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利用特殊用途的随机粒子阵列的多分析物分子分析
Abstract
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本发明提供了一种用于通过生成新的磁性纳米粒子以及编码粒子的子文库而从子文库生成新的编码的磁性粒子的文库的方法。这些按需功能化的子文库可用于形成阵列。本发明特别适用于进行定性和/或定量分析样品中大量的分析物分子的结合相互作用的多元(平行)检测。
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2005-07-06
Status
Pending
Description
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技术领域
本发明主要涉及材料科学和分析化学领域。
本发明揭示了一种用于生产编码的磁性粒子(encoded magneticparticles)以及形成包含这些粒子的平面组件的方法。本发明也揭示了一个用于实现多步生物分析检测方案的平台，该方案容许整合样品制备步骤和对多种类型的分析物与结合物之间的相互结合作用的同步分析。
背景技术
例如亲和纯化的多种生物分析方法以及例如免疫检测与DNA杂交检测的多种生化检测都要求将特殊分子或成分从复杂的混合物中分离出来。在分子和细胞生物学中，磁性聚合物粒子(“珠(beads)”)已经被广泛地用于这个样品制备的方面。例如，用带有短寡dT捕获探针的磁珠从细胞裂解物中提取信使RNA(mRNA)。在将粒子加入到裂解物中后，通过polyA尾与捕获探针的杂交将分子捕获，并收集于永久磁铁所产生的磁场梯度中，在用空白缓冲液置换裂解物期间利用所应用的磁场保留住分子，以及通过去除磁场将分子释放到悬浮液中(″BiomagneticTechniques in Molecular Biology，″Technical Handbook，3rd Edition，DYNAL，1998)。以相似的方式，用带有针对特殊的细胞表面抗原的抗体的磁珠选择性地从给定的悬浮液中提取出所需的细胞类型(″CellSeparation and Protein Purification″，Technical Handbook，2nd edition，DYNAL，1997)。一个最近的实例描述了一种磁性细胞分离方法，该方法描述了将磁珠与对收集到的细胞光学成像相结合的用法(A.G.J.Tibbe etal.″Optical tracking and detection of immunomagnetically selected andaligned cells″Nature Biotech.，17，1999，1210-1213)。
对检测步骤的整合，这个重要目标促进了临床分析仪和其他实验室自动化实例的引入，在当前的技术条件下，检测步骤的整合依赖于适用于标准的机器人液体操作(“吸量(pipetting)”)以及用读板器从各个孔中读取检测信号的多个独立反应孔的96孔(或相关的)微孔的格式。根据磁珠用于分离的用法，商业化的机器人吸量系统最近已经被引入到自动化的样品制备中。然而，生物化学和分析检测操作的小型化所极为需要的对利用微液态的操作方法的样品处理以及分析的高度平行的阵列格式的整合至今还没有被描述。
将例如抗体和寡核苷酸的多种结合物以点或条纹的形式印记于平面基层上，这促进了在平行的(“多元(multiplexed)”)结合测定中对例如抗原和DNA的多种分析物的同步监测。对用于增加检测量以及研究结合动力学的检测格式的小型化已经被描述(R.Ekins，F.W.Chu，Clin.Chem.37，955-967(1991)；E.M.Southem，U.Maskos，J.K.Elder，Genomics 13，1008-1017(1992))。在最近几年里，该方法吸引了很多的兴趣，尤其是与进行广泛的遗传分析所相关的领域(G.Ramsay，Nat.Biotechnol.16，40-44(1998)；P.Brown，D.Botstein，Nat.Genet.21，33-37(1999)；D.Duggan，M.Bittner，Y.Chen，P.Meltzer，J.M.Trent，Nat.Genet.21，10-14(1999)；R.Lipshutz，S.P.A.Fodor，T.R.Gingeras，D.J.Lockhart，Nat.Genet.21，20-24(1999))。
至今所报道的阵列制作的基本技术包括：以将探针溶液的一小样份(aliquot)以针转移到或喷墨印记到不同基层的形式对原始“点样”进行精确化(V.G.Cheung，et al.，Nat.Genet.21，15-19(1999))；将结合物依次电泳沉积于各自的电定位的基层区域(J.Cheng，et al.，Nat.Biotechnol.，541-546(1998))，以及促进在空间上可分辩的寡核苷酸原位合成(U.Maskos，E.M.Southern，Nucleic Acids Res.20，1679-1684(1992)；S.P.A.Fodor，et al.，Science 251，767-773(1991))或寡核苷酸共聚合(A.V.Vasiliskov，et al.，BioTechniques 27，592-606(1999))的方法。这些技术产生了空间编码的阵列，其中阵列中的位置提示了任何成分探针的化学特性(Bio Techniques 27，592-606(1999))。所有的这些现有的技术都要求在相关检测开始前完成阵列形成。因此，在现有技术中没有任何的阵列形成技术允许在相关结合反应完成后实时形成阵列。
将单分散的磁珠局限于平面基层或交界面，并暴露于一个垂直定向于交界面平面的单一磁场中，形成了各种有序的二维结构(W.Wen，L.Zhang and P.Sheng“Planar Magnetic Colloidal Crystals”Phys.Rev.Lett.，85，(25)，5464-5466，2000；M.Golosovksy，Y.Saado，and D.Davidov″Self-assembly of floating magnetic particles into ordered structures：Apromising route for the fabrication of tunable photonic bandgap materials″Appl.Phys.Lett.，75，(26)，4186-4170，(1999)；K.Zhan，R.Lenke，and G.Maret″Two-stage melting of paramagnetic colloidal crystals in twodimensions″Phys.Rev.Letter.，82，(13)，2721-2724，1999)。
许多技术已经被建议用于合成这些粒子。这些技术尝试赋予磁性粒子特定的性能，使得它们能满足特定的应用。这些技术可以被总结为两种策略，第一种策略涉及合成一种磁性核心以及第二种策略涉及合成一种磁性外壳。
与第一种策略所相关的专利包括：
U.S.Patent No.4,358,388，授予Daniel和U.S.Patent No.5,356,713，授予Charmot。揭示了一种利用悬浮液聚合化操作的方法。该方法的一个缺点是难以控制所形成的磁性乳液的单分散性，以及该方法显示不能很好地适用于荧光磁性粒子的生产。
U.S.Patent No.4,654,267，授予Ugelstead，揭示了一种硝化方法，该方法生成具有顺磁性核心的粒子。在磁化后，用功能性聚合物包被粒子以提供一个反应性外壳并生成了具有受控制的形态、多分散性、孔径大小分布、磁负荷以及表面化学的超顺磁性粒子。对这些粒子的编码还没有被描述过。
U.S.Patent No.4,873,102，授予Chang，揭示了一种形成磁性聚合物粒子的方法，该粒子的所有微孔中都含有统一的磁性结晶。该粒子只能在亲水条件下使用。
U.S.Patent No.5,356,713，授予Charmot，揭示了磁化组合微球，该微球可用于生物学应用，但因为它的大小分布使得它在其他应用上受到限制。
U.S.PatentNo.5,512,439，授予Homes，揭示了单分散的、超磁性粒子，它带有多个寡核苷酸的分子，该粒子可以用作为单一的标准核酸。该寡核苷酸可以被共价连接或亲和结合。
U.S.Patent No.5,698,271，授予Liberti，揭示了一种生产磁性应答粒子的方法。该粒子已经应用于各种制备和诊断技术。
U.S.Patent No.5,866,099，授予Owen，揭示了一种用于免疫检测技术和生物/医学应用的磁聚合物粒子。利用过渡金属和具有可获得的均一位点的聚合物共沉淀生产该粒子。
被认为与第二种策略相关的专利包括：
U.S.Patent No.5,736,349，授予Sasaki，揭示了一种用于免疫检测方法的磁性粒子，它包括一个核心和一个包被层。抗原或抗体结合于包被层表面。
U.S.Patent No.5,648,124，授予Sutor，揭示了一种利用反向电荷核心粒子以及磁性粒子通过异凝集生产磁性粒子的方法。分散的磁性粒子可以是被一个或多个外在聚合物被膜进一步包裹的被包裹微粒。
U.S.Patent Nos.6,013,531、5,283,079和5,091,206，授予Wang，揭示了一种生产磁性应答聚合物粒子的方法。该粒子包括一个聚合物核心粒子，该核心被一层含有磁性应答的金属氧化物聚合物层均匀地包裹。这些磁性应答聚合物粒子的表面可以被一层功能化聚合物进一步包裹。这些磁性应答聚合物粒子可以被用于与生物材料被动或共价的结合并被用作为用于各种类型的免疫检测的固体相。
一些用于合成染色的磁性粒子的各种方法已经被描述。被认为与之相关的专利包括U.S.Patent No.5,395,688，授予Wang，它揭示了一种生产磁性应答的荧光聚合物粒子的方法，该粒子包括一个荧光聚合物核心粒子，该核心被一层磁性应答的金属氧化物均匀地包裹。该方法利用将预先形成的荧光聚合物核心粒子与苯乙烯及水的磁性金属氧化物乳剂混合并聚合。类似这种两步反应方法的缺点是荧光染料可能抑制聚合反应或外壳的聚合过程对荧光的反向漂白。U.S.Patent No.6,013,531已经描述了将这些含有荧光标记的磁性粒子用于校准特定的固相检测的用途。在该步骤完成后，用功能化的聚合物包裹粒子以形成反应性外壳。
通过多步(逐层)策略可以实现从分散的胶状物质到生成核心-外壳粒子。该方法包括将带电荷的聚合物或纳米粒子和带相反电荷的聚电解质吸收到胶状粒子，利用基本的静电相互作用进行层的构建(Caruso et al″Magnetic Core-Shell Particles：Preparation of Magnetite Multilayers onPolymer Latex Microspheres″Adv.Mater.1999，11，950-953)。利用静电物理吸附所形成的外壳对于生物分析检测是不可能的，因为它在检测条件，特别是盐的浓度，发生变化时是化学不稳定的，并且它促进了带电荷生物分子的非特异性的吸附和变性。这个以往技术参考文献中所描述的粒子不适合于这里所计划进行的检测方法。
虽然先前的参考文献揭示了磁性粒子的用法，但是先前技术中没有一个粒子具有符合标准所必需的性能，这个标准是成功地实现这里所描述的检测所必需的，包括优选的大小范围、重要的单分散、化学地功能化和合成的灵活性，后者允许快速地构建编码的磁性粒子的文库，粒子可以被按需地功能化，文库中所出现的化学多样性大于2。另外，磁性粒子必需符合特定的质量标准，使得能重复地组装定制的阵列来保证定量检测的同步进行。
发明内容
本发明提供了涉及实现用于多元分子相互作用分析的生物分析检测过程的方案、组合物和方法。本发明的方法采用多种编码的磁性粒子，这些粒子在它们的编码上有所区别。这些粒子具有一种或多种结合物，这些物质能同与这些粒子接触的一种或多种特异的分析物相互作用。
本发明提供了一种制备粒子文库的方法，该粒子是一种编码粒子和多种磁性纳米粒子的组合物(“组合粒子”)。这些组合粒子可被功能化使得其能应用于特殊的检测。这种功能化的实例包括容纳结合物，例如寡核苷酸、DNA、肽或蛋白。这些组合粒子包含一种光学可区分的编码，所选择的这些编码反映了所含结合物的性能，因此通过实时的、原位的观察可以区分组合粒子以及它们所相关的结合物。利用这些文库可以按需定制珠阵列。这些阵列可用于生物检测，包括包含多元分子相互作用分析的测定。
