JP2005345716A

JP2005345716A - 顕微鏡

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Publication number: JP2005345716A
Application number: JP2004164631A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Hasegawa; 和宏長谷川; Atsuhiro Tsuchiya; 敦宏土屋
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-06-02
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2005-12-15
Also published as: EP1602960B1; US20050224692A1; EP1602960A1

Abstract

【課題】標本に照射する光の波長の高速での切り換えとムラの少ない照明と撮像装置のダイナミックレンジを十分に活用した画像取得とが可能な顕微鏡を提供する。
【解決手段】蛍光顕微鏡１０１は対物レンズ１０３と投光管１０５とＣＣＤカメラ１２２とを備えている。投光管１０５にはリヤコンバーター１０９と波長合成器１１０と第一光源部１１１と第二光源部１１５とが取り付けられている。第一光源部１１１の第一発光ダイオード１１２と第二光源部１１５の第二発光ダイオード１１６は共に対物レンズ１０３の後側焦点に対して共役な位置関係にある。標本１２１を基準にして対物レンズ１０３の反対側に測光装置が配置されている。測光装置はピンホール１２６とフォトダイオード１２７とを有している。電源装置１１９は、フォトダイオード１２７の測光値に基づいて第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の駆動電流を制御する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡に関する。

生物分野では培養細胞を用い、生体に近い状態での実験が広く行なわれている。実験では、抗原抗体反応を利用した蛍光色素や遺伝子導入により発現した蛍光蛋白を用い、蛍光顕微鏡によって特定の部位の蛍光観察が行なわれる。例えば細胞内のイオン濃度の測定などで用いるレシオイメージング法では、高速での励起波長の切り換えが望まれる。

特開２００２−１３１６４８号公報は、励起波長の切り換え可能な観察装置を開示している。図８は、特開２００２−１３１６４８号公報に開示されている観察装置の基本構成を示している。この観察装置では、図８に示されるように、異なる波長の光を発する複数の発光ダイオード８０１と８０２と８０３が対物レンズ８０４の像側焦点面と共役面内に配置されており、蛍光色素の励起・蛍光波長に合った反射・透過特性を有するダイクロイックミラー８０５と波長選択フィルター８０６を用いることにより、機械的な切り換え部を用いないために高速での励起波長の切り換えが可能である。しかし、高輝度の発光ダイオード８０１と８０２と８０３は素子の外形が数ｍｍ程度あるため、複数の発光ダイオード８０１と８０２と８０３を共に光軸近くに配置することは困難である。これは、観察視野範囲に明るさのムラが生じる原因となる。

また、特開２００３−１９５１１７号公報は、励起波長の切り換え可能な別の観察装置を開示している。この観察装置では、異なる波長の光を発する複数の発光ダイオードを回転駆動する切り換え装置を備えており、切り換え装置によって複数の発光ダイオードの一つを選択的に光軸上に配置させることにより、異なる波長による照明ムラの少ない照明を実現している。しかし、この観察装置では、機械的な機構によって発光ダイオードを切り換えるため、高速での励起波長の切り換えは困難である。

さらにレシオイメージング法では、使用する撮像装置のダイナミックレンジを有効に利用した測定が望まれる。つまり、測光する二つの波長の光の間で一方が明るくもう一方が暗い場合に、明るい波長の光に撮像装置の感度を合わせると、暗い波長の光に対して十分な分解能を得ることができない。このため、高精度な測定ができない。
特開２００２−１３１６４８号公報特開２００３−１９５１１７号公報

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、標本に照射する光の波長の高速での切り換えとムラの少ない照明と撮像装置のダイナミックレンジを十分に活用した画像取得とが可能な顕微鏡を提供することである。

本発明は、ひとつには、顕微鏡に向けられている。本発明の顕微鏡は、標本を観察するための対物レンズと、発光波長の異なる複数の光源と、複数の光源から発せられる光を合成する波長合成器と、合成された光を対物レンズの後側焦点面に結像させる照明光学系とを備えており、複数の光源は共に波長合成器と照明光学系を介して対物レンズの後側焦点に共役な位置関係にあり、さらに、標本からの光を測光する測光装置と、対物レンズによる標本の像を撮像し外部トリガーを有する撮像装置と、測光装置の測光値に基づいて光源の駆動電流を制御する電源装置とを備えている。

