TW316291B - - Google Patents

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經濟部中央祺竿局霣工消费含作杜_« 316291 A6 B6 五、發明説明（） 本申請係1991年2月6曰提交的題為“霣化學發光拥 定”（申請號：07/ 652427，發明人·· Massey等）（該申 請案又係1988年11月3日提交的申請轚爲266882的申諳案 的繼續部分，現已放索）的待批專利的繼縉部分，本申請 也係1990年6月18日提交的申請號為539389 (該申請案又 係申請號為266882的繼績部分）的申請茱的繼績部分。本 申請又是Massey等與題為“含有複合磁«的磁微粒基發光 測定的方法和裝置” （CMS登記號370068-3401)的申請案 (該申請案又係申請號為07/ 652427的申請茱的繼續部分 )同時提交申諳的申請案。上述有關申請均為本申請案的 參考文件。 本申請一般涉及進行结合測量的方法和装置，具體地 說涉及通過澜董由拥IM糸统中的一值或多鏟檫記化合物發 射的發光測定有意義被分析物，更具腥地說，本發明涉及 离靈f度的準確、精密和能重現的均相或多相專一性结合 拥(量，其中在產生霣化學發光前，發光组成份富集在澍量 组合物中並在檢測条统上進行收集。 鬨於檢測和定量分析生化物質和生物物質中的分析物 ，已经硏究和發展了許多方法和鑲条。能夠瀰釐痕量撤生 物、橥物、激素、病毒、抗鼸、核酸和其他蛋白的方法和 醱条對硏究人貝和臨床工作人員則具有重要的意義。 採用已知的结合反應方法，已經能檢澜和分析大董物 質，例如抗原-抗醱反應，核酸雜交技術和蛋白-配位鑊 条统。許多生化和生物结合醱条中的高度專一性產生了對 請 先 閩 讀 背 面 之I · 事 項k 再 填 寫 本 裝 訂 Λ 撫 t紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公騖） -3 81.9.25,000 *濟部中夹櫺準局βχ消费合作杜<fw 316291 A6 _B6_ 五、發明説明（） 硏究和診斷具有重要意義的許多測貴方法和条統。具醱地 說，在一種或多種結合材料上是否存在可觀察董的檷記物 ，即可說明是否存在有意義的分析物。待別有意義的是通 遇光化學、化學和電化學方法，將檷記物裂成發光材料。 “光致發光”是一種當材料吸收電磁輻射時能誘導發光的 方法。.螢光和磷光則是光致發光的典型例子。“化學發光 ”方法則是通遇能置的化學轉化提供發光的方法。“《化 學發光”是通過«化學方法提供發光。 現已發展起來的化學發光澜量技術是将含有意義分析 物的樣品舆用化學發光檷記物檷記的反®物相混合，該反 應混合物經誘導後，某些部分的榧記反*物與分析物结合 。誘導後將混合物的結合部分與未结合部分分離，這兩部 分或其中的一部分中檫記物的濃度可通遇化學發光方法進 行測定。埴兩部分或其一部分中所測定的化學發光的Λ可 說明丰物樣品中有意義的分析物的含董。 霄化學發光（ECL)测置技術是對化學發光技術的改進 。該方法提供了1敏精密地澍置有意義分析物的存在及其 濃度。使用渲類方法時，将經遇誘導的樣品通遇伏安工作 霣棰激發發光。在特定的化學環境中，渣種《化學發光是 在一定的時間和採用一定的方法的條件下施加在工作霣極 上的霣壓激發的。測量由檷記物產生的光，從而可說明分 析物的存在或其含量。關於莆化學發光的詳細介绍，可參 閲PCT己經公開的専利申請文件：US85/ 01253 (W086/ 02734)、US87/00987 和 US88/ 03947，上述文獻也係本文 — 卜---4---£11►---lt《-----装------訂------产； (請先《讀背*之注意事項再瑱寫本貫) 本紙張尺度逋用中Η國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公蹵） 4 81.9.25,000 316^91 A6 B6 五、發明説明（） *濟鏵+夫橒準扃霣工消费含作杜卹* 的參考文獻。 在進行《化學發光澍量時，最好在拥置程序中不需要 分離步騎，並且對不同濃度分析物的信號調製放至最大程 度，從而能«得精確1敏的拥量。在不分離拥量的己有方 法中，将撤顆粒懸浮在測量樣品中，與一櫃或多棰潮量结 合组成份相結合。 美國專利4305925涉及使用漘度澜定法和比漘法檢測 和測定與睡床有醑的蛋白和胜fe，所公開的方法包括将抗 原或抗體舆具有光散射或光吸收作用的乳謬顆粒相结合。 美國專利4480042涉及使用由殼芯顆粒组成的顆粒試 爾的技術，其顆粒殻層含有有意義生物化合物能舆之共價 结合的官能團；而且殻芯的高反應指數形成了對光散射測 量的敏感性。該技術是K凝集反臁為基礎，其由二價抗釀 與多價抗原反應產生能用各種方法檢測和/或》量的凝集 物。 美國專利4419453也涉及可用於檢拥(是否存在免疫化 學物質（例如抗鼸和免疫原）的帶色乳膠凝集測定方法的 應用。根據該項已有技術。似乎並不可能將撤顆粒用於測 置發光現象。但是可望由游離化學發光或霣化學發光部分 產生的發光可被及收、散射、甚至邇會受到徹顆粒物質的 影髻。 出乎意料的是美國專利539389 (PCT申請號U.S.89/ 04919)公開了發光現象的靈敏的專一性结合澜定方法， 其中惰性撤顆粒可與測定鱧条中的一齒結合反應物進行待 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項铋 再 填 寫

装 訂 纸張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 516291 五、發明説明（） (請先閱讀背面之注意事項存填窵本荑) 異性结合。該項測置可在多相（一個或多値分離步驟）中 進行，而在均相（無分離步»)中進行則更為有利。 美國專利89/ 04919涉及用於拥董化學現象的結合反 應的组合物，該組合物包括具有能與測量混合物中的組成 份柑结合的表面的複合懸浮顆粒。另一方面，還提供了檢 拥或定量分析樣品中被分析物的条统，該条统用本發明的 拥量组合物能夠實現澜量方法。該条统包括在測量介質中 将檷記化合物誘導發光的裝置和用於檢澜樣品中被分析物 的發光澍置裝置。 現已發現，測量条统中舆電化學發光部分相連接的组 成份舆懸浮微顆粒相结合，可以大大調製由舆該组成份相 連接的電化學發光部分產生的發光倍號的強度，從而提供 了監測拥IM糸統中專一性结合反應的装置。更令人驚奇的 是通發現，懸浮顆粒對由與該条統中的组成份柑連接的霣 致化$發光部分所產生的化學倍號強度的影響很小或沒有 彩*，所逑条統中的组成份仍未與想浮撤顆粒結合。 因此，美國專利89/ 04919中所述檢澜樣品中被分析 物的方法包括如下步 嫌濟部中央#準扃霣工消费含作社 (1)組成组合物，該组合物含有： (a) 含有可能存在著所需被分析物的樣品； (b) 用於測最的物質，S自：（i)霈要测董的分析 物或類似分析物；（Π)需要測量的分析物或類似分析物的 结合對象；（iii)能舆（i)或（ii)結合的反應組成份，其中 所述用於拥置的物質中的一棰物質與具有能誘導發光的化 本紙張尺度適用中a國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公犛） 6 81.9,25,000 A6 B6 經濟部_央標準扃員工消费含作杜_* 五、發明説明（） 學部分的禰記化合物相達接；和 (C)能舆分析物和/或（b)(i)、（ii)或（iiU中所 述物質專一性结合的複合驗浮顆粒； (2) 溫育组合物，形成含有顆粒和所述棰記化合物的 礞 錯合物； (3) 将樓記化合物誘導發光；Μ及 (4) 澍量由組合物發射的發光，檢澜存在於樣品中的 被分析物。 通遇将拥量组合物的發光與含有已知董的被分析物的 组合物的發光的對比，上述同類方法都可用於定量分析樣 品中被分析物的含Μ。 類似被分析物可以是天然的，也可以是合成的，它們 是具有與被分析物可作對比的結合専一性的化合物，但是 也包括結合能力較高或較低的化合物。適宜用於本發明的 結合對象均爲公眾所熟悉的，例如有抗體、酶、核酸、外 源凝集素、輔因子和受體。能舆被分析物或其類似物和/ 或與其結合對象结合的反應组成份可Μ是次级抗體或諸如 蛋白Α或蛋白G的蛋白，也可以是抗生物素蛋白或生物素 ，或本領域已知的能參舆结合反應的其他组成份。 發光最好是由棰記化合物（不管其是苔已與專一性结 合對象結合或未结合）經伏安工作霣極作用誘導的電致化 學發光（ECL)產生的發光。電化學發光反應混合物在一定 的時間和Μ—定的方法，在工作霣極上施加電壓，使之產 生光，從而有控制地發射出光。雖然發射可見光較好，但 'U____私___Is—I UI — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本霣) -装- 訂· < 本紙張尺度遴用中SS家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -7 _ 81.9.25,000 S16291 Α6 Β6 纒濟部中央樣準局霣工消费合作杜<f« 五、發明説明（） 是組合物或条統也可以發射其他類型的霣磁輻射，例如紅 外光或紫外光、X射線、微波等。本文所用的術語“«致 化學發光”、“《化學發光的”、“發光”、“發光的” 和“發射光線”都包括發射光和其他形式的電磁輻射。 美圃專利89/ 04919所介紹的方法*要求在硏究和臨 床方面進行的各棰測量中，檢拥和定量分析非常少量的被 分折物。硏究人貝和睡床人員的餺要使之成為非常迫切地 減少採用造些方法進行拥Μ的捶種檢測限制，提离逭些測 量的δ敏度Μ及他們能夠進行拥置的速度。 在將各種榡記物進行測1前，先將它們富集，從而增 強由它們產生的倍號*鼷於這方面的各種方法均爲公眾所 知。在美國專利4652333中，用螢光、磷光或原子螢光檷 記物棲記的顆粒可在測董前通遇微遇濾進行濃缩。 •在測量前富集檷記免疫化學物質的方法也已為本領域 的公罕所了解，例如可將磁性感應檷記顆粒移近潮鼉容器 的表面。在美画專利4731337、4777145和4115535中，就 是先將_粒移近容器壁，然後發射激發光的螢光。 在美國專利4945045中，顆粒富集在磁性霣棰上。電 化學反«發生在通過橒記化學介龌改進的霣極上。發生结 合時，免疫化學结合反應改變了產生調製信號的介鼸的效 率。 已有方法均不涉及本發明的表面S擇性檄發的方法。 盡管表面激發（例如堪化學發光）不受任何機铕學上解釋 的限制，但是可以認為固相錯合物上的檷記物必然在«極 C請先閲讀背面之注意事項再填窵本I) f ’F. —裝. 訂· 衣紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -8 - 81.9,25,000 嫌濟部中央襻毕局貝工消费合作杜，* A6 __B6_ 五、發明説明（） 上被氧化，造躭需要霣子由檷記物向霣極移動。邐可以認 爲，霣子的逭種“躍變”是由於己知的隧道現象產生的， 即霣子不必“越過”勢壘就能通過空間（勢能很高的區域 ，例如溶液）。霣子能夠通遇勢壘無需另外«ί入能量，邸 能夠由一倨分子向另一値分子移動，或由一傾分子向電極 移動。但是逭種隧道現象僅能發生在非常短的距離内，隧 道現象的概率Μ兩棰增加之間距離的指數下降。如果距離 小於25Α (2.5η*)，則發生在兩者之間的隧道現象的概 率非常高；如果距離很大，則槪率很低。25 Α的距離是本 領域專業人貝使用的經驗法則，並非絕對限制。 因此，只有具有25 A霄極表面的那些《化學發光檷記 物才能可望參舆霣化學發光的遇程。一般說來，在25 A 霣極表面範園内的顆粒面稹是非常小的。 因此，不能期望由顆粒表面產生的霣化學發光能拥出 任何衰意義的量。但是由霣化學發光方法產生的光必須通 過顆粒才能到逹光霣倍增器。由於顆粒棊本上是不透明的 (顆粒的濃缩想浮液呈黑色），卽使由霄化學發光能夠產 生大量的光，也不能期望光能通過顆粒並且用光霣倍增器 拥I JI。 本發明的目的之一在於提供進行結合測量的均相（不 分離）和多相（分離）的方法、試劑和裝置。 本發明的目的之二在於Μ測置由含撤顆粒物質的潮量 組合物發射的霣化學發光爲基礎，提供不分離專一性結合 測量、試剤和装置。 —卜——4：——！L!1---|%(-----裝------訂------《 (請先Μ讀背面之注意事項异填寓本I) 本紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 9 81.9,25,000 6231 A6 B6 «濟部令兴樣苹屬員工消费含作杜印髮 五、發明説明（） 本發明的目的之三在於輿己有技術相比提供δ敏度和 精確度离、》«迅速、專一性強和榆澜限制性低的澜量、 試幫和装置。 本申請中所用術語的定義爲："霣化畢δ光部分Λ、 含金屬的«化學發光部分”、“榧記物”、“檷記化合 物”和“檷記物質"均可交换使用^ 化學發光部分” 、“含金屬«化學發光部分”、“有機金颶化合物”、“ 金屬螯合物w、 βa渡金颺螯合物#、“稀土金羼螯合物 ”、“檷記化合物”、“檷記物質”和“檷記物”都與分 子相連接，例如分析物或其類似物*分折物或其類似物的 结合對象，以及所述结對象的结合對象，或能與所述分折 物或其類似物或结合對象结合的反IB组成份，以上所述均 羼本發明的範園。上述各類邇維輿一種或多種结合對象和 /或一種或多種反《组成份的组合物相連接。此外，上述 各類學能輿已舆结合對象、反應组成份或一種一或多種结 合對象和/或一種或多種反應组成份的组合物结合的分析 物或其類似物達接。羼於本發明箱園的邋有上逑各類直接 或通a以上紂論的其他分子舆分析物或其類似物相结合。 橱言之，逋些配位體都可用作测量物»» 術語“檢視”和“定置分析"均表示测置，可以理解 爲：定量分析可以要求裂懵有鼸的组合物和進行校準。術 語“牧集和富集繕合物”可Μ相互交換地用於描述澜量组 合物中错合物的窗集和在《檯表面上錯合物的收集。 画式簡單說明 ---1^---*ll — f--- (請先《讀背面之注意事項再填寫本I)