这里所描述的生物分析检测平台利用组合粒子文库来整合主要的检测步骤，包括样品的收集和制备、加工和分析。在优选的具体实施方案中，分析在高度平行的珠阵列格式上进行，其中阵列是在样品制备和加工步骤完成后被实时组装的。
附图说明
当参照于下面的应当被理解为对只是用于举例说明的具体实施方案的详细描述以及反映该具体实施方案的附图时，将更清楚地了解在上面简要的解释中所讨论的本发明的其他目的、特点和优点，其中：
图1是操作流程的图解，包括随机编码的珠阵列的生产以及它们在多元检测中的应用。
图2是珠的功能化的图解。
图3是芯片设计以及晶片尺度的生产步骤的图解。
图4是按需组装随机编码阵列的图解。
图5是掌上型微型实验室的图解。
图6是在本发明的随机编码阵列检测过程中所使用的检测和解码图像的示意图。
图7是概括图像分析的算法和步骤的流程图。
图8是通过应用图7所概括的图像分析算法根据珠的类型解析检测图像的步骤的图解。
图9是随机编码检测的光学可编程的(optically programmable)阵列组件的图解。
图10是由随机编码子阵列构成的阵列的图解。
图11是芯片尺度的珠阵列的自动化生产以及质控过程的站点的图解。
图12是两种细胞因子的定量结合曲线的图解。
图13是设计用于多态性分析的阵列的图解。
图14是在多态性分析中从图13所示的一个子阵列中记录到的检测及解码图像的荧光显微照片。
图15是来自对如在图14中所示的一个检测图像的分析的测定结果的强度直方图形式的图解。
图16是用于杂交检测的“环状探针”的设计的图解。
图17A和17B是在多种细胞因子分析中记录到的检测及解码图像的荧光显微照片。
图18A和18B是具有多个竞争性受体-配体相互作用的受体-配体系统中的交叉相互关系的数字模拟的图解。
图19是受体-配体结合和解离动力学的数字模拟的图解。
图20是整合利用磁捕获珠的样品捕获以及利用本发明的随机编码阵列检测方法的基于阵列的检测的图解。
图21是利用组合粒子整合基因的特异性捕获、珠上逆转录以及检测后阵列组装的多步检测的图解。
图22是适用于广泛的生化检测的多步检测序列的图解。
图23(i)是显示四种不同类型的单一光学粒子的直方图以及图23(ii)是八种双重编码的粒子的点状图。
图24是各种磁负荷的图解。
图25是暴露于磁场的本发明的组合粒子的图解。
图26是用于磁场应用的试验性组件的示意图。
图27(i)是应用于磁场前的珠组件的2D结构的示意图。图27(i)是应用于大约100高斯磁场后的珠组件的2D结构的示意图。图27(iii)是图27(ii)的2D组件的近似示意图。图27(iv)是在约20高斯磁场中更高浓度珠(2x)的2D排列的示意图。
图28显示了利用本发明的编码和磁性粒子进行的抗生蛋白链菌素-生物素结合测定的结果。
图29显示了利用本发明的编码和磁性粒子进行杂交测定的结果。
具体实施方式
特殊应用的珠阵列的制作可以包括多步顺序中的多个操作，利用现有的液体操作技术和实验室自动操作可以将该顺序自动化。这里所描述的并称为随机编码阵列测定(random encoded array detection，“READ”)的操作包括制作随机编码阵列以及将这些阵列应用于生物测定，包括涉及多元分子相互作用分析的测定，包括但不局限于分析物和结合物分子的相互作用，例如DNA和蛋白分析。这里和U.S.Patent No.6,251,691中所描述的随机编码阵列克服了许多与采用多步顺序所相关的缺点。
这里所用的名词“分析物(analyte)”和“结合物(binding agent)”指的是参与于结合相互作用的分子。举例来说，分析物和结合物可以包括DNA或RNA片段(例如，寡核苷酸)、适体(aptamer)、肽和蛋白、抗原以及小的有机分子。在具体测定中，分析了这些片段和它们的互补序列的结合(杂交)。在另一个具体检测中，分析了配体和受体之间的结合相互作用。
这里所用的名词“粒子(particles)”指的是胶状粒子以及珠。名词“粒子”也用于与本发明有关的编码粒子(encoded particles)和磁性粒子(magnetic particles)。
这里所用的名词“磁性粒子”指的是具有永久的或感应的偶极力矩的粒子。
图1提供了功能性成份以及操作流程的图解性概括，通过该操作流程可以制备定制的珠阵列并将其用于进行根据本发明的多元生物分子分析。通过采用分开的批处理生成特殊应用的基层(例如晶片尺度的芯片)，产生被编码和功能化的珠(例如比例为-10^8/100μl悬浮液)或产生被编码的、磁化的和功能化的珠，来制备阵列。在组装珠阵列之前进行相应的质控步骤(QC)，例如测定形态和电特征。另外，在将悬浮液中的珠引入到基层之前对其进行准确的测定以优化测定条件，常见的目的是使得测定敏感性和特异性最大化以及珠与珠的差异最小化。对于基层，QC步骤可以包括光学观察、椭圆偏光法以及电传输测定。
一旦将化学编码的及生物学功能化的珠与基层(例如芯片)结合，U.S.Patent No.6,251,691所描述的方法(″LEAPS″)以及PCT/US97/08159所描述的方法可以被用于在同一液体相内在基层上所设计好的区域快速地组装密集阵列，避免了点对点以及芯片对芯片之间的差异所引起的问题且不需要重新组装或重新设计方法。而且，该珠阵列格式容许珠具有独立于芯片的特性以及将检测条件最优化。另外，在同一芯片上所具有的被分隔的液态间隔内可以同时形成多个珠阵列。一旦形成，这些多个珠阵列可以被用于对多个样品的同步处理。对LEAPS和微液态的整合产生了用于蛋白和DNA平行分析的自备的、小型化的、光学可编程的(optically programmable)平台。这里将U.S.Patent No.6,251,691和PCT/US97/08159的所有内容一并进行参考。
在本发明的某些实施方案中，通过用数种光学可区分的标记物将珠染色可以实现化学编码，这些标记物例如那些含有一种或多种通过激发波长、发射波长、激发态时间以及发射强度而显著区分的荧光团染料的标记物。光学可区分的标记物可以被用于按特定比例将珠染色，例如在Fulwyler的U.S.Patent No.4,717,655中所阐述的。根据本领域人员所熟知的方法也可以通过将粒子膨胀来完成染色(Molday，Dreyer，Rembaum& Yen，J.Mol Biol 64，75-88(1975)；L.Bangs，″Uniform Latex Particles，Seragen Diagnostics，1984)。通过膨胀(swelling)和用两种颜色的大块染色(bulk staining)能编码最多到12种类型的珠，每个珠都在四种强度水平，并以四种很小的摩尔比例(nominal molar ratios)混合。在国际申请No.PCT/US/98/10719中揭示了用于外或内表面的组合颜色编码，在这里一并将其全部内容进行参考。
根据本领域已知的方法，例如用已知技术的一些结合反应中的一个反应(G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)；L.Illum，P.D.E.Jones，Methods in Enzymology 112，67-84(1985))通过将结合物分子结合到珠上将珠功能化，结合物分子包括DNA(寡核苷酸)或RNA片段、肽或蛋白、适体和小的有机分子。在本发明的某些实施方案中，功能化的珠具有共价结合于珠的结合物分子(例如DNA、RNA或蛋白)。可以把珠保存于缓冲的大量悬浮液中直到使用。功能化通常需要一步或两步反应，如图2所示，利用标准液体操作机器人以及96孔格式可以平行地进行这些反应并将一些的所需的功能化分子中的任何一种分子共价地连接到设计好的珠上。在优选的实施方案中，使用核心-外壳构架的珠，外壳由薄的聚合物阻断层组成，阻断层选择了优选的组成成份，并如本领域所熟知的，根据靶向测定应用进行功能化。可以抽出样品进行自动化QC测定。每批珠给成千上万个芯片提供了材料使得芯片对芯片的差异被最小化。
根据LEAPS的界面图案化方法(patterning methods)可以图案化本发明所使用的基层(例如芯片)，通过例如氧化物或其他绝缘材料的图案化生长以便在施加AC电场的情况下产生所需的阻抗梯度结构。图案化处理可以被设计为能生成AC场诱导的液流以及相应的粒子转运的所需的结构。如图3所示，通过使用半导体图案化技术可以在晶片尺度上图案化基层。另外，通过沉积一种UV可图案化的、光学透明的聚合物薄层而在基层上附着所需的液体管路和分隔的布局以便将基层分区，从而将液体局限于一个或多个分散的分隔中，由此可以为一个给定的基层提供多种样品。
在本发明的某些实施方案中，将第一个平板电极基本上平行于第二个平板电极放置(“三明治”结构)，两个电极之间被间隙分隔，且间隙中含有电解质溶液，由此制备珠阵列。利用界面图案化方法图案化第二个平板电极的表面或内部。将编码的和功能化的珠引入到间隙中。当将AC电压应用于间隙时，珠在第二个电极(例如“芯片”)上形成了随机编码阵列。而且也利用LEAPS，可以在光敏电极(“芯片”)上形成珠阵列。优选的，将个平板光敏电极和另一个平板电极也用于所述的三明治结构。再一次的，两个电极被一个间隙所分开并含有电解质溶液。将功能化和编码的珠引入到间隙中。在联合应用光和AC电压下，珠在光敏电极上形成阵列。
在某些的实施方案中，根据特异的阵列组成，通过从各自的库(reservoir)中选出所指定的编码珠的样份并“汇集(pooled)”，以预防样份的最初融合的方式将汇集的悬浮液的样份分配到所选择的基层上(例如芯片)，可以生成用于本发明的特殊应用的珠阵列。样份形成了多种编码珠的平面随机子阵列，每个子阵列代表来自各自汇集池的珠，且物理阵列布局独特地对应于来自汇集珠群的样本的特性。
可以使用基层上被化学地或物理地编码的编码珠的平面阵列或组件。对此，也可以添加空间编码以增加能操纵的检测的数目。例如在组装阵列时可以在单液相完成空间编码，该组件利用LEAPS按所需的反应于相应的电场和/或根据照射于基层的光的模式的构型组装平面珠阵列。LEAPS产生了硅芯片和溶液之间的界面阻抗的横向梯度以调节指导阵列组装的电流动力。电的需求是最少的：两个平板电极之间的通常100μm的液体间隙上所应用的低AC电压通常小于10Vpp。整个组装过程是快速的并且它是光学可编程的：在数秒内在电场中形成包含数千个珠的阵列。多个子阵列的形成也可以发生在保持于被分隔的芯片表面的多个液相。
利用已组装的编码珠而不是一个阵列也可以在基层表面进行本发明的多元检测。例如，通过将珠悬浮液定点滴到基层的多个区域并允许珠在重力下停留，可以在基层表面形成珠的组件。与LEAPS所形成的珠阵列相反，这些组件通常采用低密度和无序的结构。然而，通过将化学编码珠的混合物定点滴入到基层的多个不同位置所获得的空间与颜色的联合编码仍提供了多元分析的可能，这对于某些生物测定是足够的。
可以在基层上组装编码阵列之前或之后完成这些珠的结合物与分析物之间的结合相互作用。例如，珠阵列可以在检测后形成，之后可以取得阵列的检测图像或解码图像。同样的，可以用物理或化学的方法将珠组装于阵列中并固定以形成随机编码阵列，例如图10所示的阵列形状。阵列可以被固定不动，例如通过应用DC电压以生成具有图10所示的阵列形状的随机编码阵列。DC电压通常被设定为5-7V(对于2-6μm范围的珠以及100-150μm的间隙大小)并按“反偏压(reverse bias)”结构应用＜30s，以致于n掺杂硅(n-doped silicon)基层将形成阳极，引起阵列被压缩到便于阵列内相邻珠之间相互接触的范围并同时造成珠向电极表面相邻近端的高电场移动。一旦足够的接近近端，珠被介导物理吸附的范德华力所锚定。通过在珠表面提供一群延伸自珠表面的“系链(tether)”促进了该吸附过程；多赖氨酸和抗生蛋白链菌素已经被用于该用途。
在某些实施方案中，粒子阵列可以用化学方法所固定，例如通过形成组合的胶-粒子膜。在一个形成这种胶-组合粒子膜的实例中，提供有微粒悬浮液，其中含有所有随后进行的形成原位胶的成分，就是单体、交联剂和引发剂。用LEAPS应用方法将粒子组装成基层上的平面组件，例如在电极之间跨液体间隙所应用的AC电压为1-20Vp-p，其频率范围从100’赫兹到数千赫兹。阵列组装后，在存在所应用的AC电压下，利用IR灯或利用水银灯源热加温单元到40-50℃以触发液相的聚合作用，并有效地俘获胶内的粒子阵列。胶可以由从20％到5％的不同单体浓度的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物构成(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝37.5∶1，摩尔比)，或者也可以同样使用低粘度的水溶性单体或单体混合物。用这种方法制备的化学固定的功能化的微粒阵列可以用于各种生物检测，例如配体受体结合试验。
