente 18 de imagen enfoca entonces el haz luminoso fluorescente sobre un plano 20 de imagen a una distancia f2 focal desde la lente de imagen en la que se forma la imagen. En el ejemplo mostrado en la figura 3A, dado que el plano 16 de muestra está situado exactamente a la distancia f1 focal desde la lente objetivo, el plano 20 de imagen es coplanario con el plano 26 de referencia deseado en el que se forma la imagen enfocada apropiadamente. Tal como se trató previamente, el plano de referencia deseado normalmente se corresponde con una superficie en la que puede incluir un dispositivo de detección de imágenes tal como una cámara CCD o un ocular para observar directamente la imagen.

Tal como se explicó previamente, la presente invención incorpora un aparato y método para determinar directamente la cantidad en que la imagen está desenfocada sin requerir el análisis de las características de la pluralidad de imágenes. El aparato y método de la presente invención determina directamente el desplazamiento de la imagen desde su posición enfocada apropiadamente, y luego ajusta el sistema óptico para obtener una imagen enfocada. El sistema de autoenfoque de la presente invención incluye un dispositivo de detección de autoenfoque para determinar directamente la cantidad en que la imagen está desenfocada e incluye un sistema de corrección de autoenfoque.

El aparato puede incluir uno de varios tipos diferentes de dispositivos de detección de autoenfoque. La figura 3A muestra un aparato que tiene un tipo particular de dispositivo de detección de autoenfoque según un aspecto de la presente invención. El dispositivo 50 de detección de autoenfoque del ejemplo mostrado en la figura 3A incluye un iris 60 situado a la distancia f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección. La distancia f3 focal de la lente 46 del sistema de detección es una función del tamaño y el aumento de la lente 46 del sistema de detección. El iris 60 puede ser cualquier tipo de placa plana u otra estructura con una abertura para permitir que la luz se transmita a su través.

Cuando el plano 16 de muestra está situado en la posición de enfoque apropiada (distancia f1 desde la lente 14 objetivo), el iris permitirá que pase el haz luminoso de autoenfoque de longitud de onda \lambdaa (mostrado como una línea continua en la figura 3B) desde la lente 46 del sistema de detección a través del iris hasta un detector 62 luminoso sin interferencia. La lente 46 del sistema de detección tiene preferiblemente una distancia f3 focal que es adecuada de modo que el haz luminoso de autoenfoque será lo suficientemente pequeño para pasar a través del iris cuando la superficie está enfocada. El haz luminoso de autoenfoque será más pequeño a medida que la longitud focal se haga mayor. Sin embargo, el sistema de autoenfoque será compacto y robusto con distancias focales más pequeñas. Por tanto, la selección de la distancia focal de la lente del sistema de detección es un equilibrio de estas consideraciones. En una realización habitual de la presente invención, la lente 46 del sistema de detección tiene una distancia focal de entre 50 mm y 200 mm. Sin embargo, la distancia focal puede ser mayor o menor que este intervalo, según las dimensiones y otras características. En la realización mostrada en la figura 3A, el detector 62 luminoso se sitúa en el lado opuesto del iris 60 con respecto a la lente 46 del sistema de detección a lo largo del segundo eje 64 óptico.

Durante el autoenfoque, el haz 40 luminoso de autoenfoque pasa a través del iris 60 y se transmite hasta el detector a una intensidad máxima cuando el plano 16 de muestra se sitúa a la distancia f1 desde la lente objetivo. En esta posición, se crea una imagen a la distancia f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección. La imagen se crea así directamente en el iris 60 tal como se muestra en las líneas continuas de la figura 3B. La intensidad de la luz medida por el detector 62 luminoso está en su valor pico debido a que el haz 40 luminoso de autoenfoque pasa sustancialmente a través de la abertura del iris 60. En esta posición, se determina que el plano de muestra está apropiadamente enfocado por el sistema 10 óptico.

Cuando el plano 16 de muestra se mueve desde la posición mostrada en la figura 3A, el haz 40 luminoso de autoenfoque desde la lente 46 del sistema de detección (mostrado en líneas discontinuas en la figura 3B) no pasará directamente a través del iris sin efectos perturbadores. El haz cortará en un punto "X" situado a una distancia d3 desde el iris. Por tanto, para un desplazamiento d1 dado del plano 16 de muestra desde el plano de referencia deseado (por ejemplo, el plano 23 de referencia a una distancia f1 desde la lente 14 objetivo tal como se muestra en las figuras 1-2), habrá un desplazamiento d3 correspondiente del plano 66 de imagen de detección desde el plano del iris 60, tal como se muestra mejor en la figura 3B. Cuando el plano 66 de imagen de detección se sitúa a una distancia del iris, la intensidad de la luz medida por el detector luminoso es menor debido a que no todo el haz luminoso de autoenfoque pasará a través de la abertura del iris.

La figura 3C muestra dos gráficas que representan el método utilizado para calcular d3 mediante el detector 60 luminoso. La gráfica superior (marcada como i) ilustra la intensidad de la luz (I) medida por el detector frente a la distancia d3 de desplazamiento. La gráfica inferior (marcada como ii) ilustra la derivada de la intensidad de la luz (I) medida por el detector frente a la distancia d3 de desplazamiento. Tal como se muestra en la gráfica de la figura 3C, la luz medida por el detector luminoso estará en su máximo cuando la distancia d3 es cero. A través de las mediciones del detector 62 luminoso, se determina la distancia d2 de desplazamiento basándose en la intensidad del haz luminoso que pasa a través del iris.

En la realización de las figuras 3A y 3B, puede ser difícil distinguir entre una d3 positiva y negativa (es decir, un haz enfocado o bien por encima o bien por debajo del iris en las figuras 3A-3C), por tanto, es preferible que el sistema se module con el fin de solucionar este problema potencial. En consecuencia, el sistema de detección de autoenfoque del ejemplo mostrado en las figuras 3A-3C modula preferiblemente la distancia d1 con una pequeña amplitud. La modulación da como resultado un cambio en la intensidad de la luz, que es proporcional a la derivada de la intensidad (I). La distancia entre el plano 16 de muestra y la lente 14 objetivo se ajusta preferiblemente de modo que el cambio en la intensidad sea cero, tal como se muestra en la gráfica inferior de la figura 3C. El valor de d3 se envía entonces a un controlador de retroalimentación tal como se describirá a continuación.

