DE4227678A1

DE4227678A1 - Lichtleitendes Analyseelement zur Bestimmung eines Analyten

Info

Publication number: DE4227678A1
Application number: DE4227678A
Authority: DE
Inventors: Hans Lange; Herbert Dipl Chem Dr Harttig; Heinz Macho
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 1992-08-21
Publication date: 1994-02-24
Also published as: EP0585744B1; ATE160219T1; ES2110037T3; JP2897152B2; EP0585744A1; DE59307666D1; JPH06186165A

Description

Die Erfindung betrifft ein Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts in Form eines Licht leitendes Stiftes mit einer Mantelfläche und zwei im wesentlichen parallelen Stirnflächen, wobei eine der Stirnflächen mit Reagenz beschichtet ist, das in Anwesenheit des Analyts eine optisch detektierbare Reaktion eingeht, sowie ein Ver fahren zur Herstellung eines solchen Analyseelements und ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe mittels eines solchen Analyseelements.

Kommerziell erhältliche Analyseelemente zum Nachweis von Bestandteilen in Flüssigkeiten, vor allem Körperflüssig keiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin oder Speichel be stehen zur Zeit meist aus einem mehr oder weniger flachen, inerten Trägermaterial auf dem schichtenförmig Testfelder aufgebracht sind. Die Testfelder sind mehr- oder ein schichtig und liegen vor allem in Form von Streifen oder rechteckigen oder quadratischen Plättchen vor. Beispiele für solche Analyseelemente sind aus EP-A 0 045 476, EP-A 0 262 445 oder EP-A 0 256 806 bekannt. Testfelder, die nor malerweise in der Größenordnung von 0,5 × 0,5 cm liegen und die die zum Nachweis eines Analyts erforderlichen Rea genzien enthalten, werden mit der zu untersuchenden Probe kontaktiert. Auf dem Testfeld ergibt sich dann bei An wesenheit des zu bestimmenden Analyts eine detektierbare Reaktion, die ein Maß für Art und/oder Menge des Analyts darstellt. Solche Teste, insbesondere mehrschichtige, sind relativ kompliziert herzustellen da die einzelnen Test feldschichten in Form großer flächiger Gebilde gefertigt und dann in die Form von Streifen oder Quadraten zurecht geschnitten werden, bevor sie schließlich zu einem Ana lyseelement zusammenmontiert werden. Grundsätzlich weisen solche Analyseelemente nur ein begrenztes Miniaturisie rungspotential zur Untersuchung möglichst geringer Proben volumina auf. Schließlich ist es nicht oder nur sehr ein geschränkt möglich, solche Analyseelemente während des Herstellungsprozesses mit einfachen Methoden zu überprü fen. Speziell bei den aus verschiedenen Werkstoffen mon tierten Analyseelementen ist es sehr aufwendig in-Prozeß- Kontrollen durchzuführen.

Eine andere Form trockenchemischer Analyseelemente stellen faseroptische Sensoren dar. Dabei werden in der Regel eine oder mehrere Lichtleitfasern aus Glas oder Kunststoff ein gesetzt. Faseroptische Analyseelemente sind beispielsweise aus DE-A 37 01 833 bekannt. Eine Faser oder ein Bündel von Fasern aus dünnen Quarzlichtleitern trägt an ihrem einen Ende ein Enzymsubstrat, das in Anwesenheit des zu bestim menden Enzyms eine Änderung einer spektralen Eigenschaft erfährt, die über den Lichtleiter erfaßt wird und zur Be stimmung der Enzymaktivität herangezogen wird. Beispiels weise wird hierfür rückgestreutes Anregungslicht gemessen. Die beschriebenen Fasern sind ca. 200 µm dick.

In DE-A 36 17 763 ist ein Lichtleiter beschrieben, der in einer bevorzugten Ausführungsform aus einer oder mehreren optischen Fasern besteht, die auf der Oberfläche eines ersten Endes (erste Stirnfläche) Antikörper fixiert ent halten, welche mit zu bestimmendem Antigen in der Probe reagieren. Die Messung erfolgt mittels Licht, das auf das zweite Ende (zweite Stirnfläche) der optischen Fasern auf trifft, durch die Fasern geleitet wird und auf die erste Stirnfläche der Lichtleitfasern trifft. Mit Hilfe durch dieses Ende hindurchgehenden Lichts ist es möglich, das in der Probe enthaltende Antigen zu bestimmen. Ebenso wird auch die Auswertung des durch die Faser an die erste Stirnfläche geleitet und dort reflektierten Lichtes be schrieben.