在一个实例中，利用二盐酸偶氮二异丁脒(azodiisobutyramidinedihydrochloride)作为热引发剂形成热的水凝胶，二盐酸偶氮二异丁脒为低浓度以保证聚合混合物的总的离子强度在0.1mM到1.0mM的范围内。UV聚合作用所使用的引发剂为Irgacure2959(2-Hydroxy-4′-hydroxyethoxy-2-methylpropiophenone，Ciba Geigy，Tarrytown，NY)。将引发剂加入到单体中以得到1.5％重量百分比的溶液。
在某些实施方案中，粒子阵列可以被用机械方式固定。例如用标准的半导体操作方法可以在硅基层的低阻抗区生成微孔阵列。例如通过利用LEAPS介导的水动力用这些结构可以形成粒子阵列，以及利用重力转运并将粒子聚集于孔阵列上。然后关闭AC电场并将粒子收集到微孔中，因此将粒子机械地固定。去除多余的珠，在基层表面留下几何学有序的随机珠阵列。
当将珠阵列在检测之前固定时，阵列作用为一个两维的亲和矩阵，它具有受体或结合物(例如寡核苷酸、cDNA、适体、抗体或其他蛋白)以捕获来源于与阵列接触的溶液的分析物或配体(DNA、蛋白或其他小的同源配体)。珠阵列平台可以用于进行多元分子分析，例如基因表型、基因表达谱、循环蛋白水平谱以及多种动力学研究。
可以将基层(例如芯片)放置于一个或多个封闭的间隔中，该间隔允许通过流体相互连通将样品和试剂转运进或出间隔。可以用这种格式进行芯片上(on-chip)细胞因子的免疫检测，例如白介素(IL-6)。将血清样品和荧光标记的第二抗体依次引入反应间隔以允许其与固定于芯片的珠反应。图5说明了一个反应间隔的设计，根据本发明该间隔可以用于多元检测。反应也可以在一个类似于微滴度板的开放的间隔格式中进行。利用机器人液体操作装备可以将试剂吸量到芯片顶部，并可以同时操作多个样本。这样的一种格式提供了应用于现有的微滴度板格式的标准的样本处理以及液体操作，并整合了样本处理和阵列测定。
在某些实施方案中，分析物-结合物相互作用的存在与参与相互作用的珠的光学信号的改变相关，并检测和分析了这些光学改变。通过检测与这些珠所相关的化学或物理地可区分的特性可以确定出参与相互作用的结合物的特性。优选的，将化学可区分的特性包括化学分子包括荧光团染料、发光团以及其他化学分子用于结合检测中的测定目的。
当粒子在基层上被组装成平面阵列时，可以进行化学地或物理地可区分的特性的测定以及与结合相互作用相关的光学信号变化的测定，例如通过取得阵列的检测以及解码图像并比较两者的图像，例如对检测和解码图像的比较包括光学显微镜装置的使用，该装置包括图像检测器、计算机图像捕获以及分析装置。解码图像可以被用于确定独特地识别珠表面所具有的结合物的化学地和/或物理地可区分的特性，例如通过用可区分的特性确定阵列中每个粒子上的结合物的特性。阵列的检测图像被用于测定结合物和分析物复合物的光学信号。在某些实施方案中，可以将荧光标记物(荧光团染料)连接于分析物上，以致于当分析物结合于珠时，荧光强度的改变代表了珠的光学信号的改变。在某些实施方案中，解码图像的取得是在珠被组装成阵列以及被固定之后并在取得检测图像之前，优选的在将珠上的结合物与分析物接触之前。在某些其他的实施例中，当溶液中的珠被组装成阵列后，发生结合相互反应并获得解码和检测图像。
通过比较解码图像和检测图像可以发现结合物-分析物复合物的结合物的特性。
在优选的实施方案中，将图像分析算法用于分析从解码和检测图像中得到的数据。这些算法可以被用于获得阵列中每个珠的定量数据。如图7所概括的，分析软件自动定位于珠的中心，它将阵列的一个亮视野图像作为模板，根据珠的类型将珠分组，并给每个珠分配定量强度，排除了例如那些血清样本中不规则形状的“基质(matrix)”材料所产生的“污点”，分析背景强度，统计和评估了所有类型的珠的背景校正的平均强度以及相应的偏差。
本发明的方法可以用于测定结合和解离常数，例如通过以时间依赖性方式引入分析物并分析作为时间函数的结合，或通过以时间依赖性方式洗涤所结合的分析物并分析作为时间函数的结合。
本发明的方法可以用于测定分析物-结合物的相互作用的亲和常数，用于测定形成的分析物-结合物复合物的数目。
本发明也提供了用于测定生物样品中一种分析物的浓度的方法。
本发明的方法也用于测定一种给定的分析物对一组结合物的共亲和矩阵的元件。在一个实施例中，可以确定出分析物和一组结合物之间的相互作用的程度，其相互作用为竞争性、多成分的平衡反应。对共亲和常数的测定提供了有用的应用，如下所述。
多种类型的器官移植的成功率直接与供体和受体之间的人白细胞抗原(HLA)的相容性相关。对受体的群体反应性抗体(PRA)的血清学测定是避免可能的排斥反应的关键步骤之一。PRA测定的交叉反应是非常常见的现象，这归结于一些HLA抗原结构的相似性以及发生这些抗体的本性。事实上，根据组间的明显的血清学交叉反应性可以把HLA抗原编组。这些组称为交叉反应组(CREG)。在目前的临床设置中，将来自一个患者的抗体在不同的反应中测试不同的抗原。尽管结合于不同反应的结果可以产生抗体的反应形式，但是不同抗体和抗体之间的相互反应的竞争特性在这样的形式中没有被反映出来。在其他情况下，将一些抗原混合在一起用于结合测定。在该体系中缺乏对每个抗原的测定，这阻止了结合数值的产生。结果仅仅是来自不同抗原的平均信号。在珠阵列体系中，将一组不同的抗原呈递给竞争结合环境中的抗体分析物，以及用与不同类型珠的相关性可以测定每个抗原。因此，竞争性反应中的每个抗原的结合强度可以被提取于单个测定中。这种共亲和矩阵系统将给CREG提供结合数值并极大地推动了对反应本质的理解以及提供了相关的临床决定的准确性。例如，一个N抗体和M抗原体系提供了N×M种可能反应的矩阵。测定K-nm是可能的，K-nm是控制第n个抗体对第m个抗原的相互作用的亲和常数，其中m＝1，2，....M，以及n＝1，2，....N。对于不需要绝对共亲和常数的应用，根据本发明的方法将产生不同抗体的结合数值，以及来自患者样品的结果可以与这些数值或这些数值的组合相匹配。
共亲和矩阵也可以用于表征分析物。例如，结合共亲和矩阵以及已知浓度的参与分析物-结合物复合物形成的分析物和结合物的系数并用于定义竞争性结合相互作用的描述符，例如分子相互作用参数，
它提供了结合物Rm和分析物Ln之间的分子相互作用的特性，在存在分析物时{Lj；1＜j＜N}，所有的这些都代表出结合物的有限的亲和力，Kmj。也就是Pn，0≤Pn≤1，代表了在多成分竞争性反应中结合物Rm对分析物Ln的标准化的特异性，并作为结合物的基于多成分竞争性反应所具有的共亲和力的重要特征。也见于P.H.von Hippel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，1603(1986)，一并于参考。
分析物对一组结合物的结合反应模式可以被用于表征分析物并将它与其他分子进行比较。另外，通过利用一组参照的结合物所产生的分析物的共亲和矩阵，通过观察结合模式的差异可以将这些亲和力用于测定出随后加入结合物组的样品中是否含有杂质。
本发明也提供了U.S.Patent No.5,759,820和European PatentNo.83901406.5(Sintef)所描述的超顺磁性粒子(“磁性粒子”)的用法。它可以被用于整合编码珠阵列所包含的样品制备步骤以及检测步骤。两个参考文献这里都一并进行参考。
可以用化学地或物理地区分的特性(例如荧光标记物)编码超磁性粒子并将其用于进行本发明的生物检测。在某些实施方案中，用LEAPS组装粒子，如同非磁性编码的珠一样。这些编码的纳米粒子也能被用于生成阵列并被检测。本发明也包括通过将磁场应用于所述粒子可以在基层上形成编码的和功能化的超磁性粒子的平面阵列。
本发明提供了一种用于生产颜色编码磁珠的新方法，一种简单的及灵活的将根据下述的方法制备的受较好控制的数目的磁性纳米粒子，以及受较好控制的数量的一种或多种荧光染料引入到预先形成的聚合微粒中的方法。在本发明的一个具体实施方案中，控制磁性纳米粒子的数量使得其在所应用到所述粒子的磁场中在基层上形成一个阵列。这个过程包括在一个含有染料和磁性纳米粒子的有机溶剂中将聚合物粒子膨胀，并因此将其应用于任何能进入标准膨胀程序的聚合物粒子，例如那些在先前微粒的荧光染色的技术中所阐述的粒子。不同于编码方法，其中每个磁性材料以及荧光染料被定位于磁性粒子的(核心/外壳)的不同区域，粒子的统一膨胀保证了磁性粒子在整个内在容积内的分布。这个方法也允许将纳米粒子以及染料成分的数量控制在一个宽的范围内，因此可以定制粒子的磁化率(magnetic susceptibility)以及荧光强度。本发明的另外一个方法除了控制磁负荷外是控制宿主粒子的磁性特点，它是通过调整微胶粒合成反应(见下)的水成分来调节磁性纳米粒子的大小。利用现有的功能性基团物理或化学地结合了粒子表面上可能的生物分子。通过在粒子上生长更多的聚合物外壳能迅速地清除滤出的磁性纳米粒子。
本发明也提供了一种通过两步方法生产编码的磁性粒子文库的新方法。这个方法中的第一步包括生产磁性纳米粒子的子文库，方法中的第二步包括生产编码粒子的子文库。子文库形成后，如下更特异的描述，每个子文库的成员都被赋予了一种结合位点并被功能化。
通过将金属氧化物分散相与单体溶液结合并形成包被有金属氧化物粒子的粒子的聚合物矩阵可以生成磁性纳米粒子的子文库。该金属氧化物分散相可以包括一种金属氧化物，单独或与一种不同的金属氧化物联合使用。该金属氧化物可以不受限地包括氧化铁、镁、钴、锌、镍和铜等。单体溶液可以包括一种单体，单独或与一种不同的单体联合使用。单体可以不受限地包括苯乙烯、甲基丙二酸、丙烯酰胺、乙二醇丙烯酸酯、羟基-乙基-甲基丙烯酸酯、乙烯基甲苯、二乙烯基苯等。同样的，可以使用一种聚合物溶液并可以包括一种聚合物材料，例如纤维素、蛋白质样聚合物(protenaceous polymer)、玻璃、琼脂糖、凝胶等。磁性纳米粒子可以是任何大小和性状，但优选的是球形、单分散的以及从约0.01到约1微米，优选的从约0.05到约0.4微米。
通过将一种光学标记符包被于聚合物材料可以形成编码颗粒的子文库。聚合物材料可以包括一种聚合物，单独或联合使用。聚合物可以不受限地包括聚苯乙烯、聚甲基丙二酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯二醇、聚羟基-乙基-甲基丙烯酸酯、聚乙烯基甲苯、聚二乙烯基苯、溴化聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚乙烯、聚氨基甲基乙酯、聚氯乙烯或它们的组合等。光学标记物可以包括一种或多种具有200m和1200nm之间的发射波长的染料。优选的染料包括但不局限于焦甲烷(pyro-methane)和香豆素染料。可以同时使用多于一种的具有可区分的发射谱的染料，并根据染料的发射谱选择染料。
本发明的编码粒子可以是任何的大小和性状，但是优选的是聚合物的、球形、单分散的以及从约0.6到100微米，优选的从约1.5到约10微米。
根据如下面的具体实施方案和实施例所说明的相关应用，可以定制每个本发明的子文库。在一个实施方案中，通过赋予磁性纳米粒子结合位点或功能性位点可以进行这些定制，根据相关的应用选择这两种位点。通过将相关分子基团连接到磁性粒子的外表面可以形成这些位点。结合位点可以形成于聚合步骤期间以及功能性位点可以形成于更晚的阶段，但在如下图解的组合粒子的形成之前。适用于本发明生成结合位点的分子实体不受限地包括任何基团例如羧基、酯基、氨基、醛基、乙醇基、或卤化物、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素、生物素等。适合于本发明生成功能性位点的分子实体不受限地包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、中性链亲和素、生物素、蛋白A等。对赋予本发明的磁性纳米粒子特殊功能性位点的分子实体的预先选择提供了编译一组特定的子文库的能力，该子文库能用于进行特定的监测。在本发明的一个实施方案的说明中，为了进行测定相关核酸存在的检测，它将提供可应用的功能性位点使得能结合一个或多个寡核苷酸或cDNA。在本发明的实施方案的另一个说明中，为了进行测定相关蛋白存在的检测，它将提供一种功能性位点使得能结合一或多种抗原或抗体，它们是特异于相关蛋白的测定或调节。这些功能性结合可以在形成本发明的组合粒子之前或之后完成。