本発明は、ひとつには、複数の波長の光を切り換えて標本に照射し、標本からの光の画像を取得する画像取得方法に向けられている。本発明の画像取得方法は、撮像装置による画像取り込みに同期して、標本に照射される光の波長を切り換えるとともに、標本からの光の輝度を取得し、取得した複数の輝度の相互の比を演算し、複数の輝度が互いに等しくなるように演算結果の比に基づいて複数の波長の光を発する複数の光源の駆動電流を制御する。

本発明によれば、標本に照射する光の波長の高速切り換えとムラの少ない照明と撮像装置のダイナミックレンジを十分に活用した画像取得とが可能な顕微鏡が提供される。これにより高精度な撮像が可能となる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

［第一実施形態］
［構成］
本実施形態は、生体細胞で多用される倒立型の蛍光顕微鏡に向けられている。図１は、本発明の第一実施形態の蛍光顕微鏡を示している。

図１に示されるように、倒立型の蛍光顕微鏡１０１は、標本１２１を載せる標本台１０２と、標本１２１を観察するための対物レンズ１０３と、ダイクロイックミラー１０４と、照明光学系としての投光管１０５と、吸収フィルター１０６と、反射ミラー１０７と、観察光学系１０８と、蛍光画像を撮像する撮像装置としてのＣＣＤカメラ１２２とから構成されている。投光管１０５には光源装置が取り付けられている。光源装置は、リヤコンバーター１０９と波長合成器１１０と第一光源部１１１と第二光源部１１５とから構成されている。投光管１０５にリヤコンバーター１０９が取り付けられ、リヤコンバーター１０９に波長合成器１１０が取り付けられ、波長合成器１１０に第一光源部１１１と第二光源部１１５とが取り付けられている。第一光源部１１１と第二光源部１１５は共に点灯用の電源装置１１９に接続されている。

第一光源部１１１は、青色光を発する第一発光ダイオード１１２と、第一コリメートレンズ１１３と、第一励起フィルター１１４とから構成されている。第二光源部１１５は、赤色光を発する第二発光ダイオード１１６と、第二コリメートレンズ１１７と、第二励起フィルター１１８とから構成されている。第一光源部１１１には第一励起フィルター１１４を抜き差しするためのスロットが設けられ、同様に第二光源部１１５には第二励起フィルター１１８を抜き差しするためのスロットが設けられている。また、第一発光ダイオード１１２は第一コリメートレンズ１１３の焦点位置に固定され、同様に第二発光ダイオード１１６は第二コリメートレンズ１１７の焦点位置に固定されている。第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６は共に、投光管１０５とリヤコンバーター１０９と波長合成器１１０とを介して、対物レンズ１０３の後側焦点に対して共役な位置関係にある。

波長合成器１１０は、青色光を反射し赤色光を透過する特性を有する波長選択フィルター１２０を有している。

標本１２１を基準にして対物レンズ１０３の反対側には、測光装置が配置されている。測光装置は、コリメートレンズ１２３と、蛍光選択素子としてのマルチバンドの吸収フィルター１２４と、結像レンズ１２５と、ピンホール１２６と、測光素子としてのフォトダイオード１２７とから構成されている。ピンホール１２６は、結像レンズ１２５の焦点面に配置され、標本１２１と共役な位置関係にある。すなわち、ピンホール１２６は、標本面に共役な面上で光軸上に位置している。

電源装置１１９は駆動部１１９ａと制御部１１９ｂとを有している。第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６は駆動部１１９ａに接続され、フォトダイオード１２７は制御部１１９ｂに接続されている。また、ＣＣＤカメラ１２２の外部トリガーも制御部１１９ｂに接続されている。電源装置１１９は、フォトダイオード１２７により得られる測光値に基づいて第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の駆動電流を制御する。

［作用］
第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６から発せられた拡散光は、それぞれ、第一コリメートレンズ１１３と第二コリメートレンズ１１７によって平行光にされ、第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８に入射する。第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の光は、それぞれ、第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８にほぼ垂直に入射するため、第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８への入射角度による特性の変化がなく、良好な波長選択が可能である。一般に発光ダイオードの波長幅は半値幅で２０ｎｍないし５０ｎｍであり、励起フィルターの透過波長幅は２０ｎｍ程度である。そのため、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６から発せられた光はそれぞれ第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８によって２０ｎｍの波長幅に挟められる。明るさが必要な場合には第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８を取り外して使用してもよい。

第一励起フィルター１１４と第二励起フィルター１１８を透過した光は共に、波長合成器１１０の波長選択フィルター１２０に入射する。波長選択フィルター１２０は青色光を反射し赤色光を透過するため、第一発光ダイオード１１２の光は波長選択フィルター１２０で反射され、第二発光ダイオード１１６の光は波長選択フィルター１２０を透過する。その結果、波長選択フィルター１２０により二つの波長の光が合成される。