訂· 線· 衣紙張尺度適用中Β明家*準（CNS)T4蚬格（210X297公釐） -10 - 81-9.25,000 316291 A6 B6 五、發明説明（） 第1圖表示資施本發明撤顆粒無分離和分離測量的測 鼉室； 第2圓表示用第1圔的測量室在測董時的霣壓控制装 置的簡圔； 第3匾表示採用電化學發光檷記寡核苷酸和生物素霣 化學發光檷記寡核苷酸作為引物直接结合PCR; 第4匾表示使用含生物素引物產生含生物素PCR產物 的檷準PCR ; 第5圈表示所產生的用於Μ後舆《化學發光檷記寡核 苷酸雑交的含生物素單鍵DNA的不對稱PRC澜置； 第6·表示直接將電化學發光檫記寡核苷酸結合到含 -生物素PCR產品的専一性硏究； 第7鼷表示直接将霣化學發光檷記物和含生物素寡核 苷酸结合到HPV16 PCR產物中的播準曲線； 寧8鼷表示Ha-ras致癌基因黏突變； 第9鼴表示Aa-ras致癌基因的a»P霣化學發光檷記探 針鑒別霣化學發光檷記探針的專一性； 鱷濟部t央樣準屬霣工消♦合作杜*-* (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁). 第10圔表示在測定Ha-ras致癌基因點突變的3βΡ霄致 化學發光檷記物中電化學發光檷記物相對值的激定； 第11匾表示HPV18快速“不洗滌w雜交薄(Μ的榷_曲 線； 第12圏表示測量重力沈澱鍺合物的測置室； 第13圖表示重力作用下錯合物沈澱距離與時間的函數 關係，卽Dynal顆粒的沈澱速率（Y=-0.28+ 0.48X;速度 本紙張尺度適用中國困家樣準（CNS)甲4规格（21.0 X 297公蹵） -11 - 81.9.25,000 316231 A6 B6 β濟#t央樣準屬β工消费合作杜*-« 五、發明説明（） =0.5mm/ 1 i η)； 第14圈表示在對«棰不同高度澜量組合物的重力室中 «化學發光強度舆時間的函數關係，邸兩塾片厚度的強度 -時間曬係的對比，其中白點表示0.015”墊片的值，黑酤 表示0.075”墊片的值； 第15謹表示在對霣棰表面不同离度測量组合物的重力 室中測董a胎兒蛋白的《化學發光強度，即AFP澜景室的 對比，其中白黏表示0.015”墊片的值，黑點表示0.075”塾 片的值； 第16鼷表示採用霣磁饑使錯合物沈澱在霣極表面上的 沈濺澍躉室； 第17圓表示在磁場和重力作用下微顆粒錯合物沈澱的 相對速率，即磁場沈澱和重力沈澱之間撤顆粒沈澱時間的 對比，其中白點表示磁場沈澱值，黑黏表示重力沈澱值； 第18·表示装有永久磁饉的收集室； 第19圈表示ECL強度的增高舆用第18鼷收集室進行澜 ft的時間的函數鼷係，即收集時間對ECL強度的作用； 第20腫表示在霣極表面的磁力線舆在霣槿表面下磁黼 取向的函數颶係； 第21圓表示錯合物離心沈澱在電極表面的旋轉掖滾室 、本發明俘獲顆粒的離心方法和装置以及本發明的離心液 流室； 第22圖表示渐消波螢光的檢測； 第23和24蹰表示進行本發明的磁性微顆粒基分離或不 {請先Μ讀背面之注意事項再填寫本I) t