通常地，利用本领域已知的方法用共价连接可以将所述的功能性或结合基团连接于磁性纳米粒子的外表面。在磁性纳米粒子上的相关位点形成之后，将磁性纳米粒子的子文库与编码粒子的子文库接触，利用本领域已知的方法通过结合位点可以将磁性纳米粒子连接到编码粒子，同时留下未结合的功能性位点并用于进行相关检测。
如下面实施例所述，在本发明的另一个应用中，具有本发明的组合粒子的金属氧化物可以被约束并被调节使得诱导出相关的磁性应答。控制结合于编码粒子表面的磁性纳米粒子的数目可以进行先前的操作。
如下面实施例所述，在本发明的另一个应用中，编码粒子的光学标记符可以被按特定的比例组合以实现相关应用的目的。利用本领域已知的方法可以实现对光学标记符比例的控制，例如U.S.Patent No.4,717,655中所阐述的方法。
如下面实施例所述，在定制磁性纳米粒子的子文库后，通过将多个功能化磁性纳米粒子共价连接到一个编码粒子的外表面可以形成组合粒子的文库。根据进行的检测可以预先选择这些粒子的性质。如这里所例举的，本发明的组合粒子文库所呈现的化学多样性大于2。在另一个实施方案中，可以在进行检测本身的期间生成本发明的组合粒子。检测调用了本发明的磁性纳米粒子所具有的一个功能性基团和本发明的编码粒子所具有的第二个分子基团之间的相互作用以生成本发明的组合粒子。在检测中，在本发明的组合粒子可以被调整为用于检测的阵列格式之后，可以形成由磁性和非磁性粒子构成的异源结构，这是功能性基团和分子基团之间形成复合物的结果。
可以在基层上操作本发明的组合粒子，根据U.S.Patent No.6,251,691所阐述的界面图案化方法可以图案化基层。在图案化之后，利用“三明治”结构可以制备本发明的组合粒子的阵列。
本发明的组合粒子也可以被操纵并组装成对应于磁场的有序的阵列。磁场梯度的存在诱导出了一种作用于组合粒子上的力(～1/2(χV/μo)del(B2)，其中χ组合粒子的磁化率，V为其体积，B为磁场大小(磁通量密度)，磁场的方向以及大小依赖于磁场分布的准确的性质和磁场的强度。对单一轴场以及定位的磁场梯度所产生的结构的适当组合可以被用于捕获并以阵列的格式固定(可逆性)本发明的组合粒子。这种能形成2D阵列以及固定这些粒子的能力有着特殊的应用性，这种应用性与进行包括缓冲液交换以及多步洗涤步骤的多步检测相关。用于在垂直方向产生单一轴以及调节梯度的特别有用的结构是一对电磁圈，这样它们各自的场的方向是彼此对立的。因此通过调节圈之间的间隙或样品对应于圈的相对位置以及通过圈内各自的电流，可以控制作用于本发明的组合粒子上的力(1/2(χV/μo)BdB/dz。
作为增加磁场强度的一个功能，可以形成具有磁场依赖性的数目密度(或相同地，平均粒子间距离)以及垂直位于基层的线性的串珠(strings of beads)的有序的平面组件。
在优选的实施方案中，通过应用垂直定位于基层平面的一个统一磁场可以在基层或接近基层的位置上形成平面结构。对于具有平均直径3.2μm的组合颗粒的常见的磁化率值，按这里的实施例所描述的制备，一个产生磁感应范围为接近1000到2000高斯的磁场足够生成平面组件。当将永久磁场放置于极为接近基层的位置，它在接近基层表面生成一个磁场，其磁场强度足够实现所需的该组件的平面结构。电磁体也可以生成所需的磁场结构，例如本领域已知的螺线形电导管或Helmholtz结构；可以将基层放置于磁铁的内腔或放置于最接近于内腔外的线圈的位置，以保证磁场定位基本上垂直于基层平面。这样的排列所产生的磁场随着应用于电磁体的线圈的电流而增加，因此使得所使用的磁场随时间变化。例如对于线性变速的形式(对于电流随时间线性增加)或正弦的形式(对于电流变化是时间的正弦函数，也就是AC电流)。
给定平面组件或阵列内数目密度的场依赖性，通过对电流的实时控制，因此电磁体结构提供了一种可逆地实时调整该组件的数目密度的工具。在优选的实施方案中，将具有10Hz到10MHz范围频率，更常见的是10Hz到10KHz范围频率的AC电流添加到DC电流，所选择的AC电流的幅度与DC电流幅度相比较是小的；前者提供了组件内粒子间距的暂时变化，而后者设定了平均间距。平面组件的这种诱导的密度变异将引起一种电动力反应以及周围液体介质的局部流动。这种磁场诱导的流动是有用的，例如提供了局部的混合器以增强发生于接近基层和/或接近粒子表面的任何相关反应的动力学。另外，通过利用本领域已知的方法用透磁合金(perm-alloy)图案化基层可以生成空间调整的磁场。
本发明揭示了一种利用本发明的组合粒子文库进行多步生物分析检测操作的平台，该操作将多元分子相互作用分析以及样品制备和处理步骤整合在一起。样品制备可以包括从给定的混合物中捕获和分离所需的分析物，以及样品处理可以包括对捕获的分析物和/或结合物进行的任何所需的变换。分析通常可以包括对具有结合物的珠与分析分子之间的分子相互作用的程度的指示物的检测和记录，光学信号例如荧光或化学发光物是这种指示物的典型代表。另外，分析可以包括对与各个粒子相关的结合物的特性的原位解码。
在本发明的每个特殊的文库中，与计划检测相关的结合物都连接有颜色码形式的可区分的标记物。本发明特别相关的是能实时解码的编码粒子的子文库，以及据此确定结合物的化学特性。在本发明中，预先挑选的结合物可以被分别地结合到本发明的磁性纳米粒子上，以生成功能化的磁性纳米粒子的子文库，以及将该子文库与分开制备的作为珠标记物的编码粒子的子文库相结合，使得编码粒子独特地结合于每个第一个子文库所包含的功能化的磁性纳米粒子上。这个过程提供了独特的灵活性以控制所形成的文库的功能基团和标记物的组合和可能的排列。
在本发明的一个实施方案中，可以将本发明的组合粒子文库和标准微孔格式以及液体操作机器人联合使用。根据相关的检测的要求，微孔含有一组来自文库的粒子。在一个或多个孔中或其他相同的反应器皿中可以进行多元相互作用分析，优选的在保证本发明的组合粒子仍在悬浮液中的条件下，以达到有利的反应动力学和保持该反应的优化混合。本发明中的每个组合粒子能与相同的分析物分子混合物相互作用以促进在该多元检测格式中以这里所进行的实施例中所描述的方式同步形成多个结合物复合物。在完成各个粒子的分子相互作用和形成各个粒子的结合物复合物后，在每个反应器皿所含的组中，分析和解码粒子，例如利用流式细胞分析以一系列分析模式解码粒子以及同时记录一个粒子的检测信号，或者通过将一组或多组粒子转移到容许形成平面组件的基层上，例如通过容许粒子在重力下停留。
在一个优选的实施方案中，在一个微液体环境中完成检测整合，这剔除了微孔格式。如下面所讨论的，样品捕获、随后的具有结合物的珠或分析物的转换以及在完成结合相互作用后随机编码的编码粒子组件的实时形成，后者根据READ方法允许即时的图像检测，这些都以高度平行的检测格式所整合。随机编码珠阵列，由根据本发明通过使用磁场实时形成的本发明的组合粒子所构成，提供了能用于进行多步检测序列的平台。
为了说明本发明的目的，可以如图22所示进行四组步骤(称为捕获、转换、转换后阵列组件以及随机编码的阵列检测)。这些步骤被下面的实施例进一步地说明并提供了进行整合生物分析的能力。该检测方案可以在标准设计的微液体设备中完成，该设备包括一个或多个通过液体管路连接的液体间隔，并利用标准的泵方法提供了定时的液体转运。在优选的实施方案中，可以在第一个间隔进行样品捕获和转换。转换后，将珠转移到装备有磁场的第二个间隔以完成转换后组件及READ操作。
将相关样品以及一组定制的组合粒子引入到第一个间隔中并容许相互作用，以使得将分析物从样品中捕获到具有结合物的珠上。在应用磁性收集后，进行一个或多个洗涤循环，该循环包括用空白缓冲液替换第一个间隔的内容物，并最后开始转换步骤，如这里的实施例中所描述的，加入转换反应所需的液体试剂。
以下更详细地阐述本发明方法的四个步骤。
1.捕获
生物样品的分析通常开始于复杂的混合物，例如血液、血清或细胞悬浮液，它们不仅含有相关的为抗体、抗原、RNA、DNA或其他生物分子的分析物，也含有大量的可能干扰预期的分析的大量成分。和用标准的分析化学分离一样，如果非必需，通常需要将样品的分析物成分从样品的其他部分中分离出来。某些磁性粒子对这种目的的适用性已经被先前技术所广泛地阐述，所述粒子，当应用于微孔格式时，通常需要高磁化率以容许在合理的时间内在利用永久磁铁在实验室设置中可以产生的磁场梯度中收集和固定粒子。在这个步骤中，可以完成第一组磁性粒子对相关功能性集团的捕获，例如基因组DNA片段等。该捕获步骤后紧跟着一个或多个洗涤循环，包括用缓冲液取代可动的(非固定的)原始混合物的成分。感应元件也被描述用于在小型化环境内产生磁场和场梯度。
在某些情况下，可以不必要去区别不同类型的相关分析物，实例包括通过将常见的polyA尾部序列杂交到标准磁性粒子所具有的寡dT上从细胞裂解液中提取总mRNA，或和在标准亲和纯化中一样，通过将分子的Fc部分结合到具有蛋白A的珠上亲和纯化一组抗体，指的是IgG，。
然而，在许多情况下，将多种分析物以特异分析物的方式从给定的样品中捕获多种分析物是需要的或必需的。在缺少本发明的组合粒子的文库时，需要将样品分解为多个样份，添加的步骤不仅有着引入差错例如吸量错误或污染的可能，也要求所得到的少量样品的限制性使用。相反的，本发明的组合粒子文库通过以特异分析物方式同步捕获的方法推动了多元分析。实例包括从细胞裂解物中序列特异性地捕获与珠所具有的捕获序列相匹配的多种mRNA靶序列；将多种DNA靶序列从cDNA文库中挑选出来；或捕获多个罕见类型的淋巴细胞，利用它们表达的细胞表面抗原的相应的库对珠具有的单克隆抗体来识别。如实施例25所述，引入于特异捕获步骤的样品可以产生于第一个、非特异的含有例如本发明的磁性纳米粒子的捕获步骤中。
在一个在洗涤期间磁性捕获组合粒子的实施方案中，本领域已知的永久磁铁可以被用于进行临时固定。这里，检测环境的小型化保证了粒子一直处于一个短的距离内，该距离离反应器皿最接近的表面通常不超过100μm，因此缩短了从悬浮液将赋予了磁化率的粒子收集进磁性梯度所需要的时间，或反过来说，使得在给定的收集时间内保证被给定的磁场和场梯度收集所需的磁化率最小化，该时间通常不超过5分钟以及优选的不超过0.5分钟。对于本发明的组合粒子，是外壳的成分而不是核心决定磁化率，因此它们是特别好地适合于将检测环境最小化。
本发明的一个实施方案可以将本领域已知的感应元件的设计应用于捕获在或接近平面基层表面的粒子。在优选的实施方案中，在应用有磁场的第一微液体间隔里进行捕获。例如，平面液体间隔可以被三明治化于两个永久磁铁之间，放置磁铁使得它们能提供足够的线性收集器(string trap)使得在存在侧向液流最大到一特定的速度时将粒子固定在间隔的上下表面之间，当在出现更高的流速时能将它们释放出来。利用电磁电圈磁铁的组合也能容易地制成相同的磁场结构。同轴对称结构提供了更多的选择，例如10-100μm直径的毛细管，它可以被插入到透磁合金场的中心以进行收集。
2.转换(transformation)
捕获的分析物的转换、或在一些与DNA分析情况中，分析物所介导的珠所具有的探针的转换本身代表了一个重要的处理步骤。在分子生物学中，最重要的处理步骤包括一些被很好研究了的酶介导的RNA或DNA的修饰，主要包括，在前一种情况为逆转录，在后一种情况为连结、珠所具有的探针(也称为引物)的延伸或通过循环延伸反应的扩增，最普遍的是通过使用本领域熟知的聚合酶链反应(PCR)方案的扩增。与本发明特别相关的是完成对珠RNA和DNA的修饰反应。和捕获步骤一样，多元的利用珠标记引物的反应例如PCR求援于本发明的组合粒子文库的应用。一个实施例是捕获的“粒子标记的”片段的固相扩增。在转换步骤中，将“粒子标记的”DNA片段应用于一组“多元”转换步骤中，例如PCR扩增。另一个实施例是聚合酶介导的珠所具有的探针的延伸以生成珠所具有的cDNA链，它的结构是互补于捕获的RNA靶序列。一般而言，作为转换的结果，生成溶液负荷的产物也是可能的，然后该产物可以被这里所例举的本发明的第二组组合粒子所捕获。
捕获的蛋白分析物也可以在进一步分析之前被转换。例如，利用本领域已知的方法用镍功能化试剂和标记物通过螯合作用可以修饰包含一个组氨酸衍生物的蛋白。
3.转换后的阵列组件