Die bisher bekannten faseroptischen Sensoren sind schwie rig zu handhaben. Sehr nachteilig ist insbesondere die schwierige Positionierbarkeit der Lichtleiter bezüglich der Licht sendenden und Licht empfangenden Elemente inner halb des Meßgerätes. Hierbei kommt es auf einen definier ten Winkel an, mit dem das Licht auf die Licht einkoppeln de Stirnfläche trifft und ebenso auf den Winkel mit dem das Licht aus dem Lichtleiter kommend auf das Licht- em pfangende Element trifft. Zur Vermeidung eines großen Variationskoeffizienten beim Vergleich der Meßergebnisse, die bei der Verwendung mehrerer Licht leitender Analyse elemente im gleichen Meßgerät erhalten werden, sind sehr aufwendige Justierungen der Lichtleiter notwendig. Um die exakte und vergleichbare Ein- und Auskopplung von Licht zu ermöglichen sind bisher aufwendige Adapter für Lichtleit fasern erforderlich. Die Bohrung des Adapters mit dem die Lichtleitfaser in einer definierten Position gehalten wird, muß dem Durchmesser und der Querschnittsform der eingesetzten Lichtleitfaser möglichst gut angepaßt sein, damit möglichst wenig Spiel zwischen Lichtleitfaser und Bohrung bleibt. In solchen Adaptern werden die glatten, zylindrischen Lichtleitfasern des Standes der Technik durch am Adapter angebrachte Schrauben in der gewünschten Position befestigt und justiert. Bisher ist es deshalb sehr aufwendig, Lichtleitfasern in einem Adapter auszu tauschen. Adapter und Licht leitendes Analyseelement werden in der Praxis wegen ihrer gegenseitigen genauen Anpassung als Einheit aufgefaßt, die nicht getrennt wird. Schnelle, kostengünstige Reihenuntersuchungen und Unter suchungen, die auch von ungeschultem Personal durchgeführt werden können, waren mit den bisher bekannten Licht leitenden Analyseelementen deshalb bisher nicht möglich.

Die Aufgabe bestand darin, einfach und als Massenprodukt herstellbare, leicht handhabbare und einfach zu justieren de Licht leitende Analyseelemente zur Bestimmung eines Analyts zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Patentan sprüchen gekennzeichnet ist, gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein Analyseelement zur Be stimmung eines Analyts in Form eines Licht leitenden Stif tes mit einer Mantelfläche und mit zwei im wesentlichen parallelen Stirnflächen, wobei eine der Stirnflächen Rea genz trägt, das in Anwesenheit des Analyts eine optisch detektierbare Reaktion eingeht, und wobei die Mantelfläche ein herausragendes Element aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her stellung eines solchen Analyseelementes, wobei der Stift aus Kunststoff mittels Spritzguß erzeugt, Reagenz auf eine der Stirnflächen aufgebracht und abschließend erforder lichenfalls getrocknet wird.

Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer flüssigen Probe mittels eines wie vorstehend charakterisierten Analyseelements, wobei die Reagenz tragende Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes mit der zu untersuchenden Probe kontaktiert und eine optische Veränderung als Maß für Art und/oder Menge des Analyts durch die kein Reagenz tragende Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes gemessen wird.

Das erfindungsgemäße Analyseelement ist ein Stäbchen aus einem transparenten Material, das zwei im wesentlichen parallele Stirnflächen aufweist. "Im wesentlichen paral lel" bedeutet hierbei eine Abweichung von weniger als 1°. Bevorzugt sind zwei ebene parallele Stirnflächen. Ganz be sonders bevorzugt sind ebene parallele Stirnflächen, die senkrecht zur Längsachse des Stäbchens angeordnet sind. Auf der Mantelfläche, d. h. der Oberfläche des Analyse elementes mit Ausnahme der beiden Stirnflächen, befindet sich ein Vorsprung als herausragendes Element. Dieser Vor sprung kann die Gestalt beispielsweise eines Stiftes, ei nes Dorns, eines Noppen, oder einer Finne besitzen. Eine Finne, das heißt, eine dünne plättchen- oder flügelförmige Struktur, die mit einer ihrer dünnen Seiten auf der Man telfläche des erfindungsgemäßen Analyseelements aufsitzt, ist besonders bevorzugt. Die erfindungsgemäße aus der Man telfläche des transparenten Stiftes austretende Struktur erhebt sich um etwa 1 bis 250% des maximalen Durchmessers (ohne Vorsprung) des Stiftes,vorzugsweise 5 bis 50%.

Der Querschnitt des Stäbchens kann rund, elliptisch, eckig, rechteckig, quadratisch, knochenförmig, hantelför mig oder sonstwie beliebig symmetrisch oder asymmetrisch gestaltet sein. Die erfindungsgemäßen Analyseelemente wei sen eine Querschnittsfläche von mehr als 0,1 mm² auf. Vor zugsweise beträgt die Querschnittsfläche etwa 1-20 mm². Der Abstand zwischen den beiden Stirnflächen des Licht leitenden Stiftes beträgt etwa 2-100 mm, vorzugsweise 3-30 mm. Querschnittsfläche und Länge des Stiftes sind dabei nach oben grundsätzlich nicht beschränkt. Die hier angegebenen oberen und unteren Grenzen ergeben sich aus praktischen und wirtschaftlichen Überlegungen.