JL -裝· 訂· 本紙張尺度適用中國困家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公嫠） 81.9.25,000 A7 _B7_ 五、發明説明（） 分離測量方法的測置室和複合磁體以及磁體条统的複合磁 髏産生大致與電極表面相平行的磁力線； 第25圖表示進行本發明微顆粒基不分離和分離測置的 潮量室，該測量室採用第23和24颺的工作電極和複合磁醴 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印装 元件符號 10 裝置 42 環隙中心孔 12 電化學室 44 環隙内緣 14 光檢測測量裝置 48 觀測窗 16 泵 54 霄極条統 18 開閉機制 56 第一工作電極 20 第一组裝塊 58 第二工作電掻 22 進料管 60 接線管 24 排料管 62 接線管 26 第一組裝塊第一外表面 66 霣壓控制器 28 第一組裝塊第二内表面 68 反向霄極 30 樣品室 70 參考電極 32 第二組裝塊 72 反向霣極 34 笫二組裝塊第一外表面 74 反向霣極 36 第二组裝塊第二内表面 76 接線管 38 琛隙 82 接線管 40 環隙外圃部分 27/37 磁體 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國困家揉率（CNS ) A4規格（210X297公釐）_13_ A7 316291 B7 五、發明説明（） 在本發明的一俚最寬的實施例中，是结合测量樣品中 被分析物的方法，其測置步癍包括： (a) 组成組合物，其含有： (i)所述樣品； ΠΠ測童用物質，其含有與能誘導發光的標記化合 物連接的组成份，和 (iii)能與被分析物或所述拥置用物質進行專一性 結合的複合顆粒； (b) 溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標記化合 物的錯合物； (c) 在測董區收集所述錯合物； (d) 通過表面選擇性激發將所述錯合物中的標記化合 物誘導發光；以及 (e) 測置受射發光，從而測量樣品中的被分析物。 錯合物可以通過在電極上施加電壓，在受激和誘導電 致化學發光的電極表面上進行收集，也可以在表面上進行 收集，然後按以下所述的表面激發誘導産生螢光。激發和 檢_螢光標記物的表面敏感技術已經描述了總内部反射熒 火發光（TIRF)，測量標記物的另一項表面敏感技術則採甩 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐〉 -13-1- L.1-^丨U---A------t------Λ1 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部-6-央橾準局*C工消费合作社印«. A6 B6 鱺濟部中兴揲準屬员工消费合作杜t-製 五、發明説明（） 喇曼和釭外吸收的缠内部反射。表面細胞霣基因组共振是 一項根據本發明可用於拥置表面檷記物的光學技術。因此 ，本發明是採用表面激發技術激發發光的方法。 然而本發明最好在澜量區收集錯合物，即在能夠產生 發光的表面上收集錯合物，本發明所用的另一個方法，是 在測董®外收集猪合物，然後將其置於浦董匿内或採用其 他步«誘導和澍量發光。 錯合物的收集也可採用一些不同的方法，包括重力沈 澱、a濾、離心和形成部分錯合物的磁性感應顆粒的磁性 吸引等方法。下面將進一步詳述若干實施方案。 採用重力在霄棰表面拥1¾¾化學發光包括： (a)组成组合物，其含有‘· u)所述樣品； (iU澜董用物質，其含有舆能誘導霣化學發光的檷 記化合物連接的组成份，和 (iii)密度大於所述组合物平衡量並能與被分析物 或所述拥Μ用物質進行專一性结合的複合懸 浮顆粒； (b〉溫育所述組合物，組成含有顆粒和所逑檷記化合 物的錯合物； (c>将所述组合物導入拥*室； («3)使所述组合物在所述測置室中滞留足夠的時間， 從而通遇重力使顆粒沈醱在所述霄棰表面，至少 在位於該澜量室容器主要部分下面的霣極表面收 本纸張尺度適用中a®家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公楚） -14 - 81.9.25,000 —卜---，___F!---*一-| (請先閲讀背面之注意事項再填寫本買一 •裝· 訂- f 316291 A6 B6 嫌濟部中夹櫺準屬R工洧费合作杜^锾 五、發明説明（） 集所述錯合物； (e) 通遇将«壓施加在所述霣極上，將所收集的後合 物中的檷記化合物誘導發光；以及 (f) 在霣棰表面測量受射發光 > 從而澜董樣品中的被 分祈物。 在液溁室中可Μ進行連繙或半連續澜置，同時可以進 行分批澍量。在液潦室中，固相保留在拥董室内，而液醱 流經和滾出拥董室。如果固相（例如顆粒）密度大於水（ 大於1.0g/*l)，則作用在顆粒上的重力使其落到室的底 部。該室可Μ構建成使顆粒沈向底部，而液醱滾經該室， 該室也可Μ構建成使室中的大部分搛品都保持在ECL条统 工作霣極上的柱室中。在室中的足夠停留時間則可在誘導 ECL前使顆粒沈»在霣極表面上。 在本發明的第二锢資施例中，含有密度大於测Λ组合 物平f量的懸浮顆粒的澜置组合物可Μ通遇離心，使顆粒 移至测《匾舆霣極接觸，誘導霣化學發光，也可在離心 步《中直接與霣棰接«。在疸恒實施例中，澜量室可以配 置使樣品迅速轉動和包封的裝置。離心力使樣品中的顆粒 由樣品外般轉動翰向外移動，並在樣品外毂的外表面上進 行收集。逭類樣品外殼的外表面可以構成ECL澜量条统的 工作霣極。 在第三傾實施例中，顆粒可以通遇遇濾從澜量组合物 中除去。在造健實施例中，顆粒的密度不需要大於澜置组 合物的平衡量。根據本發明，通遇過濾溶液，可將顆粒與 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本 丨裝. 訂· < —r 本纸張冬度適用中國國家«準（CNS)甲4規格（210 X 297公犛） 81.9.25,000 鳜濟部中兴#準屬興工消费合作杜印髮 A6 B6 五、發明説明（） 溶液分離和瀛缩，例如在濾器表面泵集顆粒。濾器的表面 可Μ塗上能用作ECL檢拥条統中的工作霣棰的金颺薄膜。 在一匐較佳實施例中《想浮顆粒是一種磁性感應顆粒 ，例如可Μ是順磁體顆粒，也可以是鐵磁齷顆粒，並且通 過向顆粒施加磁場，在拥I置匾中收寒，最好直接在霉極表 面上進行收集。測量室裝有磁腥，當顆粒殘留在分批室中 或滾經液滾室時，磁鼸的磁場将磁力施加在顆粒上，使它 們與最靠近磁饉的室的表面上的大量溶液分鎗。如果磁羅 配置在固有的方向並且緊靠ECL檢拥(条统的工作霣極，顆 粒則集中在工作霄極的表面上。 採用上述方法，在霣極表面牧集和濃縮錯合物，可以 實施對各種不同多相和均相形成物進行结合澜置。在多相 · 结合澜曇中，在潮董由檫記物產生的發光前，《先將複合 物舆组合物分離。在均相澜量中，對結合（固相）和未结 合的_記試ϋ不必進行分離。 在多相澜量中，當錯合物在工作電極表面上集中時， 由禊記物產生的測置倍號逮大於未進行收集步»的信»。 舆此相反，由未經複合的檷記試劑產生的信號卻並無變化 。因此，耋管在澜*室中存在著未褀合的檷記試薄，由收 集到的錯合物產生的倍號強於澜量時未收集錯合物的倍》 。收集步《的结果，隳著提高了结合拥量的檢澜極限。 在本發明的較佳實施例中，均相结合澜量可以包括就 地分離步驟。在将拥量组合物（邸樣品、澜董用物質和顆 粒）泵入澜鼉室並通遇工作霣極截獲箱合物後，将另一® 本纸張尺度適用中_國豳家«準（CNS) f 4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 --i----4-------^---------裝-------^------ (請先《讀背面之注意事項#填窵本買). Α6 Β6 五、發明説明（） 液龌泵入不含榷記物或樓記試劑的測量室內，從而進行就 地洗滌或將錯合物與測董组合物中的未結合组成份進行分 離。該測量程序從技術角度上說係多相结合測量，但是在 拥(量室內進行分離的優點在於其不需要附加分離裝置，而 且一般說來，處理也比在外部進行分離迅速。 採用本發明方法，將測量组合物的各组成份互枏混合 並将它們反應預定的時間即可進行多相結合測董。然後将 潮量組合物進行分離，其中包括溶液舆顆粒的分離。接著 測置錯合物或溶液中的m化學發光。舆未經濃缠的相比在 漉缩後澜》錯合物的«化學發光可能使测量分析物具有更 高的精度和較低的檢測極限。 從以下對若干優s實施例的介紹，将會對本發明及其 目的和性質更淸楚全面地理解。 本發明工可麇泛應用於能參與結合反應的各種分析物 。逭些反應包括：抗原-抗體，配位鼸受醱，DNA和RNA的 相互反®和其他已知反應。本發明涉及定性和定量檢測多 组成份樣品中逭類被分析物的方法和裝置。 樣品 *濟部中央樓準屬霣工消费合作杜_* 含有被分析物的樣品可K是固體、乳漘液、懸浮掖、 液豔或氣腥，可以是由细胞和細胞衍生物、水、食物、血 液、血清、發毛、汗水、尿、糞便、組鏃、唾液、油類、 有檐溶劑或空氣衍生的。樣品還可以是水、乙猜、二甲亞 «、二甲基甲酰胺、η-甲基吡咯烷嗣或酵類，以及它們的 混合物。 81.9.25,000 (請先W讀背面之注意事項再填窵本霣) 本紙張尺度遴用中Β國家樣準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） A6 B6 S16S91 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本霣) 分析物 楝品中典型的被分析物是完整細胞或表面抗原、亞細 胞顆粒、病毒、Prion、類病毒、抗罐、抗原、半抗原、 脂肪酸、核酸、蛋白質、脂蛋白、多耱、脂多糖、糖蛋白 、胜呔、多胜呔、细胞代謝產物、激素、藥物、合成有拽 分子、有機金屬分子、安神蕖、巴比妥酸、生物碱、甾類 化合物、维生索、氰基酸、糖、外源凝樂索、重组匾或衍 生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鰱鯖素或無檐 分子。一般說來，被分析物的濃度為10/3摩爾或低於10·3 摩爾，例如10wa摩爾或更低。 測量用物質 嫌濟部+央樣準房霣工消费含作杜_* 舆含有被分析物的櫬品相結合的測量用物質至少含有 一棰選自下列的物質：（i〉加入Μ上所述的被分析物或其 類似物，（Π)被分析物或其類似物的结合對象，和（iii〉 能與_(i)或（ii〉结合的上述反應组成份，所逑澍Μ用物質 中的一種物質舆化合物或部分（例如能夠誘導發光的«致 化學發光部分）相連接。經1欞記的物質可Μ是完整細胞 或表面抗原、亞细胞顆粒、病毒、Prion、類病毒、抗鼉 、抗原、半抗原、脂類、脂肪酸、核酸、蛋白質、脂蛋白 、多耱、脂多耱、糖蛋白、胜肽、多胜呔、细胞代謝產物 、激素、藥物、合成有機分子、有機金屬分子、安神藥、 巴比妥酸、生物碱、類固酵、維生素、氨基酸、糖、非生 物聚合物（優選可溶性）、外源凝集素、重组《或衍生蛋 白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鍵菌素或無檐分子 本紙張尺度適琍中S國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公犛） -18 - 81.9.25,000 A6 B6 緩濟却中央樣準局ΛΧ消费含作杜，« 五、發明説明（） 。在一Μ實施例中，試劑是一種«化學發光部分，其舆抗 鼉、抗原、核酸、半抗原、短核苷酸順序、寡聚體、配位 體、酶、或生物素、抗生场索蛋白、抗生蛋白鋪菌素、蛋 白質a、蛋白質g »或它們的錯合物，或通a蛋白質相互 反醮能舆最初结合對象结合的其他次生结合對象。 