CN114144675A - S100a9作为血液生物标志物用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过确定患者的样品中的S100A9的量或浓度以及将所确定的量或浓度与参考进行比较来评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险的方法，选择供进行疗法的患者的方法，以及监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法。

Description

S100A9作为血液生物标志物用于子宫内膜异位症的非侵入性 诊断

技术领域

本发明涉及通过确定患者的样品中的S100A9的量或浓度以及将所确定的量或浓度与参考进行比较来评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险的方法，选择供进行疗法的患者的方法，以及监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法。

背景技术

子宫内膜异位症被定义为子宫外存在子宫内膜腺体和基质样病变。病变可以是腹膜病变、卵巢上的浅表植入物或囊肿，或深部浸润性疾病。子宫内膜异位症影响5-8％的所有育龄妇女和70％的慢性盆腔痛妇女。据估计，全世界有1.76亿妇女患有子宫内膜异位症(Adamson等人，J Endometr.2010；2：3-6)。对于这些女性中的许多人来说，子宫内膜异位症的诊断通常会延迟，从而导致不必要的痛苦和生活质量的降低。在18-45岁的患者中，延迟7-10年。由于大多数子宫内膜异位症女性在青春期出现症状，因此早期转诊、诊断、疾病识别和治疗可以减轻疼痛，防止疾病进展。早期诊断的疾患包括青少年患者的诊断和治疗费用高昂，以及循环和非循环疼痛等混杂症状的表现(Parasar等人，Curr Obstet GynecolRep.2017；6：34-41)。

诊断子宫内膜异位症的金标准是腹腔镜检查和随后的组织学确认。到目前为止，还没有非侵入性的子宫内膜异位症诊断方法(Hsu等人，Clin Obstet Gynecol.2010；53：413-419)。在诊断性腹腔镜检查期间，接受过子宫内膜异位症腹腔镜手术培训和技能的妇科医生应该对骨盆进行系统检查(NICE指南NG73，2017)。手术可视化需要良好的专业知识、培训和技能才能进行可靠的诊断。事实是诊断需要腹腔镜手术，医生尽量避免，这会导致诊断延迟7-10年。缺乏非侵入性诊断测试显着导致症状出现和子宫内膜异位症的明确诊断之间的长时间延迟(Signorile和BaldiJ Cell Physiol.2014；229：1731-1735)。因此，对于诊断子宫内膜异位症，特别是早期、轻微和轻度子宫内膜异位症的非侵入性测试存在未满足的医学需求(修订的美国生殖医学学会rASRM I-II期)。

子宫腺肌病被定义为良性子宫内膜腺体和基质浸润到子宫肌层(子宫的外肌层)中。取决于形态和位置，有3种不同的子宫腺肌病亚型：内部子宫腺肌病、外部子宫腺肌病和子宫腺肌瘤。内部子宫腺肌病可进一步分为局灶性、弥漫性和浅表性子宫腺肌病(Bazot M等人，Fertil Steril.2018；109：389-397)。子宫腺肌病也可以基于磁共振成像(MRI)的结果，根据其位于子宫外层还是子宫内层，分为4个亚型I-IV。子宫腺肌病的常见体征和症状包括月经期间大量出血(月经过多)和月经间期(子宫出血)、痛经、慢性盆腔痛、性交困难和不孕症(Chapron C等人，Hum Reprod Update.2020；26：392-411)。

经阴道超声(TVUS)和磁共振成像(MRI)目前用于诊断子宫腺肌病，总体敏感性/特异性分别为83.8％、63.9％和77.3％、89.8％。在不同的子宫腺肌病类型中，弥漫性子宫腺肌病更难以通过成像检测，需要有经验的超声医师。另外，获得成像设备的机会有限，尤其是初级保健保健专业人员，并且需要经过培训的员工和专业资源。因此，基于血液的非侵入性测试将允许在不需要成像装置的情况下对子宫腺肌病进行医学评估，减少操作员间的变异性并且实现更标准化的病情诊断(Chapron C等人，Hum Reprod Update.2020；26：392-411)。

子宫内膜异位症的非侵入性诊断将允许早期诊断和治疗，有可能提高生活质量并且降低与子宫内膜异位症相关的社会成本，因此被世界子宫内膜异位症协会(WES)和世界子宫内膜异位症研究基金会(WERF)选择为研究重点(Fassbender等人，Springer，Peripheral Blood Biomarkers for Endometriosis.2017)。因此，诊断子宫内膜异位症的非侵入性工具可以促进早期诊断和干预，最终可以提高生活质量并且保持生育能力(Parasar等人，Curr Obstet Gynecol Rep.2017；6：34-41)。

血液生物标志物对于减少需要腹腔镜检查的子宫内膜异位症的诊断时间延迟至关重要。CA-125是最常用的血液生物标志物之一，然而，它的诊断效用仅限于子宫内膜异位症rASRM III和IV期(Nisenblat等人，Cochrane Database of Systematic Reviews.2016；5：CD012179)。

据报道，慢性炎症(银屑病、类风湿性关节炎、囊性纤维化、炎症性肠病、克罗恩病、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化症)和若干种类型的恶性肿瘤中的S100A9水平升高(Foell等人，Clin Chim Acta.2004；344：37-51)。信使RNA(mRNA)的组织微阵列分析揭示，与没有子宫内膜异位症的女性的子宫内膜相比时，在子宫内膜异位病变中表现出最高上调的基因列表中的S100A9(Burney等人，Endocrinol.2007；148(8)：2814-2826)。在组织水平上，与来自诊断患有子宫内膜异位症的患者的在位子宫内膜相比时，S100A9 mRNA在异位病变内上调了7.5倍，如组织微阵列分析所示(Eyster K.等人，Fertil Steril.2007；88：1505-33)。使用3D液相色谱质谱分析(Irungu S等人，Clin Proteom.2019；16：14)，在异位子宫内膜对比在位子宫内膜之间不同的顶级蛋白候选物中，基于组织的蛋白发现分析鉴定了S100A9。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险的方法，其包括确定患者的样品中S100A9的量或浓度，并且将所确定的量或浓度与参考进行比较。

在第二方面，本发明涉及选择一种选择供进行子宫内膜异位症的疗法[特别是基于药物的疗法或手术疗法(腹腔镜检查)]的患者的方法，其包括确定患者的样品中S100A9的量或浓度，并且将所确定的量或浓度与参考进行比较。

在第三方面，本发明涉及一种监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法，其包括确定患者的样品中S100A9的量或浓度，并且将所确定的量或浓度与参考进行比较。

附图说明

图1：单一生物标志物的接收者操作员曲线(ROC)分析(A)S100A9、(B)CA-125和(C)临床症状痛经。

x轴＝特异性，y轴＝敏感性

图2(A-F)：S100A9和临床症状痛经组合的接收者操作员曲线(ROC)分析。

x轴＝特异性，y轴＝敏感性

图3(A-B)：子宫内膜异位症病例和对照(A)中的S100A9和子宫内膜异位症病例rASRM I-II期(G1/2)、rASRM III-IV期(G3/4)和对照(B)中S100A9的箱线图。

