CN114317761A - 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，尤其为一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，包括以下步骤：S1，对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物；S2，对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组；S3，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度，本发明可以有效解决目前采用的宫颈癌常规筛查技术着存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法。
背景技术
高危型人类乳头瘤病毒的持续性感染是宫颈癌的病因，但宫颈上皮的癌变过程还包括许多基因和表观基因的改变，DNA甲基化是最常见的表观遗传改变，常发生于肿瘤抑制基因的启动子区域，造成该基因的转录失活，从而促使肿瘤的发生，现有文献报道的宫颈癌中可检测到DNA甲基化，且可见于30％～80％的宫颈癌前期病变中，已有研究表明，检测宫颈脱落细胞中特定基因的甲基化可能作为潜在的分子标志物用于宫颈癌的早期检测。
目前采用的宫颈癌常规筛查技术着存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。
综上所述，本发明提供一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
S1，对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物；
S2，对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组；
S3，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。
作为本发明优选的方案，所述S1中提取处理的具体操作步骤为：
S11，将宫颈细胞样本送入离心机中进行离心处理，处理结束后移除上清液，得到样本沉淀物；
S12，将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，混合均匀后进行孵育，得到样本DNA，孵育的时间为45min-50min，所述孵育的温度为55℃-58℃。
作为本发明优选的方案，所述S1中重亚硫酸盐快速转化的具体操作步骤为：
S21，将NaHSO3和(NH4)2SO3·H2O溶于6.5ml(NH4)HSO3溶液中，加热至90℃至完全溶解，冷却至室温，检测溶液的pH应在5.4–5.5，得到转化液；
S22，将细胞DNA样本加入55ul转化液中，在85℃下处理15min，冷却至室温，得到转化产物。
作为本发明优选的方案，所述S2中酶切处理使用的是限制性内切酶反应液，且限制性内切酶反应液由限制性内切酶和限制性内切酶酶切缓冲液混合制成。
作为本发明优选的方案，所述PCR扩增引物组包括目标基因引物组、目标基因引物组的上游引物以及目标基因引物组的下游引物。
作为本发明优选的方案，所述S3的具体操作步骤为：
S31，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将PCR扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上；
S32，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M，第二荧光标记物的信号强度为N；
S33，计算出N/M的数值，即为宫颈细胞样品中基因甲基化程度。
作为本发明优选的方案，所述第一荧光标记物为FITC，第二荧光标记物为Cy5，第三标记物为生物素。
作为本发明优选的方案，所述S11中离心机的离心时间为2.5min-3min，离心转速为16000rpm-17000rpm。
作为本发明优选的方案，所述S12中宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为70:1:10。
作为本发明优选的方案，所述S21中NaHSO3与(NH4)2SO3·H2O的质量比为3比1，(NH4)HSO3的浓度为50％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中，通过对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物，再对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，将得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度，在检测过程中无需设计特异性探针或特异性引物，方法简便易行，所采用的技术简单易于实现，成本低，操作较为简单快捷，准确性较高，敏感性强的缺点，能够在临床上广泛使用，同时通过实时荧光定量PCR检测计算出基因的甲基化程度，使检测人员在一定程度上能够对基因的甲基化程度进行定量分析，进一步提高的检测的准确性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明，本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供一种技术方案：
一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
S1，对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物；
S2，对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组；
S3，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。
进一步的，所述S1中提取处理的具体操作步骤为：
S11，将宫颈细胞样本送入离心机中进行离心处理，处理结束后移除上清液，得到样本沉淀物；
S12，将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，混合均匀后进行孵育，得到样本DNA，孵育的时间为45min-50min，所述孵育的温度为55℃-58℃。
进一步的，所述S1中重亚硫酸盐快速转化的具体操作步骤为：
S21，将NaHSO3和(NH4)2SO3·H2O溶于6.5ml(NH4)HSO3溶液中，加热至90℃至完全溶解，冷却至室温，检测溶液的pH应在5.4–5.5，得到转化液；
S22，将细胞DNA样本加入55ul转化液中，在85℃下处理15min，冷却至室温，得到转化产物。
进一步的，所述S2中酶切处理使用的是限制性内切酶反应液，且限制性内切酶反应液由限制性内切酶和限制性内切酶酶切缓冲液混合制成。
进一步的，所述PCR扩增引物组包括目标基因引物组、目标基因引物组的上游引物以及目标基因引物组的下游引物。
进一步的，所述S3的具体操作步骤为：
S31，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将PCR扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上；
S32，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M，第二荧光标记物的信号强度为N；
S33，计算出N/M的数值，即为宫颈细胞样品中基因甲基化程度。
进一步的，所述第一荧光标记物为FITC，第二荧光标记物为Cy5，第三标记物为生物素。
进一步的，所述S11中离心机的离心时间为2.5min-3min，离心转速为16000rpm-17000rpm。
进一步的，所述S12中宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为70:1:10。
进一步的，所述S21中NaHSO3与(NH4)2SO3·H2O的质量比为3比1，(NH4)HSO3的浓度为50％。
具体实施案例：
先将宫颈细胞样本送入离心机中进行离心处理，离心机的离心时间为3min，离心转速为17000rpm，处理结束后移除上清液，得到样本沉淀物，将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为70:1:10，混合均匀后进行孵育，得到样本DNA，孵育的时间为50min，孵育的温度为58℃，接着将NaHSO3和(NH4)2SO3·H2O溶于6.5ml(NH4)HSO3溶液中，NaHSO3与(NH4)2SO3·H2O的质量比为3比1，(NH4)HSO3的浓度为50％，加热至90℃至完全溶解，冷却至室温，检测溶液的pH应在5.4，得到转化液，将细胞DNA样本加入55ul转化液中，在85℃下处理15min，冷却至室温，得到转化产物；
