CN1271081C - 亚硫酸氢盐处理的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种进行亚硫酸氢盐反应从而在核酸即甲基化或非甲基化的胞嘧啶中确定甲基化位点的方法，其中在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，核酸被结合于固相。固相优选地是含有玻璃或硅石的材料，更优选的是玻璃棉、玻璃膜或者是磁性的玻璃颗粒。更进一步地，公开了固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中用于结合核酸的用途，以及一种含有亚硫酸氢盐试剂和固相的试剂盒。

Description

亚硫酸氢盐处理的改进方法
技术领域
本申请涉及一种通过亚硫酸氢盐反应来确定核酸即甲基化或非甲基化的胞嘧啶中甲基化位点的方法，其中在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，核酸被与固相结合。固相优选地为含有玻璃或硅石的材料，更优选的是玻璃棉(glass fleece)、玻璃膜或者磁性玻璃颗粒。更进一步地，公开了固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中用于结合核酸的用途，以及一种含有亚硫酸氢盐试剂和固相的试剂盒。
背景技术
基因仅构成了全部哺乳动物基因组的一小部分，且在非编码脱氧核糖核酸(DNA)的大量存在下其表达的精确调控对它们的调控而言表现为一个重要的问题。非编码的DNA，包括内含子、重复元件以及潜在的活性可易位的元件需要有效的机制来使之长期的沉默。为了有助于这种沉默，哺乳动物通过胞嘧啶甲基化给予的可能性来提供一种可遗传的改变DNA-蛋白间相互作用的机制。DNA的甲基化是哺乳动物发育所必需的，且在老化和癌变中发挥潜在的作用。甲基化在基因表达中的涉入以及作为后生修饰标记基因已被完全的确定。在哺乳动物中，甲基化仅发生在胞嘧啶残基上，而且更特定的仅发生在与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶上，即CG序列。DNA甲基化位点的检测和图谱定位是了解显示给出的序列是否是甲基化的分子信号的必要步骤。
目前，Formmer M，等，Proc Natl Acad Sci USA 89(1992)1827-31描述的通过所谓亚硫酸氢盐法检测5-甲基-胞嘧啶已被完成。对5-甲基胞嘧啶作图的亚硫酸氢盐方法是利用亚硫酸氢钠和胞嘧啶的反应的作用，而不与或者仅仅是较少的与5-甲基-胞嘧啶反应。胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应产生磺化的胞嘧啶反应中间体，它易于去氨基而产生磺化的尿嘧啶，后者在碱性条件下能被去磺化而生成尿嘧啶。众所周知，尿嘧啶具有胸腺嘧啶的碱基配对行为，有别于胞嘧啶的离析物，而5-甲基胞嘧啶具有胞嘧啶的碱基配对行为。这就可能通过例如亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg，G.和Clark，S，Bioessays 16(1994)431-6；Grigg，G..W，DNA Seq 6(1996)189-98)或者US5786146公开的甲基化特异性PCR(MSP)区别甲基化或非甲基化的胞嘧啶。
各种不同的文献描述了关于亚硫酸氢盐反应的特殊方面(Benyajati，C，等，Nucleic Acids Res 8(1980)5649-67)，它们总体上研究了亚硫酸氢盐修饰5-甲基-脱氧胞嘧啶和脱氧胞嘧啶(Olek，A，等，Nucleic Acids Res 24(1996)5064-6)，公开了一种用于亚硫酸氢盐碱基测序的方法，由此在琼脂糖珠包埋的材料上进行亚硫酸氢盐处理和后续的PCR步骤。如Clark，S.J，等，NucleicAcids Res 22(1994)2990-7公开的方法中，样品在去氨基后脱盐。
Raizis，A.M，等，在Anal Biochem 226(1995)161-6公开了模板降解最小化的5-甲基胞嘧啶图谱定位的亚硫酸氢盐方法。他们研究了pH、温度和反应时间的影响。Grunau，C，等，Nucleic Acids Res 29(2001)E65-5或Warnecke，P.M，等，Methods 27(2002)101-7也做了同样的研究。WO01/98528或Paulin，R，等，Nucleic Acids Res26(1998)5009-10中公开了在亚硫酸氢盐混合物中的其它不同的成分。WO02/31186公开了在亚硫酸氢盐处理和PCR后的其它亚硫酸氢盐步骤。Komiyama，M.和Oshima，S，Tetrahedron Letters 35(1994)8185-8188研究了亚硫酸氢盐诱导的在寡聚脱氧核苷酸中的胞嘧啶的去氨基的催化作用。
用于进行亚硫酸氢盐处理的试剂盒是可从Intergen商业获得的，由Serologicals Corporation，Norcross，GA，USA，提供，例如CpGenomeTM DNA修饰试剂盒。
Feil，R，等，Nucleic Acids Res 22(1994)695-6公开了亚硫酸氢盐基因组测序的变换方法，其中基因组DNA在去氨基后是结合在玻璃珠上的，然后洗涤。洗脱后核酸再去磺化。已知核酸能够利用其与玻璃表面的结合特性，例如被硅胶或硅藻土吸收，在离液序列高的条件下被磁性玻璃颗粒(MGPs)或有机硅烷颗粒吸收而被分离。利用固相的提取通常包含步骤：在允许目的物质与固相结合的条件下，将核酸溶液加到固相上，从结合固相的核酸上除去残液以及随后将核酸从固相上释放到洗出液中(有时称作洗脱)。这些方法的产物通常是含有溶解状态的目的物的溶液。
所有现有技术的亚硫酸氢盐处理的方法都有缺陷。因此，本申请解决的问题是提供一种克服现有技术方法缺陷的方法。
发明内容
上述讨论的问题的解决是通过提供一种用于将核酸中的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法而解决的，优选的是将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基，由此优选的是5-甲基-胞嘧啶不会显著转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”)，在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，核酸是与固相结合的。优选的，该固相是玻璃棉，玻璃膜或者磁性玻璃颗粒。本发明进一步地公开了亚硫酸氢盐反应中去氨基和/或去磺化步骤中固相的用途，以及含有固相和用于进行亚硫酸氢盐反应的试剂的试剂盒。
固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，优选在去磺化步骤中的应用，具有操作简单和/或易于自动控制的优点。例如，在去氨基和/和去磺化步骤中使用玻璃棉时，不需要进行耗时的DNA沉淀反应；通过离心可易于实现无结合分离，玻璃棉损失的体积可以忽略不计，因此洗涤步骤就非常有效。当亚硫酸氢盐处理的DNA用于潜在的抑制因子可显著地降低灵敏度的PCR时，这是一个优点。本发明所述的方法易于手工操作，而且适用于没有常规分析仪器的较小的实验室。对于具有较大流通量的实验室，可通过常规分析仪器处理的固相特别是磁性玻璃颗粒的使用是非常有利的。在常规的亚硫酸氢盐反应中，采用变性条件，因为亚硫酸氢盐仅和不会参与碱基配对的嘧啶反应。由于核酸通过不同的相互作用与固相表面结合，这种结合可能影响亚硫酸氢盐反应的成功，因此出人意料的，本发明的方法可以使亚硫酸氢盐反应成功而且到达令人满意的程度。
根据本发明，术语“亚硫酸氢盐反应”，“亚硫酸氢盐处理”或“亚硫酸氢盐方法”应该是指在核酸中的一个胞嘧啶碱基特别是多个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基或者多个胞嘧啶碱基的反应，优选的在亚硫酸氢盐离子存在的条件下，由此5-甲基-胞嘧啶优选不被显著的转化。Frommer等，同上以及Grigg和Clark，同上详细描述了甲基化胞嘧啶的检测反应。亚硫酸氢盐反应包括一个去氨基步骤和一个去磺化步骤，这两步可以分开或同时操作(见附图1；Grigg和Clark，同上)。所述5-甲基-胞嘧啶没有被显著的转化应当仅是考虑到不排除小比例的5-甲基-胞嘧啶转化为尿嘧啶，尽管这仅仅意欲转化为(非-甲基化)的胞嘧啶碱基(Frommer等，同上)。
本发明的方法能够在几种亚硫酸氢盐反应排列和固定步骤中进行。在第一个实施方案中，当核酸与固相结合时，进行去氨基和去磺化步骤。因此在本发明优选的实施方案中，公开了将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选的是将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基(“亚硫酸氢盐反应”)，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化的方法，包括步骤：
a)将核酸与固相结合，
b)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育固相结合的核酸，从而使核酸去氨基，
c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸，
d)在碱性条件下，温育去氨基的固相结合的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化，
e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，和
f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
本发明的第二个实施方案中，当核酸与固相结合时去磺化。因此，本发明的另一个优选实施方案公开了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选地将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”)的方法，包括步骤：
a)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育核酸使核酸去氨基，
b)将去氨基的核酸与固相结合，
c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸，
d)在碱性条件下，温育去氨基的固相结合的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化，
e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，和
f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
在本发明的第三个实施方案中，当核酸与固相结合时去氨基。因此，在本发明另一个优选的实施方案中，公开了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选地将多个胞嘧啶碱基转化为多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”)的方法，包括步骤：
a)将核酸与固相结合，
b)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育固相结合的核酸，从而使核酸去氨基，
c)可选择地洗涤固相结合的核酸，
d)将去氨基的核酸从固相上洗脱下来，
e)在碱性条件下温育去氨基的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化。