Bevorzugte Analyseelemente haben, wenn man den Vorsprung außer Betracht läßt, die Form eines Zylinders oder eines Kegelstumpfes. Der Längsschnitt durch den Stift kann des halb quadratisch, rechteckig oder trapezförmig sein.

Als Material für den transparenten Stift eignet sich grundsätzlich jedes Licht leitende Material. Optisch klarer Kunststoff hat sich besonders bewährt. Als mögliche Kunststoffe sind zu nennen Polypropylen, Polymethylmetha crylat, Polycarbonat, Polyamid, Polystyrol, Cellulose acetat oder Polyester. Besonders bevorzugt wird Polyme thylmethacrylat oder Polycarbonat, als Stiftmaterial verwendet.

Lichtleitung innerhalb eines Materials erfolgt dann, wenn der Brechungsindex dieses Materials größer ist als der Brechungsindex der Umgebung und der Lichteinfallswinkel die Bedingungen der Totalreflexion erfüllt. Um die Licht leitung zu verbessern, kann auch die Mantelfläche des erfindungsgemäßen Analyseelements vollständig oder teil weise durch eine dünne Metallschicht verspiegelt sein.

Hierdurch kann der Lichteinfallswinkel freier wählbar sein, weil so gegebenenfalls Lichtleitung auch ohne die Bedingungen für Totalreflexion möglich sind. Zur Metalli sierung eignen sich insbesondere Aluminium oder Silber.

Eine der Stirnflächen des erfindungsgemäßen Analyse elements trägt ein Reagenz, das in Anwesenheit des Analyts eine optisch detektierbare Reaktion eingeht. Optisch de tektierbare Reaktionen sind insbesondere solche, die kolo rimetrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden können. Er findungsgemäß verwendbar sind Reagenzschichten, wie sie aus dem Stand der Technik für Analyseelemente bekannt sind. So sind hierfür insbesondere solche Reagenzzusammen setzungen einsetzbar, die so viskos sind, daß sie mit ei nem Rakel aufgebracht werden können, oder die so beschaf fen sind, daß sie durch Tauchen, Siebdrucken, Aufsprühen oder Applizieren einzelner Tropfen und anschließendes Trocknen erzeugt werden können. Es ist auch möglich, Ma trixmaterialien, wie Vliese, Gewebe, Folien oder Membra nen, die das für die Bestimmung eines Analyts notwendige Reagenz enthalten auf die Stirnfläche des erfindungsge mäßen Analyseelements als Reagenzschicht aufzubringen. Solche Schichten oder die zuerst genannten "reinen" Rea genzschichten können durch Haftvermittler, wie beispiels weise Propiofan auf einer Stirnfläche des erfindungsgemä ßen Analyseelements befestigt sein. Außerdem sind auch mehrschichtige Reagenzaufbauten, wie sie ebenfalls bereits aus dem Stand der Technik bekannt sind möglich. Eine oder mehrere der an den Reagenzaufbauten beteiligten Schichten kann Pigmente enthalten. Bevorzugt ist der Einsatz reflek tierender Teilchen, wie beispielsweise Titandioxid, die gleichmäßig in der Reagenzschicht verteilt sind. Besonders bevorzugt ist der Einsatz einer speziellen reflektierenden Schicht, die es ermöglicht, daß durch das Licht leitende Stäbchen eingestrahltes Licht durch die Reagenzschicht ge langt und anschließend durch den Lichtleiter zurückreflek tiert wird. Als reflektierende Schicht kann hier eine Schicht mit reflektierenden Partikeln, wie beispielsweise Titandioxid verwendet werden. Es kann aber auch eine sehr dünne Schicht aufgedampften Metalls, wie beispielsweise Silber oder Aluminium verwendet werden. Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz von reflektierenden Teilchen in der Reagenzschicht und die Überlagerung der Reagenzschicht mit einer dünnen Metallschicht, die Licht reflektiert, aber so dünn ist, daß Flüssigkeit durch sie hindurch auf die Reagenzschicht zu gelangen vermag.

Die Formulierung "im wesentlichen parallele Stirnflächen" soll auch die Möglichkeit mit einschließen, daß eine der Stirnflächen des Licht leitenden Stiftes muldenförmig aus gestaltet ist, solange die Mulde eine im wesentlichen pa rallel zu der anderen Stirnfläche verlaufende Bodenfläche aufweist. Solche Mulden, die zur Reagenzaufnahme besonders geeignet sind, können 20-1000 µm, vorzugsweise 30-200 µm tief sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Muldentiefe < 30% des Durchmessers des Stäbchens. Ent sprechende Ausführungsformen sind beispielsweise bereits aus EP-A 0 234 928 bekannt.