图4(A-B)：子宫腺肌病病例和对照组血清S100A9水平的箱线图和ROC曲线。

图5(A-B)：子宫腺肌病病例和对照组血清CA-125水平的箱线图和ROC曲线。

表的列表

表1：生物标志物S100A9和生物标志物组合在子宫内膜异位症和对照女性中的诊断性能。

表2：基于多变量逻辑回归分析和约登指数的各种生物标志物组合预测子宫内膜异位症的临界值。

表3：单一生物标志物S100A9和CA-125在子宫腺肌病病例和对照中的诊断性能。

具体实施方式

我们首次表明，与对照相比，子宫内膜异位症女性的血液中测量的S100A9增加。S100A9血液水平在子宫内膜异位症I和II期(轻微/轻度子宫内膜异位症)中已经升高。我们还证明，将S100A9与痛经(月经周期依赖性疼痛)相结合提高了区分子宫内膜异位症女性和无子宫内膜异位症女性的诊断性能。对用于子宫内膜异位症，尤其是早期子宫内膜异位症的可靠诊断的非侵入性测试存在未满足的医学需求。S100A9单独或与痛经/下腹部疼痛和/或CA-125联合使用具有非侵入性基于血液测试的优势，可鉴定患有早期子宫内膜异位症的女性，尤其是腹膜子宫内膜异位症(目前不可能使用非侵入性测试鉴定)(rASRM I-II期)。

定义

词语“包括”以及变体诸如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。

浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应理解，此类范围格式仅为简便起见，并因此应灵活地解释为不仅包括作为范围限值而明确引用的数值，而且包括该范围内所涵盖的所有个体数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确引用一样。作为例示，数值范围“150mg至600mg”应解释为不仅包括明确引用的值150mg至600mg，而且包括所指示范围内的个体值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值，例如150、160、170、180、190、……580、590、600mg和子范围，例如从150至200、150至250、250至300、350至600等。此相同原则适用于仅引用一个数值的范围。此外，无论范围的广度或所描述的特征如何，此类解释均应适用。

当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。

如本文所用，术语“指标”是指状况的标志或信号或用于监测一种状况。这种“状况”是指细胞、组织或器官的生物学状态或个体的健康和/或疾病状态。指标可以是分子的存在或不存在，包括但不限于肽、蛋白质和核酸，或者可以是这种分子在细胞、组织、器官或个体中的表达水平或模式的变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或此类疾病进一步进展的标志。指标也可以是个体发展疾病的风险的标志。

在本发明的上下文中，术语“生物标志物”是指生物系统内的物质，其用作所述系统的生物学状态的指标。在本领域中，术语“生物标志物”有时也适用于检测所述内源性物质(例如抗体、核酸探针等、成像系统)的手段。在本发明的上下文中，术语“生物标志物”应仅适用于物质，而不适用于检测手段。因此，生物标志物可以是活生物体中存在的任何种类的分子，例如核酸(DNA、mRNA、miRNA、rRNA等)、蛋白质(细胞表面受体、胞质蛋白等)、代谢物或激素(血糖、胰岛素、雌激素等)、具有另一种分子(例如蛋白质上的糖部分或磷酰基残基、基因组DNA上的甲基残基)或已被生物体内化的物质或这种物质的代谢产物的某种修饰特征的分子。

“S100A9”，S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白-B；MRP-14)是一种10千道尔顿蛋白，属于含有2-EF手钙结合基序的S100蛋白家族。这些蛋白质因其在中性pH下的100％硫酸铵饱和溶液中的溶解度而得名。早期出版物之一报道了S100A9在从类风湿性关节炎患者分离的浸润性巨噬细胞中的表达增加(Odink K.等人，Nature 1987；330：80-82)。事实上，S100A9充当警报或称为损伤相关分子模式信号(DAMP)。这些是响应组织损伤或炎症而释放的免疫刺激性内源性分子。S100A9经由与RAGE(高级糖基化终产物受体)受体以及与TLR4(toll样受体4)结合来激活MAPK/NF-kB通路并诱导先天免疫系统激活，从而发其炎症作用(Symons L.等人，Trends Mol.Med.2018；24(9)：748-763)。

“CA-125”，即碳水化合物抗原125，有时称为癌症抗原125或肿瘤抗原125，是一种粘蛋白型糖蛋白，由MUC16基因产生，并且与细胞膜结合。CA-125是上皮细胞卵巢癌的生物标志物，来源于体腔上皮，包括子宫内膜、输卵管、卵巢和腹膜。CA-125的诊断用途仅限于具有中等敏感性的子宫内膜异位症III期和IV期(中度和重度子宫内膜异位症)。

疾病的“症状”是指患有此类疾病的组织、器官或生物体可注意到的疾病，包括但不限于组织、器官或个体的疼痛、虚弱、触痛、紧张、僵硬和痉挛。疾病的“标志”或“信号”包括但不限于变化或改变，例如生物标志物或分子标志物等特定指标的存在、不存在、增加或升高、减少或下降，或症状的发展、存在，或恶化。疼痛的症状包括但不限于一种令人不快的感觉，这种感觉可能表现为持续性或不同程度的灼痛、悸动、瘙痒或刺痛。

术语“疾病”和“疾患”在本文中可互换使用，指异常状况，尤其是异常医学状况，例如疾病或损伤，其中组织、器官或个体不再能够有效地履行其功能。通常，但不一定，疾病与指示此类疾病存在的特定症状或标志相关。因此，此类症状或标志的存在可以指示患有疾病的组织、器官或个体。这些症状或标志的改变可能预示着这种疾病的进展。疾病进展的典型特征是这些症状或标志的增加或减少，这可能表明疾病的“恶化”或“好转”。疾病的“恶化”以组织、器官或生物体有效履行其功能的能力下降为特征，而疾病的“好转”通常以组织、器官或生物体有效履行其功能的能力增强为特征。处于“发展”疾病风险中的组织、器官或个体处于健康状态，但显示出可能出现疾病。通常，发展疾病的风险与此类疾病的早期或微弱的标志或症状有关。在这种情况下，仍然可以通过治疗来预防疾病的发作。疾病的实例包括但不限于炎性疾病、传染病、皮肤病、内分泌疾病、肠道疾病、神经系统疾病、关节疾病、遗传疾病、自身免疫疾病、外伤性疾病和各种类型的癌症。

“子宫内膜异位症”是一种慢性、激素依赖性、炎症性疾病，其特征是子宫外的子宫内膜样组织病变。子宫内膜异位症的临床表现因患者而异。子宫内膜异位症患者常出现经间出血、经期疼痛(痛经)、性交痛(性交困难)、排便痛(排便困难)和排尿痛(排尿困难)等症状。子宫内膜异位症引起的盆腔疼痛通常是慢性的(持续≥6个月)，并且伴有痛经(50至90％的病例)、性交困难、盆腔深部疼痛和下腹部疼痛，伴有或不伴有背痛和腰痛。疼痛可以在整个月经周期中不可预测地间歇性发生，也可以是持续性的，并且可以是钝痛、悸动或剧烈疼痛，并且会因体力活动而加剧。膀胱和肠道相关症状(恶心、腹胀和早饱)通常是周期性的。疼痛通常会随着时间的推移而恶化，并且可能会改变特征；很少有女性报告烧灼感或过敏症状，这些症状暗示有神经性成分。通常，子宫内膜异位症可能是无症状的，只有在评估不孕症时才会引起临床医生的注意(Sinaii等人，Fertil Steril.2008；89(3)：538-545)。在患有子宫内膜异位症的女性中，与可育夫妇(15-20％)相比，每月繁殖力降低(2-10％)。尽管子宫内膜异位症会损害繁殖力，但它通常不会完全阻止受孕(Fadhlaoui等人，FrontSurg.2014；1：24)。