Un aspecto importante de la presente invención es que el sistema de detección de autoenfoque realiza el autoenfoque basándose en el valor calculado para el desplazamiento d2 del plano 20 de imagen desde el plano 26 de imagen deseado (véanse las figuras 1-2). El sistema de detección de autoenfoque mide directamente el valor para d3. El sistema 10 óptico del sistema 50 de autoenfoque se puede configurar de modo que se pueda convertir directamente una medida de d3 en un valor para d2. Es decir, el valor para d2 se puede establecer para que se relacione directamente con d3. Por ejemplo, las lentes del sistema de obtención de imágenes y el sistema de autoenfoque se pueden situar de modo que d2 sea igual a d3. Alternativamente, las lentes se pueden situar de modo que el valor de d2 es proporcional al valor de d3. En otra posible configuración, las lentes se sitúan de modo que el valor de d2 se puede calcular directamente mediante un cálculo empírico basado en d3. En otra configuración posible, se puede determinar el valor de d2 basándose en un conjunto de puntos de datos o un mapa. Con cada una de estas opciones, el valor medido para d3 es representativo del valor de d2. Por tanto, el sistema 50 de autoenfoque puede detectar la cantidad en que el plano 20 de imagen está desenfocado sin tener que analizar las características reales de la imagen formada sobre la superficie de imagen. Esto potencia la velocidad y eficacia de la operación de autoenfoque de la presente invención. El método y la estructura para enfocar la lente objetivo sobre el plano de muestra como resultado de las mediciones anteriores se describirá en mayor detalle a continuación.

Según la presente invención, el aparato incluye un sistema 34 de corrección de enfoque. Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en la figura 3A, el sistema 34 de corrección de enfoque incluye un controlador 70 de retroalimentación y un dispositivo 72 de ajuste del foco. El controlador 70 de retroalimentación puede ser un controlador de retroalimentación analógico o digital tal como se conoce en la técnica. El controlador 70 de retroalimentación recibe una señal desde el detector 62 luminoso correspondiente a la distancia d3 de desplazamiento y genera una tensión de retroalimentación que se envía entonces a un dispositivo 72 de ajuste del foco.

El dispositivo 72 de ajuste del foco puede ser de varios tipos diferentes. En una realización preferida, el dispositivo 72 de ajuste del foco ajusta la posición de la lente 14 objetivo con respecto al plano 16 de muestra. En otra realización, el dispositivo 72 de ajuste del foco ajusta la posición del plano 16 de muestra con respecto a la lente 14 objetivo. Cualquier tipo de dispositivo (que ajusta la posición de la lente objetivo o que ajusta la posición del plano de muestra) está diseñado para situar el sistema óptico de modo que se pueda enfocar rápidamente el plano de muestra y se pueda tomar una imagen enfocada del plano de muestra. Un dispositivo típico para conferir este tipo de pequeños desplazamientos es un posicionador piezoeléctrico. En el ejemplo mostrado en la figura 3A, el dispositivo 72 de ajuste del foco modifica la posición de la lente 14 objetivo de modo que está a la distancia f1 focal deseada desde el plano 16 de muestra. Como resultado, el plano 20 de imagen del sistema óptico se sitúa enfocado de modo que los valores de d2 y d3 se aproximan a cero. Si el sistema 50 de detección de autoenfoque calcula un valor para d3 que es inferior a un umbral predeterminado, el sistema 34 de corrección de enfoque se puede hacer funcionar de nuevo hasta que el plano de muestra está situado enfocado. Esta operación se realiza en un periodo de tiempo más corto debido a que el presente sistema no analiza las características de la imagen, tal como se hace en otros sistemas.

En las figuras 4A, 4B y 4C se muestra otra realización del dispositivo de detección de autoenfoque según la presente invención. La estructura mostrada en las figuras 4A y 4B es similar al ejemplo de las figuras 3A y 3B excepto por el posicionamiento del iris. La siguiente discusión se concentrará en la estructura y método que es diferente de lo ya descrito en relación con las figuras 3A y 3B. El dispositivo 78 de detección de autoenfoque mostrado en las figuras 4A-4C incluye un iris 80 y un detector 84 luminoso. En el dispositivo 78 de detección de autoenfoque de las figuras 4A-4C, el iris 80 se sitúa a una distancia que no corresponde a la longitud f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección. Es decir, el iris está separado del plano 82 de referencia (mostrado en líneas discontinuas en la figura 4A), que se localiza a la distancia f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección. Tal como se observa en la figura 4B, el dispositivo de autoenfoque está diseñado de modo que el iris 80 se sitúa paralelo al plano 82 de referencia y separado por una distancia d3.

Tal como se muestra en la figura 4B, el iris 80 se sitúa a una distancia de f2 menos la distancia d3 desde la lente 46 del sistema de detección. En general, en el sistema de las figuras 4A-4C, cuando el detector 84 luminoso mide una cierta intensidad predeterminada, la superficie de la muestra estará enfocada. Sin embargo, si existen fluctuaciones en la reflectividad de la superficie o si la potencia de las fuentes luminosas fluctúa, la intensidad medida por el detector luminoso puede fluctuar aun cuando el plano de muestra esté aún enfocado. La precisión del sistema de detección de autoenfoque puede estar limitada por la estabilidad de las fuentes luminosas y por la uniformidad de la reflectividad del plano de muestra. Sin embargo, incluso si existen fluctuaciones en la estabilidad de las fuentes luminosas o en la reflectividad de la superficie, la razón entre la potencia luminosa medida por el detector y la potencia de la fuente luminosa no está afectada por estas fluctuaciones.

Con el fin de minimizar cualquier problema potencial debido a estas fluctuaciones, el sistema de autoenfoque del segundo ejemplo puede incluir además un tercer divisor 90 de haz de autoenfoque y un segundo detector 92 luminoso, tal como se muestra en la figura 4D. Tal como se muestra en la figura 4D, el tercer divisor 90 de haz de autoenfoque se sitúa entre la lente 46 del sistema de detección y el iris 80 a lo largo del segundo eje 64 óptico. El segundo detector 92 luminoso se sitúa desplazado desde el segundo eje 64 óptico tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 4D. El segundo detector 92 luminoso se podría disponer en otros lugares.