Während eine Stirnfläche des erfindungsgemäßen Analyse elements ein für die Bestimmung eines Analyts erforder liches Reagenz trägt, ist die gegenüberliegende Stirn fläche reagenzfrei. Durch sie wird Licht eingestrahlt oder eingekoppelt, weshalb diese Fläche auch "Koppelfläche" genannt wird. Gegebenenfalls kann diese Koppelfläche mit einer transparenten Polymerschicht belegt sein, die vom Stäbchenmaterial verschieden ist.

Das erfindungsgemäß aus der Mantelfläche des Analyse elementes herausragende Teil kann sich an jeder Stelle der Mantelfläche befinden. Bevorzugt ist jedoch seine An ordnung in der von der Reagenz tragenden Stirnfläche ent fernteren Hälfte des Mantels. Besonders bevorzugt ist eine solche Anordnung des vorspringenden Teils, daß es mit der reagenzfreien Stirnfläche (Koppelfläche) abschließt. Die mit der Mantelfläche verbundene Grundfläche des heraus ragenden Teils beträgt vorzugsweise weniger als 10%, in besonders vorteilhaften Ausführungsformen weniger als 5% der Mantelfläche.

Im Falle eines dünnen, plättchenartigen aus der Mantel fläche vorspringenden Elementes ist dieses Teil vorzugs weise so angeordnet, daß sich die Berührungsfläche - zwischen Mantelfläche und plättchenartigem Vorsprung im Lot mit der Längsachse des erfindungsgemäßen Analyse elementes befindet, die Länge der Berührungsfläche jedoch nicht größer als ein Drittel der Längsachse ist.

Ein solches vorteilhaftes erfindungsgemäßes Analyse element ist in Fig. 1 dargestellt. Ein Licht leitender Stift (1) trägt eine Reagenzschicht (2) und ein vor springendes Teil in Form einer Finne (3). Die Koppelfläche (4) durch die Licht eingestrahlt wird, befindet sich der Reagenzschicht (2) gegenüber. Erfindungsgemäße Analyse elemente können auch mehrere vorspringende Teile auf der Mantelfläche aufweisen. Vorteilhafterweise sind bei sol chen Ausführungsformen die Vorsprungselemente jeweils auf einander gegenüberliegenden Stellen der Mantelfläche an geordnet. Ein solches Analyseelement ist in Fig. 2 ge zeigt. Hier ist ein erfindungsgemäßes Analyseelement dar gestellt, das sich dadurch von dem in Fig. 1 skizzierten Analyseelement unterscheidet, daß es zwei als Finnen aus gebildete Erhebungen (3) auf der Mantelfläche des Licht leitenden Stiftes (1) besitzt.

Licht leitende Stifte für erfindungsgemäße Analyseelemente können je nach Material unterschiedlich hergestellt wer den. Vorzugsweise werden Licht leitende Stifte aus trans parentem, optisch klarem Kunststoff eingesetzt. Die Her stellung solcher Stifte erfolgt vorteilhafterweise durch Spritzguß, wobei der Vorsprung auf der Mantelfläche des Stiftes in die Spritzgußform miteinbezogen ist. Ganz be sonders vorteilhaft befindet sich dieses erhabene Teil in der Angußöffnung der Spritzgußform. Es ist klar, daß für das Spritzgußverfahren nur solche Materialien verwendet werden können, die in der Wärme schmelzbar sind. Vorteil hafterweise werden deshalb thermoplastische Kunststoffe eingesetzt.

In der Regel ist es nicht notwendig, bei spritzgegossenen, Licht leitenden Stiften die Stirnflächen zu polieren. Ge gebenenfalls kann eine solche Politur jedoch an den spritzgegossenen Stücken erfolgen.

Für durch Spritzguß hergestellte erfindungsgemäße Analyse elemente hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das Stäbchen die Form eines Kegelstumpfes aufweist, da ein solchermaßen geformtes Teil besonders leicht aus der Spritzgußform zu entfernen ist. Eine Entformschräge von bis zu 1° hat sich als bevorzugt erwiesen. In der Regel ist die kleinere Stirnfläche solcher Analyseelemente dann diejenige die das Reagenz trägt.

Die Beschichtung der Mantelfläche mit Licht reflektieren dem Material erfolgt beispielsweise durch Tauchen oder Auf sprühen entsprechender Lösungen oder Suspensionen re flektierender Materialien oder durch Aufdampfen oder Sput tern, wenn metallische Schichten erzeugt werden sollen. Vor der Beschichtung der Mantelfläche können die Stirnflä chen, zumindest die reagenzfreie Stirnfläche abgedeckt werden oder sie können nach dem Beschichtungsverfahren durch Entfernen (Abschneiden, Abpolieren) einer dünnen Schicht erzeugt werden.