在完成转换后，本发明利用磁场诱导形成的由本发明的组合粒子所构成的阵列作为一种生成在高度平行的实时生物分析检测格式中的随机编码组件和粒子阵列的方法。该方法可以在基层的指定区域生成本发明的组合粒子的组件以推动随后的组件图像，以及可以在广泛的保证成功的分子的相互作用分析和所形成的结合物复合物的稳定性的不同条件下生成这些组件和有序阵列，这些条件属于缓冲液组成(盐浓度，pH)、附加成分例如表面活性物质或佐剂的存在、温度等。如同在LEAPS方法中所描述的通过界面图案化可以描绘(delineate)基层的限定区域。另外，例如通过使用例如根据标准操作的透磁合金图案化基层可以生成空间调节的磁场。
本发明的粒子可以被组装成对应于所应用的磁场的平面组件或有序的平面阵列。例如，将两个相似平面表面所包围的液体间隔内的悬浮液中所含的粒子放置于人工平行的三明治几何学结构中，当它暴露于定位于界面垂直方向的磁场时，将形成平面组件。对于如同本发明方法所控制的给定的粒子磁化率，将形成对应于增加的磁场强度的具有特定数目密度的有序的平面组件；另外，垂直定位于基层(以及因此实际上是平行于所应用的磁场)的线性串珠可以形成。
利用永久磁铁或电磁体装置所形成的合理设计的磁场的应用是本领域所熟知的。可以将永久磁铁设计为能产生出所需的磁场强度以实现所需的组件结构。电磁体可以产生所需的磁场结构，例如本领域已知的螺线型电导管或Helmholtz装置；基层可以被引入进磁铁内腔或放置于非常接近于线圈的内腔外的位置以保证磁场位置基本上是垂直于基层平面。
在另一个实施方案中，在捕获步骤中所描述的磁场收集器(magnetictrap)类型可以被应用于将应用于分子相互作用分析的缓冲液与第二种缓冲液的交换，这可以被优化达到保证用LEAPS应用程序快速组装阵列的条件。
4.随机编码的阵列检测
一旦被组装，利用这里所描述的方法和操作，本发明的组合粒子的随机编码的阵列可以被摄像以记录检测信号并被解码以识别结合于阵列内各个珠的结合物质
在本发明组合粒子的阵列形成后，阵列提供了可以被用于读取多步检测序列的结果的平台。这里所阐述的方法容许快速地定制DNA或蛋白阵列而不需要预先设计，并避免了点对点以及芯片对芯片的变异性所带来的问题。而且，粒子阵列格式容许粒子的芯片非依赖性特征以及对检测条件的优化。另外，在同一个芯片上所保持的分离的液体间隔中可以同时形成多个粒子阵列，该阵列容许并行地处理多个样品。
为了更完全地理解这里所描述的发明，实施了以下实施例。应当知道这些实施例只是用于说明目的而不是用作为任何形式地对本发明的限制。
实施例
实施例1：光学可编程的阵列的形成
如图9所示，用LEAPS同时组装多个随机编码的子阵列以及将这些子阵列“拖放(drag and drop)”进一个共同的、封闭的液体环境中的芯片上的分隔的但邻近的位置。两组来自于不同的库A和B的珠(2.8μmOligo-(dT)25，Dynal，Oslo，Norway)被同时组装成同一液体内的不同的子阵列；然后将子阵列放置于所需的目的地，这个过程可被用PC可程序化的照明图案化器所生成并投射到基层空间的不同的照明值所指导(阐述于U.S.Serial No.09/397,793，1999年9月17日递交，在此一起将全部内容并入参考)。该拖放操作将两个子阵列之间的距离从近250μm减少到20μm。在5Vpp，频率为2KHz以及投射到基层表面的总能量为～5mW的场中移动珠。联合于化学和空间的编码可以多次使用给定组的化学珠标记物，减少将珠放置于任一编码尺度的需要，同时推动了实现大量编码的能力。
实施例2：在图案化后的表面上形成阵列
图10所图解的是在图案化后的硅芯片上组装的一个编码珠阵列，该组装利用了一个1-2Vpp以及频率为100-150Hz的AC电压，该电压跨于用液态珠悬浮液所填充的100μm电极间隙上；在130μm中心内通过将氧化物蚀刻成50-150深度和正方形形状(～30×30μm2)来图案化基层上的热氧化物(～1000)。也可以生成对应于适当的照明形式的相似格式的阵列。这里显示的每个子阵列包括近80个结合有抗细胞因子单克隆抗体的珠。用两种类型的荧光染料联合染色5.5μm直径的羧基修饰的聚苯乙烯珠，然后用抗细胞因子单克隆抗体进行功能化。该组装过程保证将所有的珠收集于基层表面。珠编码如下：IL-2(亮红)；IL-4(暗红)；IL-6(亮绿)；M-CSF(暗绿)以及TNF-α(黄色)。
实施例3：磁性纳米阵列的形成
胶状粒子表现出有限的抗磁化率(diamagnetic susceptibility)，当将其放置于平面基层上，响应于所增强的磁场，粒子可以被组装成有序的阵列。将商业化获得的超顺磁性粒子(Dynal，Oslo，NO)从液体悬浮液中分散到一个液体单元的两个平行的上下面的下面的平板表面上(“三明治”几何结构)，当这些粒子暴露于一个同源轴的磁场(方向垂直于基层平面)时将形成有序的组件。作为增加磁场强度的一个函数，对于本领域已知的生产方法所控制的粒子的设定的抗磁化率，可以形成有序的平面组件以及垂直定位于基层的线性串珠。可以将永久磁铁设计为能产生出所需的磁场强度以实现所需的组件结构。例如利用本领域已知的螺线型电导管或Helmholtz电磁体可以产生所需的磁场结构；基层可以被引入进磁铁内腔或放置于非常接近于线圈的内腔外的位置以保证磁场位置基本上是垂直于基层平面。利用本领域已知的方法通过用透磁合金图案化基层可以生成空间调节的磁场。
实施例4：随机珠组件的形成
将含有悬浮珠溶液的一样份放置到平面硅基层的一些不同的位置上，该基层覆盖有一层薄的氧化硅层(这里可以使用其他基层)。容许珠在重力下停放并形成随机组件。为了描绘基层上的分隔的位置，使用了以下两种方法的一种。根据第一种方法，将一种具有多个圆形1mm到2mm直径孔的网格的硅垫圈(250μm厚度)(Grace Bio-labs，Bend，Oregon)放置于亲水基层上以确定微孔(0.25μl到0.5μl体积)并用于多种分隔的珠悬浮液样品。根据本发明的第二个方法，将含有珠(体积为0.2μl到0.5液体μl)的溶液的一小样份直接放置到亲水表面的一个或多个设定好的区域上，以保证形成独立的液滴；在这种情况下不需要垫圈。当溶剂蒸发后(在室温，或在提高的温度(大约60℃)下快速干燥)，珠被留存于基层的随机位置上。在这两种方式形成的组件中都已经测定了DNA多态性反应。任选地，在重力下停放的珠可以被基层所具有的化学捕获层所固定。实施例6中描述了使用随机珠组件测定多元格式中的亲和常数。
实施例5：一种自动化的芯片级阵列的生产方法
如图11所示，本方法包括液体操纵以及将珠吸量到安装于单芯片盒(single-chip cartridges)或多芯片盒(multi-chip cartridges)内芯片上。利用实施例1、2或3中的方法形成珠阵列，之后为阵列固定和解码。储存所得到的解码图像和任选的芯片ID(“棒编码”)一起用于稍后的应用。
实施例6：利用检测后分析测定珠组件的亲和常数
细胞因子TNF-α和IL-6的定量结合曲线。通过使用悬浮液的化学编码珠进行的三明治免疫测定法生成结合曲线，所述悬浮液可以被局限于一个或多个描绘于芯片上的反应间隔中，或一个或多个脱离芯片的反应间隔中。通过完成与保持于悬浮液的珠的反应，可以获得与同源检测一样的检测动力学。在完成结合反应之后，将珠组装于芯片上可以进行多元定量图像分析。可以使用根据实施例4所制备的随机组件或根据实施例1或2制备的有序的珠阵列。利用实施例1或2的方法生成的有序的、致密的组件的优点是更高的空间密度以及通过处理更多数目的珠获得的更高的检测量。
作为图解说明，图12显示了从随机分布的珠中获得的TNF-α和IL-6的定量结合曲线。在容许整合多框架的模式中使用了商品级的8比特视频-CCD照相机(Cohu，San Diego，CA)。在两个检测中所使用的抗原的浓度范围是为TNF-α 700fM到50pM以及IL-6 2pM到50pM。在每个浓度上，通过与结合有已知每珠的量的Cy5.5标记的BSA包被的校准珠的比较，估测每珠所结合的分子数目；进行必要的调整以补偿标记的第二抗体和BSA之间的荧光量子效率的差异。
该分析格式可以测定亲和常数，KA＝[LR]/([R0-LR][L])，其中依照物质活动法则，[LR]表示每个珠的受体-配体对的数目以及[L]表示配体的溶液浓度。通过指定每ml的珠数目，nB，以及指定代表每珠的受体数目的[R0]值，计算出给定KA的理论结合曲线，将其与一组每珠的结合分子的数目进行比较并作为一个大体配体浓度的函数。通过测定每珠的平均荧光强度并将其参照于记录于包含于阵列中的校准珠的荧光强度可以测定出给定的大体浓度的每珠所结合的配体的绝对数目。
将估计的每珠的结合分子的数目与来自于物质作用法则的理论结合曲线进行比较。显示的三个曲线相应地对应于1011/摩尔、1010/摩尔和109/摩尔的亲和常数KA值。每珠的抗体的最初数目，R0等于2×105/珠以及nB＝105/ml。每个数据点代表三次重复试验的平均值，且检测对检测之间的变异＜45％。将检测敏感性设定到相应于荧光水平，它在检测图像上产生了一个统一的信号对噪音水平，图12中所描绘的细胞因子测定的敏感性设定为～2000结合配体/珠，对应于相应的检测浓度：TNF-α 700fM以及IL-6 2pM。
虽然商品化的ELISA试剂盒利用酶扩增增加了敏感性，但代价是增加了与检测条件和控制所相关的复杂性，我们的阵列检测格式，甚至没有酶的扩增，我们的芯片上检测格式可以监测循环水平的细胞因子(血清正常TNF水平是50-280 fM以及血清正常IL-6水平是0-750 fM，www.apbiotech.com/technical/technical_index.html)，它所提供的动态范围接近于标准方法的范围，也就是扩增的单分析物ELISA检测法(R & DSystems和Amersham的Assay kits)(不是最近的高敏检测法)。进一步地改善硬件和软件水平是有可能的。
实施例7：通过多态性分析的基因分型
为了说明用本发明实现基因分型，图13显示了阵列的设计，其中将五对对应于基因中四个多态性区域的20聚体结合物结合于颜色编码的珠。结合物对(pairs of binding agents)α1、α2以及β1、β2每个都在它们的相应序列中具有单个核苷酸差异；δ3、δ4具有三个核苷酸差异，γ1、γ2、γ3、γ4组的结合物具有小的插入和缺失。将十个结合物分成两个5个结合物的亚组，它们被结合于两个子阵列。在本实施例中，每个类型都有数百个珠。在珠固定后，在TMAC缓冲液(2.25M四甲基氯化铵(tetramethylammonium chloride)，37mM Tris pH8.0，3mM EDTA pH8.0，以及0.15％SDS)55℃进行芯片上杂交反应30分钟。分析物是产自患者样品的254碱基对的PCR片段，并在5’引物末端用BODIPY 630/650(Molecular Probes，Eugene，OR)荧光标记。在用纯TMAC缓冲液替换检测缓冲液后进行图像采集。
图14显示了一个子阵列的解码和检测图像。分析杂交后获得的每个检测图像中所显示的每个珠以测定荧光强度和珠类型，和细胞因子测定一样，后面的操作利用模板匹配规则比较了检测和解码图像。图15显示了每个珠类型的所获得的强度直方图，水平轴指的是从0到1的相对信号强度以及垂直轴指的是柱数目。直方图显示大多数具有探针α1的珠没有结合分析物，而大多数具有探针α2的珠表现出强烈的结合。α2珠的平均信号水平超过α1珠的信号水平3.2个系数，这提示含有DNA序列的分析物互补于α2而不是α1。对于这里所出现的患者样品，直方图说明分析物DNA的基因分型的特点是互补于该基因多态性区域内的结合物α2、β2、γ3和γ4。
实施例8：基因表达分析：cDNA片段
本发明的方法已经被应用于制造由具有寡核苷酸以及DNA片段(例如最大长度到～1000个碱基对)组成的阵列。通过切口平移在多个位置将核苷酸链生物素化并将其连接到抗生蛋白链菌素功能化的珠(M-280，Dynal，Oslo，NO)上。利用800Hz的AC电压在10Vpp进行检测。
实施例9：设计用于通用性标记的环形探针
图16中所设计的环形探针利用荧光能量转移避免了标记靶点的需要。和分子信号(molecular beacon)的设计一样(S.Tyagi，D.P.Bratu.F.R.Kramer，Nature Biotech.16，49-53(1998))，图16中的探针具有在封闭环和开放环结构的两种不同的荧光状态，但是与分子信号相反，它含有主干结构内的它的一样份结合序列以容许在竞争性杂交检测中进行严格的分子控制。