合成された光は、リヤコンバーター１０９によって観察範囲を照明するために必要な光束径に広げられて投光管１０５に入射する。投光管１０５に入射した光は、その内部のレンズによって収束光にされ、ダイクロイックミラー１０４で反射され、対物レンズ１０３の後側焦点面に結像され、明るさムラなく標本１２１を照明する。標本１２１が発する蛍光の一部は、対物レンズ１０３で捕獲される。蛍光の波長は励起光の波長より長いため、蛍光は、ダイクロイックミラー１０４を透過し、反射ミラー１０７で方向が変えられ、観察光学系１０８によりＣＣＤカメラ１２２に結像される。

また、標本１２１が発した蛍光の一部と励起光の一部は、コリメートレンズ１２３によって平行光にされ、吸収フィルター１２４に入射する。標本１２１が発した蛍光だけが吸収フィルター１２４を透過し、結像レンズ１２５によって光軸上に配置されたピンホールに結像される。ピンホール１２６の大きさは撮像面に対して１％程度で、標本１２１と光学的に共役な位置関係に配置されている。ピンホール１２６を透過した蛍光はフォトダイオード１２７に入射する。

一般に蛍光標本１２１では観察部位すなわち蛍光部位が散在する。このため、全体での光量に基づいて撮像装置の露出を決定すると、露出オーバーになって適正な露出が得られない。しかし、ピンホール１２６によって観察部位が配置される観察視野の中央の狭い領域だけの蛍光強度を測光することにより、バックグランドに左右されずに目的とする蛍光部位の正確な輝度測光が可能となる。つまり、散在する標本でも標本の密度に影響されない適正な測光が可能である。フォトダイオード１２７は光の強弱に応じて発生する電流値が変化する光起電素子であり、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６が発する励起光によって得られる標本の蛍光輝度に応じた電流値を得ることができる。

撮像の手順は、はじめに目的とする標本１２１の観察部位つまり蛍光部位を視野中央に移動して撮像を開始する。まず第一発光ダイオード１１２が電源装置１１９の駆動部１１９ａからの電流により点灯される。第一発光ダイオード１１２に対する標本１２１の蛍光輝度がフォトダイオード１２７によって測光される。測光値は電源装置１１９の制御部１１９ｂに転送される。ＣＣＤカメラ１２２は予めプログラムされていた時分割駆動に同期して外部トリガー信号を発する。電源装置１１９の制御部１１９ｂは外部トリガー信号に基づいて第二発光ダイオードの点灯に切り換える命令を駆動部１１９ａに発し、励起波長が切り換えられる。

第二発光ダイオード１１６に対する標本１２１の蛍光輝度が測光装置で測光される。制御部１１９ｂは、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６に対する蛍光輝度を比較し、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の蛍光輝度の比を演算する。演算結果により、低い蛍光輝度を示す発光ダイオードが決定され、両者の蛍光輝度が等しくなるように低い蛍光輝度を示す発光ダイオードの駆動電流値に演算結果の比が積算される。これより、以後の測定では、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６による蛍光輝度は等しくなり、ＣＣＤカメラ１２２はダイナミックレンジを広範囲に使用した状態で蛍光画像を撮像する。細胞への試薬の投与などの実験を開始し、ＣＣＤカメラ１２２の撮影データはコンピューターで処理され、実験データとして活用される。

［効果］
第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６が共に対物レンズ１０３の後側焦点面と共役な面上で光軸上に配置されているため、明るさムラのない照明が可能である。機械的な切り換えによってではなく、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の電気的な切り換えによって励起波長を切り換えるため、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の高速応答性により高速な励起波長の切り換えが可能である。さらに、測光装置によって蛍光強度を測光した結果に基づいて第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６の駆動電流を調整して励起波長ごとの蛍光輝度を合わせることにより、ＣＣＤ１２２のダイナミックレンジを有効に活用した測定が可能である。

さらに、測光装置が標本１２１を基準にして対物レンズ１０３の反対側に配置されているため、対物レンズ１０３で捕獲される蛍光を損失することなく測光が可能なため、輝度の高い測定が可能となる。また、第一発光ダイオード１１２と第二発光ダイオード１１６からの光を、第一コリメートレンズ１１３と第二コリメートレンズ１１７によってそれぞれ平行光にし、波長選択フィルター１２０によって合成した後、リヤコンバーター１０９によって必要な光束径に広げることにより、第一コリメートレンズ１１３と第二コリメートレンズ１１７を小型にでき、全体の大きさを小さくできる。