被分析物的類似物可以是天然的，也可μ是合成的。 一般說來，逭類化合物的结合性能®舆被分析物相當，但 也可Μ是具有較高或較低结合能力的化合物。能夠舆被分 折物或其類似物和/或其結合對象Κ及通過它們能舆被分 析物連接的電化學發光部分的反應組成份，最好是次级抗 觼或蛋白，例如蛋白Α或蛋白G，或抗生物素蛋白或生物 素，或本領域己知的能參舆结合反*的其他组成份。 檷記物 霄化學發光部分是金屬螯合物，該螯合物的金羼可以 使用任何金羼，例如在霣化學條件下邸施加在所討論的反 *条统上的霣學條件下，能發光的金羼螯合物。逭類金靥 螯合物的金屬，例如有遇渡金羼或稀土金羼。所述金屬優 先使用钌、锇、鍊、钕、铑、鉑、網、耙、鉬、雇^、銷、 鉻或鎢，最好使用钌和锇。 與整合物中的金羼相連接的配位醴通常总天然的雜環 或有機化合物，它們在決定金羼螯合物是否溶於水、有檐 溶剤或其他非水溶爾中起著重要作用。配位《可K是多齒 化合物，並且可以被取代。有齒化合物配位賺包括芳族和 脂族配位體。適合的芳族多齒化合物配位體包括芳族雜環 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本霣) .4- —裝· 訂· Λ 本紙張尺度適用中國國家«準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -19 - 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（） 請 先 聞 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 瑱 % 本 配位體。較佳的芳族雜環配位疆都是含氦的，例如聯吡啶 ，職丨ft唑、三聯吡啶和菲酚。適宜的取代基包括烷基、取 代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧化物 、甲醛、甲酰胺、氰基、氨基、羥基、亞胺基、羥羰基、 氨基羰基、脒、»_、酰腮、含«基、含磷基和N-羥基琥 珀K亞胺羧酸醋。蝥合物可K含有一種或多棰單齒化合物 配位鼸，其中大量的配位覦都是已知的。適宜的單齒化合 物配位醱包括一氧化硪、E化物、異氰化物、鹵化物和腊 族和雜環的膦、胺、Η和胂。 適宜的螯合物可以包括：二〔（4,4<-甲酯基）-2,2 一- 聯吡啶2-〔3- (4-甲基-2,2' -_吡啶-4-基）丙基]- 1，3-二氧戊環钌（1〉；二（2,2>-聯吡啶）〔4-(丁-1-醛）-4 '-甲基-2,2 '-職吡啶〕钌（I〉；二（2,2 —-聯吡 啶）〔4- (4* -甲基-2,2'-職吡啶-4'-基）-丁酸〕钌 (I );三（2,2,-聯吡啶）钌（1 ) ; (2,2—-聯吡 12)〔 *濟部中央樣準局霣工消费合作杜*-« 二- 二（1，2-二笨基膦基）乙烯〕2-〔3- (4-甲基-2,2 > -聯吡啶-4'-基）丙基〕-1,3-二氧戊環雄（1);二（2,2 一 -聯吡啶）〔4- (4一 -甲基-2,2> -職吡啶）-丁胺]钌（I ) ;二（2,2'-聯吡啶）〔卜溴-4 (f -甲基-2,2—-聯吡 啶-4-基〕丁烷〕钌（I );二（2,2'-職吡啶）馬來联亞 胺基己酸，4-甲基-2,2 '-聯吡啶Μ - -丁联胺钌（I )。其 他的霣化學發光部分可參閲PCT申請US87/ 00987和88/ 0394，逭些文獻也為本申請的參考文獻。 . «化學發光部分的作用在於發射霄磁羈射，從而将其 本紙張尺度適用中S B家樣準（CNS)甲4政格（210 X 297公嫠） 81.9.25,000 纒濟部中央#準房工消费含作社印« A6 _B6_ 五、發明説明（） 導入電化學能反«条統。爲此，它們必須能被激發成為受 激能狀態並且還能發射從受激雔轉變成的霄磁顇射，例如 光中的光子。並不希望受«化學發光部分參輿霣致彳fc學發 光反應的機理理論分析的約束，我們認爲通a将霣化學能 導入反應条统而氣化，然後通遇舆反應糸统中的反應物相 反醮轉化爲受瀲態。逭種狀態相對來說並不穩定，而金靨 蝥合物則迅速轉化為較爲穩定的狀態。於是螯合物發出能 被檢測的《磁輻射，例如光中的光子。 本發明所用金屬蝥合物或其他含金颺《化學發光部分 的量》箸不同条統而改變。一般說來，該部分的用量能有 效地使由上述组合物或条统中產生能檢測到（需要時可進 行定量拥量）的《磁能的發射。一般說來，被分析物的檢 拥和/或定量測鼉是將含被分析物和*化學發光部分的樣 品的發光舆用已知置的被分析物和《化學發光部分檷定的 發光#行對比得到的。逭是進行均相藹景。至於多相測量 ，則按如前所述，在進行《化學發光分析前先進行分離後 再獮置。 本領域的專業人員可以理解，合金*«化學發光部分 的同一性和用最在不同条統中隨具鑛條件而改變。本領域 的專窠人貝按照本文提供的倍息，無需遇多的試驗，邸能 根據經驗確定獲得所需结果的適宜含金羼電化學發光部分 及其足夠的用量。 顙粒 顆粒具有直徑為0.001-200ue (例如0.05μβ-200μ·) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • r. _装· 訂· 本紙張尺度適用中國國家橒準（CNS) f 4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 Α6 Β6 «濟·中央棣準馮典工消费含作杜*-« 五、發明説明（） 的徹顥粒物質，優選直悝為〇.1<ι·-1〇〇Μ·，尤以0·5μ·-10 u·為最佳，其表面组成份能麴輿被分析物和/或上逑一種 或多種其他物質相结合。微顆粒物質可以是交聯澱粉、葡 聚耱、鐵绝索、蛋白質、有機聚合物、苯乙烯共聚物，例 如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯ffi/丁二烯/苯乙烯共聚 物、丙烯酸乙烯乙酸酯共聚物或《乙烯/丙烯酸共聚物， 情性無機顆粒，二氣化絡，鐵、硅和硅混合物的氧化物， 以及蛋白類物質，或它們的混合物。最好將顙粒«浮在《 致化學發光条统中。賴粒可以是或可以包括磁性怒《顆粒 〇 澜量介資 為了使由霣極導入霣化學能的条统能狗應作，需要提 供能浸入電極並含有《化學發光部分的《介質。霣介質通 遇離子攜帶《荷。一般說來，霣介質呈液相，是由一種或 多棰¥或其他類物質與水、有櫬液龌或有機液鳢混合物或 水和一種或多種有檐液《混合物组成的溶液。但是，在本 發明的若干》施例中也可使用其他形式的«介質。例如m 介質可μ是一種或多種物霣在滾觼（如液讎、蒸汽或超睡 界滾鼸）中的分散醱，也可以是一種或多種物質在固鼸、 蒸汽或超臨界滾鼸中的溶液。 適宜的«介質是鹽的水溶液。鹽可優S使用納鹽或鉀 鹽，但在若干實施例中加入其他曝離子也是適宜的，只要 該隔離子不影響霣化學發光反應的順序。陰離子鹽可Κ是 磷酸鹽，但在本發明的若幹實施例中也可使用其他陰離子 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) r. 丨装. 訂. < 度適用中國國家橒準（CNS)甲4規格（210 X 297公驁） 81.9.25,000 ϋ濟部中央嫌準馮*工消#合作杜<f« *. ► >ί · · « ! 316291 Αϋ _._I__Β6___ 五、發明説明（） ，只要所選用的陰離子不彭響«化學發光反應的順序。 组合物也可是非水組合物。然而在若幹實施例中可以 使用超睡界滾讎，更具體地說，可以使用含有有機液醱的 非水组合物的電介質。與水電介質一樣，非水《介質也是 由離子钃帶«荷·。一般說來，疽意味著麵溶解在有機液體 介質中。適宜的有檐液鑛有乙請，二甲亞《(DMSO)，二甲 基甲酰胺（DMF)，甲酵，乙酵，或上逑兩播或多棰的混合 物。需要說明的是使用可溶於有檐溶《的四烷基銨鹽（例 如四氟礪酸四丁銨），其與K上所述一起组成非水《介質 0 在本發明的若幹實施例中，《介質是一《缓衝条統， 常用的磷酸鹽缓衝液則是符合理想的。磷酸m-氟化筘水 溶液則是逭方面的例子。 其他的拥量组成份 如已公開的PCT申請US89/ 04859 (發明名稱：利用胺-衍生的邏原殤進行霣化學發光反應）所述，合乎需要的邇 原薄，一般說來爲（較大分子的）胺或含胺部分，能夠被 氧化並且經自然分解後轉化為离還原劑。該文fe作爲本文 的參考文獻。可以認為，胺或含胺部分通可通遇將霣化學 能導入反應条统而被氧化。胺或含胺部分失去一餡霣子， 然後脫質子化或進行重新排列，轉化為強邐原劑。該邐原 劑舆經遇氧化的含金羼電化學發光部分反®，使其成爲如 上所述的受激態。為此，胺或含胺部分最好具有硪原子中 心的殘基，在形成S原劑的脫質子化«程中，其含有一值 (請先M讀背面之注意事項再填窵本霣) Γ. 丨裝. 訂· Λ 中 HB 家 «準（CNS) f 4 规格（210 X 297 公蹵） -23 - 81.9.25,000 Α6 Β6 鱷濟♦中夹禊準局ΛΧ消费含作杜*r« 五、發明説明（） 由該磺原子供给的«子和能夠起質子供醴作用的α-磺原 子。胺衍生的邏原莆提供了將含金*霣化學發光部分轉化 為其受激態所需的激發源，.由此發射出可檢澜到的霣磁輾 射。. 許多胺或相應的含肢部分均可用於實施本發明。一般 說來，胺或含胺部分的S揮醮適合於進行霣化學發光分析 的条统的pH值。另一籲有鼷的因素是胺或含胺部分應舆進 行分析時必須產生的作用的環塊相適應，卽舆可能的水或 非水環境相適應。需要考瓛的另一值因素則是胺或含胺部 分的S擇應該在具讎的條件下形成的胺衍生的邇原劑*其 足Μ在該条統中還原經遇氧化的含金颶霄化學發光部分。 用於本發明的胺（及由其衍生的相應部分）是脂族胺 和取代的脂族胺，例如伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基烷， 其中垸基各含有1-3值碳原子。相比而言*三丙胺是特別 優選@胺，因其能發射特別离強度的霣磁轘射，如在若幹 實施例中所示，能提高檢澍和定置測量的S敏度和精確度 。適用的還有二肢（如胼）和聚胺（如聚乙烯亞胺）。適 合於實施本發明的其他胺的例子有：三乙醇胺、三乙胺、 1,4-二氦二環（2.2.2)-辛烷-1-肿啶乙酵、1,4-畎嗪-二（ 乙垸磺酸）、三異丙胺和聚乙烯亞胺。 一般地說，用於本發明的含金羼《化學發光部分是限 制反應的组成份。因此，更具饑地說，提供的胺或含胺部 分«該過*的化學量。使用胺或胺部分的濃度為50-150βΜ ，為了能在PH7左右時使用，灌度爲100·Μ常常是有利的。 (請先《讀背*之注意事項弄填窵本寅y i. • JL. —裝· 訂· Λ 本紙張尺度逋用中國困家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公- 24 - 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（） 在若幹實施例中，胺或含胺部分的上限濃度由胺或含胺部 分在使用瓖境中（例如在水中）的最大溶解度決定。一般 說來*胺和含胺部分的用髯醮足以使經通氣化的含金譌霣 致化學發光部分轉化為其受檄態，從而產生發光。本領域 的専業人貝根據自己的經驗，按照本文提供的倍息，無需 通多的試驗，躭能決定在具《分析条统中胺或含胺部分的 用董。 如題為增加«化學發光反應的PCT申請US89/ 04915所 述（該文的内容作為本申請的參考文獻），本發明的澜量 最好在促進爾存在下進行*具鼸地說為下式的化合物： 式中R表示氳或C»Hna + 1，R1表示C„Han，X表示0-70 , η 表示卜20,其中η最好爲卜4。舉例來說，可通遇商業途 徑得拜的商品名為Triton Χ-100的下式化合物（式中X表 示9-10):