对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，酶切处理使用的是限制性内切酶反应液，且限制性内切酶反应液由限制性内切酶和限制性内切酶酶切缓冲液混合制成，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组，PCR扩增引物组包括目标基因引物组、目标基因引物组的上游引物以及目标基因引物组的下游引物，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将PCR扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，第一荧光标记物为FITC，第二荧光标记物为Cy5，第三标记物为生物素，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M，第二荧光标记物的信号强度为N，计算出N/M的数值，即为宫颈细胞样品中基因甲基化程度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，对宫颈细胞样本进行提取处理得到细胞DNA样本，接着对细胞DNA样本进行重亚硫酸盐快速转化，得到转化产物；
S2，对转化产物进行酶切处理，得到酶切产物，再对得到的酶切产物进行PCR扩增，得到PCR扩增引物组；
S3，对PCR扩增引物组进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。
2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S1中提取处理的具体操作步骤为：
S11，将宫颈细胞样本送入离心机中进行离心处理，处理结束后移除上清液，得到样本沉淀物；
S12，将样本沉淀物、蛋白酶K和裂解液ABL混合，混合均匀后进行孵育，得到样本DNA，孵育的时间为45min-50min，所述孵育的温度为55℃-58℃。
3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S1中重亚硫酸盐快速转化的具体操作步骤为：
S21，将NaHSO3和(NH4)2SO3·H2O溶于6.5ml(NH4)HSO3溶液中，加热至90℃至完全溶解，冷却至室温，检测溶液的pH应在5.4–5.5，得到转化液；
S22，将细胞DNA样本加入55ul转化液中，在85℃下处理15min，冷却至室温，得到转化产物。
4.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S2中酶切处理使用的是限制性内切酶反应液，且限制性内切酶反应液由限制性内切酶和限制性内切酶酶切缓冲液混合制成。
5.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述PCR扩增引物组包括目标基因引物组、目标基因引物组的上游引物以及目标基因引物组的下游引物。
6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S3的具体操作步骤为：
S31，以dTTP、dGTP、dATP以及第三标记物作为底物，将PCR扩增产物组加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上；
S32，使用第一荧光标记物标记目标基因引物组的上游引物，用第二荧光标记物标记目标基因引物组的下游引物，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M，第二荧光标记物的信号强度为N；
S33，计算出N/M的数值，即为宫颈细胞样品中基因甲基化程度。
7.根据权利要求5所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述第一荧光标记物为FITC，第二荧光标记物为Cy5，第三标记物为生物素。
8.根据权利要求2所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S11中离心机的离心时间为2.5min-3min，离心转速为16000rpm-17000rpm。
9.根据权利要求2所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S12中宫颈脱落细胞样本、蛋白酶K和裂解液ABL的体积比为70:1:10。
10.根据权利要求3所述的一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述S21中NaHSO3与(NH4)2SO3·H2O的质量比为3比1，(NH4)HSO3的浓度为50％。
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|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1495192A (zh) * | 2002-08-29 | 2004-05-12 | - | 亚硫酸氢盐处理的改进方法 |
| US20060194208A1 (en) * | 2003-08-15 | 2006-08-31 | Reimo Tetzner | Method for the detection of cytosine methylations in dna with the aid of scorpion |
| CN102321745A (zh) * | 2010-10-14 | 2012-01-18 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种定量检测dna特定位点甲基化程度的方法及试剂盒 |
| US20160168643A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Exact Sciences Corporation | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN111793674A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-20 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法 |
-
2022
- 2022-02-23 CN CN202210167520.6A patent/CN114317761A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1495192A (zh) * | 2002-08-29 | 2004-05-12 | - | 亚硫酸氢盐处理的改进方法 |
| US20060194208A1 (en) * | 2003-08-15 | 2006-08-31 | Reimo Tetzner | Method for the detection of cytosine methylations in dna with the aid of scorpion |
| CN102321745A (zh) * | 2010-10-14 | 2012-01-18 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种定量检测dna特定位点甲基化程度的方法及试剂盒 |
| US20160168643A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Exact Sciences Corporation | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN111793674A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-20 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DUAN 等: ""Cationic Conjugated Polymers for Optical Detection of DNA Methylation, Lesions, and Single Nucleotide Polymorphisms"", 《ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH》, vol. 43, no. 2, pages 260 - 270 * |
| LIU 等: ""Methylation-sensitive enrichment of minor DNA alleles using a double-strand DNA-specific nuclease"", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 45, no. 6, pages 39 * |
| 王玉倩 等: ""实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用"", 《生物学通报》, vol. 51, no. 2, pages 1 - 6 * |
| 陈贺 等: ""H19基因甲基化在Y染色体异常男性不育患者中的表达"", 《临床检验杂志》, vol. 34, no. 11, pages 861 - 864 * |
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