WO2015177933A1 - 磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス - Google Patents

磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for operating magnetic particles for selectively fixing a target substance in a sample to the surface of the magnetic particles.
  • the present invention also relates to a magnetic particle manipulation device used in the method.
  • Magnetic particles with a chemical affinity for the target substance and a molecular recognition function on the surface of the magnetic substance with a particle size of about 0.5 to 10 ⁇ m to extract and purify the target substance in the sample A method of using has been developed and put into practical use. In this method, after fixing the target substance on the surface of the magnetic particles, the magnetic particles are separated and recovered from the liquid phase by a magnetic field operation. If necessary, the recovered magnetic particles are separated into a liquid phase such as a cleaning liquid. And the step of separating and collecting the magnetic particles from the liquid phase is repeated. Thereafter, the magnetic particles are dispersed in the eluate, whereby the target substance fixed to the magnetic particles is released into the eluate, and the target substance in the eluate is recovered. By using magnetic particles, the target substance can be recovered with a magnet, and a centrifugal operation is not required, which is advantageous for automation of chemical extraction and purification.
  • Magnetic particles that can selectively fix the target substance are commercially available as part of the separation / purification kit.
  • the kit contains multiple reagents in separate containers, and the user dispenses and dispenses the reagent with a pipette when using it.
  • Devices for automating these pipette operations and magnetic field operations are also commercially available (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a tubular device in which an aqueous liquid layer such as a dissolving / fixing solution, a washing solution, and an eluent and a gel-like medium layer are alternately layered is used.
  • Patent Document 2 A method for separating and purifying a target substance by moving it in the longitudinal direction has been proposed.
  • separation / purification using magnetic particles first dissolves biological samples and removes nucleic acids, etc. on the surface of magnetic particles.
  • the target substance is fixed.
  • this lysis / binding step it is necessary to selectively fix the target substance in the liquid sample to the surface of the magnetic particles.
  • the biological sample contains a wide variety of contaminants in addition to the target substance. When these contaminants adhere to the surface of the magnetic particles, the fixation of the target substance to the magnetic particles is hindered. The recovery rate of the target substance is reduced. For example, in nucleic acid extraction from blood, contaminating proteins derived from cells adhere to the surface of magnetic particles and aggregate, which may hinder the fixation of nucleic acids to the magnetic particles.
  • a proteinase such as Proteinase K is added to the sample, and the enzyme treatment is performed at 50 ° C. to 70 ° C. to bind to the nucleic acid. Protein is degraded and removed. Thereafter, an alcohol such as ethanol is added to increase the hydrophobicity of the liquid sample, and the magnetic particles are added to selectively fix the nucleic acid on the surface of the magnetic particles.
  • the enzyme, magnetic particles and alcohol are stored in separate containers, Alternatively, it is necessary to isolate the sample by a partition wall provided in the container and sequentially add it to the sample when performing the separation / purification operation. Therefore, there is a problem that the melting / fixing operation is complicated, or complicated processing for providing a partition or the like in the device is required, resulting in an increase in the manufacturing cost of the device.
  • the present invention is a method for immobilizing a target substance on the surface of a magnetic particle with high efficiency by a simple operation without performing an enzyme treatment in the separation and purification of the target substance using magnetic particles.
  • An object of the present invention is to provide a method for operating magnetic particles.
  • the present inventors by performing a magnetic field operation in the presence of a magnetic solid having a particle size larger than that of the magnetic particles, the magnetic particles are dispersed in the liquid along with the movement of the magnetic solids.
  • the inventors have found that the target substance can be efficiently fixed on the surface of the magnetic particles, and have reached the present invention.
  • the present invention relates to a method for manipulating magnetic particles for fixing a target substance in a liquid sample to the surface of the magnetic particles, and a magnetic particle manipulating device used therefor.
  • the magnetic particles particles capable of selectively fixing a target substance are used.
  • the target substance that can selectively fix the magnetic particles include biological substances such as nucleic acids, proteins, sugars, lipids, antibodies, receptors, antigens, ligands, and cells.
  • a magnetic sample and a magnetic solid are magnetically operated by a magnetic field operation from the outside of the container in a state where a liquid sample, magnetic particles, and a magnetic solid having a particle size larger than the magnetic particles coexist in the container.
  • Body particles are moved in the liquid sample.
  • the magnetic particles together with the magnetic solid can be reciprocated in the liquid sample.
  • the target substance can be selectively fixed on the surface of the magnetic particles.
  • the liquid sample includes a component capable of lysing cells such as a chaotropic substance and a surfactant.
  • the magnetic solid those having a particle size of 50 ⁇ m or more are preferably used.
  • the particle size of the magnetic solid is preferably 10 times or more than the particle size of the magnetic particles.
  • the magnetic solid may have a coating layer on the surface for preventing corrosion in the liquid.
  • the magnetic particles having the target substance fixed are brought into contact with the eluate. Thereby, the target substance can be eluted in the eluate and the target substance can be recovered.
  • the magnetic particles capable of selectively fixing the target substance and the magnetic solid having a larger particle diameter than the magnetic particles coexist in the liquid sealed in the container.
  • the liquid enclosed in the container is a liquid capable of lysing cells.
  • magnetic particles are efficiently dispersed by performing a magnetic field operation in a liquid sample containing a target substance in a state where magnetic particles and magnetic solids coexist. . Therefore, even when the enzyme treatment with protease or the like is not performed, the target substance in the liquid sample can be efficiently fixed on the surface of the magnetic particles.
  • the present invention is applied to separation / purification of a target substance such as a nucleic acid, a high-purity target substance can be recovered in a high yield.
  • FIG. 1 is a process conceptual diagram for explaining a method of operating magnetic particles.
  • the present invention relates to a method for operating magnetic particles for fixing a target substance in a liquid sample to the surface of the magnetic particles.
  • the container 10 contains a liquid sample 31, magnetic particles 71, and a magnetic solid 60.
  • the liquid sample 31 contains a target substance to be fixed to the surface of the magnetic particles 71.
  • the magnetic particles 71 are particles that can fix the target substance on the surface thereof.
  • the magnetic solid 60 is a magnetic body having a larger particle size than the magnetic particles 71.
  • the container 10 is not particularly limited in its material and shape as long as it can move the magnetic solid particles and magnetic particles in the container by a magnetic field operation from the outside and can hold the liquid.
  • a tubular container such as a test tube or a cone-shaped container such as an eppendle tube can be used.
  • a straight tubular structure (capillary) having an inner diameter of about 1 mm to 2 mm and a length of about 50 mm to 200 mm, or a linear groove having a width of about 1 mm to 2 mm, a depth of about 0.5 mm to 1 mm, and a length of about 50 mm to 200 mm.
  • a structure or the like in which another flat plate material is bonded to the upper surface of the formed flat plate material can also be used.
  • the shape of the container is not limited to a tubular shape or a planar shape, and the particle moving path may have a structure having a cross such as a cross or a T-shape. If the size of the container is made as small as possible, it can be used as a microdevice for microfluidic manipulation or a chip for microfluidic manipulation.
  • the container after the sample is charged can be a closed system. If the container is a closed system, contamination from outside can be prevented. Therefore, it is particularly useful when an easily decomposed substance such as RNA is fixed to the magnetic particles for operation.
  • the container can be sealed using a method of heat-sealing the opening of the container or an appropriate sealing means.
  • a resin stopper or the like When it is necessary to take out the particles or aqueous liquid after the operation from the container, it is preferable to use a resin stopper or the like to seal the opening so as to be removable.
  • the material of the container 10 is not particularly limited as long as it does not shield the magnetic field from the outside.
  • Polyolefin such as polypropylene and polyethylene
  • fluorine-based resin such as tetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, etc.
  • the resin material is mentioned.
  • ceramic, glass, silicone, metal and the like can also be used.
  • coating with a fluorine-based resin or silicone may be performed.
  • a container having optical transparency is preferable. Used. Moreover, if the container is light-transmitting, it is preferable because the state of particle operation in the container can be visually confirmed. On the other hand, when it is necessary to shield liquid or magnetic particles from light, a container made of metal or the like that does not have light permeability is preferably used. A container having a light transmitting portion and a light shielding portion can also be used depending on the purpose of use.
  • the liquid sample 31 contains a target substance to be separated and purified.
  • the target substance include biological substances such as nucleic acids, proteins, sugars, lipids, antibodies, receptors, antigens, ligands and cells.
  • the liquid sample 31 contains impurities in addition to the target substance.
  • the liquid sample 31 contains a wide variety of contaminants such as proteins and sugars eluted from cells in addition to the target nucleic acid.
  • the liquid sample 31 is typically a mixture of a sample derived from a living body such as blood and a solution for extracting a target substance therefrom.
  • the solution for extracting the target substance include a cell lysate.
  • the cell lysate contains components capable of lysing cells such as chaotropic substances and surfactants.
  • the chaotropic salt include guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, potassium iodide, urea and the like.
  • a chaotropic salt is a powerful protein denaturing agent that dissolves cellular proteins and releases nucleic acids in the cell nucleus into the solution, and also has the effect of suppressing the action of nucleolytic enzymes.
  • the liquid sample 31 may contain various buffers, salts, and other various auxiliary agents, and organic solvents such as alcohol.
  • a target substance is extracted from a biological sample such as blood
  • contaminant components are decomposed by an enzymatic reaction.
  • a proteolytic enzyme such as protease K is generally used to decompose nucleoprotein bound to the nucleic acid.
  • the target substance is highly efficiently and selectively selected. It can be fixed on the surface of the magnetic particles. Therefore, it is preferable that no enzyme is added to the liquid sample 31 (however, an enzyme or the like originally contained in the biological sample may coexist).
  • the magnetic particles 71 used in the present invention are particles that can selectively fix a target substance in the liquid sample 31.
  • the method for immobilizing the target substance on the particle surface is not particularly limited, and various known immobilization mechanisms such as physical immobilization and chemical immobilization can be applied.
  • the target substance is immobilized on the surface or inside of the particle by various intermolecular forces such as van der Waals force, hydrogen bond, hydrophobic interaction, interionic interaction, and ⁇ - ⁇ stacking.
  • Target substances such as nucleic acids, proteins, sugars, lipids, antibodies, receptors, antigens, ligands and cells may be immobilized on the particle surface by molecular recognition or the like.
  • the target substance when the target substance is a nucleic acid, the nucleic acid can be selectively immobilized on the particle surface by using silica-coated magnetic particles.
  • the target substance when the target substance is an antibody (for example, a labeled antibody), a receptor, an antigen, a ligand, or the like, the amino group, carboxyl group, epoxy group, apidine, piotin, digoxigenin, protein A, protein G, etc. on the particle surface
  • the target substance can be selectively fixed on the particle surface.
  • maghemite ⁇ Fe 2 O 3
  • titanomagnetite xFe 2 TiO 4.
  • Fe 7 S 8 (x to 0.13)) , Grayite (Fe 3 S 4 ), goethite ( ⁇ FeOOH), chromium oxide (CrO 2 ), permalloy, alkoni magnet, stainless steel, samarium magnet, neodymium magnet, barium magnet.
  • the particle size of the magnetic particles is preferably about 0.1 ⁇ m to 20 ⁇ m, more preferably about 0.5 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the shape of the magnetic particles is preferably a spherical shape with uniform particle diameters, but may be irregular and have a certain particle size distribution as long as the particles can be manipulated.
  • the constituent component of the magnetic particles may be a single substance or a plurality of components.