［第二実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態の光源装置に代えて適用可能な別の光源装置に向けられている。図２は、本発明の第二実施形態による光源装置を示している。

図２に示されるように、本実施形態の光源装置は、波長合成器２００と第一光源部２０１と第二光源部２０２と第三光源部２０３とから構成されている。波長合成器２２０は投光管１０５に取り付けられ、波長合成器２２０に第一光源部２０１と第二光源部２０２と第三光源部２０３とが取り付けられている。

第一光源部２０１は、第一発光ダイオード２０５と第一コリメートレンズ２０８と第一励起フィルター２１１とから構成されている。第二光源部２０２は、第二発光ダイオード２０６と第二コリメートレンズ２０９と第二励起フィルター２１２とから構成されている。第三光源部２０３は、第三発光ダイオード２０７と第三コリメートレンズ２１０と第三励起フィルター２１３とから構成されている。第一発光ダイオード２０５は青色光を発し、第二発光ダイオード２０６は緑色光を発し、第三発光ダイオード２０７は赤色光を発する。発光ダイオード２０５と２０６と２０７はそれぞれコリメートレンズ２０８と２０９と２１０の焦点位置に固定されている。また、発光ダイオード２０５と２０６と２０７は共に点灯用の電源装置１１９に接続されている。

波長合成器２００は、青色光と緑色光と赤色光とを合成する色分解プリズム２０４を有している。色分解プリズム２０４は、互いに接合された三つのプリズムから構成され、それらの二つの接合面に第一ダイクロイック膜と第二ダイクロイック膜を有している。第一ダイクロイック膜は、青色光を反射し、青色光より長波長の光を透過する。第二ダイクロイック膜は、緑色光を透過し、緑色光より長波長の光を反射する。

［作用］
発光ダイオード２０５と２０６と２０７から発せられた発散光は、コリメートレンズ２０８と２０９と２１０によってそれぞれ平行光にされ、色分解プリズム２０４に入射する。青色光は、プリズムの構成面で全反射され、第一ダイクロイック膜で反射されて、色分解プリズム２０４から射出される。緑色光は、第二ダイクロイック膜と第一ダイクロイック膜を透過して、色分解プリズム２０４から射出される。赤色光は、プリズムの構成面で全反射され、第二ダイクロイック膜で反射され第一ダイクロイック膜を透過して、色分解プリズム２０４から射出される。これにより、青色光と緑色光と赤色光とが合成されて投光管１０５に入射する。

［効果］
本実施形態は、第一実施形態と同様の利点を有している。これに加えて、本実施形態では、光源部を放射状に配置できるため、より蛍光顕微鏡の小型化が可能である。

［第三実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態の光源装置に代えて適用可能な別の光源装置に向けられている。図３は、本発明の第三実施形態による光源装置を示している。

図３に示されるように、本実施形態の光源装置は波長合成器３００と接続ファイバー３０１とから構成されている。投光管１０５と波長合成器３００とは接続ファイバー３０１を介して接続されている。

接続ファイバー３０１は、ファイバー３０５と、ファイバー３０５の両端に設けられた第一ファイバー用コリメートレンズ３０２と第二ファイバー用コリメートレンズ３０３とから構成されている。ファイバー３０５の両端面は、それぞれ、第一ファイバー用コリメートレンズ３０２と第二ファイバー用コリメートレンズ３０３の焦点面に固定されている。

波長合成器３００は、第一ダイクロイックミラー３０６と第二ダイクロイックミラー３０７と、第一励起フィルター３０８と第二励起フィルター３０９と第三励起フィルター３１０と、第一コリメートレンズ３１４と第二コリメートレンズ３１５と第三コリメートレンズ３１６と、第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３と、第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３の熱を放熱するためのヒートパイプ３１７と、ヒートパイプ３１７の熱を放熱するためのヒートシンク３１８とから構成される。

第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３は、それぞれ、第一コリメートレンズ３１４と第二コリメートレンズ３１５と第三コリメートレンズ３１６の焦点位置に固定されている。第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３は共に、点灯用の電源装置１１９に接続されている。第一発光ダイオード３１１は青色光を発し、第二発光ダイオード３１２は緑色光を発し、第三発光ダイオード３１３は赤色光を発する。第一ダイクロイックミラー３０６は、青色光を反射し、青色光より長波長の光を透過する。第二ダイクロイックミラー３０７は、緑色光を反射し、緑色光より長波長の光を透過する。