本领域熟练的技术人员可通过参考例如Frommer等，同上，或Grigg和Clark，同上，公开的亚硫酸氢盐反应的主要参数知道如何进行亚硫酸氢盐反应。本领域的技术人员从Grunau等，同上文的文献中可知亚硫酸氢盐反应的何种改变是可能的。温育时间和温度对去氨基效率的影响，以及影响DNA降解的参数都是公开的。总而言之，在去氨基步骤中，含有亚硫酸氢盐离子的缓冲液，使用了可选择的离液剂和可选择的其它试剂例如乙醇或者稳定剂例如氢醌，而且pH在酸性范围内。亚硫酸氢盐的浓度是0.1到6M，优选地是1M到5.5M，离液剂的浓度是1到8M，优选地使用胍盐，pH是在酸性范围，优选地是4.5到6.5，温度是0℃到90℃，优选地是在室温(25℃)到90℃，而且反应时间是30分钟到24小时或48小时或更长，但是优选地是1小时到24小时。去磺化步骤是通过添加碱性溶液或缓冲剂，例如仅含氢氧化物，如氢氧化钠的溶液，或者是含有乙醇，氯化钠和氢氧化钠的溶液(例如38％EtOH，100mM NaCl，200mM NaOH)来进行的，而且是在室温或者稍高一些的温度温育几分钟，优选地是5到60分钟。
在本发明的一个实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)，特别是基因组DNA或者核酸，即DNA或者已在生物体基因组中发现的且作为生存必需的信息传递给后代的核酸。这些用语是用来区别其它类型的DNA，比如质粒中发现的DNA。核酸的来源可以是真核生物或者原核生物，优选地是脊椎动物，特别是来自哺乳动物，最优选的是来自动物或者人类。
在本发明的一个实施方案中，核酸被结合到未修饰的固相上，即核酸直接与固相结合，而没有任何介导与固相结合的化合物。核酸结合到固相的未修饰的表面，由此与表面的结合也应该考虑到固相可能含有的孔道以及核酸可能在固相的孔道中与其表面结合。根据本发明的实施方案，固相可以是一种离子交换剂(可商业获得的，例如来自Amersham Biosciences Europe，Freiburg，Germany)，在特殊条件下它能与核酸结合，羟磷灰石(可商业获得的，来自Sigma，Taufkirchen，Germany)，玻璃或硅石，或者含有玻璃或硅石的材料，优选地具有未修饰的表面。在另一个实施方案中，固相可以是已修饰的，即固相通过介导与固相结合的化合物与核酸间接结合，比如利用核酸与已连接到表面的寡聚核苷酸的序列特异性结合，或者是链亲和素(已结合到固相表面)与已生物素标记的DNA结合。适用的颗粒是可商业获得的，来自DYNAL，Oslo，Norway以及在WO90/06045中描述过的。
术语“未修饰的”应该是指没有更进一步的化学修饰，即没有其它的化学基团共价或非共价地连接。术语“未修饰的表面”，“未修饰的硅石表面”或“未修饰的玻璃表面”应该是指没有其它的化学基团共价或非共价地结合，这些化学基团用作核酸结合的中间物质，而且核酸与中间物质而非硅石表面本身结合。因此，核酸优选地通过氢键和其它的原子力直接地与“未修饰的表面”结合。一个修饰的表面的例子是硅石表面，以序列特异性方式结合核酸分子的寡核苷酸的连接在上面。另一个修饰的硅石表面的例子是以链亲和素包被的硅石表面，链亲和素与已生物素化的DNA分子结合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，固相是含有玻璃或硅石的材料，优选具有未修饰(玻璃或硅石)表面，例如玻璃纤维或，硅藻土，玻璃珠或颗粒，玻璃膜或磁性玻璃颗粒或其它的覆有未修饰玻璃面的物质。特别优选的是玻璃羊毛或玻璃膜或磁性玻璃颗粒。这些固相被公开在EP0389063或US5234809中。
DNA或核酸与玻璃或硅石表面结合的条件是本领域技术人员的基本常识。这些方法被详细描述在各种文献中。例如，在Vogelstein，B.和Gillespie，D，Proc Natl Acad USA76(1979)615-9中，建议了一种在碘化钠存在的条件下，核酸从琼脂糖凝胶结合到磨碎的燧石玻璃上的方法。Marko，M.A，等，AnalBiochem 121(1982)382-7中描述了在高氯酸钠存在的条件下，在玻璃粉尘上从细菌中纯化质粒DNA。在DE-A37 34 442中，描述了利用乙酸使噬菌体颗粒沉淀，用高氯酸盐溶解噬菌体颗粒，在玻璃棉过滤器上分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤结合到玻璃棉过滤器上的核酸，随后用含甲醇的Tris/FDTA缓冲液洗脱。Jakobi，R，等，Anal Bioehem 175(1988)196-201描述了一个相似的从入噬菌体中纯化DNA的方法。该方法需要在离液盐溶液中选择性结合核酸与玻璃表面，而且要将核酸从琼脂糖，蛋白或细胞残余物等污染物中分离出来。为了从污染物中分离玻璃颗粒，颗粒可以被离心或液体抽吸通过玻璃棉过滤器。但是，这是一种限制步骤，它使得这一程序不能用于处理大量的样品。在本发明一个优选的实施方案中，通过添加盐和乙醇，磁性玻璃颗粒沉淀后用于结合核酸，正如Alderton，R.P，等，Anal Biochem201(1992)166-9和PCTGB91/00212中所描述的。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，固相是磁性玻璃颗粒，优选地是未修饰的玻璃表面。磁性玻璃颗粒是一种小磁性核心在玻璃中的固体分散体，即它们是玻璃小滴，其中分散着非常小的磁性物体。那些提到的磁性物体是接近磁铁的，例如铁或铁磁的或超顺磁性的材料。顺磁性的物质是没有用的，因为它们仅仅是非常微弱地接近有磁性，对于本发明的方法，其磁性是不够的。优选的是铁或铁磁材料，特别是还未预磁化的。上下文中的预磁化被理解为是指与磁铁接触，它可以提高剩磁。优选的磁性材料是铁或氧化铁，正如磁铁矿(Fe3O4)或Fe2O3，优选地是γ-Fe2O3。大体上，亚铁酸钡，镍，钴，Al-Ni-Fe-Co合金或其它的铁或铁磁材料都能用。本发明特别优选的是WO96/41811，WO00/32762和WO01/37291中描述的磁性玻璃颗粒。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，磁性玻璃颗粒含有很少的铁的滤灰，因为对于后续的扩增反应，铁是一种抑制剂，即铁是一种酶抑制剂。因此，这是磁性玻璃颗粒一个重要的特性。优选地，水或1M HCl中的铁的滤灰低于40ppm，更优选的是低于20ppm，最优选的是低于10ppm。在本发明最优选的实施方案中，磁性玻璃颗粒是被描述在国际申请WO01/37291中，其也可从MagNA Pure LC DNA分离试剂盒I(Roche，Mannheim，Germany)中公开获得。根据本发明这些颗粒沉淀缓慢而且在自动控制的方法中便于使用。这种产品被概述在下面。
磁性玻璃颗粒基本是球形的而且具有很小的直径，含有至少一个具有5到500nm的直径的磁性物体。它具有惊人的沉淀动力学效果，通过半衰期值t1/2定量，半衰期是从特定的体积单元沉淀50％的颗粒的时间跨度。根据本发明，在异丙醇中3mg/ml重量/体积具有未修饰玻璃表面的MGPs悬浮液的沉淀的半衰期大于3分钟，优选4分钟，更优选6分钟。但是半衰期最优选值是大于10分钟或者甚至大于20分钟。例如，最优选的MGPs磁性物体可以是磁性色素。磁性物体的大小是在纳米范围内，也就是5到500nm，优选10到200nm，最优选是15到50nm。适用的磁性色素是由CERAC公司生产的，其具有平均直径23nm而且由γ-Fe2O3组成(BET-表面50m2/g，CERAC：P.O.Box 1178，Milwaukee，Wisconsin 53201-1178USA；Article-No.I-2012)。本发明最优选的磁性玻璃颗粒更进一步的特征是MGPs具有用高分辨率的扫描电子显微镜测定为0.5μm到5μm的颗粒直径，优选1μm到2μm，因此，磁性物体的直径如上描述是5到500nm，优选10到200mn，最优选是在15到50nm范围内。因此，MGPs的特征进一步在于当用高分辨率的扫描电镜测定时，磁性色素核与磁性玻璃颗粒的直径比例小于1到10。最优选的MGPs是多微孔的，但是被高度结构化的，因此具有超过6m2/g的相对大的表面。优选地，磁性玻璃颗粒表面积为5到100m2/g，优选5到90m2/g，更优选的是10到50m2/g，最优选的的是15到30m2/g。可以利用一种自动化的商业设备通过Braunauer-Emett-Teller-方法来测定。对于这种被谷称为BET的方法讨论参见Braunauer“TheAdsorption of Gases and Vapors”(1943)，普林斯顿大学出版社。
正如WO01/37291所描述的，本发明使用的磁性玻璃颗粒基本上可以由不同的制剂来提供。磁性玻璃颗粒可能以片剂形式，作为粉末或者优选作为悬浮物提供。在本发明的一个优选的实施方案中，这些悬浮物含有5到60mg/ml的磁性玻璃颗粒(MGPs)。在本发明的另一个实施方案中，含硅石的材料是悬浮在水性的缓冲溶液中的，缓冲溶液中可选择的含有浓度为2到8mol/l的离液剂，优选是4到6mol/l。离液盐是碘化钠，高氯酸钠，硫氰酸胍盐，异硫氰酸胍盐或氢氯化胍盐。本发明的离液剂是任意一种这样的化学物质，当该试剂存在于含DNA或RNA的溶液中时，它可以扰乱液态水的有序结构并影响DNA或RNA与本发明的MPGs的结合。本领域技术人员熟知的其它物质也是可能的。
在本发明的一个优选实施方案中，磁性玻璃颗粒是用WO01/37291，WO00/37291和WO96/41811描述的溶胶-凝胶方法制备的，这里的溶胶-凝胶方法特定地含有以下步骤：
—将磁性物体悬浮于溶胶中，
—将溶胶水解从而用凝胶覆盖磁性物体，
—在双喷嘴喷雾干燥器中将被凝胶覆盖的磁性物体喷雾干燥，
—烧结喷雾干燥的粉末以便由覆盖磁性物体的凝胶形成玻璃。
本发明的优选的MGPs是根据WO00/32762的实施例8制备的含有作为磁性色素的微米无光黑的磁性玻璃颗粒。本发明最优选的MGPs是依据国际申请WO01/37291制备的，也可是获自MagNA Pure LC DNA分离试剂盒I(Roche，Mannheim，Germany)。它们也可以用国际申请WO01/37291描述的溶胶-凝胶方法，利用直径大约23nm的磁性物体和色素(由CERAC制造，由γ-Fe2O3组成；CERAC：P.O.Box1178，Milwaukee，Wisconsin 53201-1178 USA；Article-No.I-2012)来制备。磁性物体覆盖上凝胶后，通过双流喷嘴将浆液喷雾制成粉末。合适的喷雾干燥系统由Nubilosa Molekularzerstubung，Ladisch GmbH& Co.KG，Konstanz，Germany，例如“Labor-Zerstubungstrochkner(Typ LTK)”或由Büchi AG，Uster，Switzerland制造，例如微型喷雾干燥器(B-191型)。由于磁性核与玻璃外壳的直径比例是小于1到10，优选的是1∶10和1∶1000，除了制备条件，特别是喷雾干燥过程中的条件，几何学以及掺入的磁性核或它们的惰性载体的数量并不决定颗粒的形状和大小。换句话说，喷雾干燥程序中，压力，入口的温度，出口的温度以及流速的选择是自由度，它决定了尺寸分布和玻璃滴的形状，由此修饰MGPs。因此，喷雾干燥系统的喷嘴是加热的。入口的温度是120℃到500℃，优选170℃到230℃或150℃到230℃，最优选是150℃到200℃或190℃到210℃或者在200℃或稍低。出口的温度是依据溶胶的沸点，并因此依据溶剂，可以大约，等于或稍低于溶剂沸点，也就是说低于溶剂沸点10℃。当用乙醇作溶剂时，是50℃到300℃，优选70℃到150℃，最优选的是80℃到110℃。最佳的温度是90℃到100℃。喷嘴的压力大于3bar，优选的是在4到6bar间调节。操作人员可以理解精确的参数依赖于所使用的喷雾干燥系统。但是，他可以将本发明的教导用于任何其它喷雾干燥系统，并通过考虑本发明公开的内容获得这些参数。依据“喷雾干燥手册”(1991)，JohnWiley & Sons，New York上的公式可使其找出适用与其它设备的参数。优选地，他可以查询喷雾干燥系统的手册或者与喷雾干燥系统的制造商联系求得技术服务。为使产量最大化，稠化或烧结的温度应尽可能高，也就是说，稍低于熔化的范围。精确的温度依据玻璃的成分，但是可以在400℃到1200℃之间。WO01/37291中描述的EJ玻璃成分的例子中，烧结温度是720℃到770℃，优选的是750℃左右。考虑本发明的教导时，技术人员可在其技艺范围内找出各种玻璃成分的温度。然后粉末被加热1小时到200℃，可选择地冷却到室温，再在氮气中以加热速率1K/min加热到750℃(稠化或烧结温度)并在此温度保持1小时。然后，熔炉冷却到150℃并再次在空气中加热到200℃保持1小时。冷却到室温后，将粉末移到筛网(50μm)上并筛30分钟。筛后的样品瓶装后200℃灭菌4小时，随后冷却到80℃。然后该玻璃容器从烤炉中取出，覆盖无菌箔封存。