*濟♦中夹襻準局貝X消费合作杜<f« 和商品名為Triton N-401 (NPE-40)的下式化合物（式中 X表示40):

拿紙張尺度適用中B國家櫺準（CNS) f 4規格（210 X 297公釐） -25 - 81.9.25,000 A6 B6 S16231 五、發明説明（） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本賈) 一般說來，促進剤的用董應足以使發射的霄磁輥射增加到 合乎需要。具體地說，用·:悉0.01%-5.0%，更具讎地為 0.196 -1.096 (V/V) 〇 用於本發明的霣化學發光部分通過将其激發為受激態 而誘導發射出霣磁輻射，逭是通遇作用於該条统完成的， 在該条统中《化畢發光部分與霣化學能相结合。能夠發生 m化學發光部分和形成強通原«的化合物的氧化作用的可 能性取決於它們精確的化畢结構以及諸如条统的PH值和用 於導入霣化學能的電極的性質等因索。本領域的專業人貝 都知道，如何確定最佳可能性和«化學發光条统的發射波 長。在已公開的PCT専利申請US89/01814中，公開了激發 «化學發光条统的若干較佳方法，其内容作為本文的參考 Ο 餺量霣化學發光的裝置 «濟喪«準屬員工消费合作社，* 零施本發明測量的装置示於第1和2鼷。第1H公開 了優S的《化學發光裝置，但本發明方法並不限於裝置10 的應用，而可使用其他類型《化學發光装置，該装置應包 括工作«極或其他觸發表面，使提供的《化學能将«致化 學發光部分*發為霣化學發光。當本發明的方法K靜態方 式或滾動方式實施時，裝置10包括滾通室，其悉許多種樣 品（包括结合測量樣品）提供了顯著的優點。實施本發明 霣化學發光测置的裝置詳细情況己在PCT申請的US89/ 04854 和 US90/ 01370 中公開。 裝置10包括霣化學室12,光檢测澜蓋装置14 (可Μ是 中 ΒΒ 家《準（CNS)甲 4 规格（210 X 297 公釐） -26 - 81.9.25,000 纒濟舞中央橒準局貝工消费合作杜印製 A6 __B6_ 五、發明説明（） 一fi光《倍增管），光霣二極管，《荷耩合装置，照相想 光片或乳黼等類似物和fl6(可以是一值蠕動泵），其通 遇並由室12_送液鎌。.另外；，也可使用正位移泵。在室12 和光«倍增管14之間配置一值開閉檐制18，僅在《化學發 光測景時光《倍增管14受到室12作用情況下控制两啟操作 。两閉機制可以鼷閉（例如蓮轉時）。裝置10邇可包括防 光室（第1鼷中未檫出），其由各種组件组成，在進行« 化學發光测Μ時，使光«倍增管14不受任何外來光的彩鬱 Ο 室12本身邇包括第一组装塊20,進料管22和排料管24 貢穿該组装塊，最好由不锈銷構成。组裝塊20具有第一外 ** —.. 表面26和第二內表面28,以限定室12保持樣品的容積30的 一侧。在裝置10進行蓮轉時，室12可Κ淨化和/或檢査和 /或拥量溶液。進料管和排料管22, 24由外表面26向内表 面28_遇组装塊20,並且通向樣品室30。由不锈鎸裂成的 氪二组装塊32也具有第一外表面34和第二内表面36。第二 组裝塊32由一鴒持氟隆或其他非可污染的材料裂成的瓖嫌 38舆第一组裝塊20隔閭。因此，组裝塊32的外表面34限定 樣品室30另一侧的部分。、環咮38具有外圍部分4〇和中心孔 42，其内緣44限定樣品室30的钿壁。外園部分40将第一组 装塊20的内表面28與第二組装塊32的外表面34隔開，Μ防 止溶液由兩表面28和34之間的樣品室30中滾出。組裝塊32 通具有中心孔46,其中觀測窗48被密封，以限定樣品室30 另一«的剩餘部分（即外表面34的繼績部分）。構成觀拥. (請先閲讀背面之注意事項再璜寫本I) ^. _裝· 訂. 本紙張尺度適用中國Η家櫺準（CNS) f 4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 _ B6_ 五、發明説明（） 窗48的材料應在由電化學發光部分發射的霣化學發光的光 波長處基本呈透明狀。因此，觀测窗48應由玻漓、塑料、 石英等材料製成。 進料管22在鄭近琢嫌38的樣品室30的一纗50舆樣品室 30相交，抹料管24在鄰近環嫌38的樣品室30的另一端52與 樣品室30相交。因此，進料管22、樣品室30和排料管24的 结合構成了溶液的狹窄的基本上爲《滾的連績滾路，溶液 滾向、溁經室12並可由室12潦出。箭«Α和B分別表示進 料管22和排料管24的滾入和滾出。 在一個實施例中*工作«極条统54配置在第一组装塊 20的内表面28,其包括第一和第二工作霣極56和58。在另 一個實施例中，可以配置一镳工作«極，或僅以霣極56作 為工作霣極。在工作霣棰56, 58上進行霣化學和霣化學發 光反應。工作電極56 , 58是固體的伏安霣極，因此可由鉑 、金、磺或符合要求的其他材料製成。分別舆工作霣極56 ，58連接的接線管60, 62穿過第一组装塊20。 嫌濟郜中毕4興工消费含作杜*-« (請先閲讀背面之注意寧項再填寫本霣) 接線管60 , 62與霣壓控制器66的第一“工作霣極”末 嬙64遽接（示於第2圖）。因此，霣壓控制器66按《8穩 壓器的方式蓮作，将電K倍號供给工作霣極56, 58,並在 拥量霣化學發光時可根據霈要測量由其流出的電溁。此外 ，接線管60，62可以各自與電壓控制器66的末端連接，進 行各自的運作。 霣壓控制器66的霣壓穩£器的運作還可通遇反向霣極 68和參考電極70產生有效作用。在一雇實施例中，组装塊 本纸張尺度適用中鼸國家《準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 28 81.9.25,000 Α6 Β6 纒濟部t央#準屬員工消费含作杜 五、發明説明（） 32由不锈綱製成，反向霣棰68在組裝塊32的赛_露面72, 74 。反向《槿72，74和工作霆極56，58構成的連接面，将電 £施加在樣品室30内的溶液上，把能量供拾化學反臁，激 發樣品中的霣化學發光和/或提供能董用於淨化和檢査室 12的表面。反向霣極72 , 74通遇接線管76與霣S控制器66 的另一“反向電極”末端78連接。 參考霣極70提供參考霣壓，由工作電極56, 58施加的 霣壓是由其產生的，例如+1.2V對參考《fi。參考霣棰70 配置在排料管24距室12的位置80上，並通遇接線管82與霣 K控制器66的第三“參考電極”末端84連接。在三β«極 工作的情況下，《滾可以不通過參考電槿70滾動。參考電 極70可用於三偏霄極的蓮作，Μ提供均衡、已知和穩定的 «壓，因此其由銀/氯化銀（Ag/AgCl)製成或是一®飽 和甘汞«槿。僅用兩«極遵作，邸用工作《極56和作為 反向，參考«極的«極58也可Μ使《壓控制器66運作。Μ 逋兩偏霣檯蓮作時，反向/參考霣極58舆鬈壓控制器66上 ! 的《Κ控制器末靖78 , 84進行霣連接。在逭種情況下，霣 壓控制器66基本上作為一銪霣池在工作。«壓控制器66將 «壓倍諕供給工作《極56和反向霣極58,並且可根據需要 澜量通過各自«極滾動的《滾。參考《極70也可以是一銪 由鉑、金、不锈鏑或其他材料製成的所諝“_參考”《極 ，其提供穩定性較差的《壓，但就溶液而言可Μ澜董。使 用兩值和三餡霣棰工作時，參考《極70或58可以為测董施 加於工作《極56上的電壓時提供參考。穩定的霣壓參考現 i---I-——w. — 1(»---1*11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本霣) 装· 訂. Λ Κ. 衣紙張尺度通用中國困家《準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -29 - 81.9.25,000 A6 B6 316231 五、發明説明（） <請先《讀背面之注意事項軎瑱窵本霣) 被認為頗為有利。取S控制器66以其霣壓穩壓器籩作時， 通過根據參考霣極70在工作霣棰56 , 58上提供的已知«壓 ，控制各棰不同的電極，同時澍量工作«極56，58和反向 -¾極72 , 74之間的霣流。用於此目的的霣壓穩壓器都是已 知的，霣K控制器66的内部结構可Μ相當於任何常規的通 過商業途徑可以得到的具有上述功能的《壓穩壓器，因此 其本身並不構成本發明.的一部分。装置10的结構也可不包 括内霣壓控制器66,並且可以適合於舆外電S穩壓器遵接 ，從而可以分別控制，将所要求的《Κ倍《提供给電極56 ，58, 72, 74和70。逭些霣壓信鷥（見如下所述，Μ—定 方式使用）爲工作霣極56 , 58的表面和室12的表面提供可 重複的初始條件，從整》來說逭鵪特微可以顯著提离«致 化學發光澜量的精度。 «濟鏵_央«準爲興工消费合作杜印* 泵16配置在排料管24的位置上，将樣虽溶液沿箭虢方 向Α @入到進料管22中。溶液滾經進料管22、樣品室30和 排料管24,再經參考電極70,沿箭號方向B抹出。此外， 泵16也可以配置在進料管22上，使溶掖滾經裝置10。滾經 室12的所有溶液和滾體都使用相同的滾路，即滾遇進料管 22、揉品室30和排料管24，從而使由室12滾出的滾龌都能 經滾嫌動力學的靜化處理。泵16可以控制蓮作，使在任何 時間内都能保持溶疲於室12中。 裝置10的滾向结構使工作霣極能夠接受可變«壓或保 持原先的邇作霣壓，同時使一種或多檯溶疲連續得到處理 ，又不使工作《極56, 58 (或反向和參考霣極72 , 74 , 70 81.9.25,000 本紙張Λ度適用申S躇家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公蹵） 經濟部中央揉準屬貝工消费含作杜卹髮 A6 __B6_ 五、發明説明（） )受空氣的影镛。受空氣彩《則會使電路受到參考《極70 的干擾，從而使《壓發生未知的任意的變化，破壤工作霣 極56，58表面條件的再現性。滾向结構使進行淨化和監拥 «極条统54的起始步朦和測量一種或多種形式的波的測量 步》之間迅速得到改變，或可加速激發«化學發光。 第23和24圓表示装有磁羅条統的室和磁龌27/ 37 ,該 磁鼸条统產生的磁場線舆霣極表面56, 58大致平行。磁驩 条统由各永久磁體或霣磁鳢層疊和定向排列複合而成，使 磁H 27/ 37的南北極交錯層曼。磁龌条统27/ 37的各值磁 讎由空氣或任何非磁性想_材料隔閭。按第23和24鼸的锛 列可使磁力鎳作用於舆霣棰面幾乎呈水平的工作霣槿上部 的S域。谊將使位於《棰表面的磁性想*顆粒按一定方向 排列並且很容易利用由霄極供给的霣化學能（參閲第20· )° 第23和24·中的磁讎条统27/ 37的優黏逦在於磁壜線 從磁鼸结構中並沒伸出很長一段距離（參.閲第20靨），因 而由此磁體糸统產生的磁場不可能誘導霣極装置咁近永久 - 磁髓和雄磁材料，並且不會鼗重影響液潦室裝置附近光霣 倍增管的蓮作。第25画中的装置如同第1和2·，並可參 閲以上對第1和2圏的介绍，但第25_中的装置垂直配置 在水平向霄極56下面，或霣極56、58如第23和24·—樣， 是南北向的複合磁《I条统27/ 37。 本發明邏涉及試爾组合物。廣義地說，該試劑组合物 可Μ是本發明拥量条统中的任何一棰组成部分，即U)霄 I τ---*4---4--*--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本

