DE19735144A1

DE19735144A1 - Reflexionsfluorimeter

Info

Publication number: DE19735144A1
Application number: DE19735144A
Authority: DE
Inventors: Wolfram Dr Bohnenkamp
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 1999-02-25
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: US6252657B1; DE19735144C2

Description

Die Erfindung betrifft Reflexionsfluorimeter, die einen kapillarförmigen Lichtleiter zur Aufnahme von verschiedenen Analyten in der Kapillare des Lichtlei ters verwenden. Dabei kann die Konzentration ver schiedener Analyten durch Fluoreszenzanregung mit mindestens einem lichtempfindlichen Sensor, der an einer Stirnseite für den Empfang des aus dem Licht leiter austretenden Fluoreszenzlichtes angeordnet ist, bestimmt werden.

Auf diesem Gebiet ist es bekannt, daß für den Fall, daß Licht aus einem Medium mit geringerem Brechungs index auf eine Oberfläche eines Mediums mit einem größeren Brechungsindex trifft, das auftreffende Licht zum größten Teil reflektiert wird, wenn der Einfallswinkel größer als der kritische Winkel ist. Wird jedoch Licht in der Grenzschicht, dem evaneszen ten Feld, des optisch dünneren Mediums, dessen geome trische Dicke geringer als die entsprechende Licht wellenlänge ist, erzeugt, z. B. durch Fluoreszenz, so kann das Licht auch dann in das optisch dichtere Me dium eintreten, wenn der kritische Winkel überschrit ten ist.

Eine entsprechende Vorrichtung ist in WO 93/18405 beschrieben. Dabei wird Licht einer Lichtquelle durch einen transparenten Körper auf eine Küvette gerich tet, an deren Innenseite Flureszenz angeregt wird. Aus dem Bereich des evaneszenten Feldes kann die Flu reszenz in den transparenten Körper wieder einkoppeln und wird von dort über eine geneigte Stirnfläche auf einen Detektor gerichtet, um das Fluoreszenzlicht zu erfassen. Diese Anordnung hat insbesondere den Nach teil, daß eine sehr kleine Lichtausbeute des durch Fluoreszenz angeregten Lichtes erhalten werden kann und demzufolge die Empfindlichkeit entsprechend klein ist.

Aus US 4,716,121 ist ein Aufbau für die Durchführung Fluoreszenztests und insbesondere für Immunoas says beschrieben. Dabei wird ein Lichtleiter verwen det, der in seiner gesamten Länge von einem kammer förmigen Gebilde umschlossen ist, in das eine jewei lige zu untersuchende Probe eingefüllt werden kann. Das Anregungslicht muß hierbei in eine Stirnseite des Lichtleiters eingekoppelt werden, und demzufolge ist die Energiedichte des Anregungslichtes klein, und entsprechend klein ist auch das Fluoreszenzlicht, das durch den Lichtleiter an dieser Stirnseite wieder ausgesendet und empfangen werden kann, was selbstver ständlich ebenfalls die Meßempfindlichkeit beein trächtigt.

Ähnlich wird bei dem in der EP 0 470 982 beschriebe nen Reflexionsfluorimeter gearbeitet, da auch dort das Licht an einer Stirnseite des Lichtleiters einge koppelt wird, und auch das angeregte Fluoreszenzlicht an dieser Stirnseite wieder austritt. Demzufolge tre ten auch die aus US 4,716,121 bekannten Nachteile weiter auf.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit vorzugeben, mit der angeregte Fluoreszenzen mit höhe rer Empfindlichkeit zur Bestimmung von Konzentratio nen verschiedener Analyte gemessen werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausge staltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich mit den in den untergeordneten Ansprü chen genannten Merkmalen.

Das erfindungsgemäße Reflexionsfluorimeter verwendet einen kapillarförmigen Lichtleiter zur Aufnahme von einem oder mehreren verschiedenen Analyten in der Kapillare, deren Konzentration durch Fluoreszenzanre gung mit mindestens einem lichtempfindlichen Sensor, der an einer Stirnseite des Lichtleiters angeordnet ist, bestimmt wird. Die Fluoreszenzanregung erfolgt mit einer Lichtquelle in der Form, daß deren Licht auf die äußere Mantelfläche des transparenten Licht leiters gerichtet wird. Der Lichtleiter besteht dabei selbstverständlich aus einem für das Anregungslicht der Lichtquelle transparenten Material, er kann in bestimmten Fällen auch für nicht sichtbares Licht, wie z. B. infrarotes, transparent sein.