下面详细描述将核酸结合于未修饰的玻璃或硅石表面(优选磁性玻璃颗粒)的实验室方法。优选在离液盐存在的条件下进行，浓度为1到8mol/l，优选2到6mol/l。离液盐可以是碘化钠，高氯酸钠，硫氰酸胍盐，异硫氰酸胍盐或氢氯化胍盐。本发明的离液剂是任何一种这样的化学物质，当该介质存在于含DNA(或RNA)的溶液中时，它可以扰乱液态水的有序结构并影响DNA(或RNA)与磁性玻璃颗粒的结合。本领域技术人员熟知的其它生物物质也在范围内。其它的物质也依然可能。为与核酸混合物和可选择的其它的生物成分结合，具有未修饰玻璃表面的玻璃珠要添加到混合物中，而且要温育一段足够的时间以使结合发生。技术人员通常都熟悉温育步骤的持续时间。这一步骤可以通过测定在不同的时间点，表面的固定化的核酸的量使之最优化。对于核酸来说温育时间在10秒到30分钟都是适合的。然后加入进行亚硫酸氢盐反应不同步骤的试剂(或者甚至可以在温育之前加入)。温育或洗涤之后，核酸可以从液体中分离出来。大体上可以通过重力，或者在核酸与磁性玻璃颗粒结合的有利情况下，通过利用磁场将与磁性玻璃颗粒结合的核酸分离来完成。例如，在温育反应的容器中磁性颗粒可以被吸引到容器壁上。从而可以去除含有没有与磁性颗粒结合的生物成分或反应成分的液体。用来去除的方法依赖于温育反应所用的容器的类型。适用的步骤包括通过吸取或气吸方式排除液体。随后结合核酸的材料可至少被洗涤一次，优选用70体积的乙醇30体积的水(70％乙醇)的混合液或者在WO99/40098描述的酸性洗涤溶液中。使用的洗涤溶液不会引起核酸或目的核酸从材料表面释放下来，但能使不希望的污染物尽可能地被洗掉。洗涤步骤优选用通过用结合核酸温育玻璃或硅石来完成。步骤中材料优选再悬浮。正如上述的结合步骤，被污染的洗涤溶液优选被去除。最后的洗涤步骤后，材料可以在真空中简单地干燥，或者将流体蒸干。利用丙酮的预处理步骤可以被进行。
在本发明的一个实施方案中，利用本发明的固相和本领域技术人员熟知的方法从生物样品中得到核酸。生物样品包括来自多细胞生物的细胞，比如人类和动物细胞，如白细胞，以及免疫活性的低或高分子化学成分，诸如半抗原、抗原、抗体和核酸、血浆、脑流体、痰、粪便、活组织标本、骨髓、口漱物、血清、组织、尿或其混合物。在本发明的一个优选实施方案中，生物样品是来自人体或动物体的流液。优选的生物样品是血液，血浆，血清或尿。血浆优选的是EDTA+，肝素或柠檬酸盐处理过的血浆。含有核酸的生物样品细胞被溶解产生混合的含有核酸和其它成分的生物混合物。生物样品的裂解方法是技术人员熟知的，基本上可以是化学的、酶的或物理的方式。使用这些方法的组合也是可以使用的。例如，可以用超声波，高压，剪切力，碱，去垢剂或离液盐溶液进行裂解。对于裂解获得核酸，Sambrook等：分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约以及Ausubel等：Current Protocls inMolecular Biology，1987，J.Wiley和Sons，纽约给出了特定的参考。然后用本发明的方法和固相将核酸从裂解混合物中分离出来，随后可以进行本发明的方法，也就是说本发明的亚硫酸氢盐处理。离液剂也用来裂解细胞以准备核酸和其它生物物质的混合物(参见例如Sambrool等(1989)或EP 0389063)。然后加入含有玻璃或硅石的材料，纯化的效果产生于在这样一些条件下，即存在一定浓度的离液剂，较高浓度的有机溶剂或酸性条件下，与具有玻璃表面的材料结合的DNA或RNA的状态。因此，本发明也考虑到了裂解步骤与亚硫酸氢盐反应的组合，亦即从核酸与其它生物物质混合中分离出的核酸直接进行亚硫酸氢盐处理，由此核酸在去氨基和/或去磺化步骤中与固相结合。更具体地，为将核酸中的胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基优选多个尿嘧啶碱基提供了一种方法，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有被显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”)，通过与固相，优选含有玻璃或硅石的材料相结合，使核酸从含核酸和其它生物成分的混合物中被分离出来，而且在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中仍保持与固相的结合。再进一步具体的，提供了一种方法，该方法中核酸被从核酸与其它生物成分的混合物中分离出来，而且在亚硫酸氢盐反应的去氨基和去磺化步骤中与固相结合，亦即提供了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有显著转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”)的方法，包括步骤：
a)提供核酸与其它生物成分的混合物
b)将核酸与固相结合，可选择地去除其它生物成分，并可选择地洗涤固相结合的核酸，
c)在亚硫酸盐离子存在的条件下温育结合固相的核酸，由此核酸被去氨基，
d)可选择地洗涤结合去氨基的固相结合的核酸，
e)在碱性条件下温育去氨基的固相结合的核酸，由此去氨基的核酸被去磺化，
f)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，和
g)从固相上可选择地洗脱去氨基和去磺化的核酸。
在另一个实施方案中，提供了一种方法，该方法中，核酸从核酸与其它生物成分的混合物中被分离，而且在亚硫酸氢盐反应的去磺化步骤中与固相结合，亦即提供了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有显著转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”)的方法，包括步骤：
a)提供核酸和其它生物成分的混合物
b)将核酸与固相结合，可选择地去除其它生物成分，可选择地洗涤固相结合的核酸，并将核酸从固相上洗脱下来，
c)在亚硫酸盐离子存在的条件下温育被洗脱的核酸，由此核酸被去氨基，
d)将去氨基的核酸与固相结合，
e)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸，
f)在碱性条件下，温育去氨基的固相结合的核酸，由此将去氨基的核酸去磺化，
g)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，并且
h)从固相上可选择地洗脱去氨基和去磺化的核酸。
在发明的另一个实施方案中，提供了一种方法，该方法中，核酸从核酸与其它生物成分的混合物中分离，而且在亚硫酸氢盐反应的去氨基步骤中与固相结合，亦即提供了一种将核酸中的一个胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基转化为一个尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有显著转化(“亚硫酸氢盐反应”或“亚硫酸氢盐处理”)的方法，包括步骤：
a)提供核酸与其它生物成分的混合物
b)将核酸与固相结合，可选择地去除其它生物成分和可选择地洗涤固相结合的核酸，
c)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育固相结合的核酸，由此核酸被去氨基，
d)可选择地洗涤固相结合的核酸，
e)将去氨基的核酸从固相上洗脱下来，
f)在碱性条件下温育去氨基的核酸，由此去氨基的核酸去磺化。
本发明的优选方法进一步包含了将结合的核酸从固相上洗脱下来的步骤。然后所述的核酸例如可以被扩增。为了进行洗脱，含玻璃或硅石(具有未修饰的硅石表面)的材料在溶液中要再悬浮，溶液中不含和仅有少量的离液剂和/或有机溶剂。可以选择地，悬浮液用不含或仅有少量的离液剂和/或有机溶剂稀释。这种性质的缓冲液可以从DE3724442和Jakobi等，同上文中获知。具有低盐浓度的洗脱缓冲液是一种特别的、盐浓度低于0.2mol/l的缓冲液。在一个特别优选的实施方案中，为缓冲目的，洗脱缓冲液含有Tris物质，特别是pH在7左右或高于7的Tris缓冲液。在另一个特定的实施方案中，洗脱缓冲液是软化水。现在含有核酸的溶液在去除固相后，准备用于扩增。因此，核酸被转入一个新的含有所有扩增必需试剂的反应管中。可选择地，含有所有扩增必需试剂的溶液加到固相和已释放的核酸的悬浮液中。在另一个实施方案中，含有所有扩增必需的试剂的溶液是被加到固相与结合的核酸悬浮液中，而不经洗脱步骤，由此核酸的扩增是在固相上进行的。
本发明中对于洗涤和结合步骤优先使用适于分子生物学过程，特别是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)纯化过程的液相，这些过程利用这些物质在一定条件下与固相，特别是硅石或玻璃表面，更特别是磁性玻璃颗粒的结合。优选的液相包含醇和/或酮或其与水的混合物。本发明的醇优选包括通式R-OH的伯醇，仲醇和叔醇，这里R代表通式-(-CH2)n-CH3和n＞＝0。但是其它的适用于分子生物学目的的醇也能用，正如丙三醇。特别合适的醇是异丙醇，乙醇或其与水的混合物，优选的是80体积的异丙醇和20体积的水的混合物。本发明的另一个实施方案中液相含有酮，比如丙酮。进一步的，利用合适的含水缓冲溶液。适用于分子生物学目的的缓冲系统可查询例如Sambrook，J，等，在“分子克隆：实验室手册”(1989)，Eds.J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。优选的缓冲物质是Tris-羟甲基胺(TRIS)，磷酸盐，N-(2-羟基-乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，其盐或其它适用的物质。此外可使用能改变溶液离子强度的物质，比如NaCl，KCl或CaCl2，或金属阳离子络合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。
      在本发明的一个优选实施方案中，利用聚合酶链式反应(PCR；EP0201184，EP-A-0200362，US4683202)扩增核酸。扩增方法也可是连接酶链式反应(LCR，Wu，D.Y.和Wallace，R.B.Genomics4(1989)570-9和Barany，F，Proc Natl Acad SciUSA88(1991)189-93；聚合酶连接酶链式反应(Barany，F，PCR Methods Appl 1(1991)5-16)；Gap LCR(PCT专利公告No.WO90/01069)；修复链式反应(欧洲专利公告No.EP439，182 A2)，3SR(Kwoh，D.Y，等，Proc Natl Acad SciUSA86(1989)1173-7；Guatelli，J.C.等，Proc Natl Acad Sci USA 87(1990)1874-8；PCT专利公告No.WO92/0880 A)，和NASBA(US专利No.US5,130,238)。还有链置换扩增(SDA)，转录介导的扩增(TMA)，和Qβ-扩增(综述参见Whelen，A.C.和Persing，D.H，Annu Rev Microbiol 50(1996)349-73；Abramson，RD.和Myers，TW，Curr Opin Biotechnol 4(1993)41-7)。本发明的特别优选的扩增方法是US5,786,146公开的甲基化特异性PCR方法(MSP)，它结合了亚硫酸氢盐处理与等位基因特异性PCR(参见US 5,137,806，US 5,595,890，US 5,639,611)。
在一个优选的实施方案中，其方法中进一步包含了扩增核酸的检测步骤。本领域的技术人员可以通过标准的分析方法测定或检测扩增核酸，在Sambrook，等，分子克隆，Cold Spring Harbor University Press(1989)，Lottspeich和Zorbas，“Bioanalytik”(1989)，Eds.L.a.Zorbas，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Germany，或Ausubel，F，等，“Current protocols in molecularBiology”(1994)，Eds.F.Ausubel，R.Brent和K.R.E，Wiley & Sons Verlag，NewYork.等的文献中有所描述。在目的核酸检测之前也要进一步进行纯化步骤，比如沉淀步骤。检测的方法可以包含在双链DNA上结合或间插特异的染料，比如溴化乙啶，它能间插至双链DNA并改变DNA的荧光性，但该方法也不局限于此。纯化的核酸也可在限制酶消化后通过电泳的方法可选择地被分离，并随后显现出来。也可以使用基于探针的测定方法，该方法是使用寡核苷酸与特异序列杂交，然后检测杂交物。随后也可能用本领域技术人员熟知的步骤对目标核酸进一步测序。其它的方法是将核酸序列的多态性应用于结合特异探针的硅片，当结合互补序列时产生信号。