丨裝· 訂-

A 衣紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 S16S91 A6 B6 五、發明説明（） 介質，<b)含有電化學發光部分的檷記化合物，（c)顆粒， 包括磁性S應顆粒，（d>被分析物或其類似物，（e)被分析 物或其類似物的结合對象* (f)能舆（<0或（e)反應的反應 组成份，U)還原殤，或（10霣化學發光反應的促進劑。試 劑可以與另一種常用試嫌相结合，即可製備二種组成份、 三禰组成份和更多種组成份的涯合物，只要逭些组成份在 貯衊期閬不與其他组成份相反應，Μ致在所需籣量中損寄 它們的作用。試W最好是含有顆粒和一種或多種其他组成 份的二«组分或多種组成份的混合物。 本發明邏涉及藥盒，其可包括含有上述（a)至（h)之一 棰或多種组成份的容器> 或該藥盒可包括含上述组成份的 涯合物之一種或多種試刻组合物的容器，所有逋些組成份 均可用於本發明的薄Λ方法和蘭Λ条统。 本發明優遘實施例的介绍 嫌濟央#準屬员工消费合作杜_* 在進行本發明的顆粒測量時，可以使用各棰顆粒，一 般說來顆粒密度爲1.0-5.0g/*L，優選密度备1.卜2g/»L 。最佳密度的苗擇屬於本領域專鬌人Μ的工作範園，重力 澜量的沈澱速率可在澜量速度和需要在《極表面上獲得均 勻靥的錯合物之間進行遽當遘擇。 各種平均直徑的顆粒都可使用*可以使用平均直徑悉 0.001-200ttn (如0.05-200»·)的顆粒，優逸平均直徑為 O.Ol-lOwa 的顆粒。 在测量组合物中邏可使用各種濃度的顆粒，例如可Μ 使用1-IOOOOmS/bL的疆度範園，優選5-1000*ι·/·ί的濃 81.9.25,000 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本茛) 本紙张尺度遴用中S困家«準（CNS>甲4规格（210Χ 297公釐） 鱷濟部t央#準4贵工消#合作杜_« A6 B6 五、發明説明（） 度範圔。籟粒的密度、粒徑和濰度的菹擇最好能使顆粒沉 澱的速率至少逢到0.5··/分鐘，優選更快的速率。 採用遇濾方法資施本發明時，遇濾裝置的理想孔徑應 能测出0.01至90%的平均直徑的顆粒，尤以10至90%的平 均直徑為佳。 已有技術已經介绍了大置磁性顆粒，逭些顆粒可Μ用 於本發明的测董。例如，美圃専利4628037，4695392， 4695393, 4698302 , 4554088 ,英圃專利 2005019Α 和歃洲 專利0180384 (均為本申請的參考文獻）介绍了能夠成功 地使用的各種磁性顆粒。顆粒可Μ是順磁顆粒，也可Μ是 雄磁顆粒，並且可以包覆能夠舆结合化合物结合的各種材 料，使磁性顆粒能夠用於免疫测董。用於本發明的磁《顆 粒最好具有至少O.OOlcgs單位的磁化率，優遘磁化率至少 爲0. Olegs單位。磁性顆粒的密度可以具有很寬範園，基 本上_於水的密度，即0.D卜5g/*L，優選密度為0.5-2g /L。粒徑可以為 0·001-200μ·，例如 0.001-100 或 0.05-200»*，優選範»為0.01-10»1·。顆粒濃度的範圈也很宽， 可以是 l-10000Mg/«L，優遘範圃為 5-1000wg/iL。 正如歃洲專利0180384所述，所用进性顆粒最好悉低 磁性共振，使從霣極表面移去磁場後，將顆粒去磁，並能 淨化測量室。磁性顆粒的密度、灌度和粒徑的S擇應使沈 澱時間至少達到0.5aa /分鐮，最好在該速率Μ上。在磁 室蓮作時，爲了不干擾光《倍增管的蓮作，在誘導霣化學 發光前，先從磁極表面除去磁雔装置。 本纸張尺度遴用中困团家樣準（CNS)甲4規格（210 X 297公犛） 81.9.25,000 (請先閲讀背面之注意事項再填窵本霣) —装. 訂· A6 ___B6_ 五、發明説明（） 测量 本發明方法可用於各種澜量。 按第3圏所示迤行的一種测量。由反《生成的PCR產 物用生物素和ECL檷記物（tris (2,2' -*吡啶）Rul， Ru(bpy)3P進行檷記。用生物素（抗生蛋白鍵艟素）的结 合方法，使抗生蛋白鍵«素珠粒俘獲雙功能DNA ，接著進 行洗滌，然後将结合1物的珠粒進行檢拥ECL檷記物的分 析。 按第4鼷所示進行的一種測量。在抗生蛋白鐽®索珠 粒上俘獲含生物索的PCR產物，並且除去不含生物素的_ 。然後將结合PCR產物的珠粒舆ECL檷記的（Ru(bpy)，》*〉 寡核苷酸雜交，接箸迤行ECL分析，檢餺禰記物。 按第5匾所示進行的一種籣量。在抗生蛋白鏈鼸索珠 粒上俘獲雜交物，然後無需洗滌進行ECL分析。 爭第6圈所示進行的一種测董和得到的结果。該测量 是用由對病毒型和對各病毒型具有專一性的寡核苷酸呈正 反應的SiHa和HeLa细胞条分離得到的DNA樣品檢測是否存 在HPV16和18。引物2PV16和2PV18含有生物素，而引物 3PV16和3PV18則係ECL檷記的寡核苷酸。2/3PV16和2/3PV 18寡核苷酸分別對HPV16和18具有專一性。用第1鼷所示 分析儀分析生成的珠粒俘》的ECL禰記物中的ECL。结果用 鼸示表示各樣品引物组合的ECL^。 按第7匾所示進行的一種測量和得到的结果。用第1 鼸所示分析儀，對生成的珠粒结合ECL檷記物分析ECL。根 本紙張尺度適用中囲a家櫺筚（CNS)甲4规格（210 X 297公*) 81.9.25,000 __M.______^---Ϊ-----I I--------— ------ <請先《讀背面之注意事項再填寫本霣> 鱺濟部t*樣竿爲Λ工洧费含作社，* A6 ___B6_ 五、發明説明（） 據HPV16 DNA濃度的增离（病毒拷貝與總细胞DNA拷貝之比 )用·示表示ECL光子的峰值。用於分析HPV16的引物是 1PV16 (生物素檷記物）和2PV16 (ECL檁記物）。用小牛 胸膝DNA使用於各值PCR的DNA保持在1M不變。 .按第8·所示進行的一種澜量和得到的结果。用帶未 檷記的HRP1的含生物素HRP2 (探針1T24和1CHR)和帶未檷 記的HRP2的含生物素HRP1 (探針2T24和2CHR)進行PCR測 *，產生用於雜交的珠粒结合的覃鍵的靶"DNA樣品是正 常的（胎盤） Ha-ras基因和突變的（NIH3T3-T24) Ha_ras 基因。然後用TEMAC洗滌珠粒结合DNA舆ECL檷記1T24(1T24) 、ECL 欞記 2T24(2T24)、ECL 檷記 1CHR(1CHR〉和 ECL 檷記 2CHR(2CHR)的雜交，用第1·所示分析儀，對生成的珠粒 结合ECL檫記物分析ECL。结果用示表示各樣品探針组合 的 ECLM。 {第9圔所示進行的一種澜量和得到的结果。用僅帶 未檷記HRP1的含生物素HRP2 (探針1T24和1CHR)按第8靨 所示進行PCR測量。所用的探針是含a»P的1T24和1CHR ( 1T24-P，1CHR-P)作為對照。用含3*P和ECL檷記物的1T24 » 和1CHR_定ECL檷記物的效果。按前所述，用TEMAC洗滌樣 品。在閃燦計數器中加入閃嫌合阐，分析生成的珠粒结合 的3*P。结果用示表示各樣品探針组合的每秒3*P數。 按第10匯所示進行的一種测置和得到的结果。根據第 4_所述進行拥M。所用樣品是胎盤DNA ，並用帝未檷記 HRP1的含生物索的HRP2 (探針1T24和1CHR)進行镄增。從 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝. 訂· { 本紙張尺度適用中圃國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 316S91 A6 B6 五、發明説明（） 生成的PCR產物中探樣，得到一组含有不同Μ的產物的樣 黾，將逋些樣品组輿用3*Ρ檷記的探針（1Τ23-Ρ32和1CHR-Ρ32)或舆ECL檷記物（1T24-ECL和1CHR-ECL)雜交，然後 再用90»ι1樣品的各籲棰記物的平均峰值将所得各结果檷準 化，逭些檷準化可以使倍號與本底和兩種方法的對比反 釀作更有效的對比。插·Μ稀釋曲雄的較低董說明其反應 。漾品按上述方法處理（第6和8醒）。 按第11·進行的一種測量和得到的结果。用含生物素 的2PV18和未檷記的1PV18、HeLaDNA (每館细胞400健拷貝 數）以第3鼷所述的PCR進行PCR測置。然後将生成的PCR 反應物舆專一性探針ECL榧記3PV18雜交。将雜交混合物加 到抗生蛋白包衣的珠粒上，用第1·所逑ECL分析儀對生 成的珠粒结合ECL檷記物直接進行ECL分析。结果用圓示表 示ECL量舆加到PCR的HPV18拷貝數之間的相互鼷係。 Μ下是非限制性實施例，逋些實施例是為了說明本發 明，而不是限制本發明。在不脫離本發明的精神和範匾的 情況下，顯然可Μ作出各種改變。 經濟#t央攉準扃員工消费含作杜_製 實施例：儀器，材料和方法 (1)儀器 如篥1和2·所示的滾向装置，使用三值霣極。 工作霣極：Au片，直徑3·· 反向霣極：Au片，直徑3·· 參考電極：Ag/AgCl 特氟隆墊片：0.15”厚 81.9.25,000 (請先《讀背*之注意事項存填寫本霣) 本紙張尺度適用中國困家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公薏） A6 B6 Λ濟#t央*準屬興工消费舍作杜印« 五、發明説明（) 有擄玻•面板 進料管：0.042”，《丙嫌 抽氣速率：0.01-5«L/分鐘（可變） 霣壓穩壓器：用Haiaiatsii R374 PMT (低增益紅敏光 «管）的撇理機控制的發光計；PMT 的可«電K爲0-U00伏 (2)材料 ⑷；霣化學發光檷記物：Ru(bpyh〃 (b) 霣化畢發光缓衝液：112·Μ KH«PCU，88·Μ K*HPQ4 • 3H,0 » 50jiM NaCl » 6.5 ·Μ NaN, » 0.8λΜ Triton X-100, 0.4·Μ Tweea 20,100·Μ 三丙按的水溶液 (c) 電化學發光稀釋雨：37.5·Μ ΚΗ·Ρ0*，109.2·Μ KaHPO* ♦ 3Η«0 » 151.7·Μ NaCl . 0.65·Μ NaN, » 〇.43·Μ牛血淸淸蛋6的水溶液 (d) Ru(bpy)3P-MHS : Ru ( 2·2 '-聯吡啶基）a ( 4-〔 3- (1,3-二氧戊環-2-基）丙基〕-4'-甲基-2,2' 吡啶）〃 (e) Dynal 顆粒 (i) Dynal M-450 Dynabeads, 4.5a·直《的超順磁顆 粒，30*g/aL由 Dynal (45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021)提供 (ii〉Dynal M-280 Dynabea<ls, 2.8)iM直徑的超顒磁顆 粒，10·8/^Ι·Λ Dynal (45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021)提供 --------Ψ---*)-----Η (犄先Κ讀背面之注意事項再填窝本I) 丨裝. 訂· 線- 良纸張尺度適用中8 β家樣準（CNS) 4遴格（210 X 297公騖） 37 81.9.25,000 裝濟♦中央*準扃霣工消费合作社 i A6 __B6_ 五、發明説明（) (3)霣化學發光周期（三霣極室蓮作） «化學發光周期由三值步*组成：（1)預處理，（2)測 量，和（3)淨化。預處理步骤包栝将《壓三角波Μ每秒 2.0V的速率由0.0V-+ 2.2丫變為- l.OV- + 0.6V。測量步 *包括Μ每秒1.0V將三角波由+0.6V - + 2.8¥變悉+2.(^。 淨化步《包括将«壓方波由+0.0V-+3.0V變為-0.5V-0.0V。所有電壓郝以Ag/AgCl參考霣極作基準。 實施例1 :重力牧集撤顆粒的装置和方法 在第12·所示室内進行測Λ，第12_介紹了採用重力 進行澜董的裝置，該装置包括透明窗48,塾片222 ，沉稹 室20 (包括進料口 22,工作霣棰56/ 58 ,反向電極72/74 和排料口 24)。沉積室呈水平面，邸垂直於地球重力場的 方向，通遇蠕動泵将ECL緩衢掖中的檷記微顆粒（Dynal) _送到沉積室*在顆粒送至該室後，将泵鼷閉，室内的微 顆粒碎落在工作«極表面上，微顆粒的沉落约以0.5··/ in速率沉落10·* (如第13鼷所示）。顆粒沉落的量舆沉 落時間和速率成函败《係，ECL強度與沈落在工作電極上 顆粒的量成正比。落至表面的顆粒的量Μ及由此產生的ECL 強度均受液鼉樣品對工作霣極高度的限制。第14·以沉積 時間的函數表示2届不同塾片厚度（0.015和0.075英寸) 的室的ECL強度，2值室的微顆粒沉積速率相似，但墊片 較厚的室的最大讀數為墊Η較薄的室的5倍。2鴒室的AFP (α -胎兒蛋白）拥量的结果示於第15圓，另外墊片較厚 的室產生5倍的ECL倍»強度。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) -裝· 訂. 4 本紙張尺度適用令國B家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（） 實施例2:沈鼉微顆粒的霣化學發光装置和方法 用沉稹室進行磁性收集 用第16鼴的磁力沉積埘顆粒進行澜量的沉積室。第16 麵中的檷號48表示透明窗，122表示墊片，22表示沉稹室 中的進料口，56、58表示工作霣極，24表示樣品排料口， 20表示沉積室本身，27表示霣进體。 沉積室的平面呈水平方向，用蠼動泵将霣化學發光缓 衢液中的檷記微顆粒（Dynal) _送到沉稹室，在撖顆粒被 输送到沉積室後将泵两閉。用霣磁證27產生的磁場將沉積 室中的微顆粒輸送到工作«極，霣磁齷的運作可用12V和 1.5A。由於採用了霣磁鎌，微顆粒的沉積速率逮逋超遇只 用重力作用進行顆粒沉積的速率（如第17_所示）。 實施例3:沉積撤顆粒的《化學發光装置和方法 用收集室進行磁性收集 是在如第18_所述收集室中進行。第18圈中的檫 號48表示透明窗，132表示想片，22表示牧集室中的進料 口，56、58表示工作霣極，20表示牧集室本身，24表示樣 品排料口，37表示永久进賺。 缓濟#t兴«準屬員工消#合作杜 牧集室的平面沿水平方向取向，用蠕動泵将電化學發 光鍰衡液中的檷記撤顆粒（Dynal)輸送到《化學室，在導 入樣品前，先将永久磁《37以0.035英寸的間隔直接固定 在工作霣極/溶液界面之下。當懞品鍮送到霣化學室時， 撤顆粒沉積在工作霣極上由磁《面稹限定的表面上。在全 部樣品沉積後，将泵鼷閉，除去磁場。收集時間越長，沉 81.9.25,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I> I— n n 本紙張尺度適用中Η Η家櫺準（CNS)甲4规格（210 X_ 297公蹵） •濟♦中央樣準屬員工消♦合作社t-製 A6 _____B6_ 五、發明説明（） 積的顆粒越多。隨着工作霣極上顆粒濃度的提高，導致霣 化學發光的強度增高（如第19·所示）。 實施例4:使用磁饉沉積撇顆粒 磁埸取向 如第20·所示«場98和98'，被吸引在磁匾27/ 37上 (不論其是永久磁鼸邐是«磁讎）上的微顆粒96、96'舆 磁場98、98 '的方向相一致，生成的頼粒排列96和96 '舆 工作霣極56/ 58的表面相平行（A)和垂直於（B)，且在該表 面的附近。 實施例5:過濾收集和塞集顆粒 磁性怒應、非磁性慼應和密度範園很寘的微顆粒可通 遇膜濾器表面的遇濾進行收集。在本發明的一鵪實施例中 ，用泵将顆粒泵送經通濾膜，該遇瀘膜的孔徑小於顆粒的 直徑，最好顏著小於顆粒的直徑，並且具有足鲍离的表面 密度，使顆粒收集不致堵塞膜孔。膜瀛器最好具有很离的 透明度，在收集顆粒後使膜濾器能夠置於工作電極的表面 ，誘發顆粒產生霣化學發光和澜量發光，從而定量測出顆 粒上的ECL檷.記物。 在另一fi實施例中，具有上述孔徑的膜濾器附加或配 置在吸附材料的表面上，使毛細作用将含撖顆粒的液讎自 然滾經膜濾器，不需要使液醣滾經濾器的任何裝置。 在一fi較佳實施例中，用金屬薄膜或其他導《材料包 覆具有上述孔徑的膜濾器，使膜表面能夠用作ECL裝置中 的工作霣極。採用撤《子裝置裂作中的常規方法（例如熱 本紙張尺度適用中a國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81-9.25,000 L——r——rlu----Ά-----裝------#------{ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本賣) 516B91 A6 B6 纒濟舞肀夬櫺準屬興工消费合作杜_* 五、發明説明（） 蒸發或噴塗方法），很容易将導《薄膜塗於隳上。逋種過 瀘m極很容易装配在掖滾室中，使掖讎的滾徑通1遇滅霣 極。疲滾中的顆粒通遇遇滅霣極被俘m，並且很容易就地 洗滌，從而為進行多相澜量提供快速簡便的方法，不霈要 任何外加的洗滌裝置。 資施例6:採用離心方法收集和窗集顆粒 第21鼷所示旋轉掖滾室提供了在工作霣極表面上俘a 錯合物進行發光澜量的另一倕方法。澜量溶液通a進料口 261進入裝置，經轉動密封圑263泵入室262内，旋轉運動 沿箭號R所指方向進入室内。錯合物的較密顙粒食集在工 作霣極264的表面上。在室繼鑕旋轉的同時，溶液經揉料 口 268滾出該室。滾绠室透明窗的幢出光通過光«倍增管 265進行測最。輪出光由垂直配置的工作霣槿表面264反射 到位於室中央的曲面鏡表面266 ，_中逦给出了反向霣棰 269 '然後沖洗和淸潔該室，以便用於下一謫循環。此項 操作可在停止或轉動室時進行。第21蹰給出了本發明俘播 顆粒的離心方法和装置Μ及本發明的離心掖滾室。 實施例7:用中等表面濃度的檷記非專一性蛋白包覆 顆粒 用150·Μ磷酸鹽缓衝液（ΡΗ7.5)通'過磁力分離方法， 洗滌30*g (lal)的4·5ίΐ·未包覆的进性想應聚笨乙烯M-450 DYNABEADS (DYNAL, Oslo, Norway ),每次洗滌用 2·1 溶 掖。.将 150jg Ru(bpy)3a +檷記鼠 IgG (Jackson I^aunoch-eaicals)的磷酸缓衝鹽水（PBS, Ul )和0.05%乙基汞 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,Γ.Ι 訂·