Vorteilhaft ist es, das Licht der Lichtquelle durch eine zylindrische oder prismatische Optik auf die Mantelfläche des Lichtleiters zu richten.

Die Optik sollte bevorzugt so ausgebildet sein, daß die entsprechenden Winkel und der Brechungsindex des Materials der Optik so ausgewählt sind, daß Anre gungslicht nur an der der Mantelfläche des Lichtlei ters gegenüberliegenden Seite austritt. Die Optik kann dabei im direkten Kontakt mit der äußeren Man telfläche des Lichtleiters stehen. Die Winkel der Keilflächen der Optik stehen unter Berücksichtigung des Brechungsindexes in einem Verhältnis zueinander, daß das Licht der Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung nur an der schmalen Seite, also an der Seite, die zum Lichtleiter weist, austreten kann. Dies bedeutet, daß das aus der Lichtquelle austretende Licht an den äu ßeren Flächen der Optik mehrfach reflektiert und dann auf die Mantelfläche des Lichtleiters gerichtet wird. Dabei soll vermieden werden, daß ein Teil des einge strahlten Lichtes so reflektiert wird, daß es an der Fläche wieder austritt, in die es eingestrahlt worden ist. Dies tritt dann auf, wenn der Einstrahlungswin kel zu flach auf die Einstrahlungsfläche trifft oder der Brechungsindex der Optik zu groß ist.

Bevorzugt wird für die zu verwendende Optik ein keil förmiger Reflexionstrapezoid, der seitlich an den Lichtleiter heranreicht, eingesetzt.

Die Erfindung kann ebenfalls weitergebildet werden, wenn an der anderen Stirnseite, also gegenüber dem lichtempfindlichen Sensor, eine Kopplungsvorrichtung angeordnet ist. Diese hat einmal den Vorteil, daß an dieser Seite des Lichtleiters nur ein geringer Anteil an Licht austreten kann, und weiter kann die Kopp lungsvorrichtung zur Fixierung des Lichtleiters ver wendet werden. Dabei kann an dieser Stirnseite des Lichtleiters eine Verformung (z. B. eine seitliche Ausbuchtung) vorhanden sein, in die ein Positionier ansatz zur Einhaltung einer bestimmten zirkulären Position formschlüssig eingreifen kann. Dadurch kann der verwendete Lichtleiter mit der Kapillare mehrmals in der gleichen zirkulären Position eingesetzt wer den, und verschiedene Untersuchungen können in dieser Form durchgeführt werden, so daß die Reproduzier- und Vergleichbarkeit der Meßergebnisse verbessert sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter kann günstigerweise das Licht der Lichtquelle intermittie rend auf den Lichtleiter gerichtet werden, um zeit aufgelöste Messungen durchführen zu können. Dafür kann die Lichtquelle mit einer entsprechenden Fre quenz ein- bzw. ausgeschaltet werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, sogenannte Chopper in bekannter Weise vor der Lichtquelle anzuordnen bzw. an der gleichen Stelle elektromechanische Schnellverschlüsse einzusetzen.

Mögliche Lichtquellen sind beispielsweise bekannte Glüh- und Blitzlampen oder Laser. Als lichtempfindli che Sensoren können Photomultiplier oder Diodenarrays allein oder in Kombination verwendet werden. Dabei sind die Photomultiplier für Messungen mit niedrigem Signalniveau geeigneter, und die Diodenarrays können günstig eingesetzt werden, wenn eine schnellere Da tenerfassung und -verarbeitung erforderlich wird.

Durch die Anordnung von optischen Gittern oder die Verwendung von Spektrometern vor den lichtempfindli chen Sensoren kann eine wellenlängenaufgelöste Mes sung durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil, daß bei einer Messung gleichzeitig verschiedene Fluores zenzen und demzufolge auch Analyte bestimmt werden können.

Das erfindungsgemäße Reflexionsfluorimeter kann au ßerdem verbessert werden, indem mindestens ein Hilfs sensor zur Messung des von der Lichtquelle emittier ten oder anderen reflektierten Lichtes vorhanden ist, um eine Kompensation und Meßwertkorrektur durchzufüh ren zu können.