在本发明一个特别优选的实施方案中，在扩增过程中利用测量荧光的强度来检测核酸。这种方法可以监控实时荧光。WO92/02638以及相应的美国专利US 5,210,015，US 5,804,375，US 5,487,972公开了一个特定优选的，用于同时进行扩增和通过测量荧光强度来检测的方法。该方法利用聚合酶的外切核酸酶的活性来产生信号。具体的，核酸检测方法包括：用含有与目标核酸区域互补的序列的寡核苷酸和含有和同一目标核酸链第二个区域互补的序列的已标记的寡核苷酸与样品接触，但不包括被第一种寡核苷酸确定的核酸序列，在杂交条件下产生双链体的混合物，其中双链体包含了与第一条寡核苷酸和标记寡核苷酸退火的目标核酸，这样第一条寡核苷酸的3’端与标记寡核苷酸的5’端相邻。然后该混合物用具有5’到3’核酸酶活性的、模板依赖性的核酸聚合酶处理，处理条件是足够允许聚合酶的5’到3’核酸酶活性切断退火的、被标记的寡核苷酸并释放标记片段。通过标记寡核苷酸水解产生的信号可以被检测和/或被测量。TaqMan技术消除了形成固相反应混合物的必要性，而且可以被检测。在更普通的条件下，本发明的扩增和/或检测反应的方法是均一的液相测定。更进一步优选的方法是LightCycler设备上应用的形式(例如参见US 6,174,670)。特别优选的是亚硫酸氢盐处理，在甲基化特异性探针存在的条件下用或不用甲基化特异性引物扩增，以及实时荧光检测的应用，如US6331393中的描述。
在本发明的一个优选实施方案中，方法是自动操作的，也就是说，正如WO99/16781所描述的可用自动过程来进行。可自动化过程是指过程中的步骤可适用仪器或机器来完成，它们能在很少或没有外部的控制或人为的影响的条件下操作。自动化方法是指可自动化的方法中的步骤是利用仪器或机器来完成，它们能在很少或没有外部的控制或人为的影响的条件下操作。只有方法中的制备步骤可能必需手工操作时，例如必需填装储存容器和放入地点，才必须人工选择样品和本领域技术人员公知的其它步骤，如操作控制的计算机。例如，仪器或机器可以自动添加液体，混合样品或在特定的温度下进行温育步骤。典型的，这种机器或仪器是通过计算机来控制的机器人，计算机执行指定了单个步骤和命令的程序。本发明的一个优选的实施方案中，方法是高通量形式，也就是说，自动化方法是以高通量的形式进行的，就是意味着对于高通量的样品，在短时间内使方法和利用的机器或仪器最优化。
本发明优选的是将方法用于诊断，用于诊断分析，或生物分析，或用于筛选来自人体甚至动物体的组织或流体中一定的甲基化模式的存在。更进一步地，本发明的方法可用于提高核酸中甲基化位点检测的速度，精确性或敏感性。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及固相在反应的去氨基和/或去磺化步骤中的用途，其中在亚硫酸氢盐离子的存在下，核酸中一个胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基，被转化为尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，从而5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有显著的转化(“亚硫酸氢盐反应”)。在一个优选实施方案中，本发明涉及固相在反应的去氨基和/或去磺化步骤中的用途，其中在亚硫酸氢盐离子的存在下，核酸中一个胞嘧啶碱基，优选多个胞嘧啶碱基，被转化为一个尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，从而5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有显著的转化。更特定地，该方法意味着在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，固相用于与核酸结合，也就是说核酸在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中用于与固相结合。优选地，固相是含有硅石或玻璃的材料。更优选的是，固相是玻璃棉或玻璃膜。在最优选的实施方案中，固相是磁性玻璃颗粒。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种进行亚硫酸氢盐反应的试剂盒，其中包含含有亚硫酸氢盐离子的溶液和固相。在一个优选的实施方案中，固相是含有硅石或玻璃的材料。在更优选的实施方案中，固相是玻璃棉或玻璃膜。在发明最优选的实施方案中，固相是磁性玻璃颗粒。在发明的另一个实施方案中，提供了各部分的试剂盒，其含有一个本发明的含有磁性玻璃颗粒或悬浮液的储存容器。本领域公知这种试剂盒还含塑料器皿，可使用在亚硫酸氢盐方法中，例如96或384孔形式的微量滴定板或例如由Eppendorf，Hamburg，Germany制造的反应管。试剂盒可进一步含有洗涤溶液，适用于固相，特别是玻璃棉或膜或磁性玻璃颗粒的洗涤步骤。洗涤溶液经常是以母液形式提供，在使用前要稀释。试剂盒可以进一步含有洗脱液，亦即溶液或缓冲液(例如TE.10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)或者纯水，用以洗脱与固相结合的DNA或RNA。此外，其它的试剂可被使用，包括适用于本发明的缓冲液。优选地，本发明的试剂盒用于以下反应，其中在亚硫酸氢盐离子的存在下，核酸中的一个胞嘧啶碱基优选多个胞嘧啶碱基被转化为一个尿嘧啶碱基，优选多个尿嘧啶碱基，由此5-甲基-胞嘧啶碱基优选没有被显著地转化。
下面的实施例、参考文献和附图被提供来有助于本发明的理解，其实际的保护范围被描述在所附的权利要求书中。可以理解，不违背本发明精神的条件下可以对所述方法进行改变。
具体实施方式
1.1实施例
1.实施例1：对亚硫酸氢盐处理的DNA特异的LC-PCR的确定
1.1概要
事实上亚硫酸氢盐反应以及非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶可以通过聚合酶链式反应来证明，利用对核酸序列区域有特异的引物，其中非甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，也就是说引物上的碱基腺嘌呤与非甲基化的胞嘧啶的亚硫酸氢盐反应产物尿嘧啶相对。在转化不完全的情况下，引物就不能与这个区域杂交，因为胞嘧啶不能与引物上的腺嘌呤匹配。这样就不能得到PCR产物。
US 6,174,670公开了一种利用LightCycler设备(Roche，Mannheim，Germany)进行快速聚合酶链式反应的改进的方法。在该方法中，以扩增依赖性方式使两个标记的探针紧密邻近，这样两个标记可以产生荧光能量转移(FRET)。由此，扩增的量就与一定波长的放射光强度相关。因而特异性PCR方法可用来分析非甲基化的胞嘧啶是否达到完全的转化，例如利用合适的探针和引物分析谷胱甘肽-S-转移酶π基因的启动子区(参见例如该基因全长的SEQ ID NO：1以及启动子，US 5,552,277，Genbank登记号M24485和Morrow等(1989)Gene 75，3-11)。但是本领域的熟练技术人员知道用于评价的其它方法同样可以被采用。通过除以起始的荧光测量值也就是说在反应循环早期，当循环间的荧光测量值相对恒定期间得到的背景荧光而对荧光测量值标准化。起始荧光测量值选择的循环数与所有相应的反应是一样的，这样所有测量值代表相对于同一反应循环的增加。在聚合酶链式反应扩增早期的循环中，目标分子的数目由几何等式Ni＝N0x(1+E)i描述，其中N0＝反应开始的目标分子的数目，Ni＝在第I个循环完成后目标分子的数目，E＝扩增的效率(0＝＜E＝＜1)。在扩增的几何增长期中，到达特定阈值所需的循环数(GT值或交叉点)是与(1+E)的对数成反比的。因此，GT值代表反应效率的测量值，它提供反应之间的比较。GT值降低，意味着在更少的循环中反应达到了阈值，显示了反应效率的增高。当通过测量反应荧光的增加来监控扩增产物增加时，这里GT定义为进行的扩增循环数，直到荧光超出了一个任意的荧光水平(AFL)。AEL的选择接近荧光水平的基线，但是超出被测量的荧光的随机波动的范围，因此，在扩增的几何增长期中的反应动力学被测量。在后面的循环中，扩增产物的聚积抑制反应，而且最后导致反应平台期。所有的反应选择1.5的AFL。因为PCR扩增由不连续的循环组成，而且荧光测量每个循环进行一次，在单个周期中，被测量的荧光代表性地从低于AFL增长到高于AFL。为了改进测量精度，通过在循环间插入荧光测量来计算达到AFL随机的“精确的”循环数，这里是指如GT值或交叉点。
1.2基本的方法
下面的实验证明了在LightCycler仪器上描述过的PCR可被用作评价亚硫酸氢盐处理DNA的工具。其显示设计的引物/探针组合仅用亚硫酸氢盐反应后的DNA才给出阳性结果。亚硫酸氢盐处理过的DNA(在这个例子中亚硫酸氢盐DNA依据实施例2描述的方案来处理)和未经处理的DNA利用同样的模板浓度平行扩增(每次PCR20ng和1ng)。
1.3在LightCycler仪器上进行的PCR分析
1.3.1主混合物成分
LC快速起始DNA主杂交探针1×，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供体探针250nM，受体探针250nM，模板10μl，PCR总体积20μl。
1.3.2PCR-条件
变性10分钟/95℃
55个循环95℃/10秒
        65℃/10秒-信号获得
        72℃/10秒Ramp时间20℃/秒
1.4结果
  MDAN/PCR   亚硫酸氢盐处理 CT-值或交叉点
  20ng   是   30.55
  29.72
  29.95
  30.06
  1ng   是   34.7
  35.8
  34.07
  33.86
  20ng   否   无增长曲线
  无增长曲线
  无增长曲线
  无增长曲线
  1ng   否   无增长曲线
  无增长曲线
  无增长曲线
  无增长曲线
该结果表明只有亚硫酸氢盐处理过的DNA才有交叉点。因此PCR适用于评价亚硫酸氢盐方法。如果保证引物/探针组合在亚硫酸盐处理以前不与DNA反应，对于本领域的技术人员而言，任意的PCR都可被用作评价手段。
2.实施例2：使用磁性玻璃颗粒(MGPs)的亚硫酸氢盐反应
2.1.1DNA的变性
100μl的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals Corporation，Norcross，GA，USA提供；Cat S 7821)稀释液(30ng和6ng/在1000ng hDNA背景中掺入的测定Roche Cat.1691112；每浓度10个重复)，并且混入12μl 2M NaOH，37℃温育15分钟。
2.1.2DNA的去氨基
112μl的变性DNA与200μl亚硫酸氢盐试剂(2.5M亚硫酸氢钠，125mM氢醌，pH5.0)混合，并且50℃温育16小时。
2.2利用MGPs的程序
312μl的去氨基的DNA与600μl的结合缓冲液(MagNAPure DNA分离试剂盒I，Roche Cat.Nr.3 003 990)和75μl磁性玻璃颗粒溶液(MagNAPure DNA分离试剂盒I)混合，并在连续搅拌中室温温育15分钟。随后，用1ml 70％的乙醇洗涤磁性玻璃材料3次。在磁性分离器(Roche Cat.1641794)中进行无结合的分离。其后将250μl 90％EtOH/20mM NaOH加到与MGPs结合的DNA中进行去磺化作用。在混合中，混合物在室温下温育10分钟。接着用90％的乙醇洗涤MGPs两次。为了除去MGPs中残余的乙醇，用热电搅拌器将MGPs敞口加热到60℃15分钟。然后用50μl 10mM Tris/0.1mM EDTA Ph7.5洗脱DNA(60℃15分钟)。10μl洗脱的DNA用于后续的PCR分析。