A 衣紙張尺度適用中國國家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297公嫠） -41 _ 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（） %代水播酸納加到顆粒中，該混合物可在室fi下旋轉瀑育 遇夜，然後從顆粒中磁力分離出溶液並將其除去。爲了封 阻未反靡部位，将1·1 3% BSA/PBS和0.05%疊氦化納加 到顆粒中，生成的溶液可在室溫下溫育2小時，洗滌顆粒 5次，每次2·1，然後驗浮在6·1相同的缓衝液中，貯藏備 用。 實施例8:用磁性感應顆粒澜量霣化學發光 用實施例7所述的檷記蛋白包覆均勻的和不均勻的、 聚合的和非聚合的磁性感應顆粒（Dynal, Oslo, Norway; Polysciences, Warrington, PA 18976； Cortex Bioche·, San Leandro, CA 94577; Aldrich, Milwaukee, WI 53201 .)。經過包覆的顆粒用霣化學發光缓衝掖洗滌3次，然 後製備2·1的300ttg/·!懇浮液。用蠕動泵将500^1的顆 粒懸浮掖輪送到Ji滾室（實施例3)。雷顆粒滚向工作« 棰時，由於磁體作用被吸引和富集在工作電S表面上。用 •配置在液滾室（顆粒集中在工作霣極表面）上部中心的Ha a 屬 ats.u R374光《倍增管拥量磁性顆粒的«化學發光。表 I给出了由檷纪蛋白包覆的磁性感《颡粒得到的霣致化學 發光的光發射量。 (請先Μ讀背由之注意事項再填寫本筲) -裝- 訂.

A 經濟部+央樣準爲Λ工消费合作杜印髮 表I :不同磁性惑應顆粒的霣化學發光澜量 穎粒棰類 直悝（Μβ) 密度（3/·1) 原料霣化學發光 玻璃 8.0 2.4 納鈣玻璃 2200 2.0 2.4 筘鈣玻璃 8500 石英 0.3-3.5 2.5 Si〇8 1150 金 1.0-2.0 19.3 Au 1100 豕紙張又度適用中B國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -42 - 81.9.25,000

*濟部_夹«準屬貝工消费含作杜印W A6 B6 五、發明説明（） 實施例9:用非磁性顆粒測董霣化學發光 用實施例7所述的檷記蛋白包覆均勻的和不均勻的.、 聚合的和非聚合的非磁性感.應菊粒（Aldrich. Milwaukee ,WI 53201 Duke Scientific, Palo Alto, CA 94303 ) 。經《包覆的顆粒用《化學發光缓銜筱洗滌3次，然後製 備2·1的300jig/»l懸浮液。用«動泵将500jU的顆粒懸 浮掖输送到液滾室。包覆的顆粒梭實施例1所述重力作用 富集在工作《極上。用配置在液滾室（顆粒集中在工作霣 極表面）上部中心的Ha*a«atsu R374光霣倍增管澜置非磁 性顆粒的霣化學發光。表I给出了包覆的非磁性顆粒得到 的《化學發光的光發射置。 表I:由重力收集得到的非磁性想應顆粒拥置霣化學發光 顆粒種類 直徑 顆粒密度 原 料 «化學 (μ·) (g/*l) 發光量 Rhone-Poulenc 4.0 1.5 聚苯乙烯二乙烯基苯 1680 /Fea〇4 1.5-2.1 1.4 聚苯乙烯/Fe3(U 462 Polysciences 1.5-2.1 2.1 聚苯乙烯/Fe〇a 504 Dynal 4.5 1.5 聚苯乙烯/Fea〇, 4200 Cortex 1.0-10 1.3 鵝维素/Fe3CU 125 1.0-10 1.8 聚丙烯醛/Fe3〇« 125 1.0-25 1.2 聚丙烯酰胺/Fe3〇4« 125 /活性炭 m 3.0 8.9 Ni 125 本纸張尺度適用申B國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A6 B6 纒濟_中央樣準屬ΛΧ消费合作杜印製 五、發明説明（) 實施例10:物理吸附的羊抗促甲狀味激素（TSH)包覆 的Dynal顆粒的製備（試两I ) 用150·Μ磺酸納/磺酸箄納溶液（PH9.6)通邋磁力分 離洗滌1·1 4.5«·未包覆的表面上具有-ΟΗ殘基的磁性聚 苯乙烯顆粒（DYNAL，MNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo, Norway)，每次用2*1洗滌。將0·5μ親和鈍化的 羊抗TSH，HCG纯浮的抗《 (CIBA)的磺酸銷/磷酸氫納洛 液（1·1)加到顆粒中。該混合物在室潘下ftSUft夜，然 後将溶液輿顆粒通遇磁力進行分離，並除去溶液。加入1·1 3% BSA/PBS W/0.0596重叠隽《，在室匾下攪拌簋育2 小時，封阻未反«部位。将顆粒洙»5次（每次用2·1 ) ，然後懸浮在U1相同的緩衝液中•貯藏備用。該試削1 的最終獾度总3% (重量）。 實施例11:烏本觭籌苷-BSA结合物的製備（試劑I) 烏本箭毒苷的活化 將60.4»s烏本箭毒苷八水合物（Aldrich Cat#14, 193-3)的去離子水（6·1)(薄«包裝）溶掖舆 礁酸銷（Mallinckrodt Cat#1139 )混合，該混合物在室 溫下轉動fi育2小時。反*混合物通通装有去離子水的 Dowex 1X8-50 離子交捵榭脂（Aldrich Cat#21，740-9) 终止反醮。加入200ul 1M磷酸銷（PH7.2)，將溶液的pH 調至7.0。 活化的烏本箭毒苷舆BSA结合 将50ig活化烏本筋毒苷（4.6el)滴加到108«g牛血淸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .- -丨裝. 訂- € 本紙張尺度適用t國团家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 44 81.9.25,000 S16291 A6 B6___ 五、發明説明（） {請先《讀背面之注意事項存填寫本寳) 淸蛋白（BSA〉（ Miles Fraction V)的 PBS ( 5·1，0· 15M， ΡΗ7.8)溶液中，烏本觭毒苷與BSA的比爲40 : 1。反應物 在室溫下溫育2小時。在篇合的同時迅速加入30«g氤基* 氫納。游離的烏本箭毒苷和遇量的氰基碾氳納通遇在4 ：0 下於PH7.8的重叠氮鈉（0.15M PBS W/0.05%)中透析除 去。烏本箭毒苷-BSA结合試»1貯藏在4C。 實施例12:物理吸附的烏本箭毒苷-BAS包覆的Dynal 顆粒的製備（試甯I ) 用150·Μ磺酸納/磺酸氬納溶掖（PH9.6)通遇磁力分 離洗籌4.5»·未包覆的表面具有-0Η殘基的磁性聚苯 *濟部t夹標率屬貝工消费合作杜印製 乙烯顆粒（DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A,S. Oslo, Norway)，每次洗滌用1Ό·1。将3*g烏本箭毒苷-BSA结合 物（结合試殤I)的磺酸納/磷酸氫納溶液（5·1 )加到 顆粒中。該1合物在室a下轉動滬賨遇夜，瘠液經磁力舆 顆粒分離後除去。加入5·1 3% BSA/PBS 1(1/0.05%重叠 *銷，在室溫下溫育2小時，旌轉至封阻未反應部分。顆 粒洗滌5次（每次用1〇·1)，最後嫌浮在1·1柑同的雄衝 掖中，貯藏備用。試薄I的最終濃度爲3% (重量）。 實施例13:Ru(bpy)3»*檷記的鼠抗地高辛的裂備（試 劑W) 用 Ru(bpy)檷記 1.M 鼠抗地高辛（Cambridge Medical Technologies Cat#200-014 Lot A3575)，用 Centricon 30撖濃结器（Aiiicon)将單克皤抗醴（抗地高辛抗讎）雄 沖交換到0.15M磷酸鉀缓®液中（0.15M NaCl, pH7.8) 81.9.25,000 本紙張尺度遴用中國a家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 嫌濟♦中喪#準/«霣工消#含作杜印製 A6 _B6___ 五，發明説明（） ，最终容積爲0_5·1。用125^1無水二甲亞礙（Aldrich) 溶解0.5*g Ru(bpy)3**-NHS後邸可使用。将0.18臟g Ru(bpy)a»*-NHS (45ιιΙ〉振動加入到蛋白溶疲，可得到Μ 分子*計分別爲1057和150000的25 : 1摩爾比的Ru(bpy)ap :蛋白。在室薇和黑暗下，反應管振動醞育30分鐘。加 入25»1 1M甘«酸使反應终止，再溫音10分鐘。反*混合 物通遇Sephadex G-25 柱（1X20C·的 0.15M 磷酸鉀， 0.15MNaCl和0.05%重叠気納，PH7.2 )純化。牧集和沈 澱Ru(bpy)3»*檷記的»抗地高辛部分，檷纪蛋白（試雨W )經测定，每蛋白分子具有12值榧記物。 實施例14 : Ru(bpy)3P檷記的《抗促甲狀膝激索（TSH) 的製備（試劑V) 用 Ru(bpy>，* ♦檷記 0.5m 鼠抗 TSH (CIBA)，再用 Centricon 30撤濃缠器（A«iC〇n)将抗TSH抗缓衝交換 到0.15M«酸押缓衝液、0.15M NaCl (pH7.8)中，最终容 稹^0·35·1。將 0.5*g Ru(bpy>an-NHS 溶解到 75<il 無水 二甲亞《 (Aldrich)後即可使用。将 〇.176igRu(bpy)aa* -NHS (26_4id)拫動加到蛋白溶液中，®可得到以分子量 計分別爲1057和150000的50: 1摩爾比的Ru(bpy),e♦檷記 物：蛋白。在室溫和黑暗下，反醮管搛動溫育30分鳙。加 入25ϋ1 1M甘氨酸使反®终止，再溫育1〇分瘇。反«混合 物經遇 Sephadex G-25 柱（1X20cb，0.15M 磷酸鉀、0.15M NaCl和0.05%重*氮納，PH7.2 )純化，牧集和沈澱 Ru(bpy〉aa+檷記的鼠抗TSH部分。澜定檷記的蛋白（試剤 本纸張尺度適用_«画家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 L---I-.---I-IIU---'-----裝------訂------^Ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ A6 B6 五、發明説明（） V)，每蛋白分子具有14鹤檷記物。 資施例15:促甲狀膝激素（TSH)的一步分離夾層拥定 将 100#1 檷定血淸（London diagnostics TSH Lu麗i TAG Kit)、25iil Ru(bpy)a*♦檷記的鼠抗 TSH (試 mv) 的ECL緩衡溶液和25m1羊抗TSH-DYNAL顆粒（試劑I )的 ECL缓衝溶液合並痪，在室潘下置於聚丙烯管中fi育15分 鐮混合，通遇磁力分鐮洗滌顆粒，再将顆粒懸浮到500ul 的ECL缓衝液中，該洗雔步骤再重複2次。最後将廉粒 懸浮在U1的ECL緩衝掖中，按實施例3所述方法讀得各 fi樣品的«化學發光。《化學發光量舆樣品中被分析物的 濃度成正比（《化學發光量舆被分析物的濃度成正比增加 )。表I給出了澜量曲線的值。