El tercer divisor 90 de haz de autoenfoque está configurado de modo que separe un cierto porcentaje de la intensidad del haz luminoso de autoenfoque hasta el segundo detector 92 luminoso, por ejemplo, el 50%. La intensidad (I2) de la luz separada hasta el segundo detector 92 luminoso es proporcional a la intensidad total reflejada por el plano 16. El 50% restante de la luz va hasta el iris 80. Una fracción de este 50% restante que va hasta el iris 80 se detecta por el primer detector 84 luminoso. La razón de la intensidad (I1) luminosa detectada por el primer detector 84 luminoso con respecto a la intensidad (I2) luminosa detectada por el segundo detector 92 luminoso se utiliza entonces para calcular directamente el valor de d3. Mediante esta disposición, se tendrán en cuenta las fluctuaciones en la intensidad de los haces luminosos y la reflectividad del plano de muestra. Alternativamente, el iris se podría sustituir por una red de diodos situada donde se muestra el iris en las figuras 4A y 4B. El sistema 32 de detección de autoenfoque incluye un sistema 34 de corrección de enfoque similar al descrito para las figuras 3A-3C.

En las figuras 5-7 se muestra otra realización de un dispositivo de detección de autoenfoque según la presente invención. La discusión de a continuación se concentrará en la estructura y método que es diferente a los ya descritos en relación con las figuras 3A y 3B. El dispositivo 98 de detección de autoenfoque de las figuras 5-7 incluye un prisma o lente para desviar el haz luminoso de autoenfoque de retorno de longitud de onda \lambdaa hasta puntos sobre una superficie situada a una distancia f3 desde la lente del sistema de detección. Tal como se muestra en las figuras 5-7, se proporciona un prisma 100 entre la lente 46 del sistema de detección y una superficie 102 de detección. El prisma 100 desvía el haz luminoso de autoenfoque de retorno sobre la superficie 102 de detección situada a la distancia f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección. La distancia f3 focal mostrada en la figura 5 corresponde a la distancia focal de la combinación de la lente 46 del sistema de detección y el prisma 100. La selección de la distancia f3 focal se tratará a continuación.

El sistema 98 de detección de autoenfoque incluye además pares de diodos. Se pueden situar pares de diodos tales como 104 y 106 en ambos lados del eje 64 óptico sobre la superficie 102 de detección, tal como se muestra en la figura 5. En el ejemplo mostrado en las figuras 5-7, el primer par 104 de diodos incluye un primer diodo 108 y un segundo diodo 110 y el segundo par 106 de diodos incluye un tercer diodo 112 y un cuarto diodo 114. En las figuras 5-7, el primer par 104 de diodos que incluye el primer y segundo diodos 108 y 110 se sitúan en el lado izquierdo del segundo eje 64 óptico, tal como se muestra en la figura 5, y el segundo par 106 de diodos que incluye el tercer y cuarto diodos 112 y 114 se sitúan en el lado derecho del segundo eje 64 óptico.

Las figuras 5, 6A y 7A ilustran aspectos del dispositivo 98 de detección de autoenfoque cuando el plano 16 de muestra se sitúa a la distancia f1 focal desde la lente objetivo de modo que la imagen resultante del plano 20 de imagen está enfocada. Cuando el plano 16 de muestra está situado adecuadamente para el enfoque, el haz luminoso de iluminación que se dirige hacia la lente 46 del sistema de detección está normalmente colimado tal como se muestra en la figura 6A. La lente 46 del sistema de detección proyecta entonces el haz luminoso de autoenfoque hasta el prisma 100, de la manera que se muestra en las figuras 5 y 6A. En el ejemplo mostrado, el haz luminoso de autoenfoque se divide por el prisma 100 en un primer haz 118 luminoso y un segundo haz 120 luminoso.

Cuando el plano 16 se sitúa apropiadamente para el enfoque, el primer haz 118 luminoso enfocará exactamente sobre la superficie 102 de detección situada a la distancia f3 focal desde la lente 46 del sistema de detección, tal como se muestra en las figuras 5 y 6A. El primer haz 118 luminoso creará un primer punto 122 luminoso a medio camino entre el primer diodo 108 y el segundo diodo 110, tal como se observa mejor en la vista frontal de los diodos en la figura 7A. El segundo haz 120 luminoso creará un segundo punto 124 luminoso a medio camino entre el tercer diodo 112 y el cuarto diodo 114, tal como se muestra mejor en la figura 7A. Los puntos luminosos sobre los diodos serán relativamente pequeños porque cada haz luminoso está en un mínimo en la superficie 102 de detección. El plano de muestra se enfocará apropiadamente cuando se creen puntos luminosos como los mostrados en la figura 7A.

Las figuras 6B y 7B ilustran aspectos del sistema de detección cuando el plano 16 de muestra se sitúa más lejos que la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo. Cuando el plano 16 de muestra se sitúa demasiado lejos desde la lente objetivo, el haz luminoso de autoenfoque de retorno normalmente no estará colimado (tal como se muestra en la figura 6B). La lente 46 del sistema de detección proyecta entonces el haz luminoso de autoenfoque hasta el prisma, en el que se divide el haz en el primer y segundo haces 118 y 120, respectivamente. En la realización mostrada en la figura 6B, el primer haz 118 luminoso está a un diámetro mínimo y forma un plano 130 de imagen (mostrado en líneas discontinuas) en un punto y1 situado a una distancia d3 desde la superficie 102 de detección (también denominado como el plano de imagen deseado). Debido a que el primer haz 118 luminoso no está a un diámetro mínimo en la superficie 102 de detección, el punto 122 luminoso formado sobre los diodos es relativamente más grande que el punto luminoso mostrado en la figura 7A. Tal como se muestra en las figuras 6B y 7B, el segundo haz 120 luminoso está a un diámetro mínimo en el plano 130 de imagen en un punto y2 situado a la distancia d3 desde la superficie 102 de detección. Tal como se muestra en la figura 7B, los puntos 122 y 124 luminosos se moverán hacia dentro con respecto a los puntos luminosos de la figura 7A.

Cuando el plano de muestra está demasiado lejos de la lente objetivo tal como se describió anteriormente, los puntos 122 y 124 luminosos se forman principalmente sobre el segundo diodo 110 y el tercer diodo 112, respectivamente, tal como se muestra mejor en la figura 7B. El sistema de detección de autoenfoque mide el valor de intensidad en cada uno de los diodos y determina el valor d3 de desplazamiento del haz luminoso de autoenfoque desde la superficie 102 de referencia. El controlador 70 de retroalimentación envía entonces una señal de tensión de retroalimentación hasta el sistema 72 de corrección del foco para ajustar la distancia entre la lente 14 objetivo y el plano 16 de muestra, tal como se trató previamente. El plano 16 estará enfocado apropiadamente cuando la suma de la intensidad medida en los diodos primero y cuarto sea igual a la suma de la intensidad medida en los diodos segundo y tercero.