  • the magnetic particles particles in which a substance for selectively fixing a target substance is attached to the surface of the magnetic substance or those coated with the substance are preferably used.
  • commercially available products such as Dynabeads (registered trademark) sold by Life Technologies and MagExtractor (registered trademark) sold by Toyobo can be used.
  • the material of the magnetic solid 60 used in the present invention is not particularly limited as long as it is a magnetic substance. Similarly to the magnetic substance constituting the magnetic particles, a ferromagnetic metal such as iron, cobalt, nickel, etc. And their compounds, oxides, alloys and the like.
  • the shape of the magnetic solid is not particularly limited, and may be spherical, polyhedral, flat, rod-shaped, or the like.
  • the magnetic solid preferably has a larger particle size than the magnetic particles.
  • the major axis is regarded as the particle size.
  • the particle size of the magnetic solid is preferably 100 ⁇ m or more, more preferably 300 ⁇ m or more, and further preferably 500 ⁇ m or more. Even when the magnetic particles form aggregates, the magnetic particles can be dispersed in the liquid by being moved by a magnetic field operation in the presence of a magnetic solid having a large particle size.
  • the particle size of the magnetic solid is preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, still more preferably 30 times or more, and particularly preferably 50 times or more that of the magnetic particles.
  • the upper limit of the particle size is not particularly limited as long as the magnetic solid is movable within the container.
  • the particle size of the magnetic solid is preferably 10 mm or less, more preferably 5 mm or less, further preferably 3 mm or less, and particularly preferably 1.5 mm or less.
  • the particle size of the magnetic solid is preferably 100000 times or less, more preferably 50000 times or less, and still more preferably 10,000 times or less that of the magnetic particles.
  • one magnetic solid 60 is used in the container 10, but a plurality of magnetic solids can also be used.
  • the magnetic solid commercially available metal balls such as iron balls for ball bearings and stainless steel balls can be used as they are.
  • the magnetic solid can be provided with functionality. For example, by applying a coating on the surface of a metal material such as iron or stainless steel, corrosion resistance to the reagent or sample can be provided.
  • a metal such as iron constituting the magnetic solid is easily corroded, and corrosive components (for example, metal ions eluted in the liquid layer) are generated.
  • the fixation of the target substance, the subsequent reaction with the reagent or sample for example, enzyme reaction or antigen-antibody reaction
  • elution of the target substance, etc. may be affected.
  • the magnetic solid has a coating layer for preventing corrosion on the metal surface, the influence of metal corrosion can be suppressed.
  • the coating material is not particularly limited as long as it can prevent corrosion of the metal in the gel-like medium or the liquid layer. It may be an inorganic material such as an oxide or a resin material. Examples of the metal material include gold, titanium, and platinum. Examples of the resin material include fluorine resins such as tetrafluoroethylene and epoxy resins. Further, as the coating material, a material that has little influence on the reaction with the reagent or the sample and on the immobilization and elution of the sample is preferably used.
  • the method for forming the coating layer on the metal surface is not particularly limited.
  • a metal coating such as gold, titanium, platinum or the like is applied to the metal surface to provide corrosion resistance
  • a plating method or a dry process evaporation, sputtering, CVD, etc.
  • a resin coating is preferably employed.
  • the thickness of the coating layer is preferably about several ⁇ m to several hundred ⁇ m.
  • the resin layer it is preferable to form the resin layer by wet coating.
  • a resin solution, a liquid adhesive, or the like can be used as the resin material.
  • a liquid adhesive what is marketed as a metal adhesive may be used as it is.
  • a two-component curable epoxy adhesive can be cured at room temperature and can easily form a coating layer having the above thickness, and thus is suitably used as a coating material for preventing metal corrosion.
  • the coating layer does not peel off.
  • the coated magnetic solid is left to dry or harden, the coated magnetic solid is left on a material to which the resin material is difficult to adhere or a material that is resistant to the solvent of the coating solution. It is preferable to do.
  • a coating layer other than the corrosion-resistant coating can be provided on the surface of the magnetic solid.
  • the magnetic solid surface may be coated with various functional molecules such that a substance different from the substance fixed to the magnetic particles is fixed to the magnetic solid surface.
  • the magnetic solid surface may be coated with an optical material such as a light emitting substance or a fluorescent substance.
  • the position of the magnetic solid can be optically detected. Therefore, for example, when the particle manipulation is automated, it can be applied to position detection and position correction of the magnetic solid and magnetic particles.
  • the magnetic solid can also function as a valve for magnetic field operation and an actuator for pump operation in the microchannel system.
  • a magnetic solid can be used as a power receiving element for driving a fluid control element by magnetic resonance, or can be used as a heat source for a chemical reaction as a heating element by electromagnetic induction.
  • FIGS. 1 (A) to 1 (C) a liquid sample 31, magnetic particles 71, and a magnetic solid 60 are loaded into a container 10. These loading orders are not particularly limited.
  • the liquid sample 31 includes biological samples such as animal and plant tissues, body fluids, excrement, and nucleic acid inclusions such as cells, protozoa, fungi, bacteria, and viruses.
  • Body fluid includes blood, cerebrospinal fluid, saliva, milk and the like, and excrement includes feces, urine, sweat and the like. A combination of these can also be used.
  • the cells include leukocytes in blood, platelets, exfoliated cells of mucosal cells such as oral cells, and leukocytes in saliva, and combinations thereof can also be used.
  • a solution such as a cell lysate may be loaded in the container 10 in advance, and blood or the like may be added thereto to prepare a liquid sample.
  • blood or the like may be loaded into the container 10 and a cell lysate may be injected therein.
  • magnetic particles and magnetic solids may be loaded in the container 10 together with the cell lysate, and blood or the like may be added thereto.
  • a kit in which magnetic particles and a magnetic solid are loaded together with a cell lysate in the container 10 can be prepared in advance.
  • the sample does not require enzyme treatment, if the cell lysate, the magnetic particles and the magnetic solid are stored in the same container, blood or the like is added thereto.
  • the nucleic acid can be immobilized on the surface of the magnetic particles by a simple operation. After the liquid sample, magnetic particles and magnetic solid are loaded into the container 10, it is preferable to prevent contamination from the outside by closing the upper part of the container 10 with a lid and making the device a closed system.
  • Nucleic acid as a target substance can be immobilized on the surface of the magnetic particles (silica coating) by sufficiently dispersing the magnetic particles in the container 10 loaded with the liquid sample 31, the magnetic particles 71, and the magnetic solid 60. .
  • This operation is performed by a magnetic field operation from the outside of the container.
  • a magnetic source such as a permanent magnet (for example, a ferrite magnet or a neodymium magnet) or an electromagnet can be used.
  • the liquid sample 31 contains contaminants derived from the sample.
  • the denatured protein has a function of masking the surface of the magnetic particles and causing the magnetic particles to adhere to each other. Therefore, the magnetic particles 71 attracted to the inner wall surface of the container form aggregates, reducing the chance of contact between the nucleic acid in the liquid sample and the magnetic particles, and inhibiting the fixation of the target substance on the particle surface. There is a case.
  • the magnetic particles are moved together with the magnetic solid by a magnetic field operation in a state where the magnetic particles 71 and the magnetic solid 60 coexist in the container.
  • the magnetic field operation is an operation of moving the magnet 9.
  • the moving method of the magnet include linear movement including reciprocating movement, rotational movement, and other movements that draw an irregular orbit.
  • the magnetic field operation as shown in FIG. 1C, the magnetic particles that have formed aggregates are dispersed in the liquid sample.
  • the magnet 9 is preferably reciprocated along the outer wall surface of the container 10.
  • the principle that the magnetic particles are dispersed by moving the magnetic particles together with the magnetic solid in the liquid is not always clear.
  • the magnetic solid 60 moves along the inner wall surface of the container 10 within the range in which the movement of the magnetic solid and magnetic particles are visually observed, the frictional resistance between the inner wall surface of the container and the magnetic solid and the magnetism against the movement of the magnet It has been confirmed that the magnetic solid vibrates with the delay of following the solid.
  • the fine vibration of the magnetic solid has an action to disperse the magnetic particles existing around the magnetic solid, or the fine vibration of the magnetic solid causes the aggregation of the magnetic particles existing between the container wall surface and the magnetic solid. Since it has an action of pulverizing the aggregate, it is presumed that the magnetic particles are rapidly dispersed in the liquid.
  • the aggregation state of the magnetic particles is solved and the magnetic particles are dispersed.
  • the contact opportunity of the magnetic substance particles and the target substance in the liquid sample is increased, and the target substance can be selectively fixed on the surface of the magnetic substance particles.
  • the high-purity target substance can be recovered with high efficiency. Therefore, according to the present invention, the enzyme treatment at the time of dissolution / fixation can be omitted in the separation and purification of the target substance using magnetic particles.
  • the enzyme treatment can be omitted, the cost required for the separation / purification operation can be reduced.
  • the addition of an enzyme is not required, it is not necessary to add a sample or dispense, thereby simplifying the operation and reducing the risk of contamination. Dispersion by pipetting needs to be performed in an open system, whereas the method of the present invention can be performed in a closed system, so that the risk of contamination can be reduced.
  • the magnetic particles can be dispersed in the liquid by a simple operation such as a reciprocating motion of the magnet, automation can be easily achieved.
  • the magnetic particles 71 on which the target substance is fixed are separated from the liquid sample 31 and subjected to another process.
  • the magnetic particles 71 are washed in a washing solution to remove impurities adhering to the surface, and then the nucleic acid fixed to the magnetic particles in the eluate is freely eluted.
  • the target nucleic acid can be recovered.
  • the recovered nucleic acid can be subjected to operations such as concentration and drying as necessary, and then subjected to analysis, reaction, and the like.
  • Washing and elution operations can be performed by known methods. For example, with the magnet close to the container and the magnetic particles fixed in the container near the magnet, the liquid in the container is removed, and then a new liquid (cleaning solution or eluate) is poured into the container. By dispersing the magnetic particles with the above, washing operation and elution operation can be performed.
  • the dispersion of the magnetic particles in the liquid can be performed by a pipetting operation, a stirring operation such as vortexing, or a magnetic field operation. At this time, the magnetic solid may be taken out from the container or may remain in the container together with the magnetic particles.
  • the target substance immobilized on the magnetic particles is not limited to nucleic acid, and the present invention is not limited to nucleic acids. It can also be applied to other target substances.
  • the target substance immobilized on the magnetic particles is not limited to nucleic acid, and the present invention is not limited to nucleic acids. It can also be applied to other target substances.
  • magnetic particles whose surface is coated with molecules capable of selectively immobilizing antibodies such as protein G and protein A
  • the antibody as the target substance can be selectively immobilized on the surface of the magnetic particles.
  • the magnetic particles on which the antibody is immobilized are sequentially brought into contact with a liquid containing the test antigen or an enzyme-labeled secondary antibody, and then the enzyme bound to the secondary antibody immobilized on the surface of the magnetic particle.
  • enzyme immunofixation (ELISA) assay can be performed.
  • the present invention is not limited to extraction, purification and separation of the target substance, It can also be applied to reactions, detection, qualitative / quantitative analysis, etc.
  • the method of the present invention is a method for separating and purifying a target substance using a device in which an aqueous liquid layer and a gel-like medium layer are alternately layered as disclosed in Patent Document 2 (WO2012 / 086243) described above. It can also be applied to.