Das Aufbringen des Reagenz es auf eine der Stirnflächen des lichtleitenden Stiftes kann vor oder nach der Beschichtung der Mantelfläche mit Licht reflektierendem Material er folgen. Gegebenenfalls kann das Aufbringen einer reflek tierenden Schicht auf die Reagenzschicht kombiniert werden mit der Beschichtung der Mantelfläche mit reflektierendem Material. Im übrigen können die Reagenzien in Form von Lösungen oder Suspensionen nach bekannten Verfahren auf die Stirnflächen Licht leitender Stifte aufgebracht wer den. Mögliche Verfahren sind hierbei das Tauchen, das Tauchen mit folgendem Schleudern, das Siebdrucken, das Aufsprühen und das Applizieren einzelner Tropfen. Die auf gebrachten Massen können Enzyme und Indikatoren enthalten, es ist aber auch denkbar, solche oder andere Reagenz bestandteile in weiteren Schritten einzubringen. Dies kann ebenfalls durch Tauchen, Tüpfeln, Ink-Jet etc. geschehen. Bei ausreichender Viskosität der Reagenzmasse ist es auch möglich Schichten mit einem flexiblen Rakel aufzubringen. Dieses Verfahren ist vor allem dann anwendbar, wenn die das Reagenz aufnehmende Stirnfläche eine Mulde zur Aufnah me des Reagenzes enthält. Solche Mulden können durch Aus drehen, Fräsen oder durch entsprechende Formgebung im Spritzgußverfahren gebildet werden.

Außerdem ist es auch möglich, separat fertiggestellte Rea genz enthaltende Schichten auf einer Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes zu befestigen. Die Befestigung kann beispielsweise mittels Haftvermittlers, wie bei spielsweise Propiofan erfolgen. Solche fertiggestellten Reagenz enthaltenden Schichten können Vliese, Gewebe, Folien oder Membranen sein, die Reagenz imprägniert und/oder als Beschichtung enthalten.

Nach dem direkten Aufbringen des Reagenz es als Lösung oder Suspension auf die eine Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes wird in der Regel ein Trocknungsschritt nach geschaltet. Die Temperaturen können hier je nach Reagenz zusammensetzung bis zu 70°C betragen.

Die Fertigung der erfindungsgemäßen Analyseelemente kann einzeln erfolgen. Es wird aber bevorzugt, die Fertigung anhand von Vielfachen eines einzelnen Analyseelements durchzuführen. Dazu werden beispielsweise in mehreren, sich entsprechenden, miteinander in Verbindung stehenden Spritzgußformen gleichzeitig Vielfache eines Einzelana lyseelementes gespritzt. Mit einer solchen Spritzgußform können beispielsweise Vielfache eines erfindungsgemäßen Analyseelementes hergestellt werden, die jeweils über ei nen Vorsprung auf der Mantelfläche mit dem Vorsprung auf der Mantelfläche eines anderen Licht leitenden Stiftes in Berührung stehen. Solche Strukturen können zwischen den Erhebungen so geteilt werden, daß einzelne Analyseelemente erzeugt werden. Auf diese Art und Weise ist eine Massen produktion erfindungsgemäßer Analyseelemente billig und einfach möglich.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe wird die mit Reagenz beschichtete Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes mit der zu unter suchenden Probe kontaktiert. Vorzugsweise handelt es sich bei den zu untersuchenden Proben um flüssige Proben, vor allem um Körperflüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Urin oder Speichel. Die zu untersuchende flüssige Probe kann auf die Reagenz tragende Stirnfläche des Analyse elementes aufgegeben oder das erfindungsgemäße Analyse element kann mit der das Reagenz tragenden Stirnfläche in die zu untersuchende Flüssigkeit getaucht werden. Durch die reagenzfreie Stirnfläche des erfindungsgemäßen Analyse elementes wird Licht eingestrahlt, das mit dem Reagenz auf der gegenüberliegenden Stirnfläche wechselwirkt. Eine optische Veränderung stellt das Maß für Art und/oder Menge des Analyts dar und kann im reflektierten Licht durch die kein Reagenz tragende Stirnfläche des Licht leitenden Stiftes vermessen werden oder es kann auch das durch die Reagenzschicht hindurchgelangende Licht auf der Seite der Reagenz tragenden Stirnfläche gemessen werden. Ebenso sind Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessungen möglich. Die Mes sung des reflektierten Lichts ist jedoch bevorzugt und kann nach Methoden erfolgen, die bereits als solche aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Bei der bestimmungsgemäßen Anwendung des erfindungsgemäßen Analyseelementes zeigen sich die besonderen Vorteile. So ermöglicht der aus der Mantelfläche vorspringende Teil eine gute und sehr einfache Positionierung in einem Adap ter mit bajonettartigem Verschluß, bei dem das Licht lei tende Stäbchen eingesetzt und mit Hilfe des Vorsprungs eingedreht wird. Die Positionierung erfolgt mit Hilfe des Vorsprungs der als Anschlagelement dient. Insbesondere ist mittels des vorspringenden Elements die Entfernung der Koppelfläche von der Oberfläche des optischen Sendesystems sowie gegebenenfalls bei Reflexionsmessungen auch des Empfangsystem regulierbar. Insofern dient das vorspringen de Teil als Halte- und als Positionierelement und ermög licht damit einfach durchführbare, schnelle und reprodu zierbare Messungen von Analyten in Flüssigkeiten.

Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Analyseelemente bietet aufgrund der einfachen und schnellen Positionier barkeit den Vorteil, daß während der Fertigung auch auf verschiedenen Fertigungsstufen die Präzision des Herstel lungsverfahrens bestimmt werden kann. So kann die Güte des Naßschichtauftrags der Schicht oder der Schichten während des Fertigungsprozesses durch Messung der reflektiven und transmissiven Eigenschaft jeder Einzelschicht mittels 100% Kontrolle durch die nicht mit Reagenz beschichtete Stirnfläche des lichtleitenden Stiftes erfolgen. Nach Trocknung kann durch on-line-Messung erneut die reflektive und transmissive Eigenschaft der getrockneten Schicht(en) zur Prozeßkontrolle erfolgen. Eine in-Prozeß-Kontrolle ist damit möglich.

Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurden 5 Licht leitende Stifte gemäß Fig. 1 aus Poly methylmethacrylat mit einem runden Querschnitt, einem Durchmesser von 3,05 mm und einer Länge von 30 mm per Spritzguß hergestellt, senkrecht zur Längsachse abgedreht und poliert. Die Stirnflächen waren senkrecht zur Längs achse. Eine der Stirnflächen wurde mit einer Läpp- und Poliermaschine (Typ Joke II-M, Fa. Joisten und Kettenbaum, Bergisch Gladbach, Deutschland) poliert.

Eine Farbstoffdispersion aus weißer Dispersionsfarbe und dunkelblauer Farbe wurden so zusammengemischt, daß visuell die Intensitäten
1. weiß
2. blaßblau
3. hellblau
4. mittelblau
5. dunkelblau
erhalten wurden. Ein Tropfen einer solchen Farbstoffdis persion wurde auf die polierte Stirnfläche gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Bei Einkopplung von Licht (λ= 660 nm) über eine Ulbricht′sche Kugel eines Remissionsphotometers durch die freie Stirnfläche des Analyseelements und Messung des remittierten Lichts ergab sich eine Abnahme des remittierten Lichtsignals, das dem optischen Eindruck entsprach.

Beispiel 2

Analyseelemente gemäß Fig. 2 wurden erhalten, indem ein spritzgegossener Stift aus Polymethylmethacrylat mit rundem Querschnitt, einem Durchmesser von 3,05 mm und einer Länge von 30 mm nach Politur einer Stirnfläche auf dieser Stirnfläche mit einer Reagenzmasse belegt wurde, die folgendermaßen hergestellt worden war:
2%ige Lösung von Keltrol F (Xanthangum von Kelco, Brüssel, Belgien)
in 0,2 m Citratpuffer, pH 5,0 2,7 g
15%ige Lösung von Nonlylsulfat in Wasser 0,154 g
Wasser 8,7 g
Polyvinylpyrrolidon 0,3 g
Tartrazin 0,05 g
Tetramethylammoniumchlorid 0,129 g
wurden gemischt,
N,N-Bishydroxyethyl-p-nitrosoanilin 0,06 g
Wasser 3,0 g
wurden gemischt und
Propiofan 70 D (BASF, Ludwigshafen, BRD) 3,5 g
Glucoseoxidase (184 U/mg) 0,586 g
Wasser 2,4 g
wurden gemischt
und anschließend die drei Mischungen vereinigt und bis zur Homogenität gerührt.

Die Reagenzschicht verfärbt sich in bekannter Weise durch Reaktion mit Glukose von hellgelb nach grün oder blau.

Nach dem Trocknen der Beschichtung (45°C, 60 Minuten) wurde die Schicht mit einem Tropfen wäßriger Glukose lösung benetzt. Innerhalb weniger als 30 Sekunden färbte sich die Beschichtung blau.

