DE69600924T2

DE69600924T2 - Apparat und verfahren zum mischen und trennen durch verwendung von magnetischen teilchen

Info

Publication number: DE69600924T2
Application number: DE69600924T
Authority: DE
Inventors: Iqbal W. Dr. Brea Calif. Siddiqi
Original assignee: Individual
Current assignee: Sigris Research Inc Brea Calif Us
Priority date: 1995-02-21
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2016-02-17
Also published as: US6228268B1; ATE172890T1; US6231760B1; EP0810905B1; JP3962789B2; JPH11500952A; WO1996026011A1; DE69600924D1; EP0810905A1; AU4927496A; US6033574A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und Verfahren zur Mischung und Trennung magnetischer Teilchen zum Zwecke der Isolierung von interessierenden Substanzen aus einem unmagnetischen flüssigen Testmedium.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Die magnetische Trennung von Biomolekülen und Zellen auf Basis magnetischer Teilchen und unter Benutzung biospezifischer Affinitätsreaktionen ist wegen der Selektivität, Einfachheit und Schnelligkeit von Vorteil. Diese Technik hat sich in der analytischen und präparativen Biotechnologie als ganz nützlich erwiesen und wird nun für Biotests und die Isolierung von Zielsubstanzen, wie Zellen, Proteinen, Nukleinsäuresequenzen und dergl. in zunehmendem Maße benutzt.
Der hier benutzte Ausdruck "Rezeptor" bezieht sich auf eine Substanz oder eine Gruppe von Substanzen mit einer biospezifischen Bindungsaffinität für einen gegebenen Liganden bei wesentlichem Ausschluß anderer Substanzen. Unter den Rezeptoren, die zu biospezifischen Bindungsaffinitätsreaktionen neigen, sind Antikörper (monoklonale und polyklonale), Antikörperfragmente, Enzyme, Nukleinsäuren, Lectine und dergl.. Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf Substanzen, wie Antigene, Haptene, und verschiedene zellgebundene Strukturen mit wenigstens einer charakteristischen Determinante oder einem Epitop, wobei diese Substanzen durch einen Rezeptor biospezifisch erkannt und an ihn gebunden werden können. Die Bezeichnung "Zielsubstanz" bezieht sich auf ein Element eines biospezifischen Bindungsaffinitätspaares, d. h. eines Substanzpaares oder einer Substanz und einer Struktur, die gegenseitige Wechselwirkungsaktivität zeigen, und umfaßt solche Dinge, wie biologische Zellen oder Zellkomponenten, biospezifische Liganden und Rezeptoren.
Die Affintätstrennung bezieht sich auf bekannte Verfahrenstechniken, bei denen eine Zielsubstanz, die mit anderen Substanzen in einem flüssigen Medium gemischt ist, durch eine biospezifische Affinitäts- Bindungsreaktion an die Oberfläche einer festen Phase gebunden wird. Substanzen, denen das spezifische Molekül oder die spezifische Struktur der Zielsubstanz fehlen, werden nicht an die feste Phase gebunden und können zwecks Trennung der gebundenen Substanz entfernt werden, oder umgekehrt. Kleine Teilchen, insbesondere polymere kugelförmige Teilchen haben sich als feste Phase als ziemlich brauchbar erwiesen, da sie zweckdienlich mit Biomolekülen beschichtet werden können, eine sehr hohe spezifische Oberfläche liefern und eine brauchbare Reaktionskinetik ergeben. Die Trennungen von Teilchen, die gebundene Zielsubstanz (gebundenes Material) enthalten, von dem flüssigen Medium (freies Material) kann durch Filtration oder durch Schwerkraftwirkungen, z. B. Absetzen oder Zentrifugieren, bewerkstelligt werden.
Die Trennung gebundener/freier Fraktionen wird durch Verwendung magnetisierbarer Teilchen stark vereinfacht, die die Trennung der an das Teilchen gebundenen Substanz durch ein Magnetfeld erlauben. Kleine magnetisierbare Teilchen sind in der Technik gut bekannt, ebenso ihre Benutzung bei Trennungen im Zusammenhang mit immunologischen und anderen biospezifischen Affinitätsreaktionen. Kleine magnetisierbare Teilchen fallen im allgemeinen in zwei breite Kategorien. Die erste Kategorie umfaßt Teilchen, die permanent magnetisiert sind, und die zweite Kategorie umfaßt Teilchen, die nur unter der Wirkung eines Magnetfeldes magnetisch werden. Die letzteren werden als paramagnetische oder super-paramagnetische Teilchen bezeichnet und werden gewöhnlich gegenüber permanent magnetisierten Teilchen bevorzugt.
Die Oberfläche paramagnetischer Teilchen wird für viele Anwendungen mit einem geeigneten Liganden oder Rezeptor, wie etwa Antikörper, Lectine, Oligonukleotide, oder andere bioreaktive Moleküle beschichtet, die eine Zielsubstanz aus einem Gemisch mit anderen Substanzen selektiv binden können. Beispiele kleiner magnetischer Teilchen oder Kügelchen sind beschrieben in US-Patent Nr. 4,230,685, vom 28.10.1980; US-Patent Nr. 4,554,088 vom 19.11.1985; und US-Paten Nr. 4,628,037 vom 9. Dezember 1986. Die Verwendung paramagnetischer Teilchen wird behandelt in den Veröffentlichungen "Application of Magnetic Beads in Bioassays" von B. Haukanes und C. Kvam. Bio/Technology, 11 : 60-63 (1993); "Removal of Neuroblastoma Cells from Bone Marrow with Monoclonal Antibodies Conjugated to Magnetic Microspheres" von J. G. Treleaven et.al., Lancet, 14. Januar 1984, Seite 70-73; "Depletion of T Lymphocytes from Human Bone Marrow" von F. Vartdal et.al., Transplantation, 43 : 366-71 (1987); "Magnetic Monosized Polymer Particles for Fast and Specific Fractionation of Human Mononuclear Cells" von T. Lea et.al., Scandinavian Journal of Immunology, 22 : 207-16 (1985); und "Advances in Biomagnetic Separations" (1994), M. Uhlen et.al. Herausgeber Eaton Publishing Co., Natick, MA.
Das magnetische Trennverfahren umfaßt typischerweise die Mischung der Probe mit paramagnetischen Teilchen in einem flüssigen Medium zur Bindung der Zielsubstanz durch Affinitätsreaktion und dann die Trennung des gebundenen Teilchen/Zielkomplexes von dem Probemedium durch Anwendung eines Magnetfeldes. Alle magnetischen Teilchen mit Ausnahme jener Teilchen, die kolloid sind, setzen sich mit der Zeit ab. Das flüssige Medium muß daher bis zu einem gewissen Maße gerührt werden, um die Teilchen eine ausreichende Zeitdauer suspendiert zu halten, damit die Bioaffinitäts-Bindungsreaktion eintreten kann. Beispiele bekannter Rührverfahren sind das Schütteln, Wirbeln, Hin- und Herbewegen, Rotieren oder ähnliche Behandlungen eines teilweise gefüllten Behälters. In manchen Fällen ist die Affinitätsbindung zwischen der Zielsubstanz und den paramagnetischen Teilchen relativ schwach, so daß sie durch starke Turbulenz in dem flüssigen Medium getrennt wird. In anderen Fällen sind biologische Zielsubstanzen, wie Zellen, zelluläre Fraktionen und Enzymkomplexe äußerst fragil, und sie werden ebenfalls durch äußerste Turbulenz zerlegt oder denaturiert.