Selbstverständlich können auch weitere Fehler, wie z. B. Justiermängel der Kapillare oder die Schwankun gen der Leistung der Lampe berücksichtigt und die so hervorgerufenen Fehler kompensiert werden. Alle Meß werte, auch die Korrekturwerte, werden in einer da tei- und rechnergestützten Datenverarbeitungsanlage erfaßt, und eine Auswertung führt zu analytischen und diagnostischen Aussagen.

Vorteilhaft werden Lichtleiter mit Kapillaren verwen det, die ein großes Verhältnis von innerer Oberfläche in der Kapillare und Kapillarenvolumen aufweisen, um die Empfindlichkeit und die Nachweisgrenzen zu erhö hen. Das Volumen-Oberflächenverhältnis in der Kapil lare sollte im Bereich zwischen 1 : 3 bis 1 : 10 µl/mm², bevorzugt bei 1 : 5 µl/mm², liegen. Dadurch kann im Gegensatz zu bekannten Mikrowells in einer Mikroti terplatte ein mehr als fünffach höheres Verhältnis erreicht werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter konnte gegenüber den bekannten Meßanordnungen eine mehr als tausendfach erhöhte Empfindlichkeit bei Ver wendung wesentlich einfacherer optischer und elektro nischer Komponenten erreicht werden.

So konnten bei Durchführung einer Fluoreszein-Verdün nungsreihe als kleinste Konzentration 1,33 pmol/l mit einem Signal-Rauschverhältnis von mehr als 2 bestimmt werden (siehe Fig. 3). Begrenzend ist hier vor allem die Hintergrundfluoreszenz der verwendeten Materia lien.

Bei Untersuchungen mit sehr verdünnten Lösungen kann die innere Oberfläche der Kapillare zur Konzentration des Analyten genutzt werden, indem die Kapillare sen sibilisiert wird und dann ein größeres Volumen hin durchfließen kann. Es besteht also die Möglichkeit, mehr Analyte an der inneren Oberfläche der Kapillare zu immobilisieren bzw. zu binden. Bei Immunoassays kann der sogenannte "Hook-Effekt" durch Verdünnen umgangen werden und im Anschluß daran durch Konzen tration in der Kapillare wieder eine höhere Signal stärke erreicht werden.

Bei Messungen an mit Avidin beschichteten Kapillaren und mit Biotin gekoppelten Reagenzien konnte die Ver besserung, die mit der Erfindung erreicht werden kann, nachgewiesen werden. Bei der Messung können sogenannte Mikrobeads mit Fluoreszenz-Farbstoff und Biotin eingesetzt werden. Diese binden an die mit Avidin beschichtete Innenwand der Kapillare und konn ten auch durch mehrfaches Spülen mit einem Puffer nicht entfernt werden. Dadurch konnte eine lineare Konzentration-Fluoreszenz-Beziehung nachgewiesen werden, die über zwei Zehnerpotenten reicht (siehe Fig. 4). Das Aufbringen der Beschichtung kann mit physiologischer Salzlösung erfolgen, wobei die über schüssigen Valenzen mit inerten Proteinen abgesättigt werden können.

Die Fluoreszenz-Farbstoffe können an biologische Mo leküle oder an sogenannte Mikrobeads gebunden sein. Mit dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter kön nen auch Antigen- und Antikörperreaktionen untersucht bzw. nachgewiesen werden. Die Untersuchung von DNA/RNA kann zusätzlich mit Hilfe von intercalieren den Farbstoffen, z. B. Ethidiumbromid, durchgeführt werden. Außerdem können auch Untersuchungen an größe ren (Zell-)Kompartimenten oder ganzen Zellen durch geführt werden.

Nachfolgend soll die Erfindung an einem Beispiel nä her beschrieben werden. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes Reflexionsfluorimeter, und

Fig. 2 eine Seitenansicht des in Fig. 1 darge stellten Reflexionsfluorimeters.