  • Patent Document 2 WO2012 / 086243
  • nucleic acid is separated and purified using a device in which an aqueous liquid layer and a gel-like medium layer are alternately stacked
  • the nucleic acid extract 130, the first washing liquid 132, the second washing liquid 133, and the nucleic acid elution liquid 134 are arranged along the direction in which the magnetic particles 171 are moved. It is loaded in the tubular container 110 via the gel-like medium layers 121, 122, 123 between them.
  • the gel-like medium forming the gel-like medium layers 121, 122, 123 may be in the form of a gel or a paste before the particle operation.
  • the gel-like medium is preferably a chemically inactive substance that is insoluble or hardly soluble in the liquid in the liquid layer adjacent to the gel-like medium.
  • the gel-like medium is preferably an oily gel that is insoluble or hardly soluble in the aqueous liquid.
  • the gel-like medium layer is preferably a chemically inert substance.
  • being insoluble or hardly soluble in the liquid means that the solubility in the liquid at 25 ° C. is approximately 100 ppm or less.
  • Chemically inactive substances refer to the liquid layer, magnetic particles, and magnetic particles in contact with the liquid layer and the operation of magnetic particles (that is, the operation of moving the magnetic particles in a gel-like medium). A substance that does not have a chemical effect on a fixed substance.
  • the material and composition of the gel medium are not particularly limited.
  • the gel-like medium is formed by adding a gelling agent to a water-insoluble or poorly water-soluble liquid substance such as liquid oil or fat, ester oil, hydrocarbon oil, or silicone oil, for example.
  • the gel (physical gel) formed by the gelling agent forms a three-dimensional network by weak intermolecular bonding forces such as hydrogen bonds, van der Waals forces, hydrophobic interactions, electrostatic attraction forces, Reversibly sol-gel transition by external stimulus such as heat.
  • As the gelling agent hydroxy fatty acid, dextrin fatty acid ester, glycerin fatty acid ester and the like are used.
  • the amount of gelling agent used is appropriately determined in consideration of the physical properties of the gel, for example, in the range of 0.1 to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the water-insoluble or poorly water-soluble liquid substance.
  • the method of gelation is not particularly limited.
  • a water-insoluble or poorly water-soluble liquid material is heated, a gelling agent is added to the heated liquid material, the gelling agent is completely dissolved, and then cooled to a sol-gel transition temperature or lower.
  • a physical gel is formed.
  • the heating temperature is appropriately determined in consideration of the physical properties of the liquid substance and the gelling agent.
  • hydrogel material for example, gelatin, collagen, starch, pectin, hyaluronic acid, chitin, chitosan, alginic acid, or a derivative thereof
  • Hydrogels include those obtained by chemically cross-linking hydrogel materials, gelling agents (for example, salts of alkali metals and alkaline earth metals such as lithium, potassium and magnesium, or salts of transition metals such as titanium, gold, silver and platinum, Furthermore, the thing etc. which gelatinized with silica, carbon, an alumina compound, etc. can also be used.
  • the charging of the gel-like medium and the liquid into the container 110 can be performed by an appropriate method.
  • a tubular container it is preferable that the opening at one end of the container is sealed prior to loading, and the gel-like medium and the aqueous liquid are sequentially loaded from the opening at the other end.
  • a gel-like medium is loaded into a small structure such as a capillary having an inner diameter of about 1 to 2 mm, for example, a metal injection needle is attached to an arlock syringe and the gel-like medium is pushed out to a predetermined position in the capillary. Loading is performed by the method.
  • the volume of the gel-like medium and the liquid loaded in the container can be appropriately set according to the amount of magnetic particles to be operated, the type of operation, and the like.
  • the capacity of each layer may be the same or different.
  • the thickness of each layer can also be set as appropriate, but considering the operability and the like, the layer thickness is preferably about 2 mm to 20 mm, for example.
  • nucleic acid extract 130 used for nucleic acid extraction examples include the aforementioned cell lysate (for example, a buffer solution containing a chaotropic substance, a chelating agent such as EDTA, Tris-HCl, etc.).
  • the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 are preloaded at the top of the container 110.
  • the magnetic particles 171 can selectively fix a nucleic acid.
  • magnetic particles coated with silica are used.
  • a sample containing nucleic acid such as blood is added into the nucleic acid extract 130 from the opening at the top of the device 150 in which the liquid layer and the gel-like medium layer are alternately stacked.
  • a solution (liquid sample) 131 containing the nucleic acid extract and the nucleic acid is prepared.
  • the magnet 9 is brought close to the side surface of the container of the liquid sample 131, the magnetic solid 160 and the magnetic particles 171 are attracted to the inner wall surface of the container around the magnet 9 (FIG. 2-1 (B)).
  • the magnetic solid 160 By reciprocating the magnet 9 along the outer wall surface of the container 110, the magnetic solid 160 is moved in the liquid sample, and accordingly, the magnetic particles 171 are dispersed in the liquid sample 131 (FIG. 2). -1 (C)).
  • the nucleic acid in the liquid sample is selectively fixed to the surface of the magnetic particle.
  • the magnetic solid 160 may be taken out of the system, and the subsequent steps may be performed in the state of coexisting with the magnetic particles 171.
  • the efficiency of washing and elution can be increased by moving the magnetic solid 160 in the device together with the magnetic particles 171 without taking out the magnetic solid 160. Further, since the sealed state of the device can be maintained, the risk of contamination can be reduced.
  • the magnetic particles 171 are moved into the gel-like medium layer 121 by moving the magnet 9 along the outer wall surface of the container. At this time, the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 move together in the gel-like medium (FIG. 2-2 (D)).
  • the magnetic particles 171 enter the gel-like medium layer 121, most of the liquid physically attached as droplets around the magnetic particles 171 is detached from the particle surface and is liquid in the liquid layer 131. Remain in minutes.
  • the magnetic particles 171 can easily move in the gel-like medium layer 121 while holding the target substance fixed to the particles.
  • the gel-like medium is perforated by the entry and movement of the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 into the gel-like medium layer 121, but the gel self-repairs due to its thixotropic nature.
  • the gel When shearing force is applied when the magnetic particles move in the gel by the magnetic field operation, the gel is locally fluidized (viscous) due to thixotropic properties. Therefore, the magnetic particles and the magnetic solid can easily move in the gel while perforating the fluidized portion. After the magnetic particles pass, the gel released from the shearing force quickly recovers to its original elastic state. Therefore, a through hole is not formed in a portion through which the magnetic particles have passed, and the liquid hardly flows into the gel through the perforated portion of the magnetic particles. If the moving speed of the magnet 9 is excessively high, the gel may be physically destroyed and the restoring force may be lost. For this reason, the moving speed of the magnet is preferably about 0.1 to 5 mm / second.
  • the restoring force due to the thixotropic nature of the gel as described above exerts an action of squeezing out the liquid accompanying the magnetic particles 171. Therefore, even when the magnetic particles 171 become aggregates and move into the gel-like medium layer 121 in a state where the droplets are taken in, the magnetic particles and the droplets are separated by the restoring force of the gel. obtain.
  • the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 that have passed through the gel-like medium layer 121 are moved from the gel-like medium layer 121 to the liquid layer 132 by a magnetic field operation. As described above, since the through hole is not formed in the portion of the gel-like medium layer 121 through which the magnetic particles or the magnetic solid has passed, the liquid sample 131 hardly flows into the liquid layer 132.
  • the liquid layer 132 is, for example, a cleaning liquid.
  • the washing solution is a component other than the nucleic acid (for example, protein, sugar, etc.) adhering to the magnetic particles, or a reagent used for nucleic acid extraction or the like while the nucleic acid is fixed on the surface of the magnetic particles. Etc. may be used as long as they can be released into the cleaning liquid.
  • the cleaning liquid include high salt concentration aqueous solutions such as sodium chloride, potassium chloride, and ammonium sulfate, and aqueous alcohol solutions such as ethanol and isopropanol.
  • the liquid layer 133 may also be a cleaning liquid. When the liquid layers 132 and 133 are both cleaning liquids, the compositions of these cleaning liquids may be the same or different.
  • the magnetic solid 160 and the magnetic particles 171 also move in the liquid layer as the magnet 9 moves. At this time, the magnetic particles 171 forming the aggregate are dispersed in the liquid layer 132 (FIG. 2-2 (E)).
  • the magnetic particles By moving the magnetic solid 160 in addition to the magnetic particles 171 into the liquid layer, the magnetic particles can be efficiently dispersed in the liquid as in the case of dissolution / fixation, and the cleaning efficiency is increased. be able to.
  • the magnet 9 is moved from the side surface of the liquid layer 132 to the side surface of the gel-like medium layer 122 (FIG. 2-2 (F)). Further, after moving the magnet 9 to the side surface of the liquid layer 133, the magnetic particles are sufficiently dispersed by reciprocating the magnet, and the magnetic particles are cleaned in the liquid layer 133 (FIG. 2-). 2 (G)).
  • FIG. 2 an example in which two liquid layers 132 and 133 are loaded as cleaning liquids in the container 110 via the gel-like medium layer 122 is shown, but the cleaning liquid may be only one layer, Three or more types may be used.
  • the washing can be omitted as long as the purpose of separation and undesired inhibition in use do not occur.
  • the magnet 9 is moved from the side surface of the second cleaning liquid 133 to the side surface of the gel-like medium layer 123, and the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 are moved into the gel-like medium layer 123 (FIG. 2-2 (H)). ). Further, the magnet 9 is moved to the side surface of the nucleic acid eluate 134, and the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 are moved into the nucleic acid eluate 134.
  • nucleic acid eluate water or a buffer containing a low-concentration salt can be used. Specifically, Tris buffer, phosphate buffer, distilled water, or the like can be used. In particular, it is common to use a 5-20 mM Tris buffer adjusted to pH 7-9.
  • a specific method for releasing nucleic acid includes a method of dispersing particles in the eluate.
  • the magnetic particles 171 move together with the magnetic solid 160, and the magnetic particles 171 are dispersed in the nucleic acid eluate (FIG. 2-2 (I )).
  • the nucleic acid fixed on the surface of the magnetic particles 171 is efficiently desorbed and released into the nucleic acid eluate, so that the nucleic acid recovery rate is increased.
  • the magnet 9 is moved to the gel-like medium layer 123 side along the outer wall surface of the container as necessary, so that the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 are gelled. Reenter the medium layer 123. By this operation, the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 are removed from the nucleic acid eluate 134, so that the nucleic acid eluate can be easily collected.
  • the liquid layer is held between the gel-like medium layer and between the gel-like medium layer and the container. Cannot be accessed from outside while keeping the system.
  • the magnetic particles can be dispersed in the liquid layer while maintaining the sealed system, contamination from the outside can be suppressed as compared with the case where the magnetic particles are dispersed by pipetting.
  • solid-liquid separation is performed by moving magnetic particles in the gel-like medium layer. Therefore, the target substance can be efficiently separated and recovered with a smaller amount of magnetic particles and reagent than when solid-liquid separation of magnetic particles and reagents such as washing liquid and eluate is performed by pipetting. In addition, the amount of waste liquid can be significantly reduced. In addition, after adding a sample such as blood to the lysis / fixation solution (nucleic acid extract), simply move the magnet along the outer wall surface of the container to perform the steps from fixation to elution of the target substance. Therefore, the operation can be easily automated.
  • a device for dissolution / fixation as shown in FIG. 1 can be created simply by charging a magnetic particle, a magnetic solid, and a liquid in a container.