子宫内膜异位症最常受影响的部位是盆腔器官和腹膜，但身体的其他部位(例如肺)偶尔也会受到影响。疾病的程度从其他正常盆腔器官的少数小病变到大的卵巢子宫内膜异位囊肿(子宫内膜瘤)和/或广泛的纤维化和粘连形成，导致盆腔解剖结构明显扭曲。基于位置，子宫内膜异位病变可以分为腹膜子宫内膜异位症、卵巢子宫内膜异位囊肿(子宫内膜瘤)、深部结节(深部浸润型子宫内膜异位症)和子宫腺肌病(Kennedy等人，HumReprod.2005；20(10)：2698-2704)。

术语“rASRM期”或“rASRM分期”是指美国生殖医学会(ASRM)建立的修订后的分类系统，该系统描述了基于手术(腹腔镜检查)结果的子宫内膜异位症的严重程度。分类基于腹膜和盆腔植入物的形态，例如红色、白色和黑色病变，应包括每个病变的受累百分比。应注意子宫内膜植入物、斑块、子宫内膜瘤和粘连的数量、大小和位置。根据ASRM指南，应记录肠道、泌尿道、输卵管、阴道、子宫颈、皮肤或其他位置的子宫内膜异位症。根据ASRM指南，子宫内膜异位症的分期是I、II、III和IV期，基于分数确定，对应于轻微、轻度、中度和重度子宫内膜异位症。rASRM I和II期子宫内膜异位症(轻微至轻度子宫内膜异位症)被定义为浅表腹膜子宫内膜异位症、可能存在小的深部病变、没有子宫内膜瘤和/或轻度薄膜粘连。rASRM III期和IV期子宫内膜异位症(中度至重度子宫内膜异位症)被定义为存在浅表腹膜子宫内膜异位症、深部浸润型子宫内膜异位症伴有子宫与肠道之间中度至广泛粘连和/或子宫内膜瘤囊肿伴有中度至广泛粘连，累及卵巢和输卵管。

术语“VAS”，即视觉模拟量表，是一种评估疼痛强度的工具。VAS由一条10cm长的水平线组成，其两端标记为“无痛”和“可想象的最痛”。每位患者在线上划出她的疼痛水平，并且以厘米为单位测量从最左边的“无痛”到刻度线的距离，得出从0到10的疼痛评分。“无痛”对应疼痛评分0，“可想象的最痛”对应疼痛评分10。在患有子宫内膜异位症的女性中，痛经与疼痛的最高感知相关，平均VAS评分约为6(Cozzolino等人，Rev Bras GinecolObstet.2019；41(3)：170-175)。

如本文所用，“患者”是指可受益于本文所述的诊断、预后或治疗的任何哺乳动物、鱼、爬行动物或鸟类。特别地，“患者”选自由以下项组成的组：实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔或斑马鱼)、家畜(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、乌龟、陆龟、蛇、蜥蜴或金鱼)，或灵长类动物，包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人类。特别优选的“患者”是人类。

术语“样品”或“目标样品”在本文中互换使用，其是指组织、器官或个体的一部分或切片，通常小于此类组织、器官或个体，旨在代表整个组织、器官或个体。在分析时，样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的实例包括但不限于液体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、尿液、唾液和淋巴液；或固体样品，诸如组织提取物、软骨、骨头、滑膜和结缔组织。样品的分析可以在视觉或化学基础上完成。视觉分析包括但不限于组织、器官或个体的显微成像或射线照相扫描，以允许对样品进行形态学评估。化学分析包括但不限于检测特定指标的存在或不存在或其数量、浓度或水平的改变。所述样品为体外样品，将在体外进行分析，不会再移回体内。

如本文所用的术语“量”包括本文提及的生物标志物的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性地结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测量的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用的术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物的量与本说明书其他地方指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品中生物标志物的测量或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测量的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测量的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。

表述“将确定的量或浓度与参考进行比较”仅用于进一步说明无论如何对技术人员而言都是显而易见的内容。在对照样品中建立参考浓度。

如本文中使用的术语“参考样品”或“对照样品”是指分析方法与目标样品大致相同且其信息与目标样品的信息进行比较的样品。因此，参考样品提供一种标准，用于评估从目标样品获得的信息。对照样品可能取自健康或正常的组织、器官或个体，从而提供了组织、器官或个体健康状态的判断标准。正常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可以指示疾病发展的风险或此类疾病或疾患的存在或进一步进展。对照样品可能取自异常或疾病的组织、器官或个体，从而提供了组织、器官或个体疾病状态的判断标准。异常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可能指示疾病发展的风险降低或者此类疾病或疾患不存在或好转。参考样品也可能取自与目标样品相同的组织、器官或个体，但已在更早的时间点采集。更早采集的参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可以指示疾病的进展，即疾病随时间的好转或恶化。

对照样品可以是内部或外部对照样品。使用内部对照样品，即在测试样品以及取自同一受试者的一个或多个其他样品中评估标志物水平，以确定所述标志物的水平是否有任何变化。对于外部对照样品，将取自个体的样品中标志物的存在或量与其在已知患有或已知处于给定病症风险中的个体或已知没有给定病症的个体，即“正常个体”中的存在或量进行比较。

本领域技术人员将理解，此类外部对照样品可从单个个体获得或可从年龄匹配并且无混杂疾病的参考群体获得。通常，使用来自适当参考群体的100个充分表征的个体的样品来建立“参考值”。然而，也可以选择由20、30、50、200、500或1000个的个体组成的参考群体。健康个体代表用于建立对照值的优选参考群体。

例如，可以将患者的样品中的标志物浓度与已知与某种疾病的特定病程相关的浓度进行比较。通常样品的标志物浓度与诊断直接或间接相关，标志物浓度是例如用于确定一个体是否有患某种疾病的风险。可替代地，样品的标志物浓度可以例如是在判断疾病进展的风险中、或在患者的随访中，与已知与某种疾病的治疗反应相关的标志物浓度、某种疾病的诊断、某种疾病严重程度的评估、针对某种疾病选择适当药物的指导进行比较。取决于预期的诊断用途，选择适当的对照样品并且在其中建立标志物的对照或参考值。技术人员也清楚，在对照样品中建立的绝对标志物值将取决于所使用的测定。

术语指标的“降低”或“下降”水平是指样品中这种指标的水平与参考或参考样品相比降低。

术语指标的“升高”或“上升”水平是指样品中这种指标的水平与参考或参考样品相比更高。例如，在患有给定疾病的一个个体的液体样品中比在未患有所述疾病的个体的相同液体样品中可检测的量更高的蛋白质具有升高的水平。

术语“测量(measurement或measuring)”或“确定”优选地包括定性、半定量或定量测量。

如本文所用，术语“免疫球蛋白(Ig)”是指赋予免疫球蛋白超家族的糖蛋白的免疫力。“表面免疫球蛋白”通过其跨膜区附着在效应细胞的细胞膜上，涵盖以下分子，例如但不限于B细胞受体、T细胞受体、I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)蛋白、β-2微球蛋白(～2M)、CD3、CD4和CDS。