实施例10：定量多元评价细胞因子的表达
图17显示了一对在多元三明治免疫检测中所记录的单个随机阵列的检测和解码图像。将一个含有五种不同类型珠的阵列，每个珠带有一个单克隆的抗细胞因子抗体(mAb)，暴露到含有两种细胞抗原(Ag)的样品溶液(例如血清)。随后加入Cy5.5标记的第二种抗体(pAb*)形成三重复合物，mAb-Ag-pAb*。通过将300μl样品以及7nM细胞因子检测缓冲液(20mM NaPi，pH7.4，150mM NaCI，10mg/ml BSA)加入到固定于芯片的珠阵列中来进行芯片上免疫检测，并容许在37℃进行反应1个小时。加入12nM标记的第二抗体的检测缓冲液溶液以替换缓冲液。在37℃孵育1个小时后，将空白缓冲液加入到芯片上并进行图像采集。本检测中所使用的抗体和抗原来自R & D Systems(Minneapolis，MN)；利用标准试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)用Cy5.5标记第二抗体。
图17B的解码图像显示了五种类型珠，其伪色表现具有与图10的珠的同样的编码形式。所有的珠都为相同的大小(5.5μm直径)；解码图像中不同类型的珠的大小的外观差异是一种假象，它反映了不同珠的内在的染色水平以及在CCD记录解码图像过程中的“雾化(blooming)”。将解码图像与图14A中的检测图像进行比较(利用这里所阐述的图像分析方法)发现黄色和亮绿色的活性珠相应地捕获了TNF-α和IL-6。该检测方案已经被扩展到以下的一组12种细胞因子的检测：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TGF-β1、IL-12、EGF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1以及TNF-。芯片上免疫检测除了在检测步骤中替换试剂溶液外不需要其他的洗涤。检测图像和解码图像之间的比较显示样本中存在着两种不同的细胞因子，也就是IL-6和TNF-α。在本实施例中预先形成的阵列也容许以类似于实施例6所描述的分析的方法测定亲和常数。
实施例11：用于评价蛋白的适体
因为适体对血清蛋白的高结合亲和力可以将适体从大的组合文库中挑选出来(L.Gold，B.Polisky，O.Uhlenbeck，M.Yarus，Annu.Rev.Biochem.64：763-797.(1995))。将适体所功能化的珠的随机编码阵列用于测定血清蛋白水平；阵列上的结合方式的关系(也见于实施例10)可以作为疾病状态的一种表型。
实施例12：DNA-蛋白的混合阵列
与基因组功能性分析显著相关的事实是本发明的方法提供了蛋白和DNA混合阵列，而不需要改变阵列制作的方法学。特别的，带有DNA和相应蛋白的珠所构成的混合阵列可以被用于分析同一液体样品中的基因和基因产物。
这已经被用于进行对免疫监测和DNA杂交的联合检测。例如，生成由用抗细胞因子单克隆抗体(mAb)和用寡核苷酸所功能化的珠所构成的混合阵列。在单个芯片上进行两个连续的检测。首先，根据实施例10所描述的方案进行免疫测定。在完成芯片的免疫检测后，采集图像并将DNA分析物加入到杂交缓冲液中使其终浓度为20nM，且容许在37℃反应1个小时。将空白杂交缓冲液加到芯片上并进行图像采集以记录附加的杂交检测。
实施例13.亲和力指纹
与先前技术方法相关的对受体-配体相互作用的分析有着理想化的特异性。也就是说，理想状态被认为是溶液中只存在单个配体与其匹配的受体相互作用，反之亦然。然而，在绝大多数多元检测系统中，可以存在相当水平的交叉反应性。也就是说，任何单个配体可以连接于一些受体，同时任何单一类型的受体对超过一个的配体可以有着一定的亲和力。
本发明包括一种模型，该模型被发展用于分析多元READ检测，对于这样一个在以下假设下的体系：用它们自己的亲和常数描绘这些可逆的相互作用的每个相互作用；在大体种类之间不发生相互作用；在表面上形成的复合物之间没有相互作用。这些假设可以是不被严格约束的，其代价是因为大体内和表面种类之间的相互作用而增加了模型的复杂性。结合在每个珠表面上的多个反应概括出了对于单个受体-配体对形成的标准的反应-弥散公式[R.W.Glaser，Anal.Biochem.213，152-161(1993)]：
公式(1)右侧的第一个名词代表了配体和受体结合成复合物的结合以及涉及表面上的自由位点的浓度。第二个名词代表了复合物以释放配体的方式的解离，因此释放出受体位点以参与进一步的反应。因为可以形成最大数目(i×j)的生物分子复合物，从所述公式生成的可以作为许多约束条件。对于平衡的情况，公式(1)的左手侧被设定为零，以及共亲和矩阵[Kij]＝Kon，ij/Koff，ij，然后可以被定义为说明容器内或表面上的多个种类之间的交叉反应。在平衡条件下的一批次反应器中，我们可以解答不同公式的体系以得到每种类型的珠所结合的每个配体分子的数目。
| L1 | 配体浓度 | 10pM |
| L2 | 配体浓度 | 100pM |
| R01 | 初始受体浓度 | 1×104/珠 |
| R02 | 初始受体浓度 | 1×104/珠 |
| nB1 | 珠数目密度 | 1×104/ml |
| nB2 | 珠数目密度 | 1×104/ml |
| [K] | 共亲和矩阵 | [1×1011 1×109 1×108 1×1011]1/摩尔 |
作为图解的实施例，计算了一标准组的两种配体以及固定于两个不同组珠的两种类型受体的配体分布(从公式(1)的模型)。假设在标准组中每个配体-受体组合物的亲和矩阵是已知的；为了检测第三种配体，这里假设比较于非对角元件，2×2矩阵的对角元件[Kij]是大的。在有着两种初始配体的反应器中出现的第三种配体干扰了标准体系中各种复合物与反应试剂之间的平衡，以及对于用荧光标记物标记的配体分子，从被干扰的体系中所观察到的强度不同于从标准情况下所观察的强度。
图18A显示了标准情况，其中浓度和共亲和矩阵被设定为附表中所显示的值。珠亮度被局限于0-255的线性尺度，后者代表了最亮珠的亮度。图18A显示了每个配体对珠的亮度分布。因为更低浓度的L1，珠1的亮度弱于珠2，基本上没有检测到交叉反应。
下一步，用第三种配体干扰体系，L3浓度为1pM，并假设该新配体和每个受体都有着一定数量的交叉反应；K3，1＝1×1011/M，K3，2＝1×1010/M。计算存在第三种配体时的每个珠的荧光强度产生了图18A中的模式，它发现因为第三种配体增加了珠1的亮度，同时因为体系中更高浓度的L2以及L3对R2的更低亲和力使得珠2的亮度没有改变。因此在L3对其中一个受体有着相当高的亲和力以及比较于竞争配体有着显著数量的条件下可以测定L3。
在配体混合物被容许与排列于随机编码的珠阵列的多个受体相互作用的条件下对共亲和矩阵的测定(以及和这里所阐述的理论模型的比较)提供了一种方法学，该方法学确定出多种配体和受体的相互的竞争性结合亲和力的交叉关联的特征性特点。这些共亲和力提供了一种有利的手段，通过它们的亲和指纹模式描绘受体-配体的结合公式。与很好设定的标准情况的偏差也容许测定溶液中的“干扰”配体。
实施例14.反应动力学的多元分析
如所述实施例所描述的一样，通常不需要广泛地洗涤就能将珠从溶液的背景荧光中区别开来。因此，可以以同源检测格式记录检测图像序列以进行结合反应的评估以及测定每个发生的结合反应的动力学数据。可以在简单的“三明治”液体筒中进行同源结合检测，该检测容许对珠阵列进行光学显微镜的照相以及将分析物溶液引入到含有随机编码的珠阵列的间隔中。更常见的，也可以在控制液体样份的注射或持续流动的反应物或缓冲液的条件下将阵列暴露于一个分析物或其他的反应混合物。利用理论模型，可以确定出该珠阵列反应器的相关操作控制参数的合理组合使得达到平衡的时间最小化或使得被阵列所捕获的分析物部分最大化[K.Podual and M.Seul，TMKP-99/02]。利用任意一种可利用的泵原理可以控制流速。[M.Freemantle，C & EN，77：27-36]。
列表-模拟检测中所使用的参数(图18)
| 参数，单位 | 数值 |
| 初始受体数目CR，0，摩尔/m2 | 8×10-9 |
| 流速，Q，μl/s | 1.0 |
| 弥散度，D，cm2/s | 1×10-7 |
| ON-速度，Kon，/(Ms) | 1×105 |
| 亲和常数，KA，/M | 1×1011 |
| “三明治”反应器间隙大小，H，mm | 0.1 |
| 反应器长度，L，mm | 10 |
| 反应器宽度，W，mm | 10 |
在图19中对图像序列的分析可以从中获得动力学数据，在所述的实施例所阐述的反应-弥散动力学类型的理论模型的帮助下可以测定出ON-速度和OFF-速度。图19A显示了处于吸附-去吸附循环的阶段，该循环包括溶液中所含的分析物以及固定于“三明治”反应器皿底部的珠阵列。第一张图描述了吸附过程的开始；第二张图描述了绝大多数珠达到平衡时反应器接近平衡的状态；最后一张图描述了在去吸附循环下反应器的状态，其中注射进无配体的溶液并将吸附的分子从珠表面去吸附。图19B显示了通过统计反应-弥散体系的溶液获得了单一类型的受体-配体反应的单个受体-单个配体体系的吸附-去吸附动力学；显示了两种不同浓度配体的情况。在该模拟检测中所使用的参数列于附表中。
与目前的技术方法[D.G.Myszka，Curr.Opin.Biotechnol.8：50-57.]不同，本发明依靠于成像并可以进行多元分析。另外，在实施例6中所介绍的检测方法的通用模型可以分析多个同步受体-配体相互作用的复杂结合动力学的分析，甚至出现多个配体和受体之间的交叉反应时。
以阵列格式监测反应动力学的能力使得能够进行一些尝试以增强复杂混合物中受体-配体或结合物-分析物相互作用的特异性。例如，可以进行温度调控以增强DNA杂交反应的特异性。同样的，当阵列应答被监测时可以改变应用于杂交反应的条件的严格性，例如，可以在造成过度“非特异性”结合的条件下在杂交缓冲液中进行杂交；当监测阵列应答的时候，通过转换到逐渐增加严格性的洗涤缓冲液能增加特异性。
实施例15.利用磁性粒子编码阵列的多步检测序列
已经描述了利用生化功能化的超顺磁性粒子进行分子和细胞生物学中样品制备以及进行各种酶催化的珠上反应的方法和设备[″BiomagneticTechniques in Molecular Biology″，Technical Handbook，3rd Edition，1998，Dynal，Oslo，NO]。可以将这些以珠为基础的方法和本发明的随机编码阵列检测格式联合用于进行多步芯片上检测操作。
例如，图20说明了利用具有多个间隔的单一芯片在小型化格式中对一系列多元基因分型步骤的整合。首先，利用功能化磁珠通过亲和选择从患者样品中捕获细胞，在第一个间隔中电或化学地裂解细胞，并利用非特异性结合将基因组DNA捕获到多样性磁珠的表面；下一步，用磁力将珠收集到第二个间隔中，第二个间隔和第一个间隔是液体相通的，在其中用所需的缓冲液洗涤珠和DNA；下一步，进一步将珠转移到一个进行PCR的位置，该PCR利用珠结合的DNA作为模板；本领域已知的多步PCR方法可以应用于本步骤(F.Fellmann，et.al.，Biotechniques，21：766-770)；下一步，通过杂交将所释放的PCR产物捕获到预先组装的具有结合物的随机编码阵列上，这些结合物特异于PCR扩增所靶向的不同的多样性。
编码磁性粒子和LEAPS光学编程的联合应用获得了形成可逆固定的阵列以及在一定条件下进行可编程的多步检测序列的能力，其中在最有利的悬浮液中使用珠，例如增加反应动力学，以及最有利的实时形成的阵列，例如提供了用于图像检测以及阵列读取的高度平行的格式。
例如，如同图21所示，下面的cDNA珠阵列形成的步骤序列可以被整合于一个小型化的格式中。首先，将一个每个珠都具有一个基因特异性探针的编码磁性珠库导入到一个mRNA库中，并且mRNA分子和它们相应的珠进行杂交；下一步，用珠所结合的mRNA作为模板进行珠上的逆转录(RT)[E.Horenes，L.Korsnes，US 005759820]；下一步，从珠上释放出mRNA；下一步，将珠导入到定制的芯片的表面并利用LEAPS形成cDNA珠阵列。这样的一个阵列可以在使用另一组mRNA作为靶点的基因评价试验中用作为呈递结合物。同样的，通过应用标记的DNA结合物库评价阵列内相关基因可以分析cDNA阵列本身的表达。
实施例16.超顺磁性氧化铁γFe2O3(磁赤铁矿)粒子的合成