  • the liquid loaded in the container is, for example, a liquid that can lyse cells, such as a nucleic acid extract. This liquid may be added with alcohol or the like for preventing aggregation of magnetic particles.
  • magnetic particles, magnetic solid, liquid, etc. may be provided independently.
  • the magnetic particles may be provided independently in a container or separately in a liquid state, separately from a device body in which a liquid capable of lysing cells and a magnetic solid are loaded in a container.
  • the magnetic particles may be provided as a component of a kit for producing a device.
  • Magnetic solids may also be provided separately from the device body. It can also be provided as a component of the kit in a state where the magnetic particles and the magnetic solid coexist in the liquid.
  • the device or kit is provided in a state where the magnetic solid is dispersed in the liquid, the magnetic solid is brought into contact with the liquid for a long time in the storage state of the device or kit. Therefore, for the purpose of preventing corrosion or deterioration of the magnetic solid, it is preferable to use a magnetic solid having a metal surface coated as described above.
  • a device in which a liquid layer and a gel-like medium layer are alternately stacked as shown in FIG. 2 can be easily manufactured.
  • the loading of the gel-like medium and the liquid into the container may be performed immediately before the particle operation, or may be performed after a sufficient time before the particle operation.
  • the gel-like medium is insoluble or hardly soluble in the liquid, even when a long time elapses after loading, there is almost no reaction or absorption between the two.
  • the magnetic particle manipulation device in which the liquid layers and the gel-like medium layers are alternately stacked has the magnetic particles 171 and the magnetic solid 160 loaded in the container. It can also be provided in the state.
  • the magnetic solid 160 is loaded in the liquid layer 130, but the magnetic solid 160 may be loaded in the gel-like medium layer 121, for example.
  • the magnetic solid 160 in the gel-like medium layer 121 may be moved into the liquid layer by a magnetic field operation before the magnetic particles are manipulated by dissolution / fixation.
  • the amount of magnetic particles contained in the device or in the kit is appropriately determined according to the type of chemical operation to be performed, the volume of each liquid layer, and the like.
  • the amount of magnetic particles is usually preferably in the range of about 10 to 200 ⁇ g.
  • ⁇ Washing> Remove the tube from the stand, add 500 ⁇ L of the first washing solution (37% ethanol, 4.8 M guanidine hydrochloride, 20 mM Tris-HCl pH 7.4), and sufficiently resuspend the magnetic bead mass collected on the inner wall of the tube by pipetting.
  • the liquid in the tube was removed using a micropipette in the state where it was reset on the stand and left for 1 minute and then set on the stand.
  • the tube was removed from the stand, 500 ⁇ L of the second washing solution (2 mM Tris-HCl pH7.6, 80% ethanol, 20 mM NaCl) was added, and after resuspension, the liquid was removed by setting on the stand.
  • Example 1 Collect 200 ⁇ L of human whole blood in a 1.5 mL polypropylene resin tube, and add lysis / fixation solution (50 mM Tris-HCl pH 6.4, 10% Triton X-100, 4M guanidine isocyanate) without adding Proteinase K. Added and mixed for 10 seconds.
  • lysis / fixation solution 50 mM Tris-HCl pH 6.4, 10% Triton X-100, 4M guanidine isocyanate
  • Proteinase K Added and mixed for 10 seconds.
  • magnetic beads suspended in isopropanol were added, and one steel ball (made by Shinto Kogyo Co., Ltd.) having a particle diameter of 1 mm was further added.
  • a neodymium magnet (a cylinder with a diameter of 6 mm and a length of 23 mm, trade name “NE127” manufactured by Niroku Seisakusho Co., Ltd.) is placed every second along the outer wall of the tube at a distance of about 2 cm from the bottom of the tube to the vicinity of the cap. It was reciprocated at a repetition speed of 5 times. At this time, it was visually confirmed that the steel ball moved so as to follow the magnet, and the magnetic beads were dispersed in the liquid.
  • the tube was set on a magnetic particle separation stand, allowed to stand for 1 minute, and then the liquid in the tube was removed using a micropipette while the tube was set on the stand. Thereafter, washing and elution were performed in the same manner as in Reference Example 1, and the DNA eluate was collected.
  • Example 1 As in Example 1 above, a lysate / fix solution in human whole blood and magnetic beads suspended in isopropanol were added. Thereafter, the steel ball was not thrown in, but the mixture was stirred for 1 minute with a vortex mixer, and the tube was set on a magnetic particle separation stand to remove the liquid in the tube. Thereafter, washing and elution were performed in the same manner as in Reference Example 1, and the DNA eluate was collected.
  • Comparative Example 1 where the enzyme treatment was not performed at the time of dissolution / fixation, the minimum absorbance was shifted to around 240 nm, and A 260 / A 230 was as small as about 0.4. This is considered to be because the background of absorption on the short wavelength side was increased because many low-molecular contaminant components were mixed. Therefore, in Comparative Example 1, the amount of recovered DNA could not be accurately quantified.
  • a 260 / A 230 was about 1.3, which was an acceptable level for purity for use in PCR and the like.
  • the amount of recovered DNA was not sufficient. From this result, even when the enzyme treatment was performed in the dissolution / fixation operation, the state where the magnetic bead surface was masked with a peptide or the like was not sufficiently eliminated by stirring with a vortex mixer, and the DNA was not fixed on the magnetic bead surface. It is thought that the purity is lowered due to inhibition.