2.3利用Intergen试剂盒进行亚硫酸盐处理
30ng和6ng的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals公司Norcross，GA，USA；Cat.S7821提供)依据Intergen CpGenome DNA修饰试剂盒(Intergen，由Serologicals公司，Norcross，GA，USA；Cat.S7820提供)的包装插页中描述的方法来处理。10μl的洗脱DNA用于后续的PCR分析。
2.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特异性PCR测定亚硫酸氢盐处理的DNA
2.4.1主混合物的组成
LightCycler快速起始DNA主杂交探针1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供体探针250nM，受体探针250nM，模板10μl，PCR总体积20μl。
2.4.2PCR-条件
变性10分钟/95℃
55个循环95℃/10秒
65℃/10秒—信号获得
72℃/10秒Ramp时间20℃/秒
来自MGP亚硫酸氢盐处理的和Intergen亚硫酸氢盐处理的样品在LightCycler仪器上同样的平行操作。
2.4.3结果
    每个甲基化的DNA     使用的亚硫酸氢盐方法
  重复   亚硫酸氢盐   PCR   Intergen   MGP方法
      CT-值或交叉点
  1   30ng   6ng   29.90   30.46
  2   30.07   29.86
  3   30.07   30.44
  4   30.14   30.35
  5   30.22   30.24
  6   30.26   30.46
  7   30.31   30.50
  8   30.19   30.54
  9   30.03   30.17
  10   29.85   30.69
  1   6ng   1.2ng   32.49   32.14
  2   32.67   32.60
  3   32.29   32.83
  4   32.87   32.53
  5   32.15   32.90
  6   32.23   32.77
  7   32.59   32.73
  8   32.91   33.09
  9   32.46   32.88
  10   33.17   32.83
在实时PCR中计算的CT-值或交叉点对使用两种亚硫酸氢盐方法几乎是一样的，亦即方法的效果是一样的。
3实施例3：利用MGPs的自动亚硫酸氢盐反应
3.1亚硫酸氢盐反应的进行
3.1.1DNA的变性
20μl的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals公司，Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821)稀释液(50ng/测定)，4μl的聚(dA)溶液(浓度250ng/μl)与2.6μl 2M NaOH混合并37℃温育10分钟。
3.1.2DNA去氨基
26μl的变性DNA与220μl亚硫酸氢盐试剂(2.5M亚硫酸氢钠，125mM氢醌，pH5.0)混合并50℃温育4小时。
3.1.3利用MagnaPure LC-仪器的自动化过程
250μl的去氨基DNA与600μl结合缓冲液(MagNAPure DNA分离试剂盒I，Roche，Mannheim，Germany)和75μl磁性玻璃颗粒混合，并在不断搅拌中室温温育15分钟。随后用1ml 70％乙醇洗涤磁性玻璃颗粒3次。然后加入250μl90％的EtOH/20mM NaOH到与MGPs结合的DNA中进行去磺化；在混合中室温温育混合物10分钟。接着用90％的乙醇洗涤MGPs两次并用50μl 10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5洗脱(7分钟/80℃)。
3.1.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特异性PCR测定亚硫酸氢盐处理的DNA
3.1.4.1主混合物的组成
LightCycler快速起始DNA主杂交探针1×，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供体探针250nM，受体探针250nM，模板5μl，PCR总体积20μl。
3.1.4.2PCR条件
变性10分钟/95℃
55个循环95℃/10秒
        65℃/10秒—信号获得
        72℃/10秒Ramp时间20℃/秒
3.1.4.3结果
 模板   ngDNA   ng DNA
  每亚硫酸氢盐分析   每PCR   交叉点
 通用甲基化DNA   100   10   33.97
  36.66
 通用甲基化DNA   50   5   35.66
  35.82
  37.67
  38.37
 通用甲基化DNA   10   1   37.82
  39.89
  38.76
  39.85
结果显示每个使用浓度的交叉点。这意味着自动化亚硫酸氢盐处理是成功的。
4.实施例4：利用玻璃棉进行的亚硫酸氢盐反应
4.1DNA的变性
100μl甲基化DNA(Intergen，由Serological公司Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821)稀释液(30ng和6ng/测定，每个浓度10个重复)与12μl 2MNaOH混合，并在37℃温育15分钟。
4.2DNA的去氨基
112μl变性的DNA与200μl亚硫酸氢盐试剂(2.5M亚硫酸氢钠，125mM对氢醌，pH5.0)在连续混合中温育16小时/50℃。
4.3利用高纯PCR模板制备试剂盒(Roche Cat.1796828)的去氨基DNA的过程
●312μl去氨基DNA与试剂盒中的200μl结合缓冲液，100μl异丙醇混合，并用移液管移到含玻璃棉的柱上。然后在Eppendorf平顶离心管中离心柱(1分钟/8000rpm)。
●随后用500μl的80％乙醇洗涤柱3次(离心10秒/12000rpm)
●将250μl试剂(38％乙醇/100mM NaCl/200mM NaOH)加到柱中以去磺化。室温温育5分钟后离心1分钟/800rpm。
●然后用500μl 80％乙醇洗涤柱2次(离心10秒/12000rpm)
●最后结合DNA通过加入50μl预热的(70℃)洗脱缓冲液(10mMTris/0.1mM EDTA pH7.5)洗脱，并离心1分钟/800rpm。
4.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特异性PCR测定亚硫酸氢盐处理的DNA
4.4.1主混合物组成
LightCycler快速起始DNA主杂交探针1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供体探针250nM，受体探针250nM，模板10μl，PCR总体积20μl。
4.4.2PCR条件
变性10分钟/95℃
55个循环95℃/10秒
        65℃/10秒—信号获得
        72℃/10秒Ramp时间20℃/秒
4.4.3结果
  每甲基化的DNA   CT-值或交叉点       每甲基化的DNA   CT-值或交叉点
  亚硫酸氢盐分析   PCR   亚硫酸氢盐分析   PCR
  30ng   6ng   32.27   6ng   1.2ng   34.28
  32.01   35.70
  31.89   35.52
  33.23   36.23
  32.18   35.05
  32.63   35.60
  32.65   34.75
  32.26   34.86
  32.00   34.80
  31.84   34.93
结果显示每个使用浓度的交叉点。这意味着利用玻璃棉的亚硫酸氢盐反应是成功的。
5.实施例5：在玻璃棉固相上进行的亚硫酸氢盐反应
5.1DNA与玻璃棉的结合
100μl DNA(1μl hDNA(Roche)和100ng的甲基化DNA(Intergen，由Serological公司Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821的混合物)与200μl结合缓冲液(高纯PCR模板制备试剂盒，Roche Cat.1796828)和100μl的异丙醇混合。混合物用移液管加到试剂盒的柱上。然后在平顶Eppendorf离心管中离心柱(1分钟/8000rpm)。用试剂盒中的缓冲液洗涤玻璃棉2次(500μl每洗涤步骤)。
5.2与玻璃棉结合的DNA的变性
用移液管吸取200μl的38％的EtOH/100mM NaOH/200mM NaCl加到玻璃棉上，并在室温下温育10分钟变性。然后用试剂盒中的洗涤缓冲液500μl洗涤玻璃棉一次。
5.3与玻璃棉结合的DNA的去氨基
200μl的去氨基溶液(6.25M脲/2M亚硫酸氢钠/pH5.0)用移液管加到含DNA的玻璃棉上，随后50℃水浴中温育16小时。
然后去除去氨基试剂，并用试剂盒中的洗涤缓冲液洗涤玻璃棉2次，每次500μl。
5.4与玻璃棉结合的去氨基DNA的去磺化
250μl试剂(90％乙醇/20mM NaOH)加到柱上以去磺化。室温温育15分钟后，柱离心1分钟/8000rpm。随后用500μl 80％乙醇洗涤柱两次(离心10秒/12000rpm)。
5.5洗脱DNA
最后通过加入50μl预热(70℃)的洗脱缓冲液(10mM Tris/0.1mM EDTAPh7.5)洗脱被结合的DNA，并离心1分钟/8000rpm。
5.6利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特异性PCR测定亚硫酸氢盐处理的DNA
LightCycler快速起始DNA主杂交探针1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供体探针250nM，受体探针250nM，模板10μl，PCR总体积20μl。
5.6.2PCR条件
变性10分钟/95℃
55个循环95℃/10秒
        65℃/10秒—信号获得
        72℃/10秒Ramp时间20℃/秒
5.6.3结果
  样品号   甲基化DNA每PCR   交叉点
  1   20ng   34.90
  2   20ng   35.27
  3   20ng   36.09
  4   20ng   36.80
每个反应中测定增长曲线并计算交叉点。结果表明在玻璃棉固相上进行去氨基和去磺化是可行的。
参考文献
Abramson，R.D.and Myers，T.W.，Curr Opin Biotechnol 4(1993)41-7
Alderton，R.P.，et al.，Anal Biochem 201(1992)166-9
Ausubel，F.，et al.，in″Current protocols in molecular biology″(1994)，Eds.F.Ausubel，R.Brent and K.R.E.，Wiley & Sons Verlag，New York
Barany，F.，PCR Methods Appl 1(1991)5-16
Barany，F.，Proc Natl Acad Sci USA 88(1991)189-93
Benyajati，C.，et al.，Nucleic Acids Res 8(1980)5649-67
Braunauer，in″The Adsorption of Gases and Vapors″(1943)，Princeton University PressClark，S.J.，et al.，Nucleic Acids Res 22(1994)2990-7
DE 3724442
DE-A 37 34 442
EP 0 200 362
EP 0 201 184
EP 0 389 063
EP 0 439 182
Feil，R.，et al.，Nucleic Acids Res 22(1994)695-6
Frommer，M.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 89(1992)1827-31