Bei einem Test mit entsprechend hergestellten Analyse elementen und Glukoselösungen von unterschiedlichen Kon zentrationen konnte nach dem Meßverfahren gemäß Beispiel l remissionsphotometrisch (λ= 660 nm) durch den Lichtleiter eine Kurve aufgenommen werden, die eine Abnahme der remit tierten Lichtmenge mit zunehmender Glukosekonzentration widergibt.

Beispiel 3

In Abänderung des Versuches nach Beispiel 2 wurde anstelle von wäßrigen Glukoselösungen citratgepuffertes Vollblut mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen verwendet.

Durch die rote Blutfarbe wurde die Remission des einge strahlten Lichtes (λ = 660 nm) so stark beeinflußt, daß eine akzeptable Messung der Blutglukose mit der einge strahlten Meßvorrichtung nicht mehr möglich war.

Wurde eine Meßvorrichtung eingesetzt, welche abwechselnd bei einer Wellenlänge von 564 und 660 nm die Remission durch den Lichtleiter ermittelte, war es möglich, den Ein fluß der roten Blutfarbe auf das Meßergebnis rechnerisch zu eliminieren und eine Kurve aufzunehmen, die eine Ab nahme des Meßsignals mit zunehmender Glukosekonzentration im Blut wiedergibt.

Beispiel 4

In Abänderung von Beispiel 2 wurden Analyseelemente gemäß Fig. 2 hergestellt, bei denen auf eine Stirnfläche eine Reagenzmasse enthaltend Titandioxid, bestehend aus
Keltrol F (Xanthangum von Kelco, Brüssel, Belgien) 4,30 g
Titandioxid 0,71 g
Natriumnonylsulfatlösung in Wasser (150 g/l) 2,44 g
Polyvinylpyrrolidon 0,47 g
Tartrazin 0,08 g
Tetraethylammoniumchlorid 0,20 g
2,18-Phosphormolybdänsäure 0,95 g
N,N-Bis-hydroxyethyl-p-nitrosoanilin 0,09 g
Celatom (MW25, Eagle-Picher, Cincinatti, USA) 9,97 g
Propiofan (BASF, Ludwigshafen, Deutschland) 5,46 g
Glucoseoxidase (184 U/mg) 0,93 g
bidestilliertes Wasser 24,39 g
mittels Siebdruckverfahren aufgebracht war. Trocknung war bei 45°C, 60 Minuten lang erfolgt. Sowohl nach Benetzung der getrockneten Schichten mit wäßrigen Glukoselösungen als auch mit citratgepufferten Vollblutproben mit unter schiedlichen Glukosekonzentrationen wurden remissions photometrisch (λ= 660 nm) durch den Lichtleiter Kurven erhalten, die eine Abnahme der remittierten Lichtmenge mit zunehmender Glukosekonzentration widerspiegeln.

Beispiel 5

a) In Abänderung des Beispieles 2 wurde ein Analyseelement gemäß Fig. 2 hergestellt, dessen eine Stirnfläche mit einer Reagenzmasse gemäß Beispiel 2 beschichtet und bei 45°C, 60 Minuten lang getrocknet worden war. Auf die Reagenzschicht war eine metallische Silberschicht von 60- 80 nm Dicke nach dem Sputterverfahren aufgebracht worden.

Bei Aufgabe verschiedener citratgepufferter Vollblutproben mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen konnte remis sionsphotometrisch (λ= 660 nm) innerhalb weniger als 40 Sekunden durch den Lichtleiter ein stabiles Signal aufge nommen werden. So konnte eine Kurve erstellt werden, die eine stetige Abnahme der remittierten Lichtmenge mit zu nehmender Glukosekonzentration im Blut widergibt.

b) Bei Ersatz der metallischen Silberschicht durch eine metallische Aluminiumschicht wurden nahezu identische Ergebnisse erhalten.

Beispiel 6

In Abänderung des Beispiels 2 wurden Analyseelemente her gestellt, bei denen die Reagenzschicht in einer ersten Stufe nach dem Phaseninversionsverfahren aus einer orga nischen Lösung als poröse Membranschicht gebildet wurde, wobei Puffer und Indikator bereits enthalten waren und in einer zweiten Stufe mit den notwendigen Enzymen getränkt wurde.

Die Herstellung der Reagenzschicht erfolgte im einzelnen folgendermaßen:
7,9 g Celluloseacetat Typ 27 Drexel′s Crystal, (Fa. Constauld Speciality Plastics, Derby, UK) wurden in 79,0 g Aceton p.a., (Merck, Darmstadt, Deutschland)
in einem Dreihalskolben bei 50°C unter Rühren mit einem KPG-Blattrührer innerhalb 3 Stunden gelöst.