［作用］
第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３から発せられた発散光は、それぞれ、第一コリメートレンズ３１４と第二コリメートレンズ３１５と第三コリメートレンズ３１６によって平行光にされ、第一励起フィルター３０８と第二励起フィルター３０９と第三励起フィルター３１０によって必要な波長だけが選択される。

第一発光ダイオード３１１からの青色光は、第一ダイクロイックミラー３０６で反射されて、第一ファイバー用コリメートレンズ３０２に向かう。第二発光ダイオード３１２からの緑色光は、第二ダイクロイックミラー３０７で反射され、第一ダイクロイックミラー３０６を透過して、第一ファイバー用コリメートレンズ３０２に向かう。第三発光ダイオード３１３からの赤色光は、第二ダイクロイックミラー３０７と第一ダイクロイックミラー３０６とを透過して、第一ファイバー用コリメートレンズ３０２に向かう。これにより第一発光ダイオード３１１と第二発光ダイオード３１２と第三発光ダイオード３１３から発せられた光が第一ダイクロイックミラー３０６と第二ダイクロイックミラー３０７によって合成される。

合成された光は、第一ファイバー用コリメートレンズ３０２によってファイバー３０５の端面に集光される。ファイバー３０５を伝送した光は、他方のファイバー３０５端面から射出され、第二ファイバー用コリメートレンズ３０３によって平行光にされ、投光管１０５に入射する。

発光ダイオードは温度により発光強度が変化するため、発光強度を安定化する目的で放熱を行なう。また、ヒートパイプは、パイプ内に封入された作動液が高温部と低音部で生じる蒸発・凝縮作用によって熱を移動させる。

［効果］
本実施形態は、第一実施形態と同様の利点を有している。これに加えて、本実施形態では、波長合成器を投光管に直接ではなくファイバーを介して取り付けて蛍光顕微鏡に光を供給するため、蛍光顕微鏡の小型化が可能である。ヒートパイプを用いることにより、空間の確保が困難な部位に設けた発光ダイオードでも放熱が可能である。また複数の発光ダイオードを単一のヒートシンクで放熱できるため、部材の共通化も可能である。

［第四実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態の光源装置に代えて適用可能な別の光源装置に向けられている。図４は、本発明の第四実施形態による光源装置を示している。

図４に示されるように、本実施形態の光源装置は波長合成器４００からなり、波長合成器４００が投光管１０５に取り付けられる。波長合成器４００は、プリズム４０１と、第一コリメートレンズ４０２と第二コリメートレンズ４０３と第三コリメートレンズ４０４と、第一発光ダイオード４０５と第二発光ダイオード４０６と第三発光ダイオード４０７とから構成されている。第一発光ダイオード４０５と第二発光ダイオード４０６と第三発光ダイオード４０７は共に電源装置１１９に接続されている。第一発光ダイオード４０５と第二発光ダイオード４０６と第三発光ダイオード４０７はそれぞれ異なる波長の光を発する。第一発光ダイオード４０５と第二発光ダイオード４０６と第三発光ダイオード４０７は、それらから発せられる複数の波長の光が共にプリズム４０１によって同一方向に屈折されるように、プリズム４０１の分光特性に合わせて配置されている。

［作用］
第一発光ダイオード４０５と第二発光ダイオード４０６と第三発光ダイオード４０７から発せられた発散光は、それぞれ、第一コリメートレンズ４０２と第二コリメートレンズ４０３と第三コリメートレンズ４０４によって平行光にされ、プリズム４０１に入射する。プリズム４０１に入射した複数の波長の光は共に、プリズム４０１の屈折作用によって同一光軸で重ねられて投光管１０５に入射する。

［効果］
本実施形態は、第一実施形態と同様の利点を有している。これに加えて、本実施形態では、一つのプリズム４０１で波長合成しているため、波長合成器４００の小型化が可能である。また発光ダイオードの追加も比較的容易に可能である。

［第五実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態の光源装置に代えて適用可能な別の光源装置に向けられている。図５は、本発明の第五実施形態による光源装置を示している。