GB 91/00212
Grigg，G.and Clark，S.，Bioessays 16(1994)431-6
Grigg，G.W.，DNA Seq 6(1996)189-98
Grunau，C.，et al.，Nucleic Acids Res 29(2001)E65-5
Guatelli，J.C.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 87(1990)1874-8
Jakobi，R.，et al.，Anal Biochem 175(1988)196-201
Komiyama，M.and Oshima，S.，Tetrahedron Letters 35(1994)8185-8188
Kwoh，D.Y.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 86(1989)1173-7
Lottspeich and Zorbas，in″Bioaralytik″(1998)，Eds.L.a.Zorbas，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，Berlin，Germany
Marko，M.A.，et al.，Anal Biochem 121(1982)382-7
Morrow，C.S.，et al.，Gene 75(1989)，3-11
Oakeley，E.J.，Pharmacol Ther 84(1999)389-400
Olek，A.，et al.，Nucleic Acids Res 24(1996)5064-6
Paulin，R.，et al.，Nucleic Acids Res 26(1998)5009-10
Raizis，A.M.，et al.，Anal Biochem 226(1995)161-6
Sambrook，J.，et al.，in″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(l989)，Eds.J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY
Spray Drying Handbook(1991)，John Wiley & Sons，New York
US 4,683,202
US 5,130,238
US 5,137,806
US 5,210,015
US 5,234,809
US 5,487,972
US 5,552,277
US 5,595,890
US 5,639,611
US 5,786,146
US 5,804,375
US 6,174,670
US 6,331,393
Vogelstein，B.and Gillespie，D.，Proc Natl Acad Sci USA 76(1979)615-9
Warnecke，P.M.，et al.，Methods 27(2002)101-7
Whelen，A.C.and Persing，D.H.，Annu Rev Microbiol 50(1996)349-73
WO 00/32762
WO 00/37291
WO 01/37291
WO 01/98528
WO 02/31186
WO 90/01069
WO 90/06045
WO 92/02638
WO 92/0880A
WO 96/41811
WO 99/16781
WO 99/40098
Wu，D.Y.and Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-9
                                  序列表
<110>霍夫曼—拉罗奈有限公司
<120>亚硫酸氢盐处理的改进方法
<130>21371
<140>
<141>
<150>02019097.1
<151>2002-08-29
<150>02028114.3
<151>2002-12-18
<160>1
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>4261
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_信号
<222>(1156)..(1162)
<223>转录调控基序；推定的
<220>
<221>GC_信号
<222>(1169)..(1174)
<220>
<221>GC_信号
<222>(1179)..(1184)
<220>
<221>TATA_信号
<222>(1194)..(1198)
<220>
<221>外显子
<222>(1225)..(1254)
<220>
<221>聚腺苷酸_信号
<222>(4041)..(4046)
<300>
<308>Genbank：M24485
<309>2000-03-04
<300>
<303>基因
<304>75
<305>1
<306>3-11
<307>1989
<308>Morrow等
<300>
<310>US5552277
<311>1994-07-19
<312>1996-09-03
<400>1
aacaagagat caatatctag aataaatgga gatctgcaaa tcaacagaaa gtaggcagca 60
aagccaaaga aaatagccta aggcacagcc actaaaagga acgtgatcat gtcctttgca 120
gggacatggg tggagctgga agccgttagc ctcagcaaac tcacacagga acagaaaacc 180
agcgagaccg catggtctca cttataagtg ggagctgaac aatgagaaca catggtcaca 240
tggcggcgat caacacacac tggtgcctgt tgagcggggt gctggggagg gagagtacca 300
ggaagaatag ctaagggata ctgggcttaa tacctgggtg atgggatgat ctgtacagca 360
aaccatcatg gcgcacacac ctatgtaaca aacctgcaca tcctgcacat gtaccccaga 420
acttcaaata aaagttggac ggccaggcgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt 480
gggaagccga ggcgtgcaga tcacctaagg tcaggagttc gagaccagcc cggccaacat 540
ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaatcagcca gatgtggcac gcacctataa 600
ttccacctac tcgggaggct gaagcagaat tgcttgaacc cgagaggcgg aggttgcagt 660
gagccgccga gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcca cagcgtgaga ctacgtcata 720
aaataaaata aaataacaca aaataaaata aaataaaata aaataaaata aaataataaa 780
ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaagcaat ttcctttcct ctaagcggcc 840
tccacccctc tcccctgccc tgtgaagcgg gtgtgcaagc tccgggatcg cagcggtctt 900
agggaatttc cccccgcgat gtcccggcgc gccagttcgc tgcgcacact tcgctgcggt 960
cctcttcctg ctgtctgttt actccctagg ccccgctggg gacctgggaa agagggaaag 1020
gcttccccgg ccagctgcgc ggcgactccg gggactccag ggcgcccctc tgcggccgac 1080
gcccggggtg cagcggccgc cggggctggg gccggcggga gtccgcggga ccctccagaa 1140
gagcggccgg cgccgtgact cagcactggg gcggagcggg gcgggaccac ccttataagg 1200
ctcggaggcc gcgaggcctt cgct gga gtt tcg ccg ccg cag tct  tcg cca   1251
cca gtgagtacgc gcggcccgct ccccggggat ggggctcaga gctcccagca        1304
tggggccaac ccgcagcatc aggcccgggc tcccggcagg gctcctcgcc cacctcgaga 1364
cccgggacgg gggcctaggg gacccaggac gtccccagtg ccgttagcgg ctttcagggg 1424
gcccggagcg cctcggggag ggatgggacc ccgggggcgg ggaggggggg caggctgcgc 1484
tcaccgcgcc ttggcatcct cccccgggct ccagcaaact tttctttgtt cgctgcagtg 1544
ccgccctaca ccgtggtcta tttcccagtt cgaggtagga gcatgtgtct ggcagggaag 1604
ggaggcaggg gctggggctg cagcccacag cccctcgccc acccggagag atccgaaccc 1664
ccttatccct ccgtcgtgtg gcttttaccc cgggcctcct tcctgttccc cgcctctccc 1724
gccatgcctg ctccccgccc cagtgttgtg tgaaatcttc ggaggaacct gtttacctgt 1784
tccctccctg cactcctgac ccctccccgg gttgctgcga ggcggagtcg gcccggtccc 1844
cacatctcgt acttctccct ccccgcaggc cgctgcgcgg ccctgcgcat gctgctggca 1904
gatcagggcc agagctggaa ggaggaggtg gtgaccgtgg agacgtggca ggagggctca 1964
ctcaaagcct cctgcgtaag tgaccatgcc cgggcaaggg gagggggtgc tgggccttag 2024
ggggctgtga ctaggatcgg gggacgccca agctcagtgc ccctccctga gccatgcctc 2084
ccccaacagc tatacgggca gctccccaag ttccaggacg gagacctcac cctgtaccag 2144
tccaatacca tcctgcgtca cctgggccgc acccttggtg agtcttgaac ctccaagtcc 2204
agggcaggca tgggcaagcc tctgcccccg gagccctttt gtttaaatca gctgccccgc 2264
agccctctgg agtggaggaa actgagaccc actgaggtta cgtagtttgc ccaaggtcaa 2324
gcctgggtgc ctgcaatcct tgccctgtgc caggctgcct cccaggtgtc aggtgagctc 2384
tgagcacctg ctgtgtggca gtctctcatc cttccacgca catcctcttc ccctcctccc 2444
aggctggggc tcacagacag ccccctggtt ggcccatccc cagtgactgt gtgttgatca 2504
ggcgcccagt cacgcggcct gctcccctcc acccaacccc agggctctat gggaaggacc 2564