  • Example 1 despite not subjected to enzyme treatment, A 260 / A 230 was more than 1.4. In addition, the ratio of absorbance at 260 nm and 280 nm (A 260 / A 280 ), which is an index of the purity of DNA, is also higher than that of Reference Example 1. In both the purity and recovered amount of Example 1, Example 1 It turns out that it is superior to the reference example 1 which processed. From this result, it is possible to selectively fix the target substance on the surface of the magnetic beads by performing the magnetic field operation in the presence of a magnetic solid having a particle size larger than that of the magnetic beads without performing the enzyme treatment in the dissolution / fixing operation. It can be seen that high-purity target materials can be obtained.

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Abstract

　本発明は、液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法、およびそれに用いられる磁性体粒子操作用デバイスに関する。磁性体粒子は、目的物質を選択的に固定可能な粒子である。本発明の方法では、液体試料（３１）と、磁性体粒子（７１）と、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体（６０）とを容器（１０）内に共存させた状態で、容器の外部からの磁場操作により、磁性固体（６０）とともに磁性体粒子（７１）が前記液体試料（３１）中で移動させられる。この操作により、磁性体粒子（７１）の表面に目的物質を選択的に固定できる。

Description

磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス
　本発明は、試料中の目的物質を選択的に磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法に関する。また、本発明は、当該方法に用いられる磁性体粒子操作用デバイスに関する。
　医学的検査、食品安全衛生上の管理、環境保全のためのモニタリング等では、多種多様な夾雑物を含む試料から、目的物質を抽出して、検出や反応に供することが求められる。例えば、遺伝子検査では、標的の核酸をＰＣＲ等により増幅させる前に、動植物の血液、血清、細胞、尿、糞便等や、ウィルス等の生体由来試料から、ＤＮＡやＲＮＡを効率よく抽出する必要がある。
　試料中の目的物質を抽出・精製するために、粒径が０．５μｍ～十数μｍ程度の磁性体の表面に、目的物質との化学的な親和力や分子認識機能を持たせた磁性体粒子を用いる方法が開発され、実用化されている。この方法では、磁性体粒子の表面に目的物質を固定させた後、磁場操作により磁性体粒子を液相から分離・回収し、必要に応じて、回収された磁性体粒子を洗浄液等の液相に分散させ、液相から磁性体粒子を分離・回収する工程が繰り返し行われる。その後、磁性体粒子が溶出液中に分散されることにより、磁性体粒子に固定されていた目的物質が溶出液中に遊離し、溶出液中の目的物質が回収される。磁性体粒子を用いることにより、磁石による目的物質の回収が可能となり、遠心操作が不要となるため、化学抽出・精製の自動化に有利な特徴を持つ。
　目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子は、分離・精製キットの一部として市販されている。キットは複数の試薬が別々の容器に入れられており、使用時はユーザーがピペット等で試薬を分取、分注する。これらのピペット操作や磁場操作を自動化するための装置も市販されている（例えば、特許文献１）。一方、ピペット操作に代えて、溶解／固定液、洗浄液、溶出液等の水系液体層と、ゲル状媒体層とが交互に重層された管状デバイスを用い、このデバイス内で磁性体粒子を管の長手方向に沿って移動させることにより、目的物質を分離・精製する方法が提案されている（例えば、特許文献２）。このような管状デバイスを用いる場合は、密閉系で一連の操作を実施できるため、開放系で行われるピペット操作に比べて、コンタミネーションの危険性が低減される。
　ピペット操作、およびゲルが封入されたデバイスを用いた操作のいずれにおいても、磁性体粒子を用いた分離・精製では、最初に、生体由来試料を溶解させ、磁性体粒子の表面への核酸等の目的物質の固定が行われる。この溶解（lysis）／固定（binding）工程では、液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に選択的に固定させる必要がある。生体由来試料には、目的物質の他に、多種多様な夾雑物が含まれており、これらの夾雑物が磁性体粒子の表面に付着すると、磁性体粒子への目的物質の固定が妨げられ、目的物質の回収率の低下を招く。例えば、血液からの核酸抽出では、細胞由来の夾雑タンパク質が磁性体粒子の表面に付着して凝集し、磁性体粒子への核酸の固定の妨げとなる場合がある。
　そのため、一般には、試料と磁性体粒子とを接触させる前に、Proteinase K等のタンパク質分解酵素を試料に添加し、５０℃～７０℃の加熱下で酵素処理を行うことにより、核酸と結合するタンパク質が分解除去される。その後、エタノール等のアルコールを添加して、液体試料の疎水性を高めた上で、磁性体粒子を添加することにより、磁性体粒子の表面に核酸を選択的に固定させることができる。
　なお、アルコールは酵素反応を阻害するため、溶解／固定工程で酵素処理を行う場合は、加熱条件下で酵素処理を行った後に、アルコールを添加する必要がある。また、酵素処理の前に試料に磁性体粒子が添加されると、磁性体粒子に夾雑タンパク質が付着して粒子表面がマスクされるため、酵素処理後に磁性体粒子を添加する必要がある。
ＷＯ９７／４４６７１号国際公開パンフレット ＷＯ２０１２／０８６２４３号国際公開パンフレット
　上記のように、磁性体粒子を用いた分離・精製操作において、溶解／固定の際に酵素処理を行うためには、酵素、磁性体粒子およびアルコールを、それぞれ別の容器内で保管するか、あるいは容器内に設けられた隔壁等により隔離しておき、分離・精製操作を行う際に、試料に順次添加する必要がある。そのため、溶解／固定の操作が複雑化したり、デバイスに隔壁等を設けるための複雑な加工が必要となり、デバイスの製造コスト増大を招く等の問題がある。
　また、デバイス内に酵素や磁性体粒子を順次添加する場合、これらの添加操作を開放系で行う必要がある。そのため、特許文献２に開示されているようなゲル層と液体層とを重層したデバイスを用いる場合でも、コンタミネーションの危険性が増大するとの問題がある。さらには、酵素は常温で失活し易いため、分離・精製操作を行うまでの間、冷蔵・冷凍保存しておく必要がある。また、酵素自体が高価であるため、溶解／固定の際に酵素を用いる方法は、多数の試料を処理するための簡易デバイスには不向きである。
　上記に鑑み、本発明は、磁性体粒子を用いた目的物質の分離・精製において、酵素処理を行うことなく、簡易な操作により、高効率で目的物質を磁性体粒子の表面に固定するための、磁性体粒子の操作方法の提供を目的とする。
　本発明者が検討の結果、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体の共存下で磁場操作を行うことにより、磁性固体の移動に伴って磁性体粒子が液体中に分散され、核酸等の目的物質を磁性体粒子の表面に効率的に固定できることを見出し、本発明に至った。
　本発明は、液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法、およびそれに用いられる磁性体粒子操作用デバイスに関する。磁性体粒子としては、目的物質を選択的に固定可能な粒子が用いられる。磁性体粒子を選択的に固定し得る目的物質としては、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の生体由来物質が挙げられる。
　本発明の方法では、液体試料と、磁性体粒子と、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを容器内に共存させた状態で、容器の外部からの磁場操作により、磁性固体とともに磁性体粒子が液体試料中で移動させられる。例えば、容器の外壁面に沿って、磁石を往復運動させることにより、磁性固体とともに磁性体粒子が、液体試料中で往復運動させられる。この操作により、磁性体粒子の表面に目的物質を選択的に固定することができる。本発明の一形態では、液体試料が、カオトロピック物質や界面活性剤等の細胞を溶解可能な成分を含む。
　磁性固体としては、粒径が５０μｍ以上のものが好ましく用いられる。また、磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０倍以上であることが好ましい。磁性固体は、液体内での腐食を防止するためのコーティング層を表面に有するものでもよい。
　本発明の一形態では、上記方法により磁性体粒子の表面に目的物質が選択的に固定された後、目的物質が固定された磁性体粒子が、溶出液に接触させられる。これにより、目的物質を溶出液中に溶出させ、目的物質を回収できる。
　本発明の磁性体粒子操作用デバイスでは、容器内に封入された液体中に、目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子と、磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とが共存している。一形態において、容器内に封入された液体は、細胞を溶解可能な液体である。
　本発明の方法によれば、目的物質を含む液体試料中に、磁性体粒子と磁性固体とを共存させた状態で、磁場操作が実施されることにより、磁性体粒子が効率的に分散される。そのため、プロテアーゼ等による酵素処理を行わない場合でも、液体試料中の目的物質を、効率的に磁性体粒子の表面に固定できる。本発明を核酸等の目的物質の分離・精製等に適用すれば、高純度の目的物質を、高収率で回収できる。
磁性体粒子の操作方法の概要を模式的に示す図である。 核酸を分離・精製する実施形態の各工程を模式的に示す図である。 核酸を分離・精製する実施形態の各工程を模式的に示す図である。 実施例、参考例および比較例の磁性体粒子操作により抽出・精製された核酸のＵＶ吸収スペクトルである。
　図１は、磁性体粒子の操作方法を説明するための工程概念図である。本発明は、液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法に関する。図１（Ａ）において、容器１０内には、液体試料３１、磁性体粒子７１および磁性固体６０が含まれている。液体試料３１は、磁性体粒子７１の表面に固定されるべき目的物質を含む。磁性体粒子７１は、当該目的物質をその表面に固定可能な粒子である。磁性固体６０は、磁性体粒子７１よりも粒径の大きい磁性体である。
［容器］
　容器１０は、外部からの磁場操作によって容器内の磁性固粒子や磁性体粒子を移動可能であり、液体を保持できるものであれば、その材質や形状は特に限定されない。例えば、試験管等の管状の容器や、エッペンドルチューブ等の錐形状の容器を用いることができる。また、内径１ｍｍ～２ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ～２００ｍｍ程度の直管状構造体（キャピラリー）や、幅１ｍｍ～２ｍｍ程度、深さ０．５ｍｍ～１ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ～２００ｍｍ程度の直線状溝が形成された平面板材の上面に、別の平面板材を貼り合わせた構造体等を用いることもできる。なお、容器の形状は管状や面状に限定されず、粒子の移動経路が、十字あるいはＴ字等の分岐を有する構造であってもよい。容器の大きさを極力小さくすれば、微小液体操作用マイクロデバイス、または微小液体操作用チップとしても使用できる。
　本発明では、磁場操作によって、容器１０内の磁性体粒子７１を移動可能であるため、試料投入後の容器を密閉系とすることができる。容器を密閉系とすれば、外部からのコンタミネーションを防止できる。そのため、ＲＮＡ等の分解されやすい物質を磁性体粒子に固定して操作する場合に、特に有用である。容器を密閉系とする場合、容器の開口部を熱融着する方法や、適宜の封止手段を用いて封止することができる。操作後の粒子や水系液体を容器外に取り出す必要がある場合は、樹脂栓等を用いて、取り外し可能に開口部を封止することが好ましい。
　容器１０の材質としては、外部からの磁場を遮蔽しないものであれば特に限定されず、ポリプロピレンやポリエチレン等のポリオレフィン、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン等の樹脂材料が挙げられる。これらの素材の他、セラミック、ガラス、シリコーン、金属等も用いられ得る。容器内壁面の撥水性を高めるために、フッ素系樹脂やシリコーン等によるコーティングが行われてもよい。
　磁性体粒子の操作中あるいは操作後に、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率変化等の光学的測定が行われる場合や、光照射が行われる場合は、光透過性を有する容器が好ましく用いられる。また、容器が光透過性であれば、容器内の粒子操作の状況を目視確認できることからも好ましい。一方、液体や磁性体粒子等を遮光する必要がある場合は、光透過性を有していない金属等の容器が好ましく用いられる。使用目的等に応じて、光透過部分と遮光部分とを有する容器を用いることもできる。
［液体試料］
　液体試料３１は、分離・精製の対象となる目的物質を含む。目的物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の生体由来物質が挙げられる。液体試料３１は、目的物質の他に夾雑物を含む。例えば、血液から核酸の分離・精製を行う場合、液体試料３１は、目的物質である核酸の他に、細胞から溶出したタンパク質や糖等の多種多様な夾雑物を含んでいる。