Las figuras 6C y 7C ilustran aspectos del dispositivo 98 de detección de autoenfoque cuando el plano 16 se sitúa más cerca de la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo. Cuando la superficie se sitúa demasiado cerca de la lente objetivo, el haz luminoso de autoenfoque de retorno normalmente tampoco estará colimado (tal como se muestra en la figura 6C). En la realización mostrada en la figura 6C, el primer haz 118 luminoso está en un diámetro mínimo y forma un plano 132 de imagen en un punto z1 localizado a una distancia d3 por detrás de la superficie 102 de detección (plano de imagen deseado). El punto 122 luminoso formado sobre los diodos es relativamente más grande que el punto luminoso formado en la figura 7A porque el haz 118 luminoso no está en un diámetro mínimo aún cuando choca contra la superficie 102 de detección. El segundo haz 120 luminoso se corta y forma un plano de imagen en un punto z2 situado a la distancia d3 por detrás de la superficie 102 de detección, tal como se muestra en la figura 7C. Tal como se muestra en la figura 7C, los puntos 122 y 124 luminosos se moverán hacia fuera desde el segundo eje 64 óptico con respecto a los puntos luminosos de la figura 7A. Los puntos luminosos 122 y 124 se forman principalmente sobre el primer diodo 108 y el segundo diodo 114, respectivamente, tal como se muestra mejor en la figura 7C.

En la disposición tratada anteriormente, la distancia focal de la lente 46 del sistema de detección y el prisma 100 se debe seleccionar de modo que los puntos 122 y 124 luminosos se puedan detectar por los diodos. Los puntos luminosos se deben dimensionar adecuadamente de modo que los pares de diodos puedan tomar lecturas precisas de la intensidad luminosa. En una disposición de diodos típica, los puntos luminosos serán detectables si tienen un tamaño de aproximadamente 10 \mum. Se conocen redes de diodos con un tamaño de píxel de aproximadamente 5 \mum. En aplicaciones con disposiciones de diodos fragmentadas tales como las mostradas en las figuras 5-7 (y figura 8), se pueden medir desplazamientos de haz del orden de 0,1 \mum. Esto corresponde a una precisión en la distancia f1 focal y el posicionamiento del plano de muestra inferior a 1,0 \mum en un ejemplo del sistema de autoenfoque.

El sistema 34 de corrección de enfoque de las figuras 5-7 funcionará tal como se describió previamente con el fin de enfocar rápidamente el sistema óptico sobre el plano 16 de muestra y obtener una imagen enfocada.

En las figuras 8A-8D se muestra otra realización del dispositivo de detección de autoenfoque según la presente invención. En este ejemplo, el sistema 108 de detección de autoenfoque incluye una lente del sistema de detección similar a la descrita previamente, así como una lente cilíndrica y un fotodiodo cuádruple. Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en las figuras 8A-8D, se sitúa una lente 140 cilíndrica entre la lente 46 del sistema de detección y una superficie 142 de detección con un fotodiodo 144 cuádruple. La superficie 142 de detección se sitúa preferiblemente exactamente a la distancia f3 focal de la lente 46 del sistema de detección. Tal como se ilustra en la figura 8B, el fotodiodo 144 cuádruple incluye el primer, segundo, tercero y cuarto segmentos 146, 148, 150 y 152 de diodo, respectivamente. La lente 46 del sistema de detección y la lente 140 cilíndrica proyectan el haz luminoso de autoenfoque sobre la superficie 142 de detección para formar un punto 154 luminoso sobre el diodo 144 cuádruple situado sobre la superficie 142 de detección.

El diodo 144 cuádruple determina el desplazamiento d3 de la imagen con respecto a la superficie 142 de detección midiendo la intensidad luminosa en cada uno de los cuatro segmentos 146, 148, 150 y 152 de diodo. La lente 140 cilíndrica cambia la forma de un punto 154 luminoso dependiendo de la posición del plano de muestra con respecto a la lente objetivo. La figura 8B ilustra la posición del punto 154 luminoso cuando el plano 16 de muestra está situado apropiadamente a la distancia f1 desde la lente 14 objetivo. El punto luminoso se situará sustancialmente en el centro de los cuatro diodos. La figura 8C muestra la posición del punto luminoso cuando el plano 16 de muestra se sitúa a una distancia menor que la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo. El punto luminoso será elipsoidal, estando localizada la mayor parte del punto luminoso sobre el segundo segmento 148 de diodo y el tercer segmento 150 de diodo, tal como se muestra en la figura 8C. Basándose en la intensidad medida de los segmentos de diodo, el controlador 70 de retroalimentación calcula la distancia d3 de la imagen con respecto a la superficie 142 de detección.

La figura 8D ilustra la posición del punto luminoso cuando el plano de imagen está situado apropiadamente a una distancia mayor que la distancia f1 focal desde la lente 14 objetivo. El punto luminoso será elipsoidal, estando localizada la mayor parte del punto luminoso sobre el primer segmento 146 de diodo y el cuarto segmento 152 de diodo.

En este ejemplo, el controlador 70 de retroalimentación genera una señal que se va a enviar al dispositivo de ajuste del foco para controlar la distancia entre la lente 14 objetivo y el plano 16 de muestra de manera similar a la descrita para los tres primeros ejemplos.

El sistema de autoenfoque de la presente invención es adecuado para una amplia gama de aplicaciones además de los ejemplos descritos anteriormente. La selección y disposición de las fuentes luminosas depende de la clase de microscopía que se elige. Aunque el sistema de autoenfoque descrito anteriormente se trata principalmente en relación con la microscopía de fluorescencia, la presente invención también es adecuada con otros tipos de microscopía tales como la microscospía de transiluminación y de obtención de imágenes por luminiscencia.

En la microscopía de transiluminación, la fuente de iluminación entrará desde el lado izquierdo del plano de muestra de una manera conocida en la técnica. El divisor 12 de haz tal como se muestra en las figuras, ya no será necesario. La fuente de iluminación puede ser una lámpara con un amplio espectro (es decir, el espectro visible), una lámpara filtrada mediante un filtro de paso de banda estrecho, o un rayo de láser. En un sistema de transiluminación, puede ser deseable añadir filtros apropiados entre el divisor 44 de haz y la lente 18 de imagen en la figura 3A. Esta ayuda evita que se escape nada del haz luminoso de autoenfoque a través del divisor 44 de haz. Cuando se elige luz visible como el haz de excitación, el haz luminoso del sistema de autoenfoque se puede elegir en el intervalo infrarrojo. En un ejemplo que tiene un espectro de excitación estrecho alrededor de 550 nm, se puede utilizar un haz luminoso de aproximadamente 633 nm para el sistema de autoenfoque. Estos valores se muestran con fines de ilustración solamente.