agcaggaggc agccctggtg gacatggtga atgacggcgt ggaggacctc cgctgcaaat 2624
acatctccct catctacacc aactatgtga gcatctgcac cagggttggg cactgggggc 2684
tgaacaaaga aaggggcttc ttgtgccctc acccccctta cccctcaggt ggcttgggct 2744
gaccccttct tgggtcaggg tgcaggggct gggtcagctc tgggccaggg gcccaggggc 2804
ctgggacaag acacaacctg cacccttatt gcctgggaca tcaaccagcc aagtaacggg 2864
tcatgggggc gagtgcaagg acagagacct ccagcaactg gtggtttctg atctcctggg 2924
gtggcgaggg cttcctggag tagccagagg tggaggagga tttgtcgcca gtttctggat 2984
ggaggtgctg gcacttttag ctgaggaaaa tatgcagaca cagagcacat ttggggacct 3044
gggaccagtt cagcagaggc agcgtgtgtg cgcgtgcgtg tgcgtgtgtg tgcgtgtgtg 3104
tgtgtacgct tgcatttgtg tcgggtgggt aaggagatag agatgggcgg gcagtaggcc 3164
caggtcccga aggccttgaa cccactggtt tggagtctcc taagggcaat gggggccatt 3224
gagaagtctg aacagggctg tgtctgaatg tgaggtctag aaggatcctc cagagaagcc 3284
agctctaaag cttttgcaat catctggtga gagaacccag caaggatgga caggcagaat 3344
ggaatagaga tgagttggca gctgaagtgg acaggatttg gtactagcct ggttgtgggg 3404
agcaagcaga ggagaatctg ggactctggt gtctggcctg gggcagacgg gggtgtctca 3464
ggggctggga gggatgagag taggatgata catggtggtg tctggcagga ggcgggcaag 3524
gatgactatg tgaaggcact gcccgggcaa ctgaagcctt ttgagaccct gctgtcccag 3584
aaccagggag gcaagacctt cattgtggga gaccaggtga gcatctggcc ccatgctgtt 3644
ccttcctcgc caccctctgc ttccagatgg acacaggtgt gagccatttg tttagcaaag 3704
cagagcagac ctaggggatg ggcttaggcc ctctgccccc aattcctcca gcctgctccc 3764
gctggctgag tccctagccc ccctgccctg cagatctcct tcgctgacta caacctgctg 3824
gacttgctgc tgatccatga ggtcctagcc cctggctgcc tggatgcgtt ccccctgctc 3884
tcagcatatg tggggcgcct cagtgcccgg cccaagctca aggccttcct ggcctcccct 3944
gagtacgtga acctccccat caatggcaac gggaaacagt gagggttggg gggactctga 4004
gcgggaggca gagtttgcct tcctttctcc aggaccaata aaatttctaa gagagctact 4064
atgagcactg tgtttcctgg gacggggctt aggggttctc agcctcgagg tcggtgggag 4124
ggcagagcag aggactagaa aacagctcct ccagcacagt cagtggcttc ctggagccct 4184
cagcctggct gtgtttactg aacctcacaa actagaagag gaagaaaaaa aaagagagag 4244
agaaacaaag agaaata                                                4261

Claims (21)

1.一种将核酸中胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法，其特征在于核酸在去氨基和/或去磺化步骤中被与固相结合。
2.一种如权利要求1所述的将核酸中胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法，包含以下步骤：
a)将核酸与固相结合，
b)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育固相结合的核酸，从而使核酸去氨基，
c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸，
d)在碱性条件下，温育去氨基的固相结合的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化，
e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，和
f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
3.一种权利要求1所述的将核酸中胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法，包含步骤：
a)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育核酸使核酸去氨基，
b)将去氨基的核酸与固相结合，
c)可选择地洗涤去氨基的固相结合的核酸，
d)在碱性条件下，温育去氨基的固相结合的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化，
e)可选择地洗涤去氨基和去磺化的固相结合的核酸，和
f)可选择地将去氨基和去磺化的核酸从固相上洗脱下来。
4.一种如权利要求1所述的将核酸中胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法，包含步骤：
a)将核酸与固相结合，
b)在亚硫酸盐离子存在的条件下，温育固相结合的核酸，从而使核酸去氨基，
c)可选择地洗涤固相结合的核酸，
d)将去氨基的核酸从固相上洗脱下来，
e)在碱性条件下温育去氨基的核酸，从而使去氨基的核酸去磺化。
5.根据权利要求1到4的任意一项所述的方法，其特征在于固相是含有硅或者玻璃的材料。
6.根据权利要求1到4的任意一项所述的方法，其特征在于固相是玻璃棉或者玻璃膜。
7.根据权利要求1到4的任意一项所述的方法，其特征在于固相是磁性玻璃颗粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于磁性玻璃颗粒的平均直径为0.5μm到5μm。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于磁性玻璃颗粒含有直径为5到500nm的磁性物体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于磁性玻璃颗粒含有平均直径为23nm的磁性物体。
11.根据权利要求8到10的任意一项所述的方法，其特征在于磁性玻璃颗粒是用溶胶-凝胶方法制备的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的溶胶-凝胶方法包括以下步骤：
a)将磁性物体悬浮于溶胶中，
b)将溶胶水解从而用凝胶覆盖磁性物体，
c)在双喷嘴喷雾干燥器中将被凝胶覆盖的磁性物体喷雾干燥，
d)烧结喷雾干燥的粉末以便由覆盖磁性物体的凝胶形成玻璃。
13.固相在亚硫酸氢盐离子存在的条件下将核酸中的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的反应的去氨基和/或去磺化步骤中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中固相是含有硅或者玻璃的材料。
15.根据权利要求13或14的任意一项所述的用途，其中固相是玻璃棉或者玻璃膜。
16.根据权利要求13或14的任意一项所述的用途，其中固相是磁性玻璃颗粒。
17.一种用于进行亚硫酸氨盐反应的试剂盒，含有包含亚硫酸氢盐离子的溶液和固相。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中固相是含有硅或者玻璃的材料。
19.根据权利要求17到18的任意一项所述的试剂盒，其中固相是玻璃棉或者玻璃膜。
20.根据权利要求17到18的任意一项所述的试剂盒，其中固相是磁性玻璃颗粒。
21.权利要求17到18的任意一项所述的试剂盒在亚硫酸氢盐离子存在的条件下将核酸上的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的反应中的用途。
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10154317B4 (de) * 2001-10-26 2005-06-09 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in immobilisierten DNA Proben
AU2003236461B2 (en) 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
US7534873B2 (en) * 2003-08-29 2009-05-19 Applied Biosystems, Llc Method and materials for quaternary amine catalyzed bisulfite conversion of cytosine to uracil
US7368239B2 (en) * 2003-08-29 2008-05-06 Applera Corporation Method and materials for polyamine catalyzed bisulfite conversion of cytosine to uracil
US7371526B2 (en) * 2003-08-29 2008-05-13 Applera Corporation Method and materials for bisulfite conversion of cytosine to uracil
US7262013B2 (en) * 2003-08-29 2007-08-28 Applera Corporation Bisulfite method
CA2540310A1 (en) 2003-10-09 2005-04-28 Epigenomics Ag Improved bisulfite conversion of dna
US20080070240A2 (en) * 2004-04-08 2008-03-20 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Composition for deaminating dna and method of detecting methylated dna
EP1632578A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
JP2008515784A (ja) * 2004-09-21 2008-05-15 アプレラ コーポレイション メチル化ｄｎａ分析のための硫酸水素ナトリウムの改良代替物として硫黄求核剤を使用する方法