図５に示されるように、本実施形態の光源装置は波長合成器５００からなり、波長合成器５００が投光管１０５に取り付けられる。波長合成器５００は、グレーティング５０１と、第一コリメートレンズ５０２と第二コリメートレンズ５０３と第三コリメートレンズ５０４と、第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７とから構成されている。第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７は共に電源装置１１９に接続されている。第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７はそれぞれ異なる波長の光を発する。第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７は、それらから発せられた複数の波長の光が共にグレーティング５０１によって同一方向に回折されるように、グレーティング５０１の分光特性に合わせて配置されている。

グレーティング５０１への光線の入射角をα、単位長さ当りのグレーティングの溝数をｎ、回折次数をｋ、回折角をβとすると、β＝sin^-1（ｎ・ｋ・λ−sinα）となる。つまり、回折角は波長に依存している。従って、波長に依存している回折角を考慮して、回折後の光が同一光軸で重なるように第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７が配置されている。

［作用］
第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７から発せられた散乱光は、それぞれ、第一コリメートレンズ５０２と第二コリメートレンズ５０３と第三コリメートレンズ５０４によって平行光にされ、グレーティング５０１に入射する。グレーティング５０１に入射した複数の波長の光は、波長に依存した角度でそれぞれ回折される。その結果、第一発光ダイオード５０５と第二発光ダイオード５０６と第三発光ダイオード５０７からの光は共に同一方向に回折され、同一光軸で重ねられて投光管１０５に入射する。

［効果］
本実施形態は、第一実施形態と同様の利点を有している。

［第六実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態とは異なる構成の倒立型の蛍光顕微鏡に向けられている。本実施形態は、測光装置のレイアウトの点で第一実施形態と大きく相違している。図６は、本発明の第六実施形態による蛍光顕微鏡を概略的に示している。

図６に示されるように、本実施形態の蛍光顕微鏡は、照明光学系としての投光管６０１と、ダイクロイックミラー６０２と、標本６０４を観察するための対物レンズ６０３と、測光用ダイクロイックミラー６０５と、波長選択フィルター６０６と、結像レンズ６０７と、ＣＣＤカメラ６０８と、蛍光選択素子としての吸収フィルター６０９と、結像レンズ６１０と、ピンホール６１１と、測光素子としてのフォトダイオード６１２とを備えている。測光用ダイクロイックミラー６０５と蛍光選択素子としての吸収フィルター６０９と結像レンズ６１０とピンホール６１１とフォトダイオード６１２は測光装置を構成している。ピンホール６１１は標本面に共役な面上で光軸上に位置している。投光管６０１には、図示していないが、光源装置が取り付けられる。光源装置は、第一実施形態〜第五実施形態で説明した光源装置で構成されてよい。

［作用］
投光管６０１によって収束光にされた発光ダイオードの光は、ダイクロイックミラー６０２を介して対物レンズ６０３の後側焦点面に結像して標本６０４を照明する。標本６０４から発せられた蛍光は対物レンズ６０３で捕獲されて平行光となる。蛍光は、ダイクロイックミラー６０２を透過し、測光用ダイクロイックミラー６０５に至る。測光用ダイクロイックミラー６０５は、蛍光波長の長波長域の１０％程度を透過する特性を有している。そのため、ほとんどの光は測光用ダイクロイックミラー６０５で反射され、数％の蛍光が測光用ダイクロイックミラー６０５を透過する。

測光用ダイクロイックミラー６０５で反射された光は、蛍光だけが波長選択フィルター６０６を選択的に透過し、結像レンズ６０７によってＣＣＤカメラ６０８上に結像される。

測光用ダイクロイックミラー６０５を透過した蛍光は、標本面と共役な面上で光軸上に配置されたピンホール６１１に集光する。ピンホール６１１を透過した蛍光はフォトダイオード６１２に入射する。

第一実施形態と同様に、ＣＣＤカメラ６０８の外部トリガーに同期して、発光ダイオードの切り換えを行ない、測光装置で測光した結果を、光源の制御部により発光ダイオードの駆動電流に反映し、複数の発光ダイオードによる蛍光の輝度を同等とする。

［効果］
本実施形態は、第一実施形態と同様の利点を有している。これに加えて、本実施形態では、測光装置が、光源装置やＣＣＤカメラ６０８と同じ側に配置されている。言い換えれば、標本６０４を基準にして対物レンズ６０３と同じ側に配置されている。従って、標本６０４を基準にして対物レンズ６０３の反対側に配置されるものがない。このため、他の装置の配置が容易に可能となる。

［第七実施形態］
［構成］
本実施形態は、第一実施形態とは異なる構成の倒立型の蛍光顕微鏡に向けられている。本実施形態は、投光管のレイアウトの点で第一実施形態と大きく相違している。図７は、本発明の第七実施形態による蛍光顕微鏡を概略的に示している。