合成在由来源于Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI的阴离子表面活性物质丁二酸二辛酯磺酸纳(bis(2-ethylhexyl)sodiumsulfosuccinate)(AOT)和异辛烷(Kommareddi et al.，Chem.Mater.1996，8，801-809)所组成的反向胶状离子溶液中进行。在制备含有反应物FeSO4(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)和NH4OH(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的反向胶状离子溶液中使用了0.5M AOT储存液。特异地，将0.45ml0.9M FeSO4加入到5ml 0.5M AOT异辛烷溶液中，将0.45ml NH4OH分开地加入到5ml 0.5M AOT异辛烷溶液中。通过在大力搅拌下将NH4OH反向胶状离子溶液加入到FeSO4反向胶状离子溶液触发了反应。反应进行2-3个小时，然后在40℃蒸发溶剂得到干燥的表面活性物的氧化铁组合物。将该组合物重新分散于所选择的有机溶剂中得到一深红色的透明溶液。
实施例16a.具有功能化位点的磁性纳米粒子的合成
本实施例说明了磁性纳米粒子上功能化位点的合成。将表面活性物质溶解于油中以得到反向胶状离子溶液，该溶液被用于合成实施例16的磁性纳米粒子。将获得的反应混合物干燥得到干的表面活性物质，之后将其重新分散于所选择的油中。加入单体、和或预先形成的聚合物、交联剂以及引发剂的水溶液。将混合物进行聚合步骤并干燥所聚合的反应产物。将干物质分散到水的缓冲液中；该方法可以与READ联合使用以实现多步芯片上检测操作。
实施例16b.生物分子的结合
本实施例说明了一种生物分子与本发明的磁性纳米粒子的结合。通过将某些分子结合到磁性纳米粒子的功能性位点上可以将实施例16a的磁性纳米粒子进一步地功能化以进行相关检测，这些分子例如DNA(寡核苷酸)或RNA判断、肽或蛋白、适体和小的有机分子。利用本领域已知的方法可以进行这些分子的结合，例如，利用一个或一些结合反应(见例如G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)；L.Illum，P.D.E.Jones，Methods in Enzymology 112，67-84(1985))。相关分子与功能性位点的连接通常需要一步或两步反应，利用标准的液体操纵机器人以及96孔格式可以平行地进行这些反应使得任何一个分子共价地结合到磁性纳米粒子的功能性位点上。
特异地，本实施例说明了一种利用确立的碳化二亚胺(carbodiimide)化学将探针(例如一种蛋白)连接到本发明的磁性纳米粒子的功能性位点的方法。在2ml小瓶中，将含有10mg羧酸功能化的磁性纳米粒子和1ml 10mM硼酸缓冲液(pH＝8.5)混合。然后用永久磁铁分离器磁性分离所得到的粒子并吸除上清。在0.1M MES缓冲液(pH＝4.5)中洗涤分离到的粒子两次(利用和所述的相同的方案)并最终重悬于600μl同一种缓冲液中。在另外一个小瓶中，将3mg中性链亲和素(生物素结合蛋白，PierceChemicals，Rockford，IL)溶解于300μl MES缓冲液中，将该溶液缓慢地加入到磁性粒子悬浮液中。超声降解后，加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide))(Aldrich-Sigma，Milwaukee，WI)溶液(200mg/ml)。该混合物在室温下反应2个小时，之后将得到的磁性纳米粒子磁性分离，用结合缓冲液洗涤一次，硼酸缓冲液洗涤两次，重悬并在2-8℃储存于储存缓冲液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)Tween 20，10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)中。
实施例16c.组合粒子的制备
本实施例举例说明了编码磁性粒子的生产。用实施例16b的磁性纳米粒子和编码粒子相互反应。在更常见的实施方案中，也可以使用超顺磁聚合物纳米粒子(例如哪些来自MACS微珠，Miletnyi Biotech Inc，Aubum，CA；捕获铁磁流体粒子，Molecular Probes，Eugene，OR；Nanomag粒子，Micromod，Rostock，Germany)。
图23举例说明了一个12种类型的编码磁性粒子的子文库。利用具有甲苯磺酰基的直径3.2μm的交联聚苯乙烯粒子(Bangs Labs，Fishers，IN)以及两种每个都是通过膨胀以及大体染色而导入的疏水焦甲烷染料合成编码粒子。分别地导入染料以得到四种强度水平，并按四种极小的摩尔比例混合。之后，将100μl 1％有色Latex(PBS中)溶液与100μl或200μl捕获铁磁流体(抗生蛋白链菌素共扼物，200nm直径，按所提供的用法使用)(Molecular Probes，Eugene，OR)或100μl右旋糖苷包被的Nanomag混合。按所提供的用法使用130nm直径的抗生蛋白链菌素功能化的磁性粒子(Nanomag粒子，Micromod，Rostock，Germany)。用磷酸缓冲液pH7.8将总的反应物体积达到500μl并且将结合反应物反应过夜。磁性分离所得到的粒子，洗涤1次，重悬并在2-8℃储存于储存缓冲液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)Tween 20，10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)中。
实施例16d.对金属氧化物含量的控制
本实施例举例说明了通过控制金属氧化物含量赋予本发明的编码磁性粒子磁性力矩的方法。通过变化能结合于编码粒子表面的磁性纳米粒子的数目可以实现本方法。为了方便监测，用一种荧光素金纳米粒子抗生蛋白链菌素共扼物(来自Nanoprobes，Yaphank，NY)荧光素金替代磁性纳米粒子来监测粒子的数目。反应物含有～0.08mg/ml抗生蛋白链菌素并被用作为接受剂。
在本实施例中，将0.5mg生物素功能化的3.36μm直径的聚苯乙烯珠(Spherotech，Libertyville，IL)悬浮于500μl含有0.1％BSA的20mM磷酸缓冲的pH7.4的盐水(150mM)中。将各种数目的荧光金试剂加入到珠溶液中，在室温下进行抗生蛋白链菌素-生物素结合反应1个小时。之后，离心分离微粒并去除上清。图24显示了结合于表面的粒子的荧光强度作为添加的荧光金试剂数量的函数。
实施例17.荧光染色的及磁性聚合物珠组合物的合成
利用将干的磁性组合物和染料重分散于所选择的溶剂中制成了疏水性荧光染料和氧化铁粒子的储存溶液，所选的溶剂例如CH2Cl3(AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI)或CH2Cl2/CH3OH混合物(70/30(v/v))(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)。在甲醇(3x)中充分洗涤预先设定量的聚合物珠，然后蒸发干燥。通过在有机溶剂/纳米粒子/染料混合物中膨胀珠达到荧光染料和氧化铁纳米粒子的同步结合。膨胀过程在大约1个小时内完成。之后，离心分离聚合物珠并用甲醇(3x)洗涤，之后用异辛烷(2x)以及然后用甲醇(2x)洗涤，最后重新分散于0.2％SDS-DI水溶液中。
实施例18.通过应用磁场形成阵列
当本发明的组合粒子暴露于同源轴向磁场(垂直定位于基层平面)时，组合粒子可以以2D阵列格式排列。作为一个依赖于组合粒子的顺磁化率的逐渐增加的磁场强度的一个功能，可以形成平面组件。可以将永久磁铁设计为能产生出所需的磁场强度以实现所需的组件结构。利用本领域已知的螺线型电导管或Helmholtz结构可以产生所需的磁场结构；基层可以被引入进磁铁内腔或放置于非常接近于线圈的内腔外的位置以保证磁场位置基本上是垂直于基层平面。利用本领域已知的方法通过用透磁合金图案化基层可以生成空间调节的磁场。
在本实施例中，按在此描述的合成其中编码粒子为3.2微米、6.9微米和10.9微米的三种不同大小的组合粒子。和预期的一样，组合粒子的磁化率随粒子大小的增加而增加。
图25显示了暴露于利用永久磁铁生成的大约1000高斯的磁场的3.2微米组合粒子的2D几何结构。
实施例19.二维胶状阵列：磁性“Wigner”晶体的形成
本实施例举例说明了操作本发明的组合粒子的能力。对超顺磁粒子悬浮液例如超顺磁寡(dT)25微粒(Dynal，Lake Success，NY)的操作提供了实例。通过混合0.01mM盐水中浓度为5×107珠/ml的粒子形成这些粒子的悬浮液，该盐水中含有作为稳定剂的0.05％triton-X100(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)。粒子的磁化是完全可逆的，以及在低磁场强度时，它按有效的容积磁化率(＝0.192)与外在磁场成比例。将100μm厚度的相邻空间所分隔的用一个硅电极和一个ITO包被的玻璃电极所构成的三明治单元中的悬浮液放置于显微镜载物台上。用放置于三明治单元下方的铜线圈在样品上产生一个完全统一的磁场。在应用磁场后，用连接于VCR的CCD照相机记录对悬浮液结构的测定并将图像数字化以进行进一步分析。图26显示了试验装置以及图27显示了一系列说明2维磁性阵列形成的快照。
当应用一个磁场时，粒子要求磁场力矩m＝4/3πa3μ0χH，其中a为粒子半径，μ0为真空磁性穿透性，而H为外在磁场。
实施例20.利用荧光磁性微粒进行的抗生蛋白链菌素-生物素检测
在本实施例中，将100μl已经被按实施例16c的描述用中性链亲和素所功能化的本发明的组合粒子悬浮液(1％)加入到1.5ml小瓶中并用900μl PBS以及0.1％(w/v)Tween-20(PBST)将悬浮液稀释。漩涡混合本发明的组合粒子，然后磁性分离并去除上清。将沉渣重悬于980μl PBS以及20μl浓度为26.7ng/ml的生物素-寡(dT)-Cy5.5(IDT，Coralville，IA)。在室温下孵育混合物30分钟。在此之后，磁性地分离本发明的粒子并在PBST中洗涤2x，以及重悬于1ml PBST中。然后将本发明的粒子组装于芯片上，利用先前描述的方法测定它们表面的荧光。结果显示于图28中。为了进行比较的目的，利用在本实施例中所描述的方法，缺乏本发明的磁性纳米粒子但共价结合于中性链亲和素的本发明的编码粒子也可以作用于生物素化的探针。
实施例21.靶分子的芯片上杂交
本实施例涉及靶分子对固定于本发明的组合粒子的寡核苷酸探针的芯片杂交。首先将具有已知碱基序列的生物素化的寡核苷酸结合到给定类型的颜色编码的组合粒子上，该粒子的表面已经用中性链亲和素预先包被。结合反应在0.1ml结合缓冲液(150mM NaCl，0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％牛血清白蛋白，0.5mM Tris-HCl，以及100mM磷酸钠，pH7.2)以及0.4μM生物素化寡核苷酸，以及将近6.7×105个粒子中进行。在室温下漩涡孵育结合反应混合物30分钟。在完成结合反应后，离心收集粒子。利用150mM NaCl和100mM磷酸钠，pH7.2以及0.05％Tween-20中的0.1％生物素阻断表面上未反应的Neutriavidin位点。在室温下漩涡进行阻断反应20分钟。阻断后，用0.2ml 150mM NaCl和100mM磷酸钠，pH7.2以及0.05％Tween-20洗涤粒子。所述方法可以用于将任何相关的生物素化的寡核苷酸结合到本发明的不同类型的中性链亲和素包被的粒子。