US7658288B2 (en) 2004-11-08 2010-02-09 Applied Biosystems, Llc Bisulfite conversion reagent
EP2803734B1 (en) 2005-04-01 2017-09-20 Epigenomics AG Improved bisulfite conversion of DNA
WO2007068437A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Roche Diagnostics Gmbh New method for bisulfite treatment
US7820385B2 (en) * 2006-03-22 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for retaining methylation pattern in globally amplified DNA
US20080213870A1 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Sean Wuxiong Cao Methods for obtaining modified DNA from a biological specimen
EP2240603A4 (en) * 2008-01-03 2011-07-20 Univ Johns Hopkins COMPOSITIONS AND METHOD FOR POLYNUCLEOTIDE EXTRACTION AND METHYLATION DETECTION
WO2010037001A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Immune Disease Institute, Inc. Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins
FR2940805B1 (fr) 2009-01-05 2015-10-16 Biomerieux Sa Procede d'amplification et/ou de detection d'acides nucleiques, kits et utilisations de ce procede
EP2737085B1 (en) 2011-07-29 2016-10-12 Cambridge Epigenetix Limited Methods for detection of nucleotide modification
ES2669512T3 (es) 2012-11-30 2018-05-28 Cambridge Epigenetix Limited Agente oxidante para nucleótidos modificados
ES2815684T3 (es) * 2015-06-10 2021-03-30 Biocartis N V Detección mejorada de ADN metilado
EP3839047A1 (en) * 2015-06-15 2021-06-23 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
CN110267744A (zh) 2016-12-12 2019-09-20 塞弗德公司 在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量
TWI834642B (zh) 2018-03-13 2024-03-11 美商格瑞爾有限責任公司 異常片段偵測及分類
CN108265050A (zh) * 2018-03-13 2018-07-10 普迈德（北京）科技有限公司 一种血浆直接亚硫酸氢盐转化的方法及其应用
CA3094717A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panels
CN113286881A (zh) 2018-09-27 2021-08-20 格里尔公司 甲基化标记和标靶甲基化探针板
DE102019118332B4 (de) 2019-07-07 2022-04-07 Ist Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur bisulfitmodifizierung von dna
AU2021213150A1 (en) 2020-01-30 2022-08-04 Prognomiq Inc Lung biomarkers and methods of use thereof
JP2024534992A (ja) 2021-09-13 2024-09-26 プログノミック インコーポレイテッド 生体分子の増強された検出および定量
CN114317761A (zh) * 2022-02-23 2022-04-12 厦门飞朔生物技术有限公司 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3724442A1 (de) 1987-07-23 1989-02-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
DE68926504T2 (de) 1988-07-20 1996-09-12 David Segev Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
DE68913555T2 (de) 1988-11-21 1994-07-07 Dynal As Sonden aus nukleinsäuren.
US5639611A (en) 1988-12-12 1997-06-17 City Of Hope Allele specific polymerase chain reaction
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5137806A (en) 1989-12-11 1992-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
AU669398B2 (en) 1992-11-13 1996-06-06 Becton Dickinson & Company Boron silicates aluminum silicates phosphosilicates and purification of DNA
US5503816A (en) 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
US5438127A (en) 1993-09-27 1995-08-01 Becton Dickinson And Company DNA purification by solid phase extraction using a PCl3 modified glass fiber membrane
US5552277A (en) 1994-07-19 1996-09-03 The Johns Hopkins University School Of Medicine Genetic diagnosis of prostate cancer
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
AU726501B2 (en) 1996-06-04 2000-11-09 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during PCR
JP3666604B2 (ja) * 1997-04-16 2005-06-29 アプレラ コーポレーション 核酸アーカイビング
GB9714716D0 (en) * 1997-07-11 1997-09-17 Brax Genomics Ltd Characterising nucleic acids
DE19743518A1 (de) 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
US6355792B1 (en) 1998-02-04 2002-03-12 Merck Patent Gesellschaft Method for isolating and purifying nucleic acids
DK1144620T3 (da) 1998-11-30 2004-01-05 Roche Diagnostics Gmbh Magnetiske partikler til rensning af nucleinsyrer
DE19856064C2 (de) 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6423536B1 (en) 1999-08-02 2002-07-23 Molecular Dynamics, Inc. Low volume chemical and biochemical reaction system
JP2003514383A (ja) * 1999-11-17 2003-04-15 ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 磁性ガラス粒子、それらの製造方法、及びそれらの使用
DE19958042A1 (de) 1999-12-03 2001-06-21 Invitek Gmbh Oberflächenmodifizierte Trägermaterialien zur Bindung biologischer Materialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE10029915B4 (de) 2000-06-19 2005-06-16 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen
DE10050942B4 (de) 2000-10-10 2005-11-17 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen
US20030152950A1 (en) 2001-06-27 2003-08-14 Garner Harold R. Identification of chemically modified polymers
EP1421201A4 (en) * 2001-07-31 2005-11-23 New York Inst Techn PROCESS FOR IMMOBILIZING MOLECULES AND A SOLID PHASE AND USES THEREOF
DE10154317B4 (de) 2001-10-26 2005-06-09 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in immobilisierten DNA Proben
AU2003236461B2 (en) 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
EP1394172A1 (en) 2002-08-29 2004-03-03 Boehringer Mannheim Gmbh Improved method for bisulfite treatment
WO2005054502A1 (en) * 2003-12-02 2005-06-16 Roche Diagnostics Gmbh Improved method for bisulfite treatment
WO2007068437A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Roche Diagnostics Gmbh New method for bisulfite treatment

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