Übermässige Turbulenz ist nur einer von mehreren signifikanten Nachteilen und Mängeln der Vorrichtung und der Verfahren, die im Stand der Technik der biomagnetischen Trennungen zur Anwendung kamen. Die spezifische Konfiguration einer magnetischen Trennvorrichtung zur Trennung eines partikelgebundenen Zielkomplexes von dem flüssigen Medium hängt von der Art und Größe der magnetischen Teilchen ab. Paramagnetische Teilchen in dem Größenbereich von 0,1 bis 10 mm werden mittels im Handel erhältlicher magnetischer Trenngeräte leicht entfernt. Beispiele für solche magnetischen Trenngeräte sind die Dynal MPC-Reihe der Separatoren, die von Dynal, Inc., Lake Success, NY hergestellt werden, sowie die Geräte der BioMag Separator-Reihe, die von PerSeptive Diagnostics, Cambridge, MA hergestellt werden, sowie ein magnetisches Trenngestell, das in US-Patent Nr. 4,895,650 beschrieben ist. Diese Geräte benutzen Permanentmagnete, die außerhalb eines ein Testmedium enthaltenden Behälters angeordnet sind, und besorgen nur die Trennung. Die Mischung der paramagnetischen Teilchen in dem Testmedium für die Affinitäts-Bindungsreaktion muß getrennt erfolgen. Beispielsweise erfordert die Dynal MPC-Reihe der Separatoren ein separates Mischgerät, einen Dynal-Probenmischer, für das Rühren der Testmedien. Das Verfahren muß während der verschiedenen Stufen der Mischung, Wäsche und Trennung aktiv überwacht werden und erfordert eine beträchtliche Bedienung durch die Bedienungsperson. Daher ist die Leistungsfähigkeit dieser Geräte notwendigerweise durch die Kenntnis und Leistungsfähigkeit des Bedienungsmanns begrenzt.
US-Patent Nr. 4,910,148 vom 20. März 1990 beschreibt ein Gerät und ein Verfahren zur Trennung von Tumorzellen von gesunden Zellen. Immunoreaktive paramagnetische Teilchen und Knochenmarkzellen werden durch Rührung des flüssigen Mediums auf einer hin- und hergehenden Plattform gemischt. Wenn sich die Teilchen an die Tumorzellen gebunden haben, werden sie von dem flüssigen Medium durch Magnete abgetrennt, die außerhalb auf der Plattform angeordnet sind. Obgleich diese Mischung die Flüssigkeitsturbulenz minimiert, schafft sie keinen wirksamen Kontakt zwischen den Teilchen und der Zielsubstanz. Außerdem ist der Nutzen dieses Geräts auf die Trennung von Zellen aus relativ großen Probevolumina beschränkt.
US-Patent Nr. 5,238,812 vom 24. August 1993 beschreibt ein kompliziertes Gerät zur schnellen Mischung zwecks Förderung von Bioaffiniaäts-Bindungsreaktionen unter Benutzung einer U-Rohrkonstruktion als Mischer. Das U-Rohr wird 5 bis 15 Sekunden schnell hin- und herbewegt oder gedreht, um die magnetischen Teilchen in dem Testmedium zu mischen, und dann wird ein Magnet dicht an den Boden des U-Rohres herangebracht, um die magnetischen Teilchen abzutrennen. Wie in diesem Patent angegeben ist, ist seine Brauchbarkeit auf die Behandlung sehr kleiner Volumina (< 1000 ml) des Testmediums begrenzt.
US-Patent Nr. 5,336,760 vom 9. August 1994 beschreibt ein Misch- und magnetisches Trenngerät mit einer auf einer Plattform angebrachten Kammer und einem oder mehreren direkt an dem Behälter angeordneten Magneten sowie mit einem komplizierten Mechanismus aus Getriebe und Motor, um die Plattform zu drehen. Immunoreaktive, paramagnetische Teilchen werden in dem Testmedium gemischt, indem zuerst ein Edelstahl-"Halter" zwischen der Kammer und dem Magnet angeordnet wird, um sie gegen das Magnetfeld abzuschirmen, und dann die Plattform zwischen der vertikalen und horizontalen Lage gedreht wird. Die Teilchen in dem Testmedium werden durch End-über-End-Bewegung der Kammer gemischt, um die Bindung der Zielsubstanz zu erleichtern. Nach der Mischung wird der "Halter" entfernt, so daß die magnetischen Teilchen durch das einwirkende Magnetfeld erfaßt werden. Obgleich dieses Patent die Bequemlichkeit eines einzigen Geräts zum Mischen und Trennen schafft, erfordert dieses einen komplizierten Mechanismus. Außerdem bewirkt die Rührung des flüssigen Mediums durch End-über-End-Drehung keine wirksame Mischung relativ schwimmfähiger Teilchen, und die Flüssigkeitsturbulenz kann die Zielsubstanz auch abscheren oder beschädigen.
Das am 23. Juli 1986 veröffentlichte SU-A-1245343 beschreibt ein Gerät zum Abscheiden fein verteilter magnetischer Materialien auf magnetischer Basis. Bei diesem Gerät dient eine Kombination von Magnetfeldern dazu, magnetische Blättchen in einer flüssigen Supension zu halten, während nicht-magnetische Rückstände unter Schwerkraft sedimentieren und aus dem System entfernt werden. Eins der benutzten Magnetfelder, um die Suspension der Blättchen aufrechtzuerhalten, wird durch eine rotierende Magnetquelle geschaffen, die so angeordnet ist, daß sich einzelne Magnete in Bezug auf einen die Flüssigkeit enthaltenden Behälter tangential bewegen.
US-Patent Nr. 5,110,624 vom 5. Mai 1992 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung magnetisierbarer poröser Teilchen und beschreibt eine magnetisch stabilisierte Durchlauf-Wirbelbettkolonne (MSFB) zur Isolierung von Proteinen aus Zell-Lysat. Die MSFB-Kolonne ist lose mit einem Bett magnetisierbarer Teilchen gefüllt und mit Einrichtungen zur Schaffung eines stationären Magnetfeldes ausgerüstet, das parallel zur Strömung der Lösung durch die Kolonne verläuft. Die Teilchen werden durch Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit der Lösung und der Stärke des Magnetfeldes in einem magnetisch stabilisierten Wirbelbett gehalten. Wie in diesem Patent angegeben, vergrößert das MSFB einfach das Leerraumvolumen des Bettes, um die Verschmutzung des Teilchenbetts oder einen Strömungsverschluß zu verhindern. Obgleich ein MSFB eine gute Durchmischung ergeben kann, ist es eine komplizierte Technik, die eine genaue Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit und Magnetstärke erfordert, so daß die kombinierte Wirkung der Strömungsmittelgeschwindigkeit und der magnetischen Anziehung die Wirkung der Schwerkraft auf die Teilchen genau kompensiert. Die Konstruktion der MSFB ist jedoch für den Einsatz mit kleinen Prüfvolumina nicht optimiert und kann für Anwendungen, wie Biotests oder Zelltrennungen nicht optimiert werden. Daher ist seine Brauchbarkeit etwas begrenzt.
Die Hauptnachteile der beschriebenen Geräte und Verfahren sind aus dem vorstehenden Überblick des Standes der Technik ersichtlich. Obgleich die bestehenden Geräte und Verfahren gewisse Vorteile bei der Durchführung der magnetischen Trennung bieten, unterliegen die bekannten Arbeitsverfahren Einschränkungen, darunter der Notwendigkeit eines getrennten oder mechanisch komplizierten Mischmechanismus sowie auch verschiedener Verfahrenseinschränkungen und Leistungsmängel. Es ist daher erwünscht, Geräte zur magnetischen Trennung zu schaffen, die von relativ einfacher Konstruktion und Betriebsweise sind, an die Verarbeitung großer oder kleiner Volumina der Testflüssigkeit angepaßt werden können und zahlreiche Testproben gleichzeitig verarbeiten können. Ferner ist es erwünscht, die Mischung und Trennung auf einem einzigen Gerät durchzuführen, das die Mischwirksamkeit der paramagnetischen Teilchen in dem Testmedium ohne Verursachung einer signifikanten Flüssigkeitsturbulenz maximiert.