図７に示されるように、本実施形態の蛍光顕微鏡は、照明光学系としての投光管７０１と、標本７０２を観察するための対物レンズ７０３と、測光素子としてのフォトダイオード７０４と、ピンホール７０５と、測光用結像レンズ７０６と、第一波長選択フィルター７０７と第二波長選択フィルター７０８と、第一発光ダイオード７０９と第二発光ダイオード７１０と、第一コリメートレンズ７１５と第二コリメートレンズ７１６と、コンデンサーレンズ７１１と、波長選択フィルター７１２と、結像レンズ７１３と、ＣＣＤカメラ７１４とから構成されている。投光管７０１は、標本７０２を基準にして対物レンズ７０３の反対側に配置されている。第一波長選択フィルター７０７と第二波長選択フィルター７０８は、それぞれ、第一発光ダイオード７０９と第二発光ダイオード７１０が発する光より５０ｎｍ以上長波長の光を透過するロングパスフィルターである。フォトダイオード７０４とピンホール７０５と測光用結像レンズ７０６は測光装置を構成している。ピンホール７０５は標本面に共役な面上で光軸上に位置している。

［作用］
第一発光ダイオード７０９と第二発光ダイオード７１０から発せられた光は、第一コリメートレンズ７１５と第二コリメートレンズ７１６によってそれぞれ平行光にされ、第一波長選択フィルター７０７と第二波長選択フィルター７０８で合成され、コンデンサーレンズ７１１の後側焦点面に集光し、ムラの少ない照明で標本７０２を照明する。標本７０２から発する蛍光の一部は、対物レンズ７０３で捕獲されて平行光にされ、波長選択フィルター７１２によって蛍光だけ選択され、結像レンズ７１３によってＣＣＤカメラ７１４に結像される。またコンデンサーレンズ７１１の側に発せられた蛍光は、コンデンサーレンズ７１１と投光管を７０１介して波長選択フィルター７０７と７０８に至る。標本７０２から発せられた蛍光の長波長成分だけが波長選択フィルター７０７と７０８を透過し、標本面に共役な面上で光軸上に配置されたピンホール７０５に集光する。第一発光ダイオード７０９と第二発光ダイオード７１０で生じる蛍光波長が近接しない場合は、第一波長選択フィルター７０７は第二発光ダイオード７１０の発する蛍光も透過する特性を付加すればよい。

［効果］
本実施形態では、第一実施形態と同様の利点が透過照明の構成で実現される。

［補足］
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

実施形態では、光源が発光ダイオードで構成された例を示したが、光源は、発光・消光を高速で切り換え可能でありさえすればよく、例えばランプとシャッターで構成されてもよい。また実施形態では、蛍光画像を撮像する例を示したが、撮像対象は、蛍光画像に限定されるものではなく、ほかの種類の画像であってもよい。さらに実施形態では、倒立型の顕微鏡の例を示したが、本発明は正立型の顕微鏡に適用されてもよい。

本発明の第一実施形態による蛍光顕微鏡を示している。本発明の第二実施形態による光源装置を示している。本発明の第三実施形態による光源装置を示している。本発明の第四実施形態による光源装置を示している。本発明の第五実施形態による光源装置を示している。本発明の第六実施形態による蛍光顕微鏡を概略的に示している。本発明の第七実施形態による蛍光顕微鏡を概略的に示している。特開２００２−１３１６４８号公報に開示されている観察装置の基本構成を示している。