En la microscopía de obtención de imágenes de luminiscencia, el objeto emite luz sin la necesidad de un haz de excitación. Tal como se describió previamente, un divisor de haz tal como el divisor 12 de haz en la figura 3A, no se necesita ya. La longitud de onda del haz luminoso de autoenfoque se elige preferiblemente para que esté suficientemente alejada de la longitud de onda de luminiscencia del plano de muestra. En tal disposición, la luz ambiental puede ayudar en la iluminación de la superficie. El propio objeto se puede referir como que es la fuente de iluminación en una microscopía de obtención de imágenes de luminiscencia.

Tal como se trató previamente, se utiliza normalmente una lámpara o láser como la fuente luminosa de iluminación. Si se elige la lámpara, se añaden filtros para seleccionar el espectro necesario para la aplicación. Si se elige un láser, el tipo de láser depende de la longitud de onda y la potencia necesarias para la aplicación específica. Láseres especialmente adecuados para la presente invención incluyen, por ejemplo, láseres de Ar^{+} y Kr^{+}. Estos láseres normalmente pueden emitir luz a varias longitudes de onda diferenciadas sobre el espectro y son muy versátiles para su uso en un gran número de aplicaciones. Otros tipos de sistemas de láser, tales como un sistema de oscilador paramétrico óptico, también son adecuados con la presente invención.

En todas las técnicas de autoenfoque descritas anteriormente, el plano de muestra se puede situar en cualquier superficie externa de la muestra o en un plano en el interior de la muestra. En una técnica adecuada para la presente invención, la superficie de la muestra se utiliza como referencia y el haz luminoso dirigido en la muestra se desvía en una cierta cantidad con el fin de explorar (o enfocar) sobre un plano en el interior de la muestra. Esta técnica es particularmente adecuada para enfocar el interior de una célula.

Según otros aspectos de la invención, se proporciona un método para enfocar automáticamente una imagen de un plano de objeto en un microscopio. Generalmente, los métodos que concuerdan con los principios de la invención incluyen: generar un haz luminoso de autoenfoque; dirigir el haz luminoso de autoenfoque contra el plano de objeto que va a examinarse; y reflejar el haz luminoso de autoenfoque fuera del plano del objeto. El haz luminoso de autoenfoque reflejado se dirige entonces hasta un sistema de detección, en el que al menos un detector o sensor luminoso del sistema de detección detecta el haz luminoso de autoenfoque reflejado. Posteriormente, se determina la cantidad de desplazamiento del plano de imagen del haz luminoso de autoenfoque reflejado desde un plano de referencia deseado basándose en el haz luminoso de autoenfoque detectado. Con esta información, se puede enfocar el plano de objeto para crear una imagen enfocada apropiadamente.

En métodos coherentes con los principios de la invención, la etapa de detección puede incluir transmitir el haz luminoso de autoenfoque reflejado al menos parcialmente a través de una abertura de un iris y medir la intensidad luminosa del haz luminoso de autoenfoque reflejado que se transmite a través de la abertura con el detector o sensor luminoso del sistema de detección. Alternativamente, en métodos coherentes con los principios de la invención, la etapa de determinación puede incluir comparar las intensidades luminosas del haz luminoso de autoenfoque reflejado detectado por una pluralidad de detectores o sensores luminosos.

A modo de ejemplo no limitante, la figura 9 ilustra un método coherente con los aspectos de la invención para enfocar automáticamente una imagen de un plano de objeto en un microscopio. La realización de la figura 9 se puede poner en práctica con los sistemas de autoenfoque y las características tratadas en relación con las figuras 3-4. Tal como se ilustra en la figura 9, se genera un haz luminoso de autoenfoque en la etapa 300. Por ejemplo, el haz 40 luminoso de autoenfoque se puede generar por una fuente 39 de haz luminoso de autoenfoque, tal como se muestra en las figuras 3-4. A continuación, en la etapa 310, el haz luminoso de autoenfoque se dirige hasta un plano de objeto, tal como el plano 16 de objeto en las figuras 3-4. Posteriormente, en la etapa 320, el haz 40 luminoso de autoenfoque se refleja fuera del plano de objeto y se dirige hacia un sistema de desviación tal como el sistema 32 de detección en la figura 3A. El haz luminoso de autoenfoque reflejado se transmite entonces a través de un iris del sistema de detección, en la etapa 330. Por ejemplo, en la figura 3A, el haz 40 luminoso de autoenfoque se transmite a través del iris 60.

Tal como se muestra adicionalmente en la figura 9, tras transmitir el haz luminoso de autoenfoque a través del iris del sistema de detección, el haz luminoso de autoenfoque se detecta con un detector o sensor luminoso del sistema de detección, en la etapa 340. Para poner en práctica esta etapa, se puede seleccionar un detector luminoso tal como cualquiera de la variedad de tipos mostrados en las figuras 3-4. Además, para poner en práctica la etapa 330, se puede proporcionar un iris tal como el mostrado en las figuras 3-4. Por ejemplo, en la realización de la figura 3A, el detector 62 luminoso se sitúa adyacente a la abertura del iris 60 y el iris se sitúa aproximadamente a la distancia focal desde la lente 46 del sistema de detección. Alternativamente, tal como se muestra en la figura 4A, el iris 80 se puede situar de tal manera que está desplazado desde la distancia focal desde la lente 46 del sistema de detección, y un detector 84 luminoso se sitúa adyacente a la abertura del iris.

Tras detectar la intensidad luminosa del haz luminoso de autoenfoque reflejado, se determina la cantidad de desplazamiento de un plano de imagen desde un plano de referencia deseado, tal como se representa en la etapa 350 de la figura 9. Una vez más, se pueden utilizar las características y técnicas descritas anteriormente con relación a las figuras 3-4 para determinar la cantidad de desplazamiento del plano de imagen basado en la intensidad luminosa detectada del haz luminoso de autoenfoque. En la etapa 360, con el desplazamiento determinado del plano de imagen, se enfoca entonces el plano de objeto con el fin de crear una imagen enfocada apropiadamente. Con este fin, el controlador 70 de retroalimentación y el dispositivo 72 de ajuste del foco de las figuras 3-4 se pueden utilizar para ajustar la distancia entre la lente objetivo y el plano de muestra u objeto.