　液体試料３１は、典型的には、血液等の生体由来試料と、そこから目的物質を抽出するための溶液との混合物である。目的物質を抽出するための溶液としては、例えば細胞溶解液が挙げられる。細胞溶解液は、カオトロピック物質や界面活性剤等の細胞を溶解可能な成分を含む。カオトロピック塩としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素等が挙げられる。カオトロピック塩は強力なタンパク変性剤であり、細胞のタンパク質を溶解させ、細胞核内の核酸を液中に遊離させる働きがある上、核酸分解酵素の働きを抑える効果がある。液体試料３１は、上記の他に、各種の緩衝剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を含んでいてもよい。
　一般的に、血液等の生体由来試料から目的物質を抽出する際には、目的物質の純度や回収率を向上させるために、酵素反応による夾雑成分の分解が行われる。例えば、血液から核酸を抽出する場合は、プロテアーゼＫ等のタンパク質分解酵素を用い、核酸と結合している核タンパク質の分解が行われるのが一般的である。これに対して、後に詳述するように、本発明では磁性体粒子と磁性固体の共存下で磁場操作が行われるため、酵素反応を行わない場合でも、目的物質を高効率かつ選択的に、磁性体粒子の表面に固定することができる。そのため、液体試料３１には、酵素が添加されないことが好ましい（ただし、生体由来試料に元々含まれている酵素等が共存していてもよい）。
［磁性体粒子］
　本発明に用いられる磁性体粒子７１は、液体試料３１中の目的物質を選択的に固定可能な粒子である。粒子表面への目的物質の固定方法は特に限定されず、物理固定、化学固定等の各種公知の固定化メカニズムが適用可能である。例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水相互作用、イオン間相互作用、π－πスタッキング等の種々の分子間力により、粒子の表面あるいは内部に目的物質が固定される。核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の目的物質は、分子認識等により、粒子表面に固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、シリカコーティングされた磁性体粒子を用いることにより、粒子表面に核酸を選択的に固定できる。また、目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ピオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ等により、目的物質を粒子表面に選択的に固定できる。
　磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。具体的には、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（Ｆｅ２Ｏ３、またはαＦｅ２Ｏ３）、マグヘマイト（γＦｅ２Ｏ３）、チタノマグネタイト（ｘＦｅ２ＴｉＯ４・（１－ｘ）Ｆｅ３Ｏ４、イルメノヘマタイト（ｘＦｅＴｉＯ３・（１－ｘ）Ｆｅ２Ｏ３、ピロタイト（Ｆｅ１－ｘＳ（ｘ＝０～０．１３）‥Ｆｅ７Ｓ８（ｘ～０．１３））、グレイガイト（Ｆｅ３Ｓ４）、ゲータイト（αＦｅＯＯＨ）、酸化クロム（ＣｒＯ２）、パーマロイ、アルコニ磁石、ステンレス、サマリウム磁石、ネオジム磁石、バリウム磁石が挙げられる。
　液体中での粒子操作を容易とする観点から、磁性体粒子の粒径は０．１μｍ～２０μｍ程度が好ましく、０．５μｍ～１０μｍ程度がより好ましい。磁性体粒子の形状は、粒径が揃った球形が望ましいが、粒子操作が可能である限りにおいて、不規則な形状で、ある程度の粒径分布を持っていてもよい。磁性体粒子の構成成分は単一物質でもよく、複数の成分からなるものでも良い。
　磁性体粒子としては、上記磁性体の表面に、目的物質を選択的に固定させるための物質が付着したもの、あるいは当該物質で被覆されたものが好適に用いられる。このような磁性体粒子は、例えば、ライフテクノロジーズから販売されているDynabeads（登録商標）や、東洋紡から販売されているMagExtractor（登録商標）等の市販品を用いることもできる。
［磁性固体］
　本発明に用いられる磁性固体６０は、磁性体であればその材料は特に限定されず、上記磁性体粒子を構成する磁性体として例示したのと同様に、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。磁性固体の形状は特に限定されず、球状、多面体状、偏平形状、棒状等であってもよい。
　磁性固体は、磁性体粒子よりも粒径が大きいことが好ましい。なお、磁性固体が非球状の場合は、長径を粒径とみなす。磁性固体の粒径は、１００μｍ以上が好ましく、３００μｍ以上がより好ましく、５００μｍ以上がさらに好ましい。磁性体粒子が凝集体を形成している場合であっても、粒径の大きい磁性固体の共存下で、磁場操作によって移動させることにより、磁性体粒子を液体中に分散させることができる。磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０倍以上が好ましく、２０倍以上がより好ましく、３０倍以上がさらに好ましく、５０倍以上が特に好ましい。
　磁性固体は、容器内で移動可能なものであれば、粒径の上限は特に限定されない。例えば、容器が管状であり、磁性固体が球状である場合、磁性固体の粒径が、容器の内径よりも小さければよい。磁場による操作を容易とする観点から、磁性固体の粒径は１０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以下がより好ましく、３ｍｍ以下がさらに好ましく、１．５ｍｍ以下が特に好ましい。また、磁性固体の粒径は、磁性体粒子の粒径の１０００００倍以下が好ましく、５００００倍以下がより好ましく、１００００倍以下がさらに好ましい。なお、図１に示す実施形態では、容器１０内に１個の磁性固体６０が用いられているが、複数の磁性固体を用いることもできる。
　磁性固体としては、ボールベアリング用の鉄球やステンレス球等の市販の金属球等をそのまま用いることができる。また、磁性固体に機能性を持たせることもできる。例えば、鉄やステンレス等の金属材料の表面にコーティングを施すことにより、試薬や試料に対する耐腐食性を持たせることができる。
　特に、磁性固体が粒子操作デバイス内で、水系液体等に長時間接触させられる場合、磁性固体を構成する鉄等の金属が腐食しやすく、腐食成分（例えば液体層中に溶出した金属イオン）が、目的物質の固定や、その後の試薬や試料との反応（例えば酵素反応や、抗原抗体反応）、目的物質の溶出等に影響を及ぼす場合がある。これに対して、磁性固体が金属表面に腐食を防止するためのコーティング層を有することにより、金属の腐食による影響を抑制できる。
　金属表面に耐腐食性を持たせるためのコーティングが施される場合、コーティング材料は、ゲル状媒体や液体層内での金属の腐食を防止できるものであれば、特に限定されず、金属、金属酸化物等の無機材料でも、樹脂材料でもよい。金属材料としては、金、チタン、プラチナ等が挙げられる。樹脂材料としては、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂やエポキシ系樹脂等が挙げられる。また、コーティング材料としては、試薬や試料との反応の阻害や、試料の固定および溶出への影響が少ないものが好ましく用いられる。
　金属表面へのコーティング層の形成方法は特に限定されない。例えば、金属表面に、耐腐食性を持たせるために、金、チタン、プラチナ等の金属コーティングが施される場合、メッキ法やドライプロセス（蒸着、スパッタ、ＣＶＤ等）が好ましく採用される。金属表面に樹脂コーティングが施される場合、ウェットコーティングが好ましく採用される。
　物理的な衝撃等によって、金属の腐食を防止するためのコーティングの剥がれや傷付きが生じると、金属が露出し、露出部分から金属の腐食を生じる場合がある。そのため、コーティング層の厚みは、数μｍ～数百μｍ程度が好ましい。コーティング層をこのような厚みとするためには、ウェットコーティングにより、樹脂層を形成することが好ましい。樹脂材料としては、樹脂溶液や液状接着剤等を用いることができる。液状接着剤としては、金属用の接着剤として市販されているものをそのまま用いてもよい。例えば、二液硬化型のエポキシ系接着剤は、常温での硬化が可能であり、上記厚みのコーティング層を容易に形成できるため、金属の腐食を防止するためのコーティング材料として好適に用いられる。
　ウェットコーティングにより樹脂溶液の乾燥や硬化が行われる場合、コーティング層の剥がれが生じないように、乾燥条件が設定されることが好ましい。例えば、コーティング後の磁性固体を静置して乾燥あるいは硬化する場合は、樹脂材料が付着し難い材料や、コーティング液の溶媒に対する耐溶剤性を有する材料上に、コーティング後の磁性固体を静置することが好ましい。
　磁性固体の表面には、耐腐食性コーティング以外のコーティング層を設けることもできる。例えば、磁性体粒子に固定される物質とは別の物質が磁性固体表面に固定されるように、磁性固体表面を、種々の機能性分子でコートしてもよい。その他、磁性固体表面を、発光物質や蛍光物質等の光学材料でコートしてもよい。このような構成によれば、磁性固体の位置を光学的に検出可能となるため、例えば、粒子操作を自動化する際、磁性固体や磁性体粒子の位置検出や位置補正に応用できる。また、磁性固体の、材質、大きさ、形状を調整することにより、マイクロ流路系における、磁場操作によるバルブ、ポンプ動作のためのアクチュエーターとしての機能を磁性固体に兼用させることもできる。その他、磁性固体を、磁気共鳴による流体制御素子の駆動用電力の受容体とすることや、電磁誘導による発熱体として化学反応の熱源に利用することもできる。
［磁場操作による目的物質の溶解／固定］
　以下では、図１（Ａ）～（Ｃ）を参照しながら、磁性体粒子の表面に目的物質として核酸を固定させる例を中心に説明する。まず、図１（Ａ）に示すように、容器１０内に、液体試料３１、磁性体粒子７１および磁性固体６０が装填される。これらの装填順序は特に制限されない。
　目的物質が核酸である場合、液体試料３１は、動植物組織、体液、排泄物等の生体試料、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等の核酸包含体を含む。体液には血液、髄液、唾液、乳等が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗等が含まれる。また、これらの複数の組合せを用いることもできる。細胞には血液中の白血球、血小板や、口腔細胞等の粘膜細胞の剥離細胞、唾液中白血球が含まれ、これらの組合せを用いることもできる。核酸を含む液体試料は、例えば、細胞懸濁液、ホモジネート、細胞溶解液との混合液等の態様で調製してもよい。予め容器１０内に細胞溶解液等の溶液を装填しておき、そこに、血液等を添加して、液体試料を調製してもよい。先に容器１０内に血液等を装填し、そこに細胞溶解液を注入してもよい。
　また、容器１０内に細胞溶解液とともに、磁性粒子および磁性固体を装填しておき、そこに血液等を添加してもよい。予め、容器１０内に、細胞溶解液とともに磁性体粒子および磁性固体を装填したものをキットとして準備しておくこともできる。本発明では、試料の酵素処理を必要としないため、細胞溶解液と磁性体粒子および磁性固体とを同一の容器内に装填した状態で保管しておけば、そこに血液等を投入することにより、簡便な操作で磁性体粒子表面への核酸の固定を行うことができる。液体試料、磁性体粒子および磁性固体を容器１０内に装填した後は、容器１０の上部を蓋で塞ぎ、デバイスを密閉系とすることにより、外部からの汚染を防止することが好ましい。
　液体試料３１、磁性体粒子７１および磁性固体６０が装填された容器１０内で、磁性体粒子を十分に分散させることにより、磁性体粒子表面（シリカコーティング）に目的物質である核酸を固定化できる。この操作は、容器外部からの磁場操作により行われる。図１（Ｂ）に示すように、容器の外壁面に磁石９を近付けると、磁石９周辺の容器内壁面に、磁性固体６０および磁性体粒子７１が引き寄せられる。磁場操作には、永久磁石（例えばフェライト磁石やネオジム磁石）や電磁石等の磁力源を用いることができる。
　液体試料３１内には、試料由来の夾雑物が含まれている。中でも変性タンパク質は、磁性体粒子の表面をマスクし、磁性体粒子同士を付着させる作用を有する。そのため、容器の内壁面に引き寄せられた磁性体粒子７１が凝集体を形成し、液体試料内の核酸と磁性体粒子との接触機会が減少し、目的物質の粒子表面への固定が阻害される場合がある。
　本発明においては、容器内に、磁性体粒子７１と磁性固体６０とが共存する状態で、磁場操作によって、磁性固体とともに磁性体粒子を移動させる。磁場操作とは、具体的には、磁石９を移動させる操作である。磁石の移動方法としては、往復運動を含む直線移動、回転運動、その他不規則な軌道を描く運動等が挙げられる。磁場操作によって、図１（Ｃ）に示すように、凝集体を形成していた磁性体粒子が、液体試料内で分散される。磁性体粒子を効率的に分散させるためには、磁石９を、容器１０の外壁面に沿って往復運動させることが好ましい。
　液体内で、磁性固体とともに磁性体粒子を移動させることによって、磁性体粒子が分散される原理は必ずしも明らかではない。磁性固体および磁性体粒子の動きを目視観察した範囲では、磁性固体６０が容器１０の内壁面に沿って移動する際に、容器の内壁面と磁性固体との摩擦抵抗や、磁石の移動に対する磁性固体の追随の遅延に伴って、磁性固体が微振動していることが確認されている。この磁性固体の微振動が、磁性固体周辺に存在する磁性体粒子を分散させる作用を有するか、あるいは、磁性固体の微振動が、容器壁面と磁性固体との間に存在する磁性体粒子の凝集体を粉砕させる作用を有するため、磁性体粒子が、液体内で迅速に分散されると推定される。