符号の説明

１０１…蛍光顕微鏡、１０２…標本台、１０３…対物レンズ、１０４…ダイクロイックミラー、１０５…投光管、１０６…吸収フィルター、１０７…反射ミラー、１０８…観察光学系、１０９…リヤコンバーター、１１０…波長合成器、１１１…第一光源部、１１２…第一発光ダイオード、１１３…第一コリメートレンズ、１１４…第一励起フィルター、１１５…第二光源部、１１６…第二発光ダイオード、１１７…第二コリメートレンズ、１１８…第二励起フィルター、１１９…電源装置、１１９ａ…駆動部、１１９ｂ…制御部、１２０…波長選択フィルター、１２１…標本、１２２…ＣＣＤカメラ、１２３…コリメートレンズ、１２４…吸収フィルター、１２５…結像レンズ、１２６…ピンホール、１２７…フォトダイオード、２００…波長合成器、２０１…第一光源部、２０２…第二光源部、２０３…第三光源部、２０４…色分解プリズム、２０５…第一発光ダイオード、２０６…第二発光ダイオード、２０７…第三発光ダイオード、２０８…第一コリメートレンズ、２０９…第二コリメートレンズ、２１０…第三コリメートレンズ、２１１…第一励起フィルター、２１２…第二励起フィルター、２１３…第三励起フィルター、２２０…波長合成器、３００…波長合成器、３０１…接続ファイバー、３０２…第一ファイバー用コリメートレンズ、３０３…第二ファイバー用コリメートレンズ、３０５…ファイバー、３０６…第一ダイクロイックミラー、３０７…第二ダイクロイックミラー、３０８…第一励起フィルター、３０９…第二励起フィルター、３１０…第三励起フィルター、３１１…第一発光ダイオード、３１２…第二発光ダイオード、３１３…第三発光ダイオード、３１４…第一コリメートレンズ、３１５…第二コリメートレンズ、３１６…第三コリメートレンズ、３１７…ヒートパイプ、３１８…ヒートシンク、４００…波長合成器、４０１…プリズム、４０２…第一コリメートレンズ、４０３…第二コリメートレンズ、４０４…第三コリメートレンズ、４０５…第一発光ダイオード、４０６…第二発光ダイオード、４０７…第三発光ダイオード、５００…波長合成器、５０１…グレーティング、５０２…第一コリメートレンズ、５０３…第二コリメートレンズ、５０４…第三コリメートレンズ、５０５…第一発光ダイオード、５０６…第二発光ダイオード、５０７…第三発光ダイオード、６０１…投光管、６０２…ダイクロイックミラー、６０３…対物レンズ、６０４…標本、６０５…測光用ダイクロイックミラー、６０６…波長選択フィルター、６０７…結像レンズ、６０８…ＣＣＤカメラ、６０９…吸収フィルター、６１０…結像レンズ、６１１…ピンホール、６１２…フォトダイオード、７０１…投光管、７０２…標本、７０３…対物レンズ、７０４…フォトダイオード、７０５…ピンホール、７０６…測光用結像レンズ、７０７…第一波長選択フィルター、７０８…第二波長選択フィルター、７０９…第一発光ダイオード、７１０…第二発光ダイオード、７１１…コンデンサーレンズ、７１２…波長選択フィルター、７１３…結像レンズ、７１４…ＣＣＤカメラ、７１５…第一コリメートレンズ、７１６…第二コリメートレンズ、８０１…発光ダイオード、８０２…発光ダイオード、８０３…発光ダイオード、８０４…対物レンズ、８０５…ダイクロイックミラー、８０６…波長選択フィルター。

Claims

標本を観察するための対物レンズと、
発光波長の異なる複数の発光ダイオードと、
複数の発光ダイオードから発せられる光を合成する波長合成器と、
合成された光を対物レンズの後側焦点面に結像させる照明光学系とを備えており、
複数の発光ダイオードは共に波長合成器と照明光学系を介して対物レンズの後側焦点に共役な位置関係にあり、さらに、
標本からの光を測光する測光装置と、
対物レンズによる標本の像を撮像し外部トリガーを有する撮像装置と、
測光装置の測光値に基づいて発光ダイオードの駆動電流を制御する電源装置とを備えている、顕微鏡。
請求項１において、測光装置が、フォトダイオードからなる測光素子と、測光素子と標本の間に位置し、標本面に対して共役な面上で光軸上に配置されたピンホールとを有している、顕微鏡。
請求項２において、測光装置が、標本から発せられた蛍光だけを選択的に透過する蛍光選択素子をさらに有している、顕微鏡。
請求項１において、電源装置は、複数の発光ダイオードに駆動電流を供給する駆動部と、撮像装置による画像取り込みに同期して、複数の発光ダイオードの点灯を切り換えるとともに、測光装置によって測光される標本からの光の輝度を取得し、取得した複数の輝度の相互の比を演算し、複数の輝度が互いに等しくなるように駆動部から出力される駆動電流を制御する制御部とを有している、顕微鏡。
複数の波長の光を切り換えて標本に照射し、標本からの光の画像を取得する画像取得方法であり、
撮像装置による画像取り込みに同期して、標本に照射される光の波長を切り換えるとともに、標本からの光の輝度を取得し、
取得した複数の輝度の相互の比を演算し、
複数の輝度が互いに等しくなるように演算結果の比に基づいて複数の波長の光を発する複数の発光ダイオードの駆動電流を制御する、画像取得方法。