通常，如本文所用的术语“抗体”是指分泌的免疫球蛋白，它缺乏跨膜区，因此可以释放到血流和体腔中。人类抗体基于它们拥有的重链分为不同的同种型。有五种类型的人类Ig重链，由希腊字母表示：α、γ、δ、ε和μ。·存在的重链类型定义了抗体的类别，即这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中，各自发挥不同的作用，并且指导针对不同类型抗原的适当免疫反应。不同的重链在大小和组成上不同；并且可以包含大约450个氨基酸(Janeway等人(2001)Immunobiology，Garland Science)。IgA存在于粘膜区域，例如肠道、呼吸道和泌尿生殖道，以及唾液、眼泪和母乳中，防止病原体定植(Underdown&Schiff(1986)Annu.Rev.Immunol.4：389-417)。IgD主要作为未暴露于抗原的B细胞上的抗原受体起作用，并且参与激活嗜碱性粒细胞和肥大细胞以产生抗微生物因子(Geisberger等人(2006)Immunology 118：429-437；Chen等人，(2009)Nat.Immunol.10：889-898)。IgE经由与过敏原结合，触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺，从而参与过敏反应。IgE还参与防止寄生虫(Pier等人(2004)Immunology，Infection，and Immunity，ASM Press)。IgG提供了针对入侵病原体的大部分基于抗体的免疫，并且是唯一能够穿过胎盘为胎儿提供被动免疫的抗体同种型(Pier等人(2004)Immunology，Infection，and Immunity，ASM Press)。在人类中，有四种不同的IgG亚类(IgGl、2、3和4)，按照它们在血清中的丰度顺序命名，其中IgG1的丰度最高(～66％)，其次是IgG2(～23％)、IgG3(～7％)和IgG(～4％)。不同IgG类别的生物学特征由各自铰链区的结构决定。IgM以单体形式和分泌型五聚体形式在B细胞表面表达，具有非常高的亲和力。在产生足够的IgG之前，IgM在B细胞介导的(体液)免疫的早期分期参与消除病原体(Geisberger等人(2006)Immunology 118：429-437)。抗体不仅以单体形式存在，而且已知形成两个Ig单元的二聚体(例如IgA)、四个Ig单元的四聚体(例如硬骨鱼的IgM)或五个Ig单元的五聚体(例如哺乳动物IgM)。抗体通常由四条多肽链组成，包括两条相同的重链和两条相同的轻链，它们经由二硫键连接并类似于“Y”形大分子。每条链包含许多免疫球蛋白结构域，其中一些是恒定结构域，而另一些是可变结构域。免疫球蛋白结构域由2层夹心结构组成，其中7到9条反平行的链排列成两个片。通常，抗体的重链包含四个Ig结构域，其中三个是恒定(CH结构域：CHI.CH2。CH3)结构域，并且其中之一是可变结构域(VH)。轻链通常包含一个恒定Ig结构域(CL)和一个可变Ig结构域(VL)。举例而言，人IgG重链从N末端到C末端按VwCH1-CH2-CH3(也称为VwCyl-Cy2-Cy3)顺序由连接的四个Ig结构域组成，而人IgG轻链从N末端到C末端按VL-CL的顺序由连接的两个免疫球蛋白结构域组成，是K型或λ型(VK-CK或VA.-CA.)。举例而言，人IgG的恒定链包含447个氨基酸。在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白中氨基酸位置的编号是“EU索引”的编号，如在以下文献中：Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.，(1991)Sequences ofproteins of immunological interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanService，National Institutes of Health，Bethesda，MD。如“Kabat中的EU索引”是指人IgG IEU抗体的残基编号。因此，IgG上下文中的CH结构域如下：“CHI”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置118-220；“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置237-340；并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置341-447。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指其基本上完整形式的抗体而不是如下文定义的抗体片段。该术语特别是指具有包含Fc区的重链的抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab片段”(也称为“Fab部分”或“Fab区”)，每个片段都具有单个抗原结合位点，以及一个残留的“Fe片段”(也称为“Fe部分”或“Fe区”)，名称反映了其易于结晶的能力。人IgG Fe区的晶体结构已经确定(Deisenhofer(1981)Biochemistry 20：2361-2370)。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fe区由两个相同的蛋白质片段组成，源自抗体两条重链的CH2和CH3结构域；在IgM和IgE同种型中，Fe区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2-4)。此外，更小的免疫球蛋白分子是自然存在的或人工构建的。术语“Fab′片段”是指另外包含Ig分子的铰链区的Fab片段，而“F(ab′)2片段”被理解为包含化学连接或经由二硫键连接的两个Fab′片段。尽管“单域抗体(sdAb)”(Desmyter等人，(1996)Nat.Structure Biol.3：803-811)和“纳米抗体”仅包含单个VH结构域，但“单链Fv(scFv)”片段包含经由短连接基肽连接与轻链可变结构域连接的重链可变结构域(Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883)。二价单链可变片段(di-scFv)可以通过连接两个scFv(scFvA-scFvB)来工程化。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链来实现，从而产生“串联scFv”(VHA-VLA-VHB-VLB)。另一种可能性是创建带有连接基的scFv，这些连接基对于两个可变区而言太短而无法折叠在一起，从而迫使scFv进行二聚化。通常使用长度为5个残基的连接基来产生这些二聚体。这种类型被称为“双抗体”。VH和VL结构域之间仍更短的连接基(一个或两个氨基酸)导致形成单特异性三聚体，即所谓的“三体抗体”或“三体”。双特异性双抗体是通过分别以VHA-VLB和VHB-VLA或VLA-VHB和VLB-VHA排列的链进行表达而形成的。单链双抗体(scDb)包含VHA-VLB和VHB-VLA片段，它们通过12-20个氨基酸，优选14个氨基酸的连接基肽(P)连接(VHA-VLB-P-VHB-VLA)。“双特异性T细胞接合物(BiTE)”是融合蛋白，由不同抗体的两种scFv组成，其中一个scFv经由CD3受体与T细胞结合，另一个经由肿瘤特异性分子与肿瘤细胞结合(Kufer等人，(2004)Trends Biotechnol.22：238-244)。双亲和再靶向分子(“DART”分子)是通过C末端二硫键额外稳定的双抗体。

因此，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv片段；双抗体；sdAb、纳米抗体、scFv、di-scFv、串联scFv、三体抗体、双抗体、scDb、BiTE和DART。

术语“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括但不限于基于表面等离子共振的测定(例如PCT申请公开号WO2005/012359中描述的BIAcore测定)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；和竞争测定(例如RIA)。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常快速结合抗原并且倾向于保持更长的结合时间。测量结合亲和力的各种方法是本领域中已知的，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。