　このように、磁性体粒子と磁性固体の共存下で、磁場操作を行うことにより、磁性体粒子の凝集状態が解けて、磁性体粒子が分散される。これにより、磁性体粒子と液体試料内の目的物質との接触機会が増大し、磁性体粒子の表面に目的物質を選択的に固定することができる。この方法によれば、磁性体粒子の表面に目的物質が選択的に固定されるため、高純度の目的物質を高効率で回収できる。そのため、本発明によれば、磁性体粒子を用いた目的物質の分離・精製において、溶解／固定の際の酵素処理を省略できる。
　酵素処理を省略できるために、分離・精製操作に要するコストを低減できる。また、酵素の添加を必要としないため、試料の追加や分注の操作が不要となり、操作を単純化できるとともに、コンタミネーションの危険性を低減できる。ピペット操作による分散は開放系で行う必要があるのに対して、本発明の方法は、閉鎖系で実施可能であることからも、コンタミネーションの危険性を低減できる。さらには、磁石の往復運動のような単純な動作で、液体中への磁性体粒子の分散を行い得るため、自動化も容易になし得る。
［溶解／固定後の操作］
　目的物質が固定された磁性体粒子７１は、液体試料３１から分離され、別の工程に供される。例えば、核酸の分離・精製では、磁性体粒子７１を洗浄液中で洗浄して表面に付着した夾雑物を洗浄除去した後、溶出液中で磁性体粒子に固定されていた核酸を遊離溶出させることにより、目的物質である核酸を回収できる。回収された核酸は、必要に応じて濃縮や乾固等の操作を行った後、分析や反応等に供することができる。
　洗浄や溶出の操作は、公知の方法で実施できる。例えば、容器に磁石を近付けて磁性体粒子を磁石付近の容器内に固定した状態で、容器内の液体を除去した後、新たな液体（洗浄液や溶出液）を容器内に投入し、液体内で磁性体粒子を分散させることにより、洗浄操作や溶出操作を行うことができる。液体内での磁性体粒子の分散は、ピペット操作、ボルテックス等の撹拌操作や、磁場操作などにより行い得る。この際、磁性固体は容器から取り出されてもよく、磁性体粒子と共に容器内に残されたままでもよい。
　上記では、磁性体粒子を用いて、核酸の分離・精製を行う例を中心に示したが、磁性体粒子に固定化される目的物質は核酸に限定されず、本発明は、核酸以外の各種の目的物質に対しても適用可能である。例えば、protein Gやprotein A等の抗体を選択的に固定化可能な分子で表面がコートされた磁性体粒子を用い、この磁性体粒子と磁性固体の共存下で、磁場操作を行うことにより、目的物質である抗体を、磁性体粒子の表面に選択的に固定することができる。抗体が固定化された磁性体粒子を、被検抗原を含む液体や酵素標識第二次抗体と順次接触させた後、磁性体粒子表面に固定された第二次抗体に結合している酵素と発色物質との発色反応をモニターすることにより、酵素免疫固定測定（ELISA; Enzyme-linked immuno-sorbent assay）を行うことができる。
　このように、目的物質の種類や、目的とする操作に応じて、デバイス内に装填される液体の種類を変更すれば、本発明は、目的物質の抽出、精製、分離のみならず、各種の反応、検出、定性・定量分析等にも応用できる。
［ゲル状媒体が封入されたデバイスを用いた操作］
　本発明の方法は、前述の特許文献２（ＷＯ２０１２／０８６２４３）に開示されているような、水系液体層と、ゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイスを用いた目的物質の分離・精製にも適用できる。このようなデバイスを用いる場合は、密閉系で一連の操作を実施できるため、開放系で行われるピペット操作に比べて、コンタミネーションの危険性を低減できる。
　以下では、図２を参照しながら、水系液体層と、ゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイスを用いて、核酸の分離・精製を行う例について説明する。図２－１（Ａ）に示す管状デバイス１５０では、磁性体粒子１７１を移動させる方向に沿って、核酸抽出液１３０、第一の洗浄液１３２、第二の洗浄液１３３、および核酸溶出液１３４が、それぞれの間にゲル状媒体層１２１，１２２，１２３を介して、管状の容器１１０内に装填されている。
　ゲル状媒体層１２１，１２２，１２３を形成するゲル状媒体は、粒子操作前においてゲル状、若しくはペースト状であればよい。ゲル状媒体は、それに隣接する液体層の液体に不溶性または難溶性であり、化学的に不活性な物質であることが好ましい。液体層が水系液体からなる場合、ゲル状媒体は、水系液体に不溶または難溶の油性ゲルであることが好ましい。また、ゲル状媒体層は、化学的に不活性な物質であることが好ましい。ここで、液体に不溶性または難溶性であるとは、２５℃における液体に対する溶解度が概ね１００ｐｐｍ以下であることを意味する。化学的に不活性な物質とは、液体層との接触や磁性体粒子の操作（すなわち、ゲル状媒体中で磁性体粒子を移動させる操作）において、液体層、磁性体粒子や磁性体粒子に固定された物質に、化学的な影響を及ぼさない物質を指す。
　ゲル状媒体の材料や組成等は、特に限定されない。ゲル状媒体は、例えば、液体油脂、エステル油、炭化水素油、シリコーン油等の非水溶性または難水溶性の液体物質に、ゲル化剤を添加してゲル化することにより形成される。ゲル化剤によって形成されるゲル（物理ゲル）は、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、静電的吸引力等の弱い分子間結合力により、三次元ネットワークを形成しており、熱等の外部刺激により可逆的にゾル・ゲル転移する。ゲル化剤としては、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、およびグリセリン脂肪酸エステル等が用いられる。ゲル化剤の使用量は、非水溶性または難水溶性の液体物質１００重量部に対して、例えば０．１～５重量部の範囲で、ゲルの物理特性等を勘案して適宜に決定される。
　ゲル化の方法は特に限定されない。例えば、非水溶性または難水溶性の液体物質を加熱し、加熱された当該液体物質にゲル化剤を添加し、ゲル化剤を完全に溶解させた後、ゾル・ゲル転移温度以下に冷却することで、物理ゲルが形成される。加熱温度は、液体物質およびゲル化剤の物性を考慮して適宜に決定される。
　また、ヒドロゲル材料（例えば、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、あるいはこれらの誘導体等）を、液体に平衡膨潤させることによって調製されたものを、ゲル状媒体として用いることもできる。ヒドロゲルとしては、ヒドロゲル材料を化学架橋したものや、ゲル化剤（例えばリチウム、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属・アルカリ土類金属の塩、或いはチタン、金、銀、白金等の遷移金属の塩、さらには、シリカ、カーボン、アルミナ化合物等）によってゲル化したもの等を用いることもできる。
　容器１１０内へのゲル状媒体および液体の装填は、適宜の方法により行い得る。管状の容器が用いられる場合、装填に先立って容器の一端の開口が封止され、他端の開口部からゲル状媒体および水系液体が順次装填されることが好ましい。内径が１～２ｍｍ程度のキャピラリーのような小さな構造体へ、ゲル状媒体を装填する場合、例えば、アーロック式シリンジに金属製注射針を装着して、キャピラリー内の所定位置へゲル状媒体を押し出す方法により、装填が行われる。
　容器内に装填されるゲル状媒体および液体の容量は、操作対象となる磁性体粒子の量や、操作の種類等に応じて適宜に設定され得る。容器内に複数のゲル状媒体層や液体層が設けられる場合、各層の容量は同一でも異なっていてもよい。各層の厚みも適宜に設定され得るが、操作性等を考慮した場合、層厚みは、例えば、２ｍｍ～２０ｍｍ程度が好ましい。
　核酸の抽出を行うために用いられる核酸抽出液１３０としては、前述の細胞溶解液（例えば、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ等のキレート剤、トリス塩酸等を含有する緩衝液）が挙げられる。容器１１０の最上部には、核酸抽出液１３０に加えて、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０が予め装填されている。磁性体粒子１７１は、核酸を選択的に固定可能なものであり、例えば、シリカコートされた磁性体粒子が用いられる。
　液体層とゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイス１５０の上部の開口部から、核酸抽出液１３０中に、血液等の核酸を含む試料が添加される。これにより、核酸抽出液と核酸を含む溶液（液体試料）１３１が調製される。液体試料１３１の容器側面に磁石９を近付けると、磁石９周辺の容器内壁面に、磁性固体１６０および磁性体粒子１７１が引き寄せられる（図２－１（Ｂ））。磁石９を容器１１０の外壁面に沿って往復運動させることにより、磁性固体１６０が液体試料中を移動させられ、これに伴って、液体試料１３１中に磁性体粒子１７１が分散される（図２－１（Ｃ））。この操作によって、液体試料中の核酸が、磁性体粒子の表面に選択的に固定される。
　その後、磁性固体１６０は系外に取り出されてもよく、磁性体粒子１７１と共存した状態で、以降の工程が行われてもよい。磁性固体１６０を取り出すことなく、磁性体粒子１７１とともにデバイス内を移動させることにより、洗浄や溶出の効率を高めることができる。また、デバイスの密閉状態を維持できるため、コンタミネーションの危険性を低減できる。
　磁石９を、容器外壁面に沿って移動させることにより、磁性体粒子１７１は、ゲル状媒体層１２１内へ移動させられる。この際、磁性体粒子１７１と磁性固体１６０とが一体となって、ゲル状媒体内を移動する（図２－２（Ｄ））。磁性体粒子１７１がゲル状媒体層１２１内へ侵入する際に、磁性体粒子１７１の周囲に液滴として物理的に付着している液体の大半は、粒子表面から脱離して液体層１３１の液分に残る。一方、磁性体粒子１７１は、粒子に固定された目的物質を保持したまま、ゲル状媒体層１２１内を容易に移動できる。
　ゲル状媒体層１２１内への磁性体粒子１７１および磁性固体１６０の進入および移動により、ゲル状媒体が穿孔されるが、チクソトロピックな性質により、ゲルは自己修復する。磁場操作により、磁性体粒子がゲル内を移動する際、剪断力が付与されると、チクソトロピックな性質により、ゲルは局所的に流動化（粘性化）する。そのため、磁性体粒子および磁性固体は、流動化した部分を穿孔しながら、ゲル内を容易に移動できる。磁性体粒子が通過した後、剪断力から解放されたゲルは、速やかに元の弾性状態に復元する。そのため、磁性体粒子が通過した部分に貫通孔が形成されず、磁性体粒子の穿孔部分を介して、液体がゲル内へ流入することは、ほとんど生じない。なお、磁石９の移動速度が過度に大きいと、ゲルが物理的に破壊され、復元力が失われる場合がある。そのため、磁石の移動速度は、０．１～５ｍｍ／秒程度とすることが好ましい。
　上記のようなゲルのチクソトロピックな性質による復元力が、磁性体粒子１７１に付随する液体を搾り取る作用を奏する。そのため、磁性体粒子１７１が凝集体となり、その中に液滴が取り込まれた状態でゲル状媒体層１２１内へ移動した場合でも、ゲルの復元力によって、磁性体粒子と液滴とが分離され得る。
　ゲル状媒体層１２１内を通過した磁性体粒子１７１および磁性固体１６０は、磁場操作により、ゲル状媒体層１２１から液体層１３２へと移動させられる。上述のように、ゲル状媒体層１２１の磁性体粒子や磁性固体が通過した部分には貫通孔が形成されないため、液体層１３２への液体試料１３１の流入はほとんど生じない。
　液体層１３２は、例えば洗浄液である。洗浄液は、核酸が磁性体粒子の表面に固定された状態を保持したまま、磁性体粒子に付着した核酸以外の成分（例えばタンパク質、糖質等）や、核酸抽出等の処理に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。なお、液体層１３３も洗浄液であってもよい。液体層１３２，１３３がいずれも洗浄液である場合、これらの洗浄液の組成は、同一でもよく異なっていてもよい。
　液体層１３２の側面に沿って磁石９を移動させると、磁性固体１６０および磁性体粒子１７１も、磁石９の移動に伴って液体層内を移動する。この際、凝集体を形成していた磁性体粒子１７１が、液体層１３２内で分散される（図２－２（Ｅ））。磁性体粒子１７１に加えて、磁性固体１６０を、液体層内へ移動させることにより、溶解／固定の際と同様に、磁性体粒子を効率よく液体中に分散させることができ、洗浄効率を高めることができる。洗浄効率を高めるためには、液体層１３２の側面（容器の外壁面）に沿って磁石を往復運動させることが好ましい。
　その後、磁石９を液体層１３２の側面から、ゲル状媒体層１２２の側面に移動させる（図２－２（Ｆ））。さらに、磁石９を液体層１３３の側面へ移動させた後、磁石を往復運動させることにより、磁性体粒子を十分に分散させ、液体層１３３中で磁性体粒子の洗浄が行われる（図２－２（Ｇ））。
　なお、図２では、容器１１０内に、ゲル状媒体層１２２を介して、洗浄液として２層の液体層１３２，１３３が装填された例が示されているが、洗浄液は１層のみでもよく、３種以上が用いられてもよい。また、分離の目的や、用途における不所望の阻害が生じない範囲において、洗浄を省略することもできる。
　磁石９を第二の洗浄液１３３の側面から、ゲル状媒体層１２３の側面に移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０を、ゲル状媒体層１２３内へ移動させる（図２－２（Ｈ））。さらに、磁石９を、核酸溶出液１３４の側面に移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０を、核酸溶出液１３４内へ移動させる。
　核酸溶出液としては、水または低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水等を用いることができる。中でも、ｐＨ７～９に調整された５～２０ｍＭトリス緩衝液を用いることが一般的である。核酸が固定された粒子が核酸溶出液中に移動することにより、磁性体粒子の表面に固定された核酸を遊離させることができる。核酸を遊離させる具体的方法は、上記溶出液中で粒子を分散させる方法が挙げられる。例えば、核酸溶出液１３４の側面に沿って磁石９を移動させると、磁性固体１６０とともに磁性体粒子１７１が移動し、磁性体粒子１７１が核酸溶出液内で分散される（図２－２（Ｉ））。これにより、磁性体粒子１７１の表面に固定されていた核酸が効率的に脱着され、核酸溶出液内に遊離するために、核酸の回収率が高められる。