La figura 10 ilustra otro método para enfocar automáticamente una imagen de un plano de objeto en un microscopio. El método de la figura 10 se puede poner en práctica con los sistemas de autoenfoque y las características descritas anteriormente en relación con las figuras 5-8. En el método ilustrado en la figura 10, se genera un haz luminoso de autoenfoque en la etapa 400. Por ejemplo, se genera el haz 40 luminoso de autoenfoque por una fuente 39 de haz luminoso de autoenfoque, tal como se muestra en las figuras 5-8. En la etapa 410, el haz luminoso de autoenfoque se dirige entonces hasta un plano de objeto, tal como el plano 16 de objeto. Posteriormente, en la etapa 420, el haz 40 luminoso de autoenfoque se refleja fuera del plano de objeto y se dirige hacia un sistema de desviación. Tal como se muestra en la etapa 430 en la figura 10, el haz luminoso de autoenfoque reflejado se hace entonces que se detecte por una pluralidad de detectores o sensores luminosos. Para poner en práctica las etapas 420 y 430, se puede proporcionar una disposición de sensores tal como se muestra en cualquiera de las realizaciones de las figuras 5-8. Por ejemplo, en las figuras 5-7, el haz luminoso de autoenfoque reflejado se puede dividir en dos haces 118 y 120 luminosos separados mediante un prisma 100, detectándose los haces luminosos por pares de diodos 104 y 106 luminosos. Alternativamente, tal como se muestra en las figuras 8A-8C, el haz luminoso de autoenfoque se puede transmitir a través de una lente 140 cilíndrica y detectar por un fotodiodo 144 cuádruple.

Tal como se muestra adicionalmente en la figura 10, tras detectar el haz luminoso de autoenfoque reflejado con los sensores, se comparan los valores de intensidad luminosa detectados por la pluralidad de sensores en la etapa 440. Por ejemplo, en las figuras 5-7, se comparan los valores de intensidad luminosa detectados por cada uno de los cuatro diodos 108, 110, 112 y 114. Alternativamente, tal como se muestra en las figuras 8A-8C, se comparan los valores de intensidad luminosa detectados por cada uno de los cuatro diodos 146, 148, 150 y 152. Tras compararse los valores de intensidad luminosa, se determina la cantidad de desplazamiento de un plano de imagen desde un plano de referencia deseado en la etapa 450. Para poner en práctica esta etapa, se pueden utilizar las características y técnicas descritas anteriormente en relación con las figuras 5-8 para determinar la cantidad de desplazamiento del plano de imagen basándose en los valores comparados de los sensores. En la etapa 460, con el desplazamiento determinado del plano de imagen, se enfoca entonces el plano de objeto con el fin de crear una imagen enfocada apropiadamente. Con este fin, el controlador 70 de retroalimentación y el dispositivo 72 de ajuste del foco de las figuras 5-8 se pueden utilizar para ajustar la distancia entre la lente objetivo y el plano de objeto.

El método según la presente invención es evidente a partir del aparato descrito anteriormente. También se pueden realizar otras variaciones al método de la presente invención.

El método de autoenfoque se refiere en particular a métodos y aparato de autoenfoque adecuados para detectar, caracterizar y cuantificar materia particulada suspendida en un fluido. Más específicamente, la invención proporciona un sistema de autoenfoque para detectar materiales particulados, particularmente células, suspendidos en un fluido, especialmente un fluido biológico. Más en particular, la invención proporciona una plataforma de autoenfoque para obtener imágenes de un ensayo basado en la unión por afinidad.

Este descubrimiento de fármacos modernos está limitado por el rendimiento de los ensayos que se utilizan para seleccionar compuestos que podrían tener efectos deseados. En particular, la selección del máximo número de compuestos diferentes necesita reducir los requisitos de tiempo y trabajo asociados con cada selección. En muchos casos, los volúmenes de reacción son muy pequeños para representar las cantidades pequeñas de los compuestos de prueba que están disponibles. La selección al microscopio de tal compuesto con pequeños volúmenes de muestra da como resultados errores asociados con imágenes desenfocadas. Como estas imágenes, en general, son los únicos resultados medidos, se realizan investigaciones adicionales en las mismas tales como cálculos por ordenador.

En las pruebas de selección de alto rendimiento, la velocidad para obtener y mantener el autoenfoque es un factor importante. En muchas realizaciones, las muestras estarán contenidas en placas de microtitulación de múltiples pocillos habituales, teniendo cada placa una serie de pocillos, tales como las que tienen 96, 384, 1536 o un número superior de pocillos. Las placas de microtitulación de 96 pocillos habituales que son de 86 mm por 129 mm, con pocillos de 6 mm de diámetro con una separación entre agujeros de 9 mm, se utilizan por su compatibilidad con sistemas de manejo robótico y carga automatizada actuales. Otras microplacas conocidas son normalmente de 20 mm por 30 mm, con localizaciones celulares que son de dimensiones de aproximadamente 100 a 200 micras y que tienen una separación entre agujeros de aproximadamente 500 micras. Ambos términos "pocillo" y "micropocillo" se refieren normalmente a una localización específica en una red de cualquier construcción a la que se adhieren células y dentro de la que se obtienen imágenes de las células.

Se pueden proporcionar procedimientos de equipo lógico informático a elección del usuario con el fin de obtener que se mueva en un eje Z a través de varias posiciones diferentes, adquiera una imagen en cada posición y encuentre el máximo de un foco calculado que estima el contraste de cada imagen.

La presente invención también se refiere a un microscopio mejorado que comprende un aparato de autoenfoque para visualizar un plano de muestra. El aparato de autoenfoque según se explicó en combinación con las figuras 1-10 se puede incluir dentro o fuera del alojamiento del microscopio. Según la presente invención, el microscopio incluye una pluralidad de lentes situadas a lo largo de un eje óptico principal, un brazo de sonda que soporta la pluralidad de lentes, un soporte sobre el que se sitúa un plano de muestra que se va a examinar, y un dispositivo de salida óptico para crear una imagen del plano de muestra sobre un plano de imagen. En la realización mostrada, el eje óptico principal está desplegado y se extiende sustancialmente a lo largo de un único plano. Tal como se realiza en el presente documento y se muestra en las figuras 11-12, el microscopio 200 incluye un brazo 213 de sonda. Se sitúa una serie de lentes y otros dispositivos ópticos a lo largo del eje 202 óptico principal. En el ejemplo mostrado en la figura 11, la serie de lentes incluye un filtro 204 de emisión, una lente 206 de tubo, una entrada 208 de iluminación, una lente 210 de retransmisión y una lente 212 de cuerpo. Se puede situar cualquier variedad de dispositivos ópticos a lo largo del eje óptico principal en el brazo 213 de sonda.