Abriß der Erfindung

Nach der vorliegenden Erfindung erfolgt die Affinitätstrennung einer Zielsubstanz von einem Testmedium durch Mischung magnetischer Teilchen mit auf der Oberfläche immobilisierten Liganden oder Rezeptoren, um so eine spezifische Affintäts-Bindungsreaktion zwischen den magnetischen Teilchen und der Zielsubstanz zu fördern. Das Testmedium mit den magnetischen Teilchen in einem geeigneten Behälter ist in einem erfindungsgemäßen Gerät entfernbar angebracht, und in dem Testmedium wird ein Magnetfeldgradient geschaffen. Dieser Gradient veranlaßt die magnetischen Teilchen, sich relativ zu dem bewegungslosen Testmedium zu bewegen. Je nach der benutzten Ausführungsform der Erfindung wird zur Mischung der magnetischen Teilchen in dem Testmedium die Bewegung der magnetischen Quelle oder des Behälters in Gang gesetzt und eine genügende Zeit fortgesetzt, um durch Affinitätsreaktion eine optimale Bindung der Zielsubstanz zu gewährleisten. Die Bewegung des Magneten oder des Behälters wird dann angehalten, wodurch die magnetischen Teilchen auf der Innenseite der Behälterwandung an der dem Magneten nächsten Stelle immobilisiert werden. Das verbleibende Testmedium kann entfernt werden, während die magnetischen Teilchen auf den Behälterwandungen verbleiben und nach Wunsch einer weiteren Verarbeitung unterworfen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung, die als neu erachtet werden, sind insbesondere in den folgenden Ansprüchen angegeben. Die vorliegende Erfindung kann hinsichtlich ihrer Organisation und Ausführungsweise zusammen mit weiteren Zielen und Vorteilen am besten anhand der folgenden Beschreibung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung verstanden werden.
Fig. 1 zeigt eine perspektivische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die einen stationären Magneten dicht an einem beweglichen Behälter umfaßt, der teilweise mit einem magnetische Teilchen enthaltenden Testmedium gefüllt ist;
Fig. 2 zeigt eine perspektivische Darstellung eines anderen erfindungsgemäßen Geräts, das einen beweglichen Magneten dicht an einem stationären Behälter umfaßt, der mit einem magnetische Teilchen enthaltenden Testmedium teilweise gefüllt ist.
Fig. 3 zeigt eine perspektivische Ansicht eines erfindungsgemäßen Geräts, das eine Reihe beweglicher Magnete dicht an entsprechenden stationären Behältern umfaßt, wobei die Magnete durch einen gemeinsamen Mechanismus drehbar angeordnet sind;
Fig. 4 zeigt eine perspektivische Darstellung einer anderen erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Reihe von stationären Magneten dicht an entsprechenden drehbaren Behältern, wobei die Magnete durch einen gemeinsamen Mechanismus gedreht werden;
die Fig. 5a, 5b, 5c, 5d, 5e und 5f erläutern schematisch verschiedene Stufen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur magnetischen Mischung und magnetischen Trennung einer Zielsubstanz unter Benutzung magnetischer Teilchen mit Hilfe eines magnetischen Misch- und Trenngeräts nach Fig. 2;
Fig. 6 zeigt schematisch eine perspektivische Ansicht einer Magnetfeldgradienten-"Kammer" in einem Testmedium nach einer Ausführungsform der Erfindung, bei der ein Permanentmagnet dicht an dem Behälter angeordnet ist;
Fig. 7 zeigt schematisch eine perspektivische Darstellung einer Magnetfeldgradienten-"Kammer" in einem Testmedium nach einer Ausführungsform der Erfindung mit zwei auf gegenüberliegenden Seiten des Behälters angeordneten Magneten;
Fig. 8 zeigt schematisch eine perspektivische Ansicht mehrerer Magnetfeldgradienten-"Kammern" in einem Testmedium nach einer Ausführungsform der Erfindung mit einer vertikalen Reihenanordnung von sechs dicht an dem Behälter angeordneten Permanentmagneten;
Fig. 9 zeigt schematisch eine perspektivische Darstellung mehrerer Magnetfeldgradienten-"Kammern" in einem Testmedium nach einer Ausführungsform der Erfindung mit zwei vertikalen Reihenanordnungen von an gegenüberliegenden Seiten des Behälters angeordneten Permanentmagneten;
Fig. 10A zeigt schematisch eine Draufsicht eines erfindungsgemäßen Geräts mit zwei an gegenüberliegenden Seiten des Behälters angeordneten Elektromagneten;
Fig. 10B zeigt schematisch eine Draufsicht eines erfindungsgemäßen Geräts mit einem den Behälter umgebenden Ring von Elektromagneten; und
die Fig. 11a und 11b zeigen die magnetischen Feldlinien in dem Behälter, die durch zwei auf den gegenüberliegenden Seiten des Behälters angeordneten Magneten erzeugt werden.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die folgende Beschreibung soll den Fachmann in die Lage versetzen, die Erfindung herzustellen und zu benutzen. Sie erläutert die von dem Erfinder erdachten besten Ausführungsformen der Erfindung. Verschiedene Änderungen sind dem Fachmann jedoch geläufig, da die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung hier spezifisch definiert wurden, um ein Gerät und ein Verfahren zur Mischung von magnetische Teilchen enthaltende Proben durch Bewegung der Teilchen mittels eines Magnetfeldes zu schaffen.
Die vorliegende Erfindung schafft ein verbessertes Gerät und Verfahren zur Trennung von Zielsubstanzen von einem flüssigen Testmedium (Testmedium) durch magnetische Teilchen auf Affinitätsbasis. Die Erfindung beinhaltet ein neues Mischsystem, bei dem die magnetischen Teilchen in einer relativ bewegungslosen Testflüssigkeit durch magnetische Einrichtungen gemischt werden, die außerhalb des die Testflüssigkeit enthaltenden Behälters angeordnet sind. Die Erfindung schafft auch eine Vorrichtung, in der die Vorgänge der Mischung und Trennung durch eine in einem einzigen Apparat angeordnete, gemeinsame magnetische Einrichtung durchgeführt werden, wodurch die Vorrichtung einfacher und praktischer in der Anwendung wird.
Die vorliegende Erfindung erlaubt eine schnelle, wirksame und saubere Trennung einer Zielsubstanz von Testmedien und ist besonders brauchbar bei der affinitätsmagnetischen Trennung interessierender organischer, biochemischer oder zellulärer Komponenten von beispielsweise Prüf-Reaktionsgemischen, Zellkulturen, Körperflüssigkeiten und dergl..
Die Vorrichtung der Erfindung umfaßt wenigstens einen Behälter zur Aufnahme eines Testmediums, äußere magnetische Einrichtungen zur Erzeugung eines Magnetfeldgradienten in dem Testmedium und Einrichtungen zur Schaffung einer magnetisch induzierten Bewegung der magnetischen Teilchen in dem Testmedium. Der Behälter ist vorzugsweise von zylindrischer Gestalt aus einem nichtmagnetischen Material, wie Glas oder Kunststoff und hat eine Kammer zur Durchführung der gewünschten Mischung und Trennung. Vorzugsweise hat der Behälter wenigstens eine Öffnung zur Aufnahme des die magnetischen Teilchen enthaltenden Testmediums.
Die magnetische Einrichtung kann einen oder mehrere Permanent- oder Elektromagnete umfassen, die außerhalb des Behälters zwecks Erzeugung von Magnetfeldgradienten innerhalb des Testmediums angeordnet sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die magnetische Einrichtung ein Permanentmagnet einer seltenen Erdlegierung und in Bezug auf den Container so angeordnet, daß in einem gewünschten Querschnitt des Testmediums eine Magnetfeldgradient-"Kammer" begrenzt wird. Der Ausdruck "Kammer" wird benutzt, weil die Gradienten der magnetischen Feldstärke die Wirkung haben, die magnetischen Teilchen so einzuschließen oder zu konzentrieren, als ob sie in einer Kammer oder einem Hohlraum enthalten wären.
Die magnetische Feldstärke in der Kammer ist stärker an einem dem Magneten (Ort der magnetischen Kraft) näheren Teil der Innenfläche des Behälters als irgendwo sonst in der Kammer und wird außerhalb der Kammer vernachlässigbar. Infolgedessen unterliegen die magnetischen Teilchen in der Nähe dieses Ortes einer wesentlich größeren Magnetkraft als jene, die weiter von ihm entfernt sind. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können zwei Magnete auf gegenüberliegenden Seiten des Behälters angeordnet werden, vorzugsweise mit einander zugewandten gleichen Magnetpolen, um die Magnetflußlinien zu verzerren und zwei Magnetfeldgradienten und zwei eine Kammer bildende Magnetkraft-Ortskurven zu erzeugen. Eine solche Anordnung ist besonders nützlich für die Rührung magnetischer Teilchen, wie weiter unten beschrieben wird. Bei einer besonders vorteilhaften Anordnung kann ein Aggregat mit einer vertikalen Reihenanordnung von Magneten außerhalb des Containers angeordnet sein, um mehrere Magnetfeldgradient-Kammern innerhalb eines gewünschten Querschnitts des Testmediums zu schaffen.