将已知序列的生物素化的寡核苷酸结合到本发明的一些类型的色彩编码的粒子并将这些粒子组合到试管中用于硅芯片上的阵列组装。然后将形成的阵列用于肽核酸(PNA)低聚体对预先结合于本发明微粒的特异性互补寡核苷酸的芯片杂交。具体的，在30μl杂交溶液(90mM NaCl，83mM硫氰酸胍，8mM MgCl2，17nM EDTA，0.02％生物素，0.1％Tween-20，70mM mM Tris-HCI，pH7.5)以及218nM生物素化PNA低聚体中进行杂交。将杂交混合物中的阵列在40℃孵育60分钟。在完成杂交后，用50μl的250mM NaCl，10mM Tris-HCI，pH7.5，0.1％Tween-20在室温下洗涤阵列10分钟。为了检测杂交于本发明的组合粒子上的生物素化的PNA低聚体，将阵列与150mM NaCl和100mM磷酸钠，pH7.2中的Cy5.5结合的抗生蛋白链菌素(18μg/ml)在室温下反应30分钟。用15mMNaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5洗涤后，用荧光显微镜检查阵列。利用具有特定波长的光学滤片测定从本发明的粒子以及Cy5.5标记的PNA低聚体发射出的荧光。根据粒子的颜色码解码本发明的粒子。利用计算机程序(READ)测定特殊粒子所发射的Cy5.5荧光。将无磁性特征的颜色编码的粒子用作为本检测中的对照。图29所示的检测结果说明PNA特异地杂交到结合于组合粒子的互补寡核苷酸。在芯片杂交检测中，从来自两个阵列(芯片A和B，相应的为图A和B)的四种类型的本发明的粒子(I、II、III和IV)测定出荧光信号强度。I型粒子是本发明的组合粒子，而II、III和IV型为本发明的三种不同类型的编码粒子。I和II型是用生物素化的互补于PNA低聚体的寡核苷酸功能化的编码粒子。III型是用具有与PNA非相关碱基序列的寡核苷酸功能化的编码粒子。IV型编码粒子表面无寡核苷酸。芯片B用作为芯片A的阴性对照，将芯片B与无靶PNA的杂交混合物一起孵育。标记“n”表示每种类型的粒子数目以及条代表平均值的标准差。
实施例22.利用荧光磁性微粒进行免疫检测
在本实施例中，将本发明的组合粒子用于进行免疫检测。本发明的组合粒子可以被定制为在其表面具有相关的抗体。可以将本发明的组合粒子的阵列暴露于含有相关抗原的样品溶液(例如血清溶液)。随后加入的荧光标记的第二抗体使得形成了三重荧光复合物，利用本发明所阐述的方法通过记录组合粒子表面的荧光可以监测复合物浓度。本发明的抗体功能化的组合粒子的阵列因此可以被用于监测血清蛋白水平，以及相关抗原的结合形式可以被用于蛋白测定。
实施例23.选择I：磁场诱导的阵列形成
本实施例举例说明了图22的操作以及从mRNA分子的序列特异性捕获到具有cDNA的EFM珠阵列的形成的一系列反应步骤。这样一个阵列对于许多应用都是有用的。例如，在基因测定中，一个平面cDNA阵列可用于测定cDNA浓度；同样的，用标记的DNA结合物或探针库可以直接探查cDNA阵列以测定阵列内相关的基因。在温度控制装置中进行的方案包括以下步骤：(1)将一组本发明的组合粒子引入到含有mRNA分子库的第一个间隔中，每种类型的粒子都具有一个基因特异性的寡核苷酸探针；mRNA分子可以退火于它们的相应的探针。该捕获步骤的检测条件是本领域已知的并在此是适用的；(2)将粒子所结合的mRNA作为模板进行粒子上的逆转录(RT)并从粒子上释放出mRNA；(3)应用来自永久磁铁的磁场并保持住粒子时进行洗涤；(4)释放磁场并将粒子重悬于缓冲液中以进行LEAPS操作；(5)指导粒子进入到含有定制的芯片的间隔中并利用LEAPS形成本发明的组合粒子的平面阵列。
实施例24.选择II：磁场诱导的阵列形成
本实施例举例说明了图22的操作以及从mRNA分子的序列特异性捕获到具有eDNA的EFM珠阵列的形成的一系列反应步骤。使用在实施例21中所设定的方案除了通过使用磁场形成本发明的组合粒子的平面阵列，以及磁场的使用以及实施例21的步骤(4)和(5)被删除。实施例25.利用编码磁性珠的阵列进行的多步检测序列
本实施例举例说明了一个多步生化反应方案，它整合了第一组磁性纳米粒子对基因组DNA片段的捕获，以及随后根据图22描述的常用方法进行的捕获的“粒子标记的”片段的磁性分离和固相扩增。该捕获步骤后紧跟的是同步的“多元”PCR扩增的转换步骤，每个反应含有一小组引物对以生成溶液中的扩增产物(amplicons)。收集并将这些扩增产物放置到与一组本发明的组合粒子接触以进行磁场应用所介导的转换后的多元分析。
所述的方法可以通过以下步骤完成：
1.样品捕获和首次转换
将给定的含有基因组DNA片段的溶液分成四个相等的部分，并将它们注射到四个分开的反应间隔中，其配置为可以允许根据标准的PCR温度循环方案调温和控制。将一种或多种磁性纳米粒子标记的引物注射到每个间隔中。粒子标记的引物由具有直接对抗于一个相关的基因组DNA靶片段的寡核苷酸探针的磁性纳米粒子构成，所述探针也作为随后聚合酶催化的引物延伸反应的第一个引物。下一个步骤容许通过将所选择的片段杂交于与之匹配的具有探针的粒子上进行捕获，所述靶点作为随后延伸反应的模板。往每个间隔中加入聚合酶以及所需要的一种或多种第二引物以容许在温度循环下在所有的间隔中同时进行模板介导的粒子结合的捕获探针的延伸，因此生成了第一个延伸产物，且锚定于磁性纳米粒子上。应用磁场以在每个间隔内形成磁性纳米粒子的平面阵列。当保持有粒子锚定的延伸产物时洗涤间隔。
下面是利用粒子标记的引物扩增基因组DNA片段的常用的PCR方案。设计了对应于相关片段内的特异性靶点的寡核苷酸探针，探针的可变的3’末端排列于靶点或接近靶点处。合成的探针包含有5’生物素-TEG以及12C间隔。根据例如如下的标准的反应方案将探针连接到抗生蛋白链菌素包被的磁性珠上：在室温下将探针加入到1×TE(100mM Tris-HCl，10mM EDTA)以及500mM NaCl的磁珠悬浮液中45分钟。用1×TE洗涤珠，用150mM NaCl洗涤3x并悬浮于50μl同种溶液中。下一步，将1μl每种珠悬浮液加入到含有1x缓冲液(100m MTris-HCl，pH9.0，1.5mM氯化镁，500mM KCl)，40M Cy5标记的dCTP(Amersham PharmaciaBiotechNJ)，以及80μM其他三种dNTP，和3单位Taq DNA聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech NJ)的PCR混合物中。在刚刚开始延伸之前将基因组DNA靶片段(40ng)加入到PCR混合物中。在这些条件下，利用Perkin Elmer9600热循环器进行的十个循环的扩增足够产生有效的珠锚定的延伸产物，温度循环包括变性(90℃，30s)、退火(55℃，30s)以及延伸(72℃，20s)。在完成延伸反应后，通常用1×TE缓冲液离心洗涤珠四次。
2.第二次扩增的同步操作
将聚合酶以及一组一种或多种设计为对应于粒子锚定的第一次延伸产物内的选择区域的引物对注射到每个反应间隔中，每个间隔接受一组独特的引物对。容许发生在温度循环下的珠锚定片段的同步扩增，因此在每个间隔中，生成了一组加入到间隔中的相应引物所指导的特异的扩增子。本步骤中使用了标准PCR反应方案(REF)。
3.反应产物的收集、检测后阵列的组装和检测
组合含有扩增子的溶液以生成分析物溶液并将其转移到检测间隔中，以及放置到与一组本发明的编码的磁性的纳米粒子接触，每个粒子带有序列特异性的寡核苷酸探针，该探针独特地指向于分析物溶液中的一个扩增子。容许发生扩增子与具有探针的珠的退火形成杂交复合物，并利用所选择的方法分析所选择的靶序列的区域，例如杂交复合物的不同的热稳定性或探针延长。应用磁场以形成本发明粒子的平面阵列。记录检测图像信号。记录解码图像以解码捕获探针的特征。
应用于本步骤的用于多态性分析的标准检测条件也提供了形成编码的功能化的磁性珠的平面阵列的条件，在此联合于实施例NN和图MM(SB：EFM珠阵列，由永久磁铁诱导)举例说明了这些条件。
实施例26.混合簇和阵列
本实施例举例说明了一种检测格式，其中将靶DNA链连接于本发明的磁性纳米粒子。利用本领域已知的标准的生物结合化学方案可以轻易地完成化学连接。例如，DNA链被轻易地生物素化以及然后可以被连接到抗生蛋白链菌素所包被的磁性纳米粒子。同样的，如实施例21中所讨论的，利用珠标记的引物通过PCR生成了带有DNA链的粒子。利用这里所提供的方法生成了一组必不可少的本发明的编码粒子。利用本领域已知的生物结合化学的标准方法用特异的寡核苷酸探针将粒子功能化。在检测过程中，作为形成结合配体之间的复合物的结果，形成了由磁性纳米粒子和编码粒子形成的异源结构，并且这些复合物被组装成平面阵列用于检测。
这里提出了两种可供选择的方案。在第一个可选择的方案中，光学编码的珠的大小通常明显地超过了磁性珠的大小，相应半径的常见比例是100∶1；如同在此以及实施例22所讨论的，100直径的抗生蛋白链菌素包被的磁性纳米粒子是商品化可获得的。下一步，在容许匹配的磁性珠标记的靶链与探针杂交的条件下，将具有DNA靶链的磁性珠的混合物与一组色彩编码的具有寡核苷酸探针的珠混合。将用大量的磁性纳米粒子“装饰”每个颜色编码的珠以生成一个磁性外壳并生成杂交混合物，造成这里所讨论的结构和组合粒子的形成。
根据本发明的方法使用磁场将生成本发明的编码和磁性纳米粒子的平面阵列，并容许记录多色的荧光图像以识别捕获的目标DNA。同样的，可以选择检测条件以优化簇的形成。也就是说，本发明的磁性纳米粒子作用为多齿的“配体”并介导本发明的编码粒子“聚集”成本发明的编码的和磁性的粒子的簇。使用通常产生超过1000高斯磁力的强磁场可以将这些簇从溶液中分离成扩展的孤立簇的组件。
在第二个可选择的方案中，本发明的磁性和编码粒子的作用以及相对大小被颠倒，以致更大的磁性纳米粒子被编码粒子所装饰。根据实施例19所设定的条件应用磁场，(Dynal珠-螺线管)在此生成了一个磁性纳米粒子的平面阵列，其中每个粒子具有一个光学信号或不具有光学信号，这依赖于粒子是否已经被赋予了一种光学标记物。
本实施例的这两个可选择的方案都要求读取多个光学信号以识别捕获的目标。当通过应用常为两种或三种的少量的编码颜色得到光学编码的粒子，以及根据本领域以致的标准方法得到的这些编码颜色比例的差异时，利用本领域已知的多个滤片装置通过标准的多色彩荧光成像容易得到多色彩图像。另外，如果将多种不同色彩的组合用于生成颜色码，那么通常用多光谱成像方法记录检测图像。
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1.一种用于生成编码的磁性粒子文库的方法，包括以下步骤：
a.生成第一个磁性纳米粒子的子文库，
b.生成第二个编码粒子的子文库，
c.在所述第一个子文库所包含的磁性纳米粒子上提供一种结合位点，
d.将所述第一个子文库和第二个子文库接触使得所述磁性纳米粒子共价结合于所述的编码粒子以形成所述文库，以及
e.在所述文库所包含的编码的磁性粒子上提供一种功能性位点。
2.一种用于生成编码的磁性粒子文库的方法，包括以下步骤：
a.生成第一个磁性纳米粒子的子文库，
b.生成第二个编码粒子的子文库，
c.在所述第一个子文库所包含的磁性纳米粒子上提供一种结合位点，
d.在所述第一个子文库所包含的磁性纳米粒子上提供一种功能性位点，以及
e.将所述第一个子文库和第二个子文库接触使得所述磁性纳米粒子共价结合于所述的编码粒子以形成所述文库。
3.权利要求1或2的方法，其中所述编码粒子由一种光学标记物进行编码。
4.根据权利要求1或2的方法生成的编码的磁性粒子的文库。
5.权利要求4的编码的磁性粒子的文库，其具有的化学多样性大于2。
6.权利要求5的编码的磁性粒子的文库，其在一种基层的指定区域以平面组件的形式排列于所述基层上。
7.一种检测分析物和结合物之间的结合相互作用的方法，包括以下步骤：
(a)提供一群包含附着的分析物的磁性纳米粒子；
(b)提供一群包含附着的结合物的编码粒子；
(c)在容许所述分析物和结合物结合的条件下混合所述磁性纳米粒子和编码粒子以形成它们的包含附着的磁性纳米粒子和编码粒子的复合物；以及
(d)检测所述分析物和结合物之间的结合。
8.权利要求7的方法，其中所述分析物包含配体而所述结合物包含配体受体。
9.权利要求7的方法，其中所述结合物包含配体而所述分析物包含配体受体。
10.权利要求7的方法，其中所述分析物包含DNA而所述结合物包含寡核苷酸。
11.权利要求7的方法，其中所述结合物包含寡核苷酸而所述分析物包含DNA。
12.权利要求7到11中任一项的方法，进一步包含给包含所述附着的磁性纳米粒子和编码粒子的所述复合物施加磁场。
13.权利要求12的方法，其中通过施加所述磁场将所述复合物组装成用于检测的平面阵列。
14.权利要求12的方法，其中通过施加所述磁场将所述复合物的簇分隔为一个扩展的独立的簇的组件。
15.权利要求7到14中任一项的方法，其中所述编码粒子由一种光学标记物进行编码。
16.权利要求15的方法，其中所述编码粒子是荧光编码的。
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