En el ejemplo mostrado en la figura 11, se sitúa un espejo 214 de reflexión pura hacia el extremo del brazo de sonda más próximo al objeto que va a explorarse. La superficie del espejo 214 está formando un ángulo con respecto al eje 202 óptico principal de modo que los haces luminosos a lo largo del eje 202 óptico principal se puedan reflejar hacia una lente 220 objetivo y sobre el plano 216 de objeto. En el ejemplo mostrado en la figura 11, el espejo 214 forma un ángulo de, por ejemplo, 45 grados de modo que la luz procedente del plano de objeto se reflejará de vuelta hasta el espejo y a lo largo del eje 202 óptico principal para formar una imagen. La muestra u objeto que se va a examinar se puede situar directamente sobre una superficie 221 de exploración correspondiente al plano 216 de objeto. La superficie del objeto puede corresponder a la superficie del objeto real o a un plano dentro del objeto. Como estos objetos o muestras pueden tener una profundidad considerable, la velocidad de autoenfoque se puede aumentar además mediante una imagen en volumen. Tal imagen en volumen se puede obtener observando un objeto de imagen en cada plano de imagen de una pluralidad de planos de imagen, en la que cada plano de imagen está desplazado verticalmente con respecto a cada uno de los demás planos de imagen. Alternativamente, la superficie del objeto puede corresponder a la superficie 221 de exploración sobre la que se sitúa la muestra. Las muestras (u objetos) se pueden situar en dispositivos de sujeción de muestras tales como una o más placas 218 de microtitulación mostradas en las figuras 11 y 12. Las placas 218 de microtitulación y las muestras se soportan mediante un soporte 219, tal como se muestra en la figura 12. El soporte 219 está montado y sujeto de manera rígida a una fase 240 de exploración que está unida a una primera mesa 242. El soporte 219 mantiene las muestras de modo que están físicamente aisladas del microscopio, por motivos que se tratarán a continuación. La superficie 221 de exploración puede comprender una mesa móvil en un movimiento X, X-Y o X-Y-Z.

El microscopio de la realización mostrada en la figura 11 incluye además un segundo espejo 222 de reflexión pura en la parte más a la izquierda del eje 202 óptico principal del brazo 213 de sonda. La luz reflejada fuera del segundo espejo 222 de reflexión pura se dirige hacia una primera salida 230 de video y un primer plano 232 focal de video. El microscopio también incluye una segunda salida 234 de video y un montaje 236 de ocular con un plano 238 de imagen. Tal como se conoce en la técnica, el plano de imagen puede ser cualquier posición en la que se sitúa el ojo de un observador, o un lugar en el que se coloca una cámara o dispositivo de detección de imágenes.

El microscopio está configurado preferiblemente de modo que el brazo 213 de sonda tenga una forma alargada tal como se muestra en las figuras 11-12. Esto se consigue diseñando el brazo de sonda de modo que el eje 202 óptico principal esté desplegado. La forma alargada y el eje principal desplegado son particularmente deseables con el fin de minimizar la transmisión de vibraciones desde estructuras de generación de vibración adyacentes al brazo de sonda por motivos que se tratarán a continuación. La segunda realización de la presente invención también es adecuada para dispositivos de microscopio que exploran la imagen del objeto. Durante la exploración, los motores de exploración normalmente generan vibraciones indeseables. Si la fase de exploración con los motores de exploración se sitúa en o contra el brazo de sonda del microcopio, las vibraciones de los motores se transmiten normalmente al microscopio, dando como resultado imágenes de baja calidad.

El diseño alargado del microscopio permite el montaje del microscopio en una mesa separada de la mesa en la que se monta la fase de exploración. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 12, la fase 240 de exploración para un microscopio se puede situar sobre la primera mesa 242 y el microscopio 200 se puede situar sobre una mesa 244 separada. La primera mesa 242 puede tener una estructura de mesa pesada o robusta y la fase 240 de exploración se puede unir de manera rígida o fijar a la superficie de la primera mesa. Tal como se muestra adicionalmente en la figura 12, las placas 218 de microtitulación se pueden soportar mediante la estructura 219 de soporte sobre la fase 240 de exploración, de modo que las placas están aisladas físicamente del brazo 213 de sonda del microscopio. De esta manera, no se transmiten las vibraciones procedentes de la fase 240 de exploración al microscopio 200. Por tanto, debido a que hay una falta de vibraciones en el microscopio, será más fácil obtener una imagen enfocada de la muestra mediante procesos manuales o automáticos.

En el ejemplo mostrado en las figuras 11-12, el eje 202 óptico principal del microscopio está configurado para que sea paralelo al plano 216 de objeto. Esta configuración, junto con el brazo de sonda alargado, permite que el observador se coloque a una distancia sustancial de las muestras que se están observando. Esto puede ser particularmente deseable si se trata con muestras que implican productos químicos tóxicos, o si las muestras se deben situar en una sala o cámara aislada que se retira del área en la que se localiza el observador. Además, se pueden cambiar los elementos ópticos sin tener que entrar en la sala o cámara aislada. Como resultado, el microscopio mejorado de la presente invención permite la microscopía para una gama más amplia de tipos de muestra.

El brazo de sonda alargado y el microscopio de las figuras 11-12 también tienen otros beneficios. Por ejemplo, el brazo de sonda más largo permite explorar objetos más grandes con el microscopio. El brazo de sonda más largo también permite que se exploren varios objetos de una vez, sin descargar y volver a cargar la fase de exploración. Además, el brazo de sonda más largo permite que los elementos ópticos sean más accesibles. Debido al diseño, también es más fácil incorporar elementos ópticos adicionales al brazo de sonda del instrumento. El brazo de sonda más largo también permite que se incluyan accesorios adicionales, tales como el sistema de autoenfoque de la primera realización de la invención.

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en las realizaciones descritas referentes a un aparato para enfocar automáticamente un instrumento óptico sobre un plano de objeto, un método para enfocar automáticamente un instrumento óptico sobre un plano de objeto y un microscopio para enfocar un plano de objeto, uso del aparato de la presente invención y en la construcción de este aparato, sin salir del alcance o el espíritu de la invención. Las características y aspectos de las realizaciones descritas se pueden combinar, modificar o sustituir para proporcionar ventajas y características adicionales.