Die vorliegende Erfindung schafft zwei Verfahren zur Rührung und Mischung der magnetischen Teilchen innerhalb des Testmediums, während dieses relativ bewegungslos gehalten wird:
(1) Bewegung der magnetischen Teilchen durch das Testmedium durch Drehung des Behälters gegenüber einem stationären Magneten, der einen stationären Magnetfeldgradienten-Hohlraum begrenzt und so Induzierung einer Winkelbewegung der magnetischen Teilchen relativ zu dem im wesentlichen bewegungslosen Testmedium, die durch die Änderung der Winkellage zwischen dem Behälter und der magnetischen Einrichtung verursacht wird; und
(2) Bewegung der magnetischen Teilchen in dem Testmedium durch Drehung des Magneten um den stationären Behälter, wodurch ein sich bewegender Magnetfeldgradient- Hohlraum begrenzt wird, und Induzierung einer Winkelbewegung der Teilchen relativ zu dem im wesentlichen bewegungslosen Testmedium, die durch Änderung der Winkellage zwischen dem Behälter und der magnetischen Einrichtung verursacht wird.
Der Magnetfeldgradient-Hohlraum in dem Testmedium schließt tendenziell die magnetischen Teilchen ein und induziert durch die Verschiebung der relativen Winkellage zwischen dem Behälter und dem Magneten eine Winkelbewegung bei den magnetischen Teilchen, wodurch sie in Kontakt mit einem großen Volumen des Testmediums kommen und der Kontakt mit der Zielsubstanz erhöht wird. Die Rührung der magnetischen Teilchen ist in einem sich bewegenden Hohlraum des Magnetfeldgradienten wesentlich verbessert, in dem die Magnetflußlinien wie bei zwei Permanentmagneten mit zwei einander zugewandten gleichen Magnetpolen auf den gegenüberliegenden Seiten des Behälters verzerrt werden, wie in Fig. 11A gezeigt ist.
Die so durch die beiden Magneten erzeugten magnetischen Feldlinien stoßen sich gegenseitig ab, und der Hohlraum ist dadurch gekennzeichnet, daß er zwei große Magnetfelder mit entsprechenden Zonen hoher magnetischer Anziehung und einen sehr kleinen Bereich in der Mitte (neutrale Zone) hat, wo es eigentlich kein Magnetfeld gibt. Da diese neutrale Zone sehr klein ist, tendiert die Zufallsbewegung der magnetischen Teilchen durch Brownsche, durch Schwerkraft bedingte, thermische und ähnliche Bewegung dazu, die meisten magnetischen Teilchen in eins der beiden Magnetfelder in dem Hohlraum zu treiben. In einer dynamischen Situation, in der sich die relative Winkellage zwischen den Magneten und dem Behälter stetig ändert, veranlassen die sich gegenüberliegenden magnetischen Flußlinien die magnetischen Teilchen, zu einer wirksameren Dispergierung und Mischung als im Falle eines einzigen Magneten. Wenn jedoch die zwei Magneten entgegengesetzte Pole haben, wie in Fig. 11b gezeigt, ziehen sich die Magnetfeldlinien gegenseitig an, und der Hohlraum ist dadurch gekennzeichnet, daß er zwei relativ kleine magnetische Felder mit entsprechenden Ortskurven hoher magnetischer Anziehung und einen großen Bereich in der Mitte (neutrale Zone) hat, wo faktisch kein Magnetfeld existiert. Obgleich eine solche Anordnung in bestimmten Situationen von Nutzen sein kann, sind eine große neutrale Zone und sich gegenseitig anziehende Magnetflußlinien im allgemeinen weniger vorteilhaft.
Anders als bei den im Stand der Technik beschriebenen Mischverfahren werden die magnetischen Teilchen bei dem erfindungsgemäßen Mischsystem in dem Testmedium ohne bedeutende Flüssigkeitsturbulenz gerührt, d. h. das Testmedium bleibt relativ bewegungslos. Diese Mischung ergibt zur Steigerung der Affinitätsbindung eine hohe Kontaktrate zwischen der Affinitätsoberfläche der magnetischen Teilchen und der Zielsubstanz, während die hydrodynamische Kraft an der Kontaktoberfläche auf einem Wert bleibt, der kleiner als die Affinitäts- Bindungsfestigkeit ist oder zu gering ist, um eine Denaturierung oder andere Schädigung zu bewirken. Der bei der Praxis der Erfindung benutzte Mischungsmechanismus eignet sich besonders für magnetische Teilchen im Mikrometerbereich und erlaubt einen Betriebswirkungsgrad, der bisher nicht erreichbar war.
Die Reinheit und Ausbeute der Zielsubstanz, die man durch eine besondere magnetische Affinitätstrennung erreicht, wird weitgehend durch das Mischungsverfahren bestimmt, das man anwendet, um die Affinitäts- Bindungsreaktion zwischen der Zielsubstanz und der Oberfläche der magnetischen Teilchen zu begünstigen. Die Bindungsreaktionen erfordern einen engen Kontakt zwischen der Affinitätsoberfläche und der Zielsubstanz. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt weitgehend von der Stoßfrequenz zwischen den beiden Gebilden und der Geschwindigkeit der Oberflächenerneuerung der magnetischen Teilchen ab. Die Oberflächenerneuerung ist der Vorgang der Entfernung der dünnen Medienschicht an der Affinitätsoberfläche und des Austausches gegen frisches Medium aus der Masse. Die hydrodynamische Scherkraft an der Affinitätsoberfläche muß daher sorgfältig abgeglichen werden, so daß sie ausreicht, die dünne Medienschicht ohne Trennung von Affinitätsbindungen zu entfernen. Dies war bei den früheren Mischverfahren auf Basis der Rührung des Testmediums schwierig zu erreichen. Nach der Erfindung kann jedoch eine hohe Stoßfrequenz und eine im wesentliche ausgeglichene Scherkraft durch magnetische Induzierung einer kontrollierten Bewegung der magnetischen Teilchen in einem im wesentlichen bewegungslosen Testmedium erreicht werden.
Da sich die relative Winkellage zwischen dem Magnet und dem Behälter ändert, entfernt sich der Punkt maximaler Feldstärke von der inneren Behälteroberfläche stetig, und er induziert eine Winkelbewegung bei den magnetischen Teilchen, während das Testmedium in Bezug auf die innere Oberfläche des Behälters relativ stationär bleibt. Eine solche Winkelbewegung der magnetischen Teilchen gewährleistet eine sehr wirksame Rührung der magnetischen Teilchen in dem Testmedium, indem die Affinitätsoberflächen der Teilchen der Zielsubstanz optimal ausgesetzt werden. Bei mässigen Drehzahlen, vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 100 Umdrehungen pro Minute kann die Testflüssigkeit in dem Behälter als stationär bleibend angesehen werden. Da die an der Oberfläche der magnetischen Teilchen angreifende hydrodynamische Scherkraft im wesentlichen durch die Geschwindigkeit der Bewegung des magnetischen Teilchens in dem Testmedium bestimmt wird, kann sie durch Einstellung der Geschwindigkeit der Winkelbewegung gesteuert werden.
Die Trennung der magnetischen Teilchen von dem Testmedium erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß man die Drehung des Magnets oder des Behälters wie oben beschrieben anhält, um die Rührung der magnetischen Teilchen zu beenden. Bei stationärer Position des Behälters oder des Magneten werden die magnetischen Teilchen in dem Hohlraum des Magnetfeldgradienten innerhalb des Testmediums angezogen und auf der Innenseite der Behälterwandung an der dem Magneten nächsten Stelle immobilisiert. Dadurch, daß der Misch- und Trennvorgang durch eine einzige Magnetfeldquelle bewerkstelligt wird, wird durch die vorliegende Erfindung eine große Vereinfachung des gesamten Prozesses erreicht und das Gerät mechanisch weniger kompliziert und weniger kostspielig gemacht.
Die erfindungsgemäße magnetische Mischung und Trennung sind bei verschiedenen labormäßigen und klinischen Arbeitsgängen einschließlich biospezifischer Affinitäts-Bindungsreaktionen für Trennungen von besonderem Nutzen. Bei diesen Arbeitsverfahren werden magnetische Teilchen eingesetzt, deren Oberfläche mit einem Element eines spezifischen Affinitäts- Bindungspaars, nämlich Ligand oder Rezeptor beschichtet ist, die in der Lage sind, eine interessierende Substanz in dem Testmedium zu binden.
Diese biospezifischen Affinitäts-Bindungsreaktionen können zur Bestimmung oder Isolierung eines breiten Bereichs von Zielsubstanzen in biologischen Proben dienen. Beispiele für Zielsubstanzen sind Zellen, Zellkomponenten, Zell-Subpopulationen (eukaryotisch und prokaryotisch), Bakterien, Viren, Parasiten, Antigene, spezifische Antikörper, Nukleinsäuresequenzen und dergl.. Das Gerät und das Verfahren der Erfindung können somit dazu dienen, immunospezifische Zelltrennungen für die Analyse oder Isolierung von Zellen durchzuführen, einschließlich zum Beispiel von Tumorzellen aus Knochenmark, T-Lymphozyten aus peripherem Blut oder Knochenmark, Lymphozyten-Untergruppen, wie CD2, CD4, CD8 und CD19 aus peripherem Blut, Monozyten, Granulozyten und anderen Zelltypen. Die Entfernung oder Verarmung verschiedener Zelltypen kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung kann auch bei der Trennung oder Analyse verschiedener Bakterien oder Parasiten aus Blutprodukten, Kulturmedien, Körperflüssigkeiten und dergl. eingesetzt werden. Ebenso kann das vorliegende Gerät und das Verfahren benutzt werden bei Bioproben einschließlich Immunproben und Nukleinsäure-Sondenproben, Isolierung und Bestimmung von DNA und mRNA direkt aus dem rohen Zell-Lysat und Isolierung und Bestimmung von Proteinen.