“夹心免疫测定”广泛用于检测目标分析物。在这样的测定中，分析物被“夹在”第一抗体和第二抗体之间。通常，夹心测定要求捕获和检测抗体与目标分析物上的不同非重叠表位结合。通过适当的手段测量这种夹心复合物并且由此定量分析物。在典型的夹心型测定法中，结合到固相载体或能结合到固相的第一抗体以及被可检测地标记的第二抗体各自与分析物结合于不同的非覆盖型表位。第一分析物特异性结合剂(例如抗体)共价或被动结合到固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。该固相支持体的形式可以是小管、磁珠、微孔板托盘或其他适合于进行免疫测定法的任何表面。结合方法为本领域所公知，通常由交联共价结合或物理吸附组成，在制备测试样品时洗涤聚合物-抗体复合物。然后将待测样品的等分试样加入固相复合物中，并且在适合的条件下(例如从室温到40℃，例如25℃和37℃之间)孵育足够长的一段时间(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)，以允许第一或捕获抗体与相应抗原之间的结合。该温育期结束之后，可洗涤固相，其包括第一抗体或捕获抗体以及与其相结合的抗原，并用结合于该抗原上另一个表位的二级抗体或标记的抗体进行温育。第二抗体连接到报告物分子，该分子用于指示第二抗体与第一抗体-目标抗原复合物之间的结合。

极为通用的其他夹心测定法方式包括使用结合对的第一配偶体包被的固相载体，例如顺磁性链霉亲和素包被的微粒。将所述微粒与以下物质混合后温育：与结合对的第二配偶体结合的分析物特异性结合剂(例如生物素化的抗体)；疑似包含或包含分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体结合到所述分析物特异性结合剂；以及可检测地标记的第二分析物特异性结合剂。如对本领域技术人员显而易见的那样，所述组分在适当条件下温育足够长的一段时间，以使标记的抗体(通过分析物)、与结合对的第二配偶体(结合)的分析物特异性结合剂以及结合对的第一配偶体与固相微粒相结合。视情况而定，所述测定法可包含一个或多个洗涤步骤。

术语“可检测地标记的”包含可直接或间接检出的标记。

可直接检出的标记提供可检测的信号或它们与第二标记相互作用以修正第一或第二标记提供的可检测的信号，例如发生FRET(荧光共振能量转移)。标记诸如荧光染料及发光(包括化学发光和电化学发光)染料(Briggs等人，″Synthesis of FunctionalisedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测的信号并且通常适用于标记。在一个实施例中，“可检测地标记的”指提供或诱导提供可检测的信号的标记，即分别指荧光标记、发光标记(例如化学发光标记或电化学发光标记)、放射性标记或基于金属螯合物的标记。

大量的可用标记(也称为染料)通常可分为以下类别，全部类别的总体及其每一个类别均表示如本公开所述的实施例：

(a)荧光染料

荧光染料例如，如Briggs等人所描述，″Synthesis of FunctionalizedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)。

荧光标记或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型标记，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺(Lissamine)；花青；藻红蛋白；得克萨斯红(Texas Red)；及其类似物。采用本文所公开的技术，可将荧光标记缀合至目标分子所包含的醛基。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/MolecularProbes(Eugene，Oregon，USA)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Ill.)购得的这类荧光染料和试剂。

(b)发光染料

发光染料或标记还可进一步划分为以下子类别：化学发光染料和电化学发光染料。

不同类别的化学发光标记包括鲁米诺、吖啶类化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶的标记(详细综述见Dodeigne C.等人，Talanta 51(2000)415-439)。

用作电化学发光标记的主要相关性标记分别是钌基和铱基电化学发光络合物。已经证明，电化学发光(ECL)作为高灵敏度和选择性方法在分析应用中非常有用。该方法使化学发光分析的分析优势(无背景光信号)和通过采用电极电位更方便地控制反应相结合。通常，钌络合物，特别是与TPA(三丙胺)在液相或液固界面再生的[Ru(Bpy)3]2+(发射出波长约620nm的光子)被用作ECL标记。

电化学发光(ECL)测定法提供了灵敏、精确地检测目标分析物的存在性和浓度的方法。所述技术采用的是可在适当化学环境下发生电化学地氧化或还原时被诱导发光的标记或其他反应物。所述电化学发光由施加在工作电极上的电压在特定时间以特定方式激发。标记所发出的光经测定后，可指示分析物的存在性或数量。为了更全面地描述这类ECL技术，本文引用了以下文献：美国专利号5,221,605、美国专利号5,591,581、美国专利号5,597,910，、PCT公布的申请WO90/05296、PCT公布的申请WO92/14139、PCT公布的申请WO90/05301、PCT公布的申请WO96/24690、PCT公布的申请US95/03190、PCT申请US97/16942、PCT公布的申请US96/06763、PCT公布的申请WO95/08644、PCT公布的申请WO96/06946、PCT公布的申请WO96/33411、PCT公布的申请WO87/06706、PCT公布的申请WO96/39534、PCT公布的申请WO96/41175、PCT公布的申请WO96/40978、PCT/US97/03653以及美国专利申请08/437,348(美国专利号5,679,519)。还引用了Knight等人1994年发表的ECL分析应用回顾(Analyst，1994，119：879-890)以及该文章所引用的文献。在一个实施例中，使用电化学发光标记实施根据本说明所述的方法。

最近，对铱基ECL标记已有描述(WO2012107419)。

(c)放射性标记使用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。

(d)金属螯合物的配合物适合用作成像和治疗目的的标记，这是本领域所公知的(US 2010/0111861；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,461；Hnatowich等人，J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares等人，Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等人，Bioconjugate Chem.1(1990)59-65；Meares等人，J.Cancer(1990)，增刊10：21-26；Izard等人，Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula等人，Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等人，J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera等人，J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人，Cancer Res.50(1990)4221-4226；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等人，Cancer Res.61(2001)4474-4482；Mitchell等人，J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等人，Bioconjugate Chem.10(1999)103-111；Miederer等人，J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo等人，ClinicalCancer Research 4(1998)2483-90；Blend等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363；Nikula等人，J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等人，J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals，14(1999)209-20)。

实施例

在第一方面，本发明涉及一种评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险的方法，其包括

a)确定所述患者的所述样品中的S100A9的量，以及

b)将所确定的量与参考进行比较。

在实施例中，患者的样品中升高的S100A9量指示患者体内存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。特别地，如果患者的样品中S100A9的量高于参考或参考样品中S100A9的量，则患者的样品中S100A9的量指示患者体内存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。特别地，与未患子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险中的个体的相同液体样品中相比，在评估存在子宫内膜异位症或处于其发展风险中的患者的液体样品中可检测到更高量的S100A9。

特别地，S100A9的量升高50％或更多，指示存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。特别地，S100A9的量升高100％或更多，指示存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。特别地，S100A9的量升高150％或更多，指示存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。特别地，S100A9的量升高200％或更多，指示存在子宫内膜异位症或有发展子宫内膜异位症的风险。

在实施例中，患者的样品是体液样品。在具体实施例中，样品是全血、血清或血浆样品。在实施例中，所述样品为体外样品，即将在体外进行分析，不会再移回体内。

在具体实施例中，患者是实验室动物、家畜或灵长类动物。在具体实施例中，患者是人。在具体实施例中，患者是女性人类患者。

在实施例中，评估的子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的III期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的IV期子宫内膜异位症。在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症是I期、II期、III期或IV期子宫内膜异位症。在实施例中，子宫内膜异位症是早期子宫内膜异位症，特别是根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症或根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症。在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症处于III期或IV期。

在实施例中，评估的子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：腹膜子宫内膜异位症、子宫内膜瘤、深部浸润型子宫内膜异位症(DIE)和子宫腺肌病。

在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症是根据rASRM分期的I期或II期腹膜子宫内膜异位症。

在实施例中，其中独立于rASRM分期执行所述评估。特别地，在不执行腹腔镜检查的情况下执行评估。特别地，在不使用腹腔镜检查和/或rASRM分期评估患者体内子宫内膜异位症的存在或严重程度的情况下进行评估。