In den Figuren ist dargestellt, wie Licht der Licht quelle 2 auf die äußere Mantelfläche über die gesamte Länge eines Lichtleiters 1 gerichtet wird. Dabei wird das Licht, wie dies die Strahlen verdeutlichen, durch eine Optik 6 auf den Lichtleiter 1 gerichtet. Die Optik 6 ist bevorzugt ein keilförmiger Reflexionstra pezoid, dessen Geometrie- und Brechnungsindex si chern, daß nahezu der gesamte Lichtanteil des von der Lichtquelle 2 abgestrahlten Lichtes auf die Oberflä che des Lichtleiters 1 trifft und zur Anregung ausge nutzt werden kann.

Der Lichtleiter 1 ist kapillarförmig, und in der Ka pillare kann mindestens ein Analyt enthalten sein, der durch Fluoreszenz-Anregung mit bekannten Verfah ren aus der Chemie und Biochemie auch quantitativ bestimmt werden kann.

Das angeregte Fluoreszenzlicht tritt aus einer Stirn seite des Lichtleiters 1 aus, wie mit den Pfeilen kenntlich gemacht, und kann mit lichtempfindlichen Sensoren 4 bestimmt werden. Dabei ist es günstig, zur Unterdrückung des Streulichteinflusses vor den bzw. die lichtempfindlichen Sensor(en) 4 ein optisches Filter 5 anzuordnen.

Anstelle des optischen Filters 5 kann aber auch für wellenlängenaufgelöste Messungen ein optisches Gitter oder ein Spektrometer verwendet werden, wobei dann der lichtempfindliche Sensor in Form eines entspre chend angeordneten und dimensionierten Diodenarrays ausgebildet ist.

An der anderen Seite des Lichtleiters 1 ist eine Kopplungsvorrichtung 3 vorhanden, um den Lichtleiter 1 zu fixieren und zu positionieren.

An dieser Seite kann ein Positionieransatz 7 an den Lichtleiter 1 ausgebildet werden, der sicherstellt, daß dieser in einer ganz bestimmten zirkulären Posi tion gehalten wird, so daß der Lichtleiter 1 auch für nachfolgende Untersuchungen in reproduzierbarer Form erneut fixiert werden kann.

Claims

1. Reflexionsfluorimeter mit einem kapillarförmigen Lichtleiter (1) zur Aufnahme von Analyten in der Kapillare und mindestens einem lichtempfindli chen Sensor (4), der an einer Stirnseite für den Empfang des aus dem Lichtleiter (1) austretenden Fluoreszenzlichtes angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtquelle (2) zur Fluoreszenzanregung in der Kapillare so angeordnet ist, daß Licht auf die äußere Mantelfläche des transparenten Lichtleiters (1) trifft.

2. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an der anderen Stirnseite des Lichtleiters (1) eine Kopplungs vorrichtung (3) angeordnet ist.

3. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht der Lichtquelle (2) durch eine zylindrische oder prismatische Optik (6) auf die Mantelfläche des Lichtleiters (1) gerichtet ist.

4. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Winkel und der Brechungsindex der Einstrahlungs-Optik (6) so ausgewählt sind, daß Anregungslicht nur an der der Mantelfläche des Lichtleiters (1) gegenüber liegenden Seite austritt.

5. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einstrahlungs- Optik (6) ein keilförmiger Reflexionstrapezoid ist.

6. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Licht der Lichtquel le (2) intermittierend auf den Lichtleiter (1) richtbar ist.

7. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der/die lichtemp findliche(n) Sensor(en) (4) Photomultiplier und/oder Diodenarrays sind.

8. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem/den licht empfindlichen Sensor(en) (4) ein optisches Fil ter (5) angeordnet ist.

9. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Lichtleiter (1) und lichtempfindlichen Sensor(en) (4) ein optisches Gitter (6) oder ein Spektrometer an geordnet ist.

10. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Hilfssensor zur Messung des emittierten Lichtes der Lichtquelle (2) oder des reflektierten Lich tes vorhanden ist.

11. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtleiter (1) in seiner Kapillare ein Volumen-Oberflächenver hältnis von 1 : 3 bis 1 : 10 µl/mm² aufweist.

12. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in der Kapillare mehrere Analyte gleichzeitig enthalten sind.

13. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß an einer Stirnseite des Lichtleiters (1) eine Verformung, in die ein Positionieransatz (7) zur Einhaltung einer be stimmten zirkulären Position formschlüssig ein greift, ausgebildet ist.