Durch Anlegen von Unterdruck von ca. 100 mbar wurde nach Abkühlung entgast. Unter langsamem Rühren wurden
0,04 g Brÿ 56, (Polyoxyethlyenmonocetylether der Fa. Serva, Heidelberg, Deutschland)
0,2 g Tetramethylbenzidin (Fa. Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland)
19,75 g Isopropanol p.a. (Fa. Riedel de Haen, Seelze, Deutschland) in
45,0 g Wasser bidestilliert
zugegeben bzw. zugetropft.

Auf die obere Stirnfläche eines spritzgegossenen Stiftes mit einer Länge von 30 mm und einem Durchmesser von 3,05 mm aus Polycarbonat wurden 2 µl der klaren Polymer lösung aufdosiert. Bei 21°C und 45% relativer Feuchte erfolgt binnen 15 Minuten die Ausbildung einer Membran schicht durch Phaseninversion. Danach erfolgte Trocknung bei 50°C über 15 Minuten.

Auf die trockene Membranschicht wurden 2 µl einer Lösung aus
9,5 mg Glukoseoxidase (211,9 U/mg) (Fa. Boehringer Mann heim GmbH, Mannheim, Deutschland)
54,7 mg Peroxidase (2118 U/mg) (Fa. Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland)
in
100 g Wasser bidestilliert
aufgetüpfelt. Nach 15 Minuten Trocknen bei 50°C im Trocken schrank wurden bei Testen mit Glukoselösungen entsprechend Beispiel 2 vergleichbare Ergebnisse erhalten.

Beispiel 7

Analyseelemente gemäß Fig. 2 wurden aus spritzgegossenen Stiften aus Polymethylmethacrylat mit einem runden Quer schnitt, mit einem Durchmesser von 3,05 mm und einer Länge von 30 mm hergestellt. Auf einer Stirnfläche war eine zen trische Ausnehmung von 2,8 mm Durchmesser und 0,2 mm Tiefe ausgefräst. Eine Reagenzmasse gemäß Beispiel 4 wurde durch Aufrakeln mit einem Hartgummirakel in die Ausnehmung ein gebracht und bei 50°C, 30 Minuten lang getrocknet. An schließend wurde auf die Reagenzschicht a) eine metal lische Silberschicht von 60-80 nm Dicke aufgesputtert beziehungsweise b) eine metallische Aluminiumschicht von 60-80 nm Dicke aufgedampft.

Bei Aufgabe von citratgepufferten Vollblutproben mit un terschiedlichen Glukosekonzentrationen wurden remissions photometrisch (λ= 660 nm) durch den Lichtleiter Ergebnis se erhalten, die mit den Resultaten aus Beispiel 5 ver gleichbar sind, jedoch in ihren relativen Remissionswerten ca. 15% höher liegen.

Claims

1. Analyseelement zur Bestimmung eines Analyts in Form eines Licht leitenden Stäbchens mit einer Mantelfläche und zwei im wesentlichen parallelen Stirnflächen, wo bei eine der Stirnflächen ein Reagenz trägt, das in Anwesenheit des Analyts eine optisch detektierbare Reaktion eingeht, dadurch gekennzeichnet, daß die Mantelfläche mindestens einen Vorsprung aufweist.

2. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die Mantelfläche des Licht leitenden Stäb chens teilweise oder vollständig mit Licht reflektie rendem Material bedeckt ist.

3. Analyseelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der Vorsprung die Form eines Dorns, eines Noppen oder einer Finne hat.

4. Analyseelement gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Mantelfläche mehrere Vorsprünge trägt.

5. Analyseelement gemäß einem der vorangehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht leitende Stäbchen aus thermoplastischem Kunststoff besteht.

6. Analyseelement gemäß einem der vorangehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz tragende Stirnfläche des Licht leitenden Stäbchens eine zentrische Mulde im Stiftmaterial enthält, die eine Tiefe aufweist, die kleiner als 30% des Durch messers des Stäbchens ist und diese Mulde Reagenz enthält.

7. Analyseelement gemäß Ansprüchen 1-6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Reagenz tragende Stirnfläche teil weise oder vollständig mit Licht reflektierendem Material bedeckt ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Analyseelements gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stift aus thermoplastischem Kunststoff mittels Spritzguß er zeugt und Reagenz auf eine der Stirnflächen aufge bracht wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz mittels Tauchen, Drucken, Sprühen, Tüpfeln oder Rakeln auf eine der Stirnflächen auf gebracht wird.

10. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe mittels eines Analyseelements gemäß einem der An sprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz tragende Stirnfläche des Licht leitenden Stäbchens mit der zu untersuchenden Probe kontaktiert und eine optische Veränderung als Maß für Art und/oder Menge des Analyts durch die Reagenz freie Stirnfläche des Licht leitenden Stäbchens gemessen wird.

11. Verwendung eines Analyseelementes gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung eines Analyts in flüssiger Probe.