在实施例中，本发明的方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定S100A9的量。在实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括执行免疫测定。在实施例中，免疫测定以直接或间接形式执行。在实施例中，此类免疫测定选自由以下项组成的组：酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定。

在特定实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括以下步骤

i)将患者的样品与一种或多种与S100A9特异性结合的抗体一起孵育，从而在抗体和S100A9之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中S100A9的量。

在具体实施例中，在步骤i)中，样品与两种抗体一起孵育，特异性结合S100A9。如对本领域技术人员显而易见的那样，可以按任意需要的顺序使样品接触第一和第二抗体，即首先接触第一抗体，然后接触第二抗体；或首先接触第二抗体，然后接触第一抗体；或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物。如本领域技术人员所容易理解的是，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适合或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗S100A9抗体和S100A9抗原/分析物的复合物(＝抗S100A9复合物)，或形成二级复合物或夹心复合物，其包括S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和第二抗S100A9抗体(＝抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物)。

可采用任何适当的手段对抗S100A9抗体/S100A9复合物执行检测。可采用任何适当的手段对第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物执行检测。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包含针对S100A9、S100A9(分析物)的第一抗体和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中所述第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包含针对S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记并且其中第一抗S100A9抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在具体实施例中，用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记第二抗体。

在实施例中，所述方法进一步包括评估患者中存在痛经和/或下腹部疼痛。在实施例中，根据VAS量表评估痛经和/或下腹部疼痛的存在。在实施例中，4或更高的痛经VAS评分表示中度或重度痛经。在实施例中，3或更低的分数表示没有痛经或有轻度痛经。在实施例中，所述方法进一步包括确定CA-125的量或浓度。

在实施例中，所述方法包括计算S100A9的所述量或浓度与痛经的比率、S100A9的所述量或浓度与根据VAS量表的下腹部疼痛的比率、或S100A9的所述量或浓度与CA-125的所述量或浓度的比率。

在第二方面，本发明涉及一种选择供进行子宫内膜异位症的疗法的患者的方法，其包括

a)确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

b)将所确定的量或浓度与参考进行比较。

在实施例中，如果确定患者的样品中S100A9的量升高，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。特别地，如果患者的样品中S100A9的量高于参考或参考样品中S100A9的量，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。特别地，如果评估用于子宫内膜异位症的疗法的患者的液体样品中S100A9的量高于未患子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险中或未被选择进行子宫内膜异位症的疗法的个体的相同液体样品中的量，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。

特别地，如果S100A9的量升高50％或更多，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。特别地，如果S100A9的量升高100％或更多，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。特别地，如果S100A9的量升高150％或更多，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。特别地，如果S100A9的量升高200％或更多，则选择患者进行子宫内膜异位症的疗法。

在实施例中，被选择进行子宫内膜异位症的疗法的患者，所述治疗选自由以下项组成的组：基于药物的治疗或手术治疗。在实施例中，子宫内膜异位症的手术治疗是腹腔镜检查或神经保留手术。在实施例中，子宫内膜异位症的基于药物的治疗是抑制或靶向神经源性炎症和/或止痛药和/或激素疗法(例如激素避孕药或GnRH激动剂)。

在实施例中，患者的样品是体液样品。在具体实施例中，样品是全血、血清或血浆样品。在实施例中，所述样品为体外样品，即将在体外进行分析，不会再移回体内。

在具体实施例中，患者是实验室动物、家畜或灵长类动物。在具体实施例中，患者是人。在具体实施例中，患者是女性人类患者。

在实施例中，子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的III期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的IV期子宫内膜异位症。在具体实施例中，子宫内膜异位症是I期、II期、III期或IV期子宫内膜异位症。在实施例中，子宫内膜异位症是早期子宫内膜异位症，特别是根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症或根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症。在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症处于III期或IV期。

在实施例中，子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：腹膜子宫内膜异位症、子宫内膜瘤、深部浸润型子宫内膜异位症(DIE)和子宫腺肌病。

在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症是根据rASRM分期的I期或II期腹膜子宫内膜异位症。

在实施例中，本发明的方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定S100A9的量。在实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括执行免疫测定。在实施例中，免疫测定以直接或间接形式执行。在实施例中，此类免疫测定选自由以下项组成的组：酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定。

在特定实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括以下步骤

i)将患者的样品与一种或多种与S100A9特异性结合的抗体一起孵育，从而在抗体和S100A9之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中S100A9的量。

在具体实施例中，在步骤i)中，样品与两种抗体一起孵育，特异性结合S100A9。如对本领域技术人员显而易见的那样，可以按任意需要的顺序使样品接触第一和第二抗体，即首先接触第一抗体，然后接触第二抗体；或首先接触第二抗体，然后接触第一抗体；或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物。如本领域技术人员所容易理解的是，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适合或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗S100A9抗体和S100A9抗原/分析物的复合物(＝抗S100A9复合物)，或形成二级复合物或夹心复合物，其包括S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和第二抗S100A9抗体(＝抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物)。

可采用任何适当的手段对抗S100A9抗体/S100A9复合物执行检测。可采用任何适当的手段对第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物执行检测。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包含针对S100A9、S100A9(分析物)的第一抗体和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中所述第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包含针对S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记并且其中第一抗S100A9抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在具体实施例中，用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记第二抗体。

在实施例中，所述方法进一步包括评估患者中存在痛经和/或下腹部疼痛。在实施例中，根据VAS量表评估痛经和/或下腹部疼痛的存在。在实施例中，4或更高的痛经VAS评分表示中度或重度痛经。在实施例中，3或更低的分数表示没有痛经或有轻度痛经。

在实施例中，所述方法进一步包括确定CA-125的量或浓度。

在实施例中，所述方法包括计算S100A9的所述量或浓度与痛经的比率、S100A9的所述量或浓度与根据VAS量表的下腹部疼痛的比率、或S100A9的所述量或浓度与CA-125的所述量或浓度的比率。

在第三方面，本发明涉及一种监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法，其包括

a)确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

b)将所确定的量或浓度与参考进行比较。

在实施例中，监测患有子宫内膜异位症的患者以确定患者的样品中S100A9的量或浓度是否随时间变化。特别地，监测患有子宫内膜异位症的患者以确定S100A9的量或浓度是否随时间升高、降低或不变化。在实施例中，如果确定患者的样品中S100A9的量升高，则监测患有子宫内膜异位症的患者。

在实施例中，监测正在接受子宫内膜异位症治疗的患者以确定患者的样品中S100A9的量或浓度是否发生变化。特别地，监测正在接受子宫内膜异位症治疗的患者以确定S100A9的量或浓度是否升高、降低或不变化。特别地，监测正在接受子宫内膜异位症治疗的患者以确定S100A9的量或浓度是否因所应用的治疗而升高、降低或不变化。在实施例中，正在接受子宫内膜异位症治疗的患者体内S100A9的量或浓度降低指示治疗有效。在实施例中，正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的样品中S100A9的量或浓度不变或升高指示治疗无效，即正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的样品中S100A9的量或浓度不变或升高指示持续或复发的子宫内膜异位症。特别地，如果S100A9的量增加到50％或更多，则对子宫内膜异位症的治疗是无效的。特别地，如果S100A9的量增加到100％或更多，则对子宫内膜异位症的治疗是无效的。特别地，如果S100A9的量增加到150％或更多，则对子宫内膜异位症的治疗是无效的。特别地，如果S100A9的量增加到200％或更多，则对子宫内膜异位症的治疗是无效的。