表I: 一步分離夾靥澜量：檢满TSH

請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 填 % 本 I 装 訂 緻濟♦中央«準屬興工消费含作杜*-« TSH» 度 霄化學發光置 (ulU/«l) (雙份樣品） .0.00 1918 1885 0.05 2584 2530 0.10 3365 3288 0.50 8733 8652 2.50 35688 35347 10.0 125316 136994 25.0 300248 288272 50.0 549034 564948 象紙張尺度適用中國國家標搴（CNS>甲4规格（210 X 297公*) 81.9.25,000

Si 6291 A6 B6 五、發明説明（）

實施例16:促甲狀膝激素（TSH)的一步不分離夾層籣 定 .将 IOOmI欏定血淸（Lonjdon Diagnostics TSH LuiiTAG Kit)、25iil Ru(bpy)3*♦檷記的鼠抗 TSH (試薄 V)的 ECL 缓衝溶液和25μ1羊抗TSH-DYNAL賴粒（試劑I )的ECL緩衝 溶液合並後，在室溫下置於聚丙烯管中fi育15分鳙混合， 在得出结果之前，先加入1·1 ECL缓銜液，然後按實施例 3所述，讓得各镶樣品的霣化學發光數。霣化學發光量輿 樣品中被分析物的濃度成正比（《化學發光董輿被分析物 的濃度成正比增加）。表IV给出了澜董曲線的值。 表W : —步不分離夾層瀰董：撿測TSH 霣化學發光量 (雙份樣品） 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 鱺濟部中央#準4戮工消f含作社<r« TSH»度 (ΐι1ϋ/·1) 0.00 2610 2769 0.05 2870 2894 0.10 2970 2950 0.50 3473 3403 2.50 5588 5495 10.0 13051 13139 25.0 26468 27306 50.0 47104 48664 實施例17:地高辛的兩步分離對比澜定 将 50μ1 檷定血淸（TDx Assay, Abbott Labs, Chicago: 本紙張尺廋適用中國H家櫺準（CNS) T 4规格（210 X 297公釐） -48 - 81.9.25,000 鱷濟舞t央#準屬Λ工消费合作社*-« A6 _，__B6_ 五、發明説明（） IL)和25»1 Ru(bpy)3*♦樓記的»抗地离辛（試薄IV)的 ECL緩衡溶液合並後，在室a下fi育20分鐘混合，加入25 111烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒（試爾1)的ECLSg衡液， 再在室溫下瀛育20分鳙混合，通過磁力分離洗滌顆粒，再 将顆粒»浮到500 ill的ECL緩衡液中，該洗滌步*再重複 2次。最後將願粒懸浮在U1的ECL缓衝液中，按實施例 3所述方法讀得各籲樣品的霣化學發光數。霣化學發光量 舆樣品中被分析物的橐度成反比（《化學發光量醣著被分 析物的濃度增加而降低）。表V给出了測置曲線的值。 表V:兩步分離對比籣量：檢測地离辛 地高辛濃度 霣化學發光董 (ng/«l) (雙份樣品） 0.0 22031 21154 0.5 13367 13638 1.0 9506 9607 2.0 5244 5129 3.0 2959 2994 5.0 1581 1631 實施例18:地离辛的兩步不分離對比澍定 将 50*il 檷定血淸（TDx Assay, Abbott _Labs, Chicago,. IL)和25*il Ru<bpy)3a*禰記的鼠抗地髙辛（試miV)的 ECL缓衡溶液合並後，在室溫下匾育20分鐘混合，加入25 »1烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒（試鑲1)的ECL緩衝掖， 本紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公嫠） 81.9.25,000 .ί-Γ-1! t A ——裝------訂------A (請先閲讀背面之注意事項再填窵本賓) _ A6 B6 五、發明説明（ 再在室S下瀛育20分鼈混合，在讀數前将顆粒鼉浮在1>1 的εα缓衝液中，按實施例3所述方法纊得各鴒樣品的霣 致化學發光數。霣化學發光置舆樣品中被分析物的橐度成 反比（¾化學發光量隨著被分析物的濃度的增加而降低） 。表w给出了蘭曇曲線的值。 表VI :兩步不分繍對比澜量：檢澜地离辛 霣化學發光ft (雙份樣品） 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本I* 1 地离辛濃度 (ng/«l) 0.0 42051 39643 0.5 28721 28074 1.0 22190 21364 2.0 14660 14542 3.0 11315 11893 5.0 9161 8945 裝 訂 敏濟♦中夹«準屬員工消费含作社t-髮 實施例19:在霣極上加洗最终反應樣品通遇讀數周期 進行地离辛兩步不分離對比澜定 将 50ul 檷定血淸（TDx Assay, Abbott Labs, Chicago, IL)和25jil Ru(bPy)3〃檷記的鼠抗地高辛（試薄W)的 ECL缓衝溶液合並後，在室溫下醞育20分鳙涯合，加入25 ttl烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒（試劑I)的ECL緩衝篏 ，再在室溫下溫育20分鐘混合，在讚數前先将顆粒懸浮在 U1的ECL缓衝液中，按實施例3所述方法讀得各ft樣品 的霣化學發光數。霄化學發光量與樣品中被分析物的濃度 本紙張尺度適用_匾國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 _____B6_ 五、發明説明（） 成反比（霄化學發光董讖箸被分析物的橐度增加而降低） 。表VI给出了澜量曲線的值。 表VI:甬步分離對比澜量：檢澍地离辛 地高辛濃度 «化畢發光量 (ng/il) (雙份樣品） 0.0 42613 35309 0.5 24211 24168 1.0 17561 17206 2.0 10491 9909 3.0 6712 7145 5.0 4680 4603 實施例20 :寡核苷酸的合成 鱺濟#t央樣準屬興工消费含作杜 使用/3-氡基磷酸氰乙_(1)在朦用生物条統自動寡 核苷轉合成儀上合成寡核苷酸，用改性固相（受控帚孔玻 璃）在最後结合步*時對端和蠼進行寡核苷酸氨基 的嫌變。Cloneich公司（San Diego CA)提供了氰基改性 劑，生成的嫌饑變的寡核苷酸被稱爲（C6,NH)的氨基 部含有6®碩原子的間隔鱅段，矯飾變的寡梭苷酸對 氨基則都含有3值磺原子的閜隔鋪段。被構建的寡核苷酸 及其修飾和利用将在下面詳述。 HPV的寡核苷酸已有文獻（2〉介绍為 寡核苷酸順序如下： 本紙張尺度遄用中國a家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 五、發明説明（） A6B6 HPV 16； 1PV16 5' (C6, NH2) TTAGTGAGTA.XACACATTATTGTTATAGTT; 2PV16 5' (C6, NH2) CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC; 3PV16 5' (C6, NH2) ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG; HPVI8; 1PV18 5· (C6, MH2 ) TXAGAGAATTAAGACATTATTCAGACT; | 2PV18 5' (C6, NH2) CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGXAT; | 3PV18 5' (C6, KH2) GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTCGG. 上逑寡核苷酸能使PCR產生各種片段，3PV16或3PV18 舆 2PV16 或 2PV18 形成 62bp片段；1PV16 舆 2PV16 形成 lOObp 片段；1PV18舆2PV18形成103bp片段。已知3PV16和3PV18 寡核苷酸遍能用作輿由lPV16i?2PV16以及1PV18舆2PV1S的 PCR反®的產物進行雜交的探針，Μ及用作舆由PCR内寡 核苷酸2PV16和2PV18產生的鍵進行雜交的探針。用於Ha-ras黏突變澍量的寡核苷醴如下： HRP1 5，（C6, HH2) GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG; HPP2 5* (C6, NH2) TTCXOGATCAGCTGGATCGTCAGCGCACTC;上逑2鶴寡核苷酸引物就是80bp片段的PCR合成，用 於該黏突變的探針的順序如下： 1T24 5' (C6, NH2) GGCGCCGTCGGTGTGGGCAA; CCGTCGG1 CCGOCGG1 諸 先閲讀背 面 乏 注意 事項再填 寫本 裝 *濟#t夹樣準爲霣工消#合作杜<f« 1CHR 5' (C6f NH2) GGCGCCGOCGGTGTGGGCAA; 2T24 5· (C6, NH2) TTGCCCACACCGACGGCGCC;! 2CHR 5* (CS, KH2) TTGCCCACACCGCCGGCGCC. 除上述顒序外，我們邐合成了上述的1CHR和2T24順序 ，其不含5 ~端氨基飾變但幣3 <端氨基，這些3 /端氨基 修餘的寡核苷酸用ECL檷記物橒記並用於雜交。突變/失 配的位酤由核苷酸淸楚地指出。探針1T24和1CHR輿由PCR 中的寡核苷酸HRP2產生的鏈雜交，探針2T24和2CHR舆由 PCR中的寡核苷酸HRP1產生的鍵雜交。 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 % A6 __B6__ 五、發明説明（） 與顆粒相結合的寡核苷酸JK8和JK8C的2值順序是由 水母發光蛋白順序衍生得到的並且彼此互補。JK8和JK8C /順序如下：

JK8 5，(C6, NH2)GTCCAATCCATCTT-GGCTTGTCGAAGTCTGA j JK8C 5' (C6, NH2 )TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGAXTGGA1C 寡核苷睃JK7是用由Clontech公司（San Diego CA) 得到的能在頤序内進氡基餘變的氨基改性劑修株遇的氨基 。JK7用RMbpyhn檷記物檷記，其順序如下：

JK7 5'TCAGACTTCGACAA(NH2)CCCAAGATGGATTGGA 由離證轉錄產生的用於水母發光蛋白RNA的寡核苷酸 深針T35用生物素和Ri^bpyh11*檷記物檷記，T35的順序 如下：

T35 5，(NH2)GATTXTTCCATTGXGGTTGACATCAAGGAA 為了檢測大腸桿菌DNA ，我們合成了對如下所示的基 因组（3)的Trp E/D S具有專一性的寡核苷酸： TRP.C03 5' (C6, NH2 ) GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC (KH2 } 該順序用Ru(bpy)3p檷記物檷記，和

TRP.C04 5' (C6 ,NH2 )GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG 該順序用生物索檷記，詳述於後。 實施例21 :檷記寡核苷酸 所有合成寡核苷酸都通遇Biogel P6 (BioRad Lans) 柱的凝膠遇濾進行純化，除去雜的氨基。使用NHS-生物素 (Clontech, San Diego CA)，通遇 PCR 引物的 5'-氨基 引入生物素（4)。按如下所述，通遇修飾的寡核苷酸的氨 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） __, — ！r*—！l?!l-*il*-l-----裝------訂----丨_《 (請先闖讀背面之注意事項再填寫本頁) 鱷濟部中央#準局霣工消费合作社印« 81.9.25,000

A A 鱺濟部中夹標箏屬貝工消费合作杜印ft A6 B6 五、發明説明（） 基引入Ru(bpy)3〃-NHS。在室租和黑暗條件下，将溶於 lOOul PBS (pH7.4 )的寡核苷酸（0.1»1 ·ο1β )舆溶於 DMS0的5μ ·ο1β Ru(bpy)3·*檷記物反應過夜。用乙酵沈澱 法由谊些檷記反應物中回收寡核苷酸。最近的硏究證明， 用0.5tt «ole Ru(bpy)3!♦檷記物能夠有效地進行禳記（ >80%)(數據未示）。 榧記的寡核苷酸通過逆向Vydac C-18半裂備柱上的 HPLCit—步進行總化，其滾動相為：（A) 100·Μ乙酸四乙 銨，ΡΗ7.0;和（Β) 50%的（Α)和50% 乙請，由 20% 至 40 % Β梯度移動。 探針1CHR和1Τ24也用3βΡ、Τ4多核苷酸激酶和由己 建立的方法產生的比活性爲77000cp«i/ng的探針進行檷記 (5)。 實施例22:核酸磁性顆粒的製備 按常規方法（6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-1-甲基吡啶 激活Dynal M450顆粒，然後將澂活的