　その後、必要に応じて、図２－２（Ｊ）に示すように、磁石９を容器の外壁面に沿ってゲル状媒体層１２３側へ移動させ、磁性体粒子１７１および磁性固体１６０をゲル状媒体層１２３内へ再び進入させる。この操作によって、核酸溶出液１３４から磁性体粒子１７１および磁性固体１６０が除去されるため、核酸溶出液の回収が容易となる。
　上記のように、液体層とゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイスを用いる場合、液体層は、ゲル状媒体層間やゲル状媒体層と容器との間に保持されているため、密閉系を保ったままで外部からアクセスできない。この実施形態では、密閉系を保持したままで、液体層中に磁性体粒子を分散できるため、ピペット操作により磁性体粒子を分散させる場合に比べて、外部からのコンタミネーションを抑制できる。
　この実施形態では、ゲル状媒体層中で磁性体粒子を移動させることにより、固液分離が行われる。そのため、ピペット操作により、磁性体粒子と洗浄液や溶出液等の試薬との固液分離を行う場合に比して、より少ない磁性体粒子や試薬量で、目的物質を効率よく分離・回収することが可能となる上に、廃液量も大幅に抑制し得る。また、溶解／固定液（核酸抽出液）に、血液等の試料を添加した後は、容器の外壁面に沿って磁石を移動させるのみの単純な操作で、目的物質の固定から溶出までを行い得るため、操作の自動化も容易になし得る。
［粒子操作用デバイスおよびキット］
　本発明の方法は、目的物質の溶解／固定の際の酵素処理が不要であるため、操作用デバイスの作製も容易である。すなわち、容器内に、磁性体粒子と、磁性固体と液体とを装填するだけで、図１に示すような、溶解／固定のためのデバイスを作成できる。容器内に装填される液体は、例えば、核酸抽出液等の細胞を溶解可能な液体である。この液体は、磁性体粒子の凝集を防ぐためのアルコール等が添加されたものでもよい。
　容器とは別に、磁性体粒子、磁性固体および液体等が、独立に提供されてもよい。例えば、容器内に、細胞を溶解可能な液体と磁性固体とが装填されたデバイス本体とは別個に、磁性体粒子が単体あるいは液体中に分散された状態で独立に提供されてもよい。この場合、磁性体粒子は、デバイスを作製するためのキットの一構成部材として提供されてもよい。磁性固体も、デバイス本体とは別に提供されてもよい。磁性体粒子と磁性固体とを液体中に共存させた状態で、キットの構成部材として提供することもできる。なお、磁性固体が液体中に分散された状態で、デバイスまたはキットが提供される場合、デバイスやキットの保管状態で、磁性固体が液体に長時間接触させられる。そのため、磁性固体の腐食や劣化を防止する目的で、前述のように、金属表面にコーティングが施された磁性固体を用いることが好ましい。
　また、図２に示すような液体層とゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイスも、容易に作製できる。容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、粒子操作の直前に行われてもよく、粒子操作前に十分な時間をおいて行われてもよい。前述のように、ゲル状媒体が液体に不溶または難溶である場合は、装填後に長時間が経過しても、両者の間での反応や吸収はほとんど生じない。
　液体層とゲル状媒体層とが交互に重層された磁性体粒子操作用デバイスは、図２－１（Ａ）に示すように、容器内に磁性体粒子１７１と磁性固体１６０とが装填された状態で提供することもできる。なお、図２－１（Ａ）では、液体層１３０内に磁性固体１６０が装填されているが、例えば、ゲル状媒体層１２１内に磁性固体１６０が装填されていてもよい。この場合は、溶解／固定で磁性体粒子の操作を行う前に、磁場操作によって、ゲル状媒体層１２１内の磁性固体１６０を、液体層内へ移動させればよい。
　デバイス内あるいはキットに含まれる磁性体粒子の量は、対象となる化学操作の種類や、各液体層の容量等に応じて適宜に決定される。例えば、容器として、内径１～２ｍｍ程度の細長い円筒形のキャピラリーが用いられる場合の磁性体粒子の量は、通常、１０～２００μｇ程度の範囲が好適である。
　以下では、シリカコートされた磁気ビーズを用いてヒト全血からＤＮＡを抽出する実験例により、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は下記の例に限定されるものではない。
[参考例１]
＜溶出／固定＞
　ヒト全血２００μＬを、容量１．５ｍＬのポリプロピレンチューブ（Eppendorf セイフロックチューブ Cat.No. 0030 120.086）に採取し、Proteinase K（２０ｍｇ／ｍＬ）水溶液５μＬを加え、１０秒間混合した。ここに、溶解／固定液 (30 mM Tris-HCl pH 8.0、30mM EDTA、5% Tween-20、0.5% Triton X-100、800 mM 塩酸グアニジン）１００μＬを加え、１０秒間混合した後、予め６８℃に保温したアルミブロック恒温槽で５分間インキュベートした。恒温槽からチューブを取出し、直ちに、イソプロパノール（７５μＬ）に懸濁した平均粒子径約３μｍの磁性ビーズ（東洋紡製の核酸抽出キット「MagExtractorTM-Genome」に付属の核酸抽出用シリカコート磁気ビーズ）１ｍｇを加え、連続攪拌用アダプタを取り付けたボルテックスミキサーで５分間攪拌した。磁性体粒子分離用スタンドにチューブをセットし、１分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体を除去した。
＜洗浄＞
　スタンドからチューブを外し、第１洗浄液（37% エタノール、4.8M 塩酸グアニジン、20mM Tris-HCl pH7.4）５００μＬを加え、チューブ内壁に集められた磁気ビーズ塊をピペッティングにより十分再懸濁した後、スタンドに再セットし、１分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体を除去した。スタンドからチューブを外し、第２洗浄液（2mM Tris-HCl pH7.6、80％ エタノール、20mM NaCl）５００μＬを加え、上記と同様に、再懸濁後にスタンドにセットして液体を除去した。
＜溶出＞
　スタンドからチューブを外し、溶出液として蒸留水２００μＬを加え、磁気ビーズ塊をピペッティングにより再懸濁し、室温で５分間放置した。ピペッティングにより磁気ビーズを再懸濁させ、スタンドにチューブをセットし、１分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体（ＤＮＡ溶出液）を回収した。
［実施例１］
　ヒト全血２００μＬを、容量１．５ｍＬのポリプロピレン製樹脂チューブに採取し、Proteinase Kを加えずに、溶解／固定液（50mM Tris-HCl pH 6.4、10 % Triton X-100、4M グアニジンイソシアネート）を加え、１０秒間混合した。ここに、上記参考例１と同様に、イソプロパノールに懸濁した磁性ビーズを加え、さらに、粒径１ｍｍのスチール球（新東工業製）を一個投入した。次に、ネオジム磁石（直径６ｍｍ、長さ２３ｍｍの円柱形、二六製作所製　商品名「ＮＥ１２７」）を、チューブの底からキャップ付近までの約２ｃｍの距離で、チューブの外壁面に沿って毎秒５回の反復速度で往復移動させた。この際、スチール球が磁石に追随するように移動し、これに伴って磁気ビーズが液中で分散することが目視で確認された。
　磁性体粒子分離用スタンドにチューブをセットし、１分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体を除去した。その後は、上記参考例１と同様にして、洗浄および溶出を行い、ＤＮＡ溶出液を回収した。
［比較例１］
　上記実施例１と同様に、ヒト全血に溶解／固定液、およびイソプロパノールに懸濁した磁性ビーズを加えた。その後、スチール球を投入せずに、ボルテックスミキサーで１分間攪拌し、磁性体粒子分離用スタンドにチューブをセットしてチューブ内の液体を除去した。その後は、上記参考例１と同様にして、洗浄および溶出を行い、ＤＮＡ溶出液を回収した。
[評価]
　参考例、実施例および比較例で回収した溶出液のＵＶ吸収スペクトルを、分光光度計（島津製作所製「ＢｉｏＳｐｅｃ　ｎａｎｏ」）により測定した。結果を図３に示す。また、ＵＶ吸収スペクトルから求めた、波長２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０、およびＡ２６０／Ａ２３０）、ならびにＤＮＡの回収量を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　純度の高いＤＮＡでは２３０ｎｍ付近に吸光度の極小値（ピークの谷）が現れ、２６０ｎｍと２３０ｎｍの吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２３０）が大きいほど、純度が高いことを示している。溶解／固定の際に酵素処理が行われた参考例１、および溶解／固定の際にスチール球の共存下で磁性体粒子の操作が行われた実施例１では、２３０ｎｍ付近に吸光度の極小が存在し、ＤＮＡが精製されていることが確認された。一方、溶解／固定の際に酵素処理が行われなかった比較例１では、吸光度の極小が２４０ｎｍ付近にシフトしており、Ａ２６０／Ａ２３０が約０．４と小さかった。これは、低分子夾雑成分が多く混入しているために、短波長側の吸収のバックグラウンドが上昇したためであると考えられる。そのため、比較例１では、ＤＮＡの回収量を正確に定量することができなかった。
　参考例１では、Ａ２６０／Ａ２３０が約１．３であり、ＰＣＲ等に用いるための純度としては許容レベルであった。しかしながら、参考例１では、ＤＮＡの回収量が十分ではなかった。この結果から、溶解／固定操作において酵素処理を行った場合でも、ボルテックスミキサーによる撹拌では、ペプチド等で磁気ビーズ表面がマスキングされた状態が十分に解消されず、磁気ビーズ表面へのＤＮＡの固定が阻害され、純度が低下していると考えられる。
　一方、実施例１では、酵素処理を行っていないにも関わらず、Ａ２６０／Ａ２３０が１．４を超えていた。また、ＤＮＡの精製度の指標となる２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０）も参考例１を上回っており、ＤＮＡの純度および回収量のいずれにおいても、実施例１は、酵素処理を行った参考例１よりも優れていることが分かる。この結果から、溶解／固定操作において酵素処理を行わなくても、磁気ビーズよりも粒径の大きい磁性固体の共存下で磁場操作を行うことにより、磁気ビーズ表面に目的物質を選択的に固定させ、高純度の目的物資が得られることが分かる。
　　１０，１１０　容器
　　６０，１６０　磁性固体
　　７１，１７１　磁性体粒子
　　３１，１３１　液体試料
　　９　磁石
　　１５０　核酸抽出用粒子操作デバイス
　　１２１～１２３　ゲル状媒体
　　１３０　液体層（核酸抽出液）
　　１３２，１３３　液体層（洗浄液）
　　１３４　液体層（核酸溶出液）

Claims (11)

  1. 　液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法であって、前記磁性体粒子は、前記目的物質を選択的に固定可能な粒子であり、
    　前記液体試料と、前記磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを容器内に共存させた状態で、前記容器の外部からの磁場操作により、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が前記液体試料中で移動させられることにより、前記磁性体粒子の表面に前記目的物質が選択的に固定される、磁性体粒子の操作方法。
  2. 　前記磁性体粒子が選択的に固定し得る前記目的物質が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上である、請求項１に記載の磁性体粒子の操作方法。
  3. 　前記液体試料が、細胞を溶解可能な成分を含む、請求項１または２に記載の磁性体粒子の操作方法。
  4. 　前記磁性固体は、粒径が１００μｍ以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。
  5. 　前記磁性固体の粒径が、前記磁性体粒子の粒径の１０倍以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。
  6. 　前記磁場操作によって、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が、前記液体試料中で往復運動させられる、請求項１～５のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。
  7. 　前記磁性固体は、液体内での腐食を防止するためのコーティング層を表面に有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の磁性体粒子の操作方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法により、磁性体粒子の表面に目的物質が選択的に固定された後、
    　前記目的物質が固定された前記磁性体粒子が、溶出液に接触させられることにより、前記目的物質が前記溶出液中に溶出される、磁性体粒子の操作方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法に用いるための磁性体粒子操作用デバイスであって、
    　容器内に、液体と、目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とが装填されている、磁性体粒子操作用デバイス。
  10. 　前記容器内に装填された液体が、細胞を溶解可能な液体である、請求項９に記載の磁性体粒子操作用デバイス。
  11. 　前記磁性体粒子および前記磁性固体が、前記液体中で共存している、請求項９または１０に記載の磁性体粒子操作用デバイス。
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