在具体实施例中，如果确定了正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的样品中S100A9的量或浓度不变或升高，则调整疗法。

在实施例中，在不同时间点多次监测患者。在实施例中，在数周、数月或数年的时间范围内多次监测患者。在具体实施例中，每月一次或每年一次监测患者。在实施例中，在子宫内膜异位症诊断后每月一次或每年一次监测患有子宫内膜异位症的患者。在实施例中，正在接受治疗子宫内膜异位症的患者在治疗后监测一次，特别是在手术治疗后监测一次。特别地，每月一次或每年一次监测正在接受子宫内膜异位症治疗的患者以确定子宫内膜异位症的治疗效果和/或复发。

在实施例中，子宫内膜异位症的疗法选自由以下项组成的组：基于药物的治疗或手术治疗。在实施例中，子宫内膜异位症的手术治疗是腹腔镜检查或神经保留手术。在实施例中，子宫内膜异位症的基于药物的治疗是抑制或靶向神经源性炎症和/或止痛药和/或激素疗法。在实施例中，患者的样品是体液样品。在具体实施例中，样品是全血、血清或血浆样品。在实施例中，所述样品为体外样品，即将在体外进行分析，不会再移回体内。

在具体实施例中，患者是实验室动物、家畜或灵长类动物。在具体实施例中，患者是人。在具体实施例中，患者是女性人类患者。

在实施例中，子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的III期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的IV期子宫内膜异位症。在具体实施例中，子宫内膜异位症是I期、II期、III期或IV期子宫内膜异位症。在实施例中，子宫内膜异位症是早期子宫内膜异位症，特别是根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症或根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症。在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症处于III期或IV期。

在实施例中，子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：腹膜子宫内膜异位症、子宫内膜瘤、深部浸润型子宫内膜异位症(DIE)和子宫腺肌病。

在具体实施例中，评估的子宫内膜异位症是根据rASRM分期的I期或II期腹膜子宫内膜异位症。

在实施例中，本发明的方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定S100A9的量。在实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括执行免疫测定。在实施例中，免疫测定以直接或间接形式执行。在实施例中，此类免疫测定选自由以下项组成的组：酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定。

在特定实施例中，确定患者的样品中S100A9的量的步骤a)包括以下步骤

i)将患者的样品与一种或多种与S100A9特异性结合的抗体一起孵育，从而在抗体和S100A9之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中S100A9的量。

在具体实施例中，在步骤i)中，样品与两种抗体一起孵育，特异性结合S100A9。如对本领域技术人员显而易见的那样，可以按任意需要的顺序使样品接触第一和第二抗体，即首先接触第一抗体，然后接触第二抗体；或首先接触第二抗体，然后接触第一抗体；或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物。如本领域技术人员所容易理解的是，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适合或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗S100A9抗体和S100A9抗原/分析物的复合物(＝抗S100A9复合物)，或形成二级复合物或夹心复合物，其包括S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和第二抗S100A9抗体(＝抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物)。

可采用任何适当的手段对抗S100A9抗体/S100A9复合物执行检测。可采用任何适当的手段对第一抗S100A9抗体/S100A9/第二抗S100A9抗体复合物执行检测。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包含针对S100A9、S100A9(分析物)的第一抗体和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中所述第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包含针对S100A9的第一抗体、S100A9(分析物)和针对S100A9的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记并且其中第一抗S100A9抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在具体实施例中，用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记第二抗体。

在实施例中，所述方法进一步包括评估患者中存在痛经和/或下腹部疼痛。在实施例中，根据VAS量表评估痛经和/或下腹部疼痛的存在。在实施例中，4或更高的痛经VAS评分表示中度或重度痛经。在实施例中，3或更低的分数表示没有痛经或有轻度痛经。

在实施例中，所述方法进一步包括确定CA-125的量或浓度。

在实施例中，所述方法包括计算S100A9的所述量或浓度与痛经的比率、S100A9的所述量或浓度与根据VAS量表的下腹部疼痛的比率、或S100A9的所述量或浓度与CA-125的所述量或浓度的比率。

在其他实施例中，本发明涉及以下方面：

1.评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险中的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

2.一种选择供进行子宫内膜异位症的疗法(特别是基于药物的疗法或手术疗法(腹腔镜检查))的患者的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

3.一种监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

4.根据方面1至3所述的方法，其中所述患者的所述样品中升高的S100A9的量或浓度指示所述患者体内存在子宫内膜异位症。

5.根据方面1至4所述的方法，其中所述样品是体液。

6.根据方面1至5所述的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。

7.根据方面1至6所述的方法，其中受试者是雌性患者，特别地是人类女性患者。

8.根据方面1至7所述的方法，其中独立于rASRM分期执行所述评估。

9.根据方面1至8所述的方法，其中子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的III期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的IV期子宫内膜异位症。

10.根据方面1至9所述的方法，其中子宫内膜异位症是早期子宫内膜异位症，特别是根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症或根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症。

11.根据方面1至10所述的方法，其中子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：腹膜子宫内膜异位症、子宫内膜瘤、深部浸润型子宫内膜异位症和子宫腺肌病。

12.根据方面1至11所述的方法，其进一步包括根据VAS量表评估痛经和/或根据VAS量表评估下腹部疼痛。

13.根据方面1至12所述的方法，其进一步包括确定CA-125的量或浓度。

14.根据方面12或13所述的方法，其包括计算S100A9的所述量或浓度与痛经的比率、S100A9的所述量或浓度与根据VAS量表的下腹部疼痛的比率、或S100A9的所述量或浓度与CA-125的所述量或浓度的比率。

提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

实例

实例1：生物标志物S100A9和生物标志物组合在子宫内膜异位症和对照女性中的诊断性能

对于测量，总共分析了来自人类女性的21份血清和31份血浆样品。通过ELISA(酶联免疫吸附测定)确定分析物的浓度。病例组由经腹腔镜检查诊断为盆腔子宫内膜异位症(rASRM I-IV期)的患者组成，并且对照组包括无子宫内膜异位症的健康女性。

使用来自CircuLex/MBL(由德国Biozol Eching分销；目录号：CY-8062)的人S100A9/MR14 ELISA试剂盒，确定人血清中的S100A9的浓度。所述试剂盒利用定量夹心ELISA技术。此测定的测量范围是50pg/mL-3,200pg/mL。微量滴定板预先涂有对人S100A9特异性的单克隆抗体。样品在稀释缓冲液中稀释10倍进行测量。将所有试剂置于室温后，加入100μL的每个样品和标准品。样品单份测量，标准品一式两份测量。在设置为650rpm的微孔板振荡器上室温孵育1h期间，存在的任何S100A9都与微量滴定板上固定的捕获抗体结合。在洗涤步骤(4x350μL)期间，在将100μL的对S100A9特异性的酶联单克隆抗体添加到孔中之前，从板上去除未结合的物质。在振荡器上孵育1h和另一个洗涤步骤以去除任何未结合的检测抗体后，将100μL的底物溶液添加到板中。在接下来的10min内，显色与初始步骤中结合的S100A9的量成比例。通过添加100μL的终止溶液停止显色，并且使用读板器在450nm处测量颜色强度以进行检测，并且在570nm处测量颜色强度以进行背景扣除。为了产生校准品曲线，将随试剂盒提供的冻干重组S100A9重新溶解并且在校准品稀释剂中稀释。所述测定的校准范围是50pg/mL-3,200pg/mL。校准品6(3,200pg/mL)是通过用1mL的稀释缓冲液重新溶解冻干的人S100A9标准品(试剂盒中提供)并且按1∶2进一步稀释来制备的。校准品5到校准品1(78.1pg/mL)是通过在校准品稀释剂中连续2倍稀释步骤制备的。将纯校准稀释剂用作空白(0pg/mL)。使用无加权的4参数非线性回归(Newton/Raphson)拟合校准曲线。