Por ejemplo, aunque se describen las características de la invención con referencia a haces luminosos de autoenfoque e iluminación que son de longitudes de onda diferentes para permitir el funcionamiento simultáneo, naturalmente es posible seleccionar haces luminosos que son de la misma longitud de onda o similar. En tal caso, las características de la invención se pueden poner en práctica en un modo asíncrono, en el que el haz luminoso de autoenfoque se genera y aplica en un tiempo diferente al del haz luminoso de iluminación. También es posible poner en práctica los haces luminosos y características de la invención en un modo asíncrono, independientemente de las longitudes de onda de los haces luminosos (es decir, independientemente de si el haz luminoso de autoenfoque y el haz luminoso de iluminación tienen la misma longitud de onda o diferentes).

Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descrita en el presente documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren a modo de ejemplo solamente, estado indicado el verdadero alcance de la invención por las reivindicaciones siguientes.

Claims (13)

1. Un microscopio adecuado para la selección de alto rendimiento, que comprende:

- un sistema de obtención de imágenes para crear una imagen de un plano (216) de objeto utilizando un haz (52) luminoso de iluminación de una primera longitud de onda, que comprende una pluralidad de lentes (206) (210) (212) situadas a lo largo de un eje (202) óptico principal del microscopio, y un dispositivo (230) de salida óptico para crear una imagen del plano de objeto sobre el plano (232) de ima-
gen;

- un sistema para enfocar automáticamente dicha imagen en dicho microscopio, comprendiendo dicho sistema para enfocar automáticamente:

-

un haz (40) luminoso de autoenfoque de una segunda longitud de onda, dirigiéndose el haz luminoso de autoenfoque para reflejarse fuera del plano (16) de objeto;

-

un dispositivo (50) de detección de autoenfoque que comprende una lente (46) del sistema de detección para recibir el haz luminoso de autoenfoque reflejado y dirigir el haz luminoso de autoenfoque reflejado sobre una superficie (142) de detec-ción;

- una pluralidad de sensores (108, 110, 112, 114) luminosos adaptados para medir la intensidad luminosa del haz luminoso de autoenfoque reflejado en dicha superficie (142) de detección, en el que se determina la distancia que la imagen del plano (216) de objeto se desplaza desde una superficie (23) de referencia de foco deseada comparando las intensidades medidas por la pluralidad de sensores;

caracterizado porque el sistema de obtención de imágenes comprende además:

- un brazo (213) de sonda que soporta la pluralidad de lentes, extendiéndose dicho brazo de sonda generalmente a lo largo del eje (202) óptico principal; y

- una fase (240) de exploración y un soporte (219) sobre el que se sitúa un objeto con el plano (216) de objeto que se va a examinar, en el que el plano (216) de objeto se extiende sustancialmente a lo largo de un plano focal que se observa a través del microscopio; y

en el que el plano (216) de objeto es sustancialmente paralelo al eje (202) óptico principal.

2. El microscopio según la reivindicación 1, en el que la fase (240) de exploración y el soporte (219) se sitúan en una mesa (242) separada de la mesa (244) del brazo (213) de sonda del microscopio, de tal manera que el brazo (213) de sonda está aislado sustancialmente de las vibraciones producidas por la fase (240) de exploración.

3. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el brazo (213) de sonda está situado entre el objeto que se va a examinar y la fase (240) de exploración.

4. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el brazo (213) de sonda es sustancialmente alargado de modo que el dispositivo (230) de salida óptico se sitúa alejado del objeto que va a examinarse.

5. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el objeto se sitúa en un dispositivo (218) de sujeción de muestras tal como una o más placas de microtitulación.

6. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dispositivo (50) de detección de autoenfoque comprende además un prisma (100) situado entre la lente (46) del sistema de detección y la pluralidad de sensores (108, 110, 112, 114) luminosos, estando configurado dicho prisma (100) para dividir el haz de autoenfoque en dos haces (118) (120) separados, comprendiendo la pluralidad de sensores luminosos al menos dos pares (104, 106) de sensores, estando el primer par (104) de sensores sustancialmente alineado con un primer haz (118) luminoso procedente del prisma, estando el segundo par (106) de sensores sustancialmente alineado con un segundo haz (120) luminoso procedente del prisma, midiendo dichos pares de sensores la intensidad del haz luminoso que choca con cada par de senso-
res.

7. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el sistema de obtención de imágenes comprende además una lente (14) objetivo y en el que el dispositivo de detección de autoenfoque comprende además una lente (140) cilíndrica situada entre la lente (46) del sistema de detección y la pluralidad de sensores (108, 110, 112, 114) luminosos, estando configurada dicha lente (140) cilíndrica para cambiar la forma de un punto luminoso sobre la pluralidad de diodos (108, 110, 112, 114) cuando cambia la distancia entre el plano (16) de objeto y la lente (14) objetivo del sistema de obtención de imágenes.

8. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la pluralidad de sensores luminosos comprende un fotodiodo (144) cuádruple con cuatro segmentos (146) (148) (150) (152) de diodo distintos.

9. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el sistema para enfocar automáticamente comprende un controlador (70) de retroalimentación y un dispositivo (72) de ajuste del foco para ajustar automáticamente la distancia entre la lente (14) objetivo y el plano (16) de objeto, basándose en el haz luminoso de autoenfoque reflejado detectado por dichos sensores luminosos, con el fin de enfocar apropiadamente la imagen en el sistema de obtención de imágenes.

10. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el dispositivo (72) de ajuste del foco está configurado para ajustar la posición de la lente (14) objetivo con el fin de enfocar apropiadamente el sistema de obtención de imágenes sobre el plano (16) de objeto.

11. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que incluye además un segundo eje (64) óptico, estando situado el segundo eje óptico entre el plano focal y el eje (202) óptico principal, siendo el segundo eje óptico sustancialmente perpendicular al eje óptico principal.

12. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además un tercer eje óptico, estando situado el tercer eje óptico entre el eje (202) óptico principal y el plano de imagen en el dispositivo de salida óptico, estando configurado el tercer eje óptico a un ángulo con respecto al eje óptico principal.

13. El microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el haz (52) luminoso de iluminación y el haz (40) luminoso de autoenfoque se seleccionan para tener diferentes longitudes de onda de modo que los haces luminosos no interfieran entre sí.