Die Art der für die Praxis der Erfindung brauchbaren magnetischen Teilchen ist nicht-kolloidal und paramagnetisch, d. h. sie sind magnetisierbar, behalten aber keinen Magnetismus, nachdem das magnetische Feld entfernt wurde. Diese magnetischen Teilchen sind typischerweise polymeres Material mit einer kleinen Menge ferromagnetischer Substanz, wie etwa Oxide auf Eisenbasis, z. B. Magnetit, Übergangsmetalle oder Seltenerd-Elemente, die durch ein Magnetfeld eingefangen werden. Die für die Praxis der Erfindung brauchbaren, paramagnetischen Teilchen sollten eine geeignete Bindungsflächenkapazität für die Adsorption oder kovalente Kopplung eines Glieds eines spezifischen Affinitäts-Bindungspaares, d. h. eines Liganden oder Rezeptors, und typischerweise einen Durchmesser zwischen 0,1 und 10 mm haben. Geeignete paramagnetische Teilchen sind im Handel erhältlich von Dynal Inc. in Lake Success, NY; PerSeptive Diagnostics, Inc., Cambridge, MA; und Cortex Biochem, Inc., San Leandro, CA. Die bevorzugten Teilchen sind solche, die unter den Identifizierungsnummern M-280 und M-450 von Dynal Inc. verkauft werden und gleichmäßige Größen von 2,8 bzw. 4,5 mm Durchmesser haben und darin gleichmäßig verteiltes, magnetisierbares Material enthalten. Diese Kügelchen sind mit einer dünnen Schale Polystyrol beschichtet, die eine definierte Oberfläche für die Immobilisierung verschiedener Liganden oder Rezeptoren schafft. Diese Immobilisierung kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wobei Verfahren unter Benutzung der physikalischen Adsorption oder der kovalenten Bindung bevorzugt werden.
Die Magnetfeldgradienten können durch einen oder mehrere Permanentmagnet(e) oder Elektromagnet(e) erzeugt werden. Permanentmagnete werden für die meisten Misch- und Trenngeräte bevorzugt, etwa für jene, die bei Arbeitsgängen im Labormaßstab und für in der klinischen Diagnose eingesetzte Automatikgeräte Anwendung finden. Geräte für größeren Maßstab und automatisierte Geräte, wie etwa jene in der pharmazeutischen oder industriellen Produktion, können jedoch vorteilhafter unter Benutzung von Elektromagneten hergestellt werden, da die Feldgradienten durch automatische Regelung leichter verändert werden können, um verschiedene Prozeßstufen zu bewirken.
Permanentmagnete für die praktische Ausführung der Erfindung sollten eine ausreichende Oberflächen- Feldstärke haben, um die Mehrheit der magnetischen Teilchen anzuziehen. Permanentmagnete von Seltenerd- Legierungen mit einer Oberflächenfeldstärke in dem Bereich von 1 bis einigen 10 kG (kiloGauss) werden bevorzugt. Permanentmagnete aus Neodym-Eisen-Bor oder Samarium-Cobalt-Magnete, die durch ein BHmax (maximales Energieprodukt) in dem Bereich von 10 bis 35 mGOe (megaGauss Oersted) werden besonders bevorzugt. Diese Magnete können bezogen werden von International Magnaproducts Inc. in Valparaiso, IN und vielen anderen kommerziellen Quellen. Die Permanentmagnete haben vorzugsweise einen rechteckigen Querschnitt und können mechanisch an einem nicht magnetischen Halteträger angeklebt oder befestigt werden, um ein Permanentmagnetaggregat zu bilden. Das Aggregat kann eine ferromagnetische Ausrüstung umfassen, um den Magneten oder die Magnete aufzunehmen und das Magnetfeld zu focussieren. Die Magnete sind vorzugsweise mit ihrer Magnetfeldachse senkrecht zu der vertikalen Behälterachse ausgerichtet. Andere Querschnittsformen und Ausrichtungen der Magnete liegen auch innerhalb des Erfindungsumfangs.
Im allgemeinen wird das Permanentmagnetaggregat dicht an dem Behälter angeordnet, ohne daß sich der Magnet bis zum Behälterboden erstreckt. Der bevorzugte Abstand zwischen jedem Magnetaggregat und dem Behälter, der bei dem Gerät der Fig. 1 bis 6 gezeigt ist, beträgt im allgemeinen etwa 5 mm bis etwa 20 mm. Die Feldstärke des Magneten oder der Magnete sollte groß genug sein und der Abstand zwischen dem Magnet und dem Behälter kurz genug, um einen wirksamen Hohlraum des Magnetfeldgradienten in dem Testmedium zu erzeugen. In bestimmten Situationen einschließlich der Verarbeitung mehrerer Behälter kann von Vorteil sein, das Permanentmagnetaggregat zwischen Behältern oder zwischen Reihen von Behältern so anzuordnen, daß ein einzelnes Permanentmagnetaggregat dazu dienen kann, in den zwei Behältern in der Nachbarschaft einen Magnethohlraum zu erzeugen.
Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zum Mischen und Trennen von magnetischen Teilchen nach der Erfindung, die einen an einem festen Träger 2 befestigten Magneten 1 umfaßt, wobei der Träger 2 nahe an einem zylindrischen Behälter 3 angeordnet ist, ohne sich bis zum Behälterboden zu erstrecken. Bei der gezeigten Ausführungsform ist der Behälter 3 zur Aufnahme des Testmediums 8 ein Prüfrohr, und die magnetischen Teilchen 9 sind als kleine Punkte gezeigt. Wenn der Magnet 1 ein Permanentmagnet ist, umfaßt er vorzugsweise einen Seltenerd-Verbundstoff, wie Neodym-Eisen-Bor oder Samarium-Kobalt, und es hat eine Oberflächenfeldstärke, die für die Anziehung der magnetischen Teilchen, vorzugsweise ein BHmax von über 20 mGOe, ausreicht. Wenn ein Elektromagnet als Magnet 1 benutzt wird, sollte er eine vergleichbare Feldstärke haben.
Der das Testmedium 8 und die magnetischen Teilchen 9 enthaltende Behälter 3 ist in vertikaler Position lösbar in einem Halter 5 angeordnet, der an einer Drehwelle 4 befestigt ist, die an einem Elektromotor 6 mit variabler Drehzahl angebracht ist. Der Halter 5 hat vertikale Schlitze 7, die elastisch sind und den Behälter 3 fest umgreifen. Die Einschaltung des Elektromotors 6 veranlaßt den Behälter 3 zur Drehung, wodurch die relative Winkellage des Behälters 3 zu dem Magneten 1 stetig verändert wird und die magnetischen Teilchen 9 veranlaßt werden, sich in dem Hohlraum des innerhalb des Testmediums 8 begrenzten Magnetfeldgrandienten zu bewegen. Der Behälter 3 wird mit einer mässigen Drehzahl, vorzugsweise zwischen 10 und 100 Umdrehungen pro Minute gedreht, während das Testmedium 8 im Inneren relativ stationär bleibt. Die Abschaltung des Elektromotors 6 stoppt die Drehung des Behälters 3, und die magnetisch induzierte Rührung der magnetischen Teilchen 9 wird beendet. Gleichzeitig werden die magnetischen Teilchen 9 angezogen und an der Innenseite der Wandung des Behälters 3 an der dem Magneten 1 nächstliegenden Stelle immobilisiert. Die Zusammenballung der magnetischen Teilchen 9 auf der senkrechten Seite des Behälters 3 erleichtert die Entfernung des Testmediums 8.
Fig. 2 zeigt ein anderes Gerät zur Mischung und Trennung magnetischer Teilchen nach der vorliegenden Erfindung mit einem Prüfrohr 23, das an seinem oberen Ende in einer Öffnung des Prüfrohrhalters 25 in vertikaler Lage lösbar befestigt ist, und einem Magneten 21, der dicht an dem Prüfrohr 23 angeordnet ist, ohne sich bis zu dem Rohrboden zu erstrecken. Der Magnet 21 kann wiederum ein Elektromagnet oder ein Permanentmagnet sein. Wenn er ein Permanentmagnet ist, besteht der Magnet 21 vorzugsweise aus einem Seltenerd-Verbundstoff, wie etwa Neodymium-Eisen-Bor oder Samarium-Kobalt, und er hat eine ausreichende Oberflächenfeldstärke, um die magnetischen Teilchen 9 anzuziehen, vorzugsweise einen BHmax-Wert von über 20 mGOe. Der Magnet kann aus einem oder mehreren Magneten geeigneter Dimensionen und Geometrien bestehen, so daß ein Magnetfeld-Hohlraum definiert wird, der einen gewünschten Querschnitt des Testmediums 28 in dem Testrohr 23 aufnimmt.
Der Magnet 21 ist auf einer Scheibe 22 befestigt, die auf einer Drehwelle 24 an einem elektrischen Getriebemotor angebracht ist. Wiederum dreht der Elektromotor 26 bei Einschaltung den Magneten 21 auf einer Bahn um die vertikale Achse des stationären Testrohres 23, wodurch in dem Testrohr 23 ein sich winkelmäßig bewegender Magnetfeldgradient geschaffen wird. Während der Drehung bleibt das Testrohr 23 bewegungslos, während der Magnetfeld-Hohlraum stetig durch das stationäre Testmedium 28 rotiert. Das sich winkelmäßig bewegende Magnetfeld veranlaßt die magnetischen Teilchen 29, sich in dem Hohlraum des Magnetfeldgradienten in dem Testmedium 28 zu bewegen. Der Magnet 21 dreht sich mit einer mässigen Geschwindigkeit, vorzugsweise 10 bis 100 Umdrehungen pro Minute, um die magnetischen Teilchen 29 durch das im wesentlichen bewegungslose Testmedium 28 zu bewegen. Wenn der Elektromotor 6 abgeschaltet wird, hört die Drehung des Magneten 21 auf, wodurch die magnetisch induzierte Rührung beendet wird. Die magnetischen Teilchen 28 in dem jetzt stationären Magnetfeld werden zur Innenseite der Wandung des Testrohres 23 an der dem Magneten 21 nächstliegenden Stelle angezogen und dort immobilisiert. Die Zusammenballung der magnetischen Teilchen auf der vertikalen Seite des Testrohres 23 erleichtert die Entfernung des Testmediums 28 durch Ansaugung oder eine andere Maßnahme.
Fig. 3 zeigt eine Ausführungsform eines Geräts nach der vorliegenden Erfindung zur gleichzeitigen Bearbeitung mehrerer Testmedien und stellt eine Variante des in Fig. 2 gezeigten Geräts dar. Das Gerät nach Fig. 3 umfaßt eine Reihe identischer Prüfrohre 33, die in vertikaler Lage an ihren oberen Enden durch entsprechende Öffnungen in einer festen horizontalen Trägerplatte 32 befestigt sind, sowie eine entsprechende Reihe von Magneten 31, die dicht an den Testrohren 33 ausgerichtet sind, ohne daß sie bis zu den unteren Enden der Rohre reichen. Wenn Permanentmagnete benutzt werden, sind dies vorzugsweise solche des Seltenerd-Typs, wie sie in Bezug auf Fig. 2 beschrieben sind. Sie werden in geeigneten Dimensionen und Geometrien ausgewählt, um einen Magnetfeld-Hohlraum zu begrenzen, der in jedem Testrohr 33 einen gewünschten Querschnitt des Testmediums 29 aufnimmt.
Die Reihe der Magnete 31 ist auf einer beweglichen Trägerplatte 35 montiert, die an ihren Enden an zwei Wellen 34A und 34B befestigt ist, die an Rollen 38A und 38B exzentrisch angebracht sind, welche ihrerseits durch ein Antriebsband 39 verbunden sind. Die Rolle 38A ist an einen elektrischen Getriebemotor 36 angeschlossen, so daß der eingeschaltete Motor 36 die Rollen 38A und 38B in Drehung versetzt und dadurch der Trägerplatte 35 eine exzentrische Drehung verleiht. Diese Bewegung veranlaßt jeden Magneten 31, eine Bahn um die vertikale Achse seines stationären Prüfrohres 33 zu beschreiben und dadurch in den bewegungslosen Testmedien 28 jedes Testrohres 33 einen separaten, sich bewegenden Magnetfeldgradienten zu schaffen. Die gleichzeitige Bewegung mehrerer Magnetfelder veranlaßt die magnetischen Teilchen in jedem Prüfrohr 33 zu einer Bewegung in ihrem individuellen Hohlraum des Magnetfeldgradienten. Die Abschaltung des Elektromotors 36 beendet die Rotation der Magnete 31 und die magnetisch veranlaßte Rührung hört auf. Die magnetischen Teilchen 29 in den nun stationären Magnetfeldern werden zur Innenseite der Wandungen jedes Testrohres 33 hin angezogen und dort immobilisiert. Die Abtrennung der magnetischen Teilchen auf der vertikalen Seitenwand der Prüfrohre 33 erleichtert die Entfernung der überstehenden flüssigen Medien durch Absaugung oder andere Methoden.
Fig. 4 erläutert eine andere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Geräts zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer flüssiger Testmedien, das eine Variante des in Fig. 1 gezeigten Geräts ist. Das Gerät nach Fig. 4 umfaßt eine Reihe von Magneten 41, die auf einer vertikalen Platte 42C befestigt sind, die Teil eines Prüfrohrgestells 42 ist. Die Magnete 41 sind in geringem Abstand auf die Reihe der Testrohre 43 ausgerichtet, ohne sich bis zu deren Böden zu erstrecken. Gewünschtenfalls können die Magnete 41 abwechselnd so zwischen Testrohren 43 angeordnet werden, daß nur ein Magnet für zwei benachbarte Teströhrchen 43 benötigt wird, wodurch sich ein einfacheres und wirtschaftlicheres Gerät ergibt. Wenn Permanentmagnete benutzt werden, sind sie vorzugsweise solche des zu Fig. 1 beschriebenen Seltenerd-Typs und von einer geeigneten Dimension und Geometrie, so daß sie einen Magnetfeldhohlraum begrenzen, der den gewünschten Querschnitt des Testmediums in jedem Teströhrchen 43 aufnimmt.
Die Teströhrchen 43 sind in vertikaler Lage entfernbar angeordnet, wobei ihre Böden in einer Reihe flacher Vertiefungen auf einer Bodenplatte 42A ruhen und ein Teil ihres Oberteils durch entsprechende Öffnungen in einer Oberplatte 42B des Prüfrohrgestells 42 ragen. Der Durchmesser der Öffnungen in der Oberplatte 42B ist etwas größer als der Durchmesser der Prüfröhrchen 43, so daß sie leicht eingesetzt und frei gedreht werden können. Die Platten 42A und 42B sind so auf Abstand gehalten, daß sie die Prüfröhrchen 43 in einer stabilen vertikalen Ausrichtung halten.
Ein Antriebsriemen 49 ist auf zwei Riemenscheiben 48B und 48C montiert, die an einem Getriebemotor 46 angebracht, und durch zwei parallele Reihen Führungsrollen 47 geführt sind, die auf der Oberplatte 42B angebracht sind. Die Führungsrollen 47 sind zwischen den Öffnungen der Reihe so angeordnet, daß sie leicht gegen den Antriebsriemen 49 drücken, so daß dieser die oberen Enden der Prüfröhrchen 43 erfaßt. Bei Einschaltung des Motors 46 wird der Antriebsriemen 49 bewegt, und durch die lineare Gleitreibung des Riemens 49 werden alle Prüfröhrchen 43 um ihre vertikalen Achsen gleichzeitig gedreht.
Bei der Drehung der Teströhrchen 43 wird die relative Winkellage jedes Teströhrchen 43 und seines Magneten 41 stetig verändert, was dazu führt, daß die magnetischen Teilchen 9 sich in dem Hohlraum des Magnetfeldgradienten bewegen. Die Prüfröhrchen 43 rotieren mit mäßigen Drehzahlen, vorzugsweise zwischen 10 und 100 Umdrehungen pro Minute, um die Rührung der magnetischen Teilchen 9 zu gewährleisten, während die Testmedien 8 in den Röhrchen relativ stationär bleiben. Bei Abschaltung des Elektromotors 46 wird die Drehung des Teströhrchen 43 angehalten, und die magnetisch induzierte Rührung hört auf. Die magnetischen Teilchen 9 in jedem Teströhrchen werden zur Innenseite der den Magneten 41 nächstliegenden Wand angezogen und dort immobilisiert. Die Zusammenballung der magnetischen Teilchen 9 auf der senkrechten Seite des Teströhrchens 43 erleichtert die Entfernung des Testmediums 8 durch Ansaugung oder ähnliche Methoden.
Die Fig. 5A bis 5F zeigen typische Stufen bei einem Verfahren nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit affinitätsreaktiven magnetischen Teilchen zwecks Biountersuchungen oder zellulärer Isolierung von Molekülarten aus einer Probenlösung oder Suspension biologischer Flüssigkeiten. Fig. 5A zeigt ein Gerät gemäß Fig. 2, bei dem eine Suspension magnetischer Teilchen 58 in einer Probenlösung mit einer Pipette 59 in ein Teströhrchen 23 eingegeben wird. Das Gerät wird angeschaltet, und die magnetischen Teilchen 58 werden durch Rotation des Magneten 21 um das Teströhrchen 23 gemischt. Fig. 5B zeigt das gleiche Gerät, nachdem die Mischung beendet ist und die Drehung des Magneten 21 aufgehört hat. Die magnetischen Teilchen 58 sind an der Innenwand des Prüfröhrchens 23 an der dem stationären Magneten 21 nächstliegenden Stelle immobilisiert. Fig. 5C zeigt das gleiche Gerät während einer Waschstufe, in der die gesammelten magnetischen Teilchen 58 gewaschen werden, indem ein Abzugsrohr 59A eingeführt wird, um das überstehende Testmedium abzusaugen, und ein Einführungsrohr 59B eingeführt wird, um eine geeignete Waschlösung in das Prüfröhrchen 23 einzubringen. Die magnetischen Teilchen 58 werden dann in der Waschlösung gemischt und von ihr getrennt, um die Entfernung der Waschlösung zu ermöglichen, wie oben beschrieben wurde.
Die Waschstufe kann so oft wie erforderlich wiederholt werden.
Fig. 5D zeigt das gleiche Gerät, während es für die Zugabe einer oder mehrerer Reagenzlösungen durch die Pipette 59 angehalten wurde, um eine gewünschte analytische Reaktion für eine Biountersuchung oder eine chemische Verdrängungsreaktion zwecks Elution der Zielsubstanz von den magnetischen Teilchen 58 zu bewirken. Fig. 5E zeigt das gleiche Gerät wieder eingeschaltet, um die magnetischen Teilchen 58 zur Durchführung der gewünschten Reaktion zu dispergieren und zu mischen. Fig. 5F zeigt dasselbe Gerät nach dem Anhalten, um die magnetischen Teilchen 58 von dem Reaktionsmedium zu trennen. Im Falle von Biountersuchungen kann die überstehende Flüssigkeit durch irgendeine gewünschte Messmethode entweder direkt in dem Prüfröhrchen 23 oder nach ihrer Überführung woanders hin gemessen werden. Zwecks Isolierung einer Zell- oder Molekülart kann das Überstehende in einen geeigneten Behälter zur anschließenden Behandlung nach Wunsch überführt werden.
Verschiedene Ausgestaltungen der Magnetaggregate und ihrer Position in Bezug auf den Behälter werden nun unter Bezugnahme auf die Fig. 6 bis 9 beschrieben. Fig. 6 zeigt eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform des Magnetaggregats 61, bei der ein rechtwinkeliger Permanentmagnet 62 auf einer nichtmagnetischen Basis 63 befestigt und in die Nähe eines Behälters 64 gebracht ist, um in dem Querschnitt eines Testmediums 66 einen Hohlraum von Magnetfeldgradienten 65 zu erzeugen. Das brauchbare Magnetfeld bleibt größtenteils auf diesem Hohlraum beschränkt, d. h. außerhalb des Hohlraums herrscht eine vernachlässigbare Feldstärke.
Fig. 7 zeigt zwei Magnetaggregate 71A, 71B, die jeweils aus zwei rechteckigen Permanentmagneten 72A und 72B bestehen, die auf zwei nicht-magnetischen Basiskörpern 73A bzw. 73B befestigt sind. Die beiden Magnetaggregate 71A, 71B sind auf gegenüberliegenden Seiten eines Behälters 74 angeordnet, wobei sich gleiche Magnetpole gegenüberstehen, um die Magnetflußlinien zu verzerren und einen Hohlraum des Magnetfeldgradienten 75 in dem Testmedium 76 und zwei Magnetkraftkurven in dem Hohlraum 75 (siehe Fig. 11A) zu schaffen, wie oben erläutert wurde. Eine solche Anordnung hat sich für die Mischung magnetischer Teilchen als besonders wirksam erwiesen.
Fig. 8 zeigt beispielhaft eine Ausführungsform eines Magnetaggregats 81 zur Erzeugung mehrerer Hohlräume von Magnetgradienten in einem Behälter 84 und stellt eine Anordnung von 6 rechteckigen Permanentmagneten 82A bis 82F in gleichem Abstand voneinander dar, die auf einem unmagnetischen Trägerrahmen 83 befestigt sind. Das Magnetaggregat 81 ist dicht an dem Behälter 84 angeordnet, um in dem Testmedium 86 sechs Hohlräume 85A bis 85F des Magnetfeldgradienten zu erzeugen.
Fig. 9 zeigt zwei solcher Magnetaggregate 91A und 91B, von denen jedes eine Reihenanordnung von sechs in gleichem Abstand angeordneten, rechteckigen Permanentmagneten 92A bis 92F umfaßt, die auf zwei unmagnetischen Trägerrahmen 93A bzw. 93B befestigt sind. Die beiden Magnetaggregate 91A und 91B sind auf gegenüberliegenden Seiten eines Behälters 94 mit einander zugewandten gleichen Magnetpolen angeordnet. So werden sechs Hohlräume 95A bis 95F des Magnetfeldgradienten in dem Testmedium 96 erzeugt, die in jedem Hohlraum verzerrte Magnetflußlinien der beiden Betriebsmagnetfelder haben.
Verschiedene Ausgestaltungen der Magnetaggregate und ihrer Lage können bei dem in den Fig. 1 bis 4 abgebildeten erfindungsgemäßen Gerät wie oben beschrieben mit Vorteil Anwendung finden.
Wie oben erwähnt sind Permanentmagnete und Elektromagnete bei den meisten Ausgestaltungen der Erfindung gegenseitig austauschbar. Dem Fachmann ist jedoch geläufig, daß eine Ausgestaltung, die die Bewegung des Magneten erfordert, leichter mit Permanentmagneten realisiert werden kann, weil Elektromagnete Kommutatoren oder andere Einrichtungen erfordern, um den beweglichen Magneten Elektrizität zuzuführen. Es gibt jedoch bestimmte Ausgestaltungen, bei denen Elektromagnete in hohem Maße bevorzugt werden. Fig. 10A zeigt zwei Elektromagnetspulen 101A und 101B, die auf einem Trägerrahmen 104 montiert sind und unter etwa 180º zueinander auf der Außenseite des Behälters 102 mit dem Testmedium und den magnetischen Teilchen 103 angeordnet sind. Fig. 10B zeigt den Querschnitt eines einzelnen Behälters 102 mit dem Testmedium und den magnetischen Teilchen 103, der von einem Ring einzelner, auf einem Trägerrahmen 104 angebrachter Elektromagnetspulen 101A bis 101R umgeben ist.
Hier bewegen sich weder der Behälter 102 noch die Elektromagnete 101 wirklich. Stattdessen wird die Winkelbewegung in den in dem Testmedium 103 in dem Behälter 102 suspendierten Magnetteilchen durch aufeinanderfolgende Erregung der Elektromagnete induziert. Diese aufeinanderfolgende Erregung kann "binär" (d. h. An und Aus) oder "analog" sein, wobei ein erster Elektromagnet allmählich voll erregt und dann seine Kraft reduziert wird, während der nächste Elektromagnet allmählich erregt wird usw.. Es ist ersichtlich, daß die Geschwindigkeit der Bewegung der magnetischen Teilchen 103 durch die Wechselgeschwindigkeit und das Maß der Überlappung zwischen den aufeinanderfolgenden Elektromagneten moduliert werden kann.
Die genaue Anzahl der benutzten, aufeinanderfolgenden Elektromagnete hängt von der Größe des Behälters 102 und anderen Parametern ab. Fig. 10A zeigt, daß diese Ausgestaltung sich auf eine der Fig. 7 nicht unähnliche Konfiguration reduziert, jedoch mit zwei einander gegenüberliegenden Elektromagneten anstatt der beiden Permanentmagnete. Die Winkelbewegung von einem Magnet zu dem anderen ist tatsächlich 180º, so daß sich die magnetischen Teilchen in dem Testmedium 103 tatsächlich in relativ geraden Linien vor und zurück quer durch den Behälter 102 bewegen. Insbesondere in diesem Fall können die Wege der magnetischen Teilchen stärker variiert werden, indem man die Polarität sowie die Stärke des elektrischen Stroms verändert, so daß die Richtungsänderung der Magnetpole mit Änderungen des Magnetfeldes entsprechend den in den Fig. 11A und 11B gezeigten Feldern einhergeht.
Es wurde gefunden, daß eine Ausgestaltung mit vier um den Behälter in gleichmäßigem Abstand (d. h. 90º voneinander entfernt) angeordneten Elektromagneten durch eine kluge Anwendung der aufeinanderfolgenden Aktivierung der Elektromagnete und durch Polaritätsumkehrungen wie oben dargelegt eine sehr annehmbare Rührung der magnetischen Teilchen erzeugen kann.
Der die Misch- und Trennkammer begrenzende Behälter hat wenigstens eine Öffnung für die Eingabe und Entfernung eines Testmediums. Der Behälter hat vorzugsweise im wesentlichen eine zylindrische Form und ist aus einem magnetisch durchlässigen Material, wie Kunststoff oder Glas hergestellt. Ferner kann die innere Oberfläche der Kammer bioverträglich sein, und gewünschtenfalls kann die Kammer für die aseptische Verarbeitung von Testmedien sterilisiert werden. Das Volumen des Behälters ist nicht kritisch, solange ein ausreichender Magnetfeldgradient geschaffen werden kann, um in dem Volumen die Kammer und insbesondere den gewünschten Querschnitt des Testmediums aufzunehmen.
Wie in den Fig. 1 bis 9 gezeigt, kann der Behälter zur Aufnahme des Testmediums ein Teströhrchen sein. Die Volumenkapazität des Teströhrchens liegt vorzugsweise zwischen etwa 1 ml und etwa 300 ml, und die Größe und Geometrie des Magneten wird so eingestellt, daß ein passender Magnetfeldgradient in dem Testmedium innerhalb einer besonderen Größe des Teströhrchens erzeugt wird.
Obgleich Ausführungsformen der Erfindung, die für den Einsatz im Forschungslabor besonders geeignet sind, vorzugsweise leicht entfernbare und austauschbare Behälter, wie Teströhrchen benutzen, können diagnostische und andere Geräte nach der Lehre der Erfindung sich auch Zellen mit permanenter Strömung oder anderer, nicht- entfernbarer Kammern für die Mischung und Trennung bedienen.
Nach der vorliegenden Erfindung werden die affinitätsreaktiven, magnetischen Teilchen mit dem Testmedium in einem Behälter gemischt, indem man eine relative Winkelbewegung der magnetischen Teilchen in dem Testmedium bewirkt, das im wesentlichen bewegungslos bleibt. Die relative Winkelbewegung kann in den magnetischen Teilchen dadurch induziert werden, daß man entweder das Magnetfeld um den stationären Behälter oder den Behälter relativ zu einem festen Magnetfeld dreht. Der das Feld erzeugende Magnet wird außerhalb des Behälters angeordnet und begrenzt innerhalb des Testmediums einen Hohlraum des Magnetfeldgradienten. Die vorliegende Erfindung faßt auch die Benutzung reifenförmiger Behälter ins Auge, so daß die Magnetquelle - obgleich sie sich "außerhalb" des Behälters befindet - tatsächlich "innerhalb" des Behälters ist in dem Sinne, daß sie das Loch des Reifens ausfüllt.
Der Fachmann erkennt, daß verschiedene Anpassungen und Modifizierungen der eben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform vorgenommen werden können, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen. Daher kann die Erfindung innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche praktisch auch anders ausgeführt werden, als sie hier im einzelnen beschrieben wurde.