由cobas e 601分析仪确定CA-125的浓度。使用cobas e 601分析仪检测CA 125II是基于

电化学发光(ECL)技术。简而言之，生物素标记的和钌标记的抗体与相应量的未稀释样品结合，并且在分析仪上孵育。随后，添加链霉亲和素包被的磁性微粒并且在仪器上孵育，以便促进生物素标记的免疫复合物的结合。在这个孵育步骤之后，反应混合物被转移到测量池中，在那里珠子被磁性捕获在电极的表面上。然后将含有用于后续ECL反应的三丙胺(TPA)的ProCell M缓冲液引入测量池中，以便将结合的免疫分析复合物与游离的剩余颗粒分离。然后工作电极和对电极之间的电压感应引发反应，导致钌复合物以及TPA发射光子。产生的电化学发光信号由光电倍增管记录并转换为指示相应分析物浓度水平的数值。

生成了接收者操作特征(ROC)曲线(单一生物标志物参见图1，生物标志物与临床症状痛经的组合参见图2)。模型性能通过查看曲线下面积(AUC)来确定。最好的可能的AUC是1，而最低的可能的是0.5。使用约登指数(最大敏感性加特异性的总和-1)选择最佳临界值。

表1：生物标志物S100A9和生物标志物组合在子宫内膜异位症和对照女性中的诊断性能

对于多变量分析，AUC图(不同生物标志物组合的临界值)被应用于基于多变量逻辑回归分析和约登指数预测子宫内膜异位症。4或更高的痛经VAS评分表示中度或重度痛经。3或更低的分数表示没有痛经或有轻度痛经。

表2：基于多变量逻辑回归分析和约登指数的各种生物标志物组合预测子宫内膜异位症的临界值

*截距α：曲线与y轴相交的点；**参数β：每个变量的线性回归曲线的斜率。

参数α和β的值分别取决于多变量分析中包括的分析物和临床症状而变化。

具有S100A9和痛经VAS的多变量逻辑回归模型：

如果logit＝α+(β1*S100A9值[pg/mL])+(β2*痛经值[VAS])≥临界值，则有疾病(即子宫内膜异位症I、II、III或IV期)，否则没有疾病

或

如果logit＝-121.3+(0.0200*S100A9)+(42.6309*痛经值)≥2.75879，则有疾病(即子宫内膜异位症I、II、III或IV期)，否则没有疾病

为子宫内膜异位症病例/对照和子宫内膜异位症病例G1/2(I-II期)/子宫内膜异位症病例G3-4(III-IV期)/对照生成箱线图(参见图3)。数据使用箱线图表示，包括中位数(中间四分位数)、四分位间距(代表该组分数的中间50％)、上四分位数(75％的分数低于上四分位数))，下四分位数(25％的分数低于下四分位数)。线分别显示第5个百分位数和第95个百分位数。

实例2生物标志物S100A9和生物标志物组合在子宫腺肌病和对照女性中的诊断性能。

病例组由通过腹腔镜观察诊断为子宫腺肌病并随后进行组织学确认的患者组成，并且对照组包括没有子宫腺肌病的健康女性。病例组的入选标准是存在骨盆疼痛/不孕症和年龄在18-45岁之间。病例组的排除标准为妊娠/哺乳、恶性肿瘤、子宫腺肌病复发和腹腔镜检查/剖腹手术≤6个月。

使用来自CircuLex/MBL的人S100A9/MR14 ELISA试剂盒确定人血清中S100A9的浓度(详情参见上述实例1)。

CA-125的浓度是通过cobas e 601分析仪使用

CA 125 II确定的，如之前在实例1中所述。

接收者操作特征(ROC)曲线由单一生物标志物的单变量模型生成。模型性能通过查看曲线下面积(AUC)来确定。

表3.单一生物标志物S100A9和CA-125在子宫腺肌病病例和对照中的诊断性能。

与生物标志物CA-125的诊断性能相比，S100A9区分子宫腺肌病病例与对照的诊断性能更高。

图4.子宫腺肌病病例和对照组血清S100A9水平的箱线图和ROC曲线。(A)箱线图显示了对照与子宫腺肌病病例的血清S100A9水平。每个箱的下边缘和上边缘分别对应于第一个和第三个四分位数。中间粗线表示中值，并且上下线表示四分位距的1.5倍的值。(B)血清S100A9的ROC曲线显示对照和子宫腺肌病病例。

图5.子宫腺肌病病例和对照组血清CA-125水平的箱线图和ROC曲线。(A)箱线图显示了对照与子宫腺肌病病例的血清CA-125水平。每个箱的下边缘和上边缘分别对应于第一个和第三个四分位数。中间粗线表示中值，并且上下线表示四分位距的1.5倍的值。(B)血清CA-125的ROC曲线显示对照和子宫腺肌病病例。

Claims (15)

1.一种评估患者是否患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

2.一种选择供进行子宫内膜异位症的疗法(特别是基于药物的疗法或手术疗法(腹腔镜检查))的患者的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

3.一种监测患有子宫内膜异位症或正在接受子宫内膜异位症治疗的患者的方法，其包括

确定所述患者的样品中的S100A9的量或浓度，以及

将所确定的量或浓度与参考进行比较。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述患者的所述样品中升高的S100A9的量或浓度指示所述患者中存在子宫内膜异位症。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述样品是体液。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中受试者是雌性患者，特别地是人类女性患者。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中独立于rASRM分期执行所述评估。

9.根据权利要求1至8所述的方法，其中子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的III期子宫内膜异位症、根据rASRM分期的IV期子宫内膜异位症。

10.根据权利要求1至9所述的方法，其中子宫内膜异位症是早期子宫内膜异位症，特别是根据rASRM分期的I期子宫内膜异位症或根据rASRM分期的II期子宫内膜异位症。

11.根据权利要求1至10所述的方法，其中子宫内膜异位症选自由以下项组成的组：腹膜子宫内膜异位症、子宫内膜瘤、深部浸润型子宫内膜异位症和子宫腺肌病。

12.根据权利要求1至11所述的方法，其中优选评估子宫腺肌病。

13.根据权利要求1至12所述的方法，其进一步包括根据VAS量表评估痛经和/或根据VAS量表评估下腹部疼痛。

14.根据权利要求1至13所述的方法，其进一步包括确定CA-125的量或浓度。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其包括计算S100A9的所述量或浓度与痛经的比率、S100A9的所述量或浓度与根据VAS量表的下腹部疼痛的比率、或S100A9的所述量或浓度与CA-125的所述量或浓度的比率。

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