Claims

1. Vorrichtung zum Mischen von magnetischen Partikeln in einem flüssigen Testmedium, um eine Affinitäts- Bindungsreaktion zwischen einer Zielsubstanz in dem Testmedium und den Partikeln auszuführen, wobei die Vorrichtung umfaßt:

- einen magnetisch durchlässigen Behälter zur Aufnahme des Testmediums und zur Bereitstellung einer Kammer für eine magnetische Mischung und Trennung;

- einen Halter zum Halten des Behälters;

- eine magnetische Einrichtung, die sich außerhalb des in dem Halter gehaltenen Behälters befindet, zum Erzeugen eines Magnetfeldgradienten innerhalb des Behälters, wobei das Magnetfeld an einem Punkt auf einer inneren Oberfläche einer Seitenwand des Behälters in nächster Nahe zu der magnetischen Einrichtung stärker ist, wodurch innerhalb des Testmediums ein Magnetfeldhohlraum gebildet wird;

- eine Bewegungseinrichtung zum kontinuierlichen Ändern der relativen Winkelposition zwischen dem Behälter und der magnetischen Einrichtung, um eine Bewegung der magnetischen Partikel durch das Testmedium zu bewirken, um einen Kontakt zwischen der Affinitätsoberfläche der Partikel und einer Zielsubstanz in dem Testmedium zu maximieren, während das Testmedium relativ zu den Seitenwänden des Behälters im wesentlichen stationär gehalten wird; und

- eine Einrichtung zum Anhalten der Bewegungseinrichtung, wodurch der magnetischen Einrichtung ermöglicht wird, eine Trennung durch Immobilisierung und Ansammlung der magnetischen Partikel auf der inneren Oberfläche der Seitenwand des Behälters in nächster Nähe zu der magnetischen Einrichtung zu bewirken.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der magnetisch durchlässige Behälter eine im wesentlichen zylindrische Konfiguration aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung wenigstens einen Permanentmagneten umfaßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung wenigstens einen Elektromagneten umfaßt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung ein maximales Energieprodukt zwischen ungefähr 10 und ungefähr 30 MegaGaussOersted, hat.

6. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Permanentmagnet eine magnetische Legierung mit Seltenerd-Elementen umfaßt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung eine Vielzahl von Magneten umfaßt, die voneinander beabstandet und vertikal auf einer nicht magnetischen Halterung einer über dem anderen parallel zu der Seitenwand des Behälters angeordnet sind, um eine vertikal angeordnete Mehrzahl von Magnetfeldhohlräumen zu definieren, und daß die magnetische Einrichtung bewirkt, daß die magnetischen Partikel in jedem der Hohlräume eingeschlossen werden.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegungseinrichtung die magnetische Einrichtung auf einer Bahn um eine äußere Oberfläche der Seitenwand des Behälters herum bewegt, wobei der Behälter stationär bleibt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung antriebsmäßig mit einem Motor verbunden ist, wobei der Behälter so angeordnet ist, daß ein Betrieb des Motors bewirkt, daß die magnetische Einrichtung auf einer Bahn nahe der Außenfläche der Seitenwand des Behälters umläuft.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Einrichtung zwei Magnete umfaßt, die auf einer ersten Seite und einer zweiten gegenüberliegenden Seite des Behälters angeordnet sind, wobei gleiche Magnetpole auf die Außenflächen gegenüberliegender Seitenwände des Behälters gerichtet sind, so daß sich die Magnetfelder der Magnete gegenseitig abstoßen.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegungseinrichtung den Behälter in Bezug auf die magnetische Einrichtung dreht, die im wesentlichen stationär bleibt.

12. Verfahren zum Mischen von magnetischen Partikeln in einem Testmedium zum Ausführen einer Affinitäts- Bindungsreaktion zwischen einer Zielsubstanz und den Partikeln, um so den Kontakt zwischen einer Affinitätsoberfläche der Partikel und der Zielsubstanz zu maximieren, die Turbulenz und Scherkräfte zwischen den Partikeln und dem Medium zu minimieren und die Trennung der Partikel von dem Medium zu vereinfachen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

- Einbringen des Testmediums und der magnetischen Partikel in einen magnetischen durchlässigen Behälter;

- Mischen der magnetischen Partikel innerhalb des Testmediums zur Herstellung eines Kontakts zwischen der Zielsubstanz und der Affinitätsoberfläche der magnetischen Partikel unter Verwendung einer Magnetquelle, die sich außerhalb des Behälters befindet, um die Partikel relativ zu dem Testmedium zu bewegen, indem die relative Winkelposition zwischen dem Behälter und der Magnetquelle geändert wird, während das Medium relativ zu dem Behälter stationär bleibt;

- Trennen der Partikel von dem Testmedium durch Anhalten der Bewegung der Magnetquelle und des Behälters relativ zueinander, so daß die Partikel sich auf einer inneren Oberfläche des Behälters in nächster Nähe zu der Magnetquelle konzentrieren, wobei eine Entfernung des Testmediums ohne Störung der konzentrierten Partikel ermöglicht wird.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Misch- und Trennungsschritte wiederholt werden, um eine Hinzufügung und Entfernung von Wasch- und Reaktionslösungen zu erlauben.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von Behältern und eine Mehrzahl von magnetischen Einrichtungen, Bewegungsrichtungen und Anhalteeinrichtungen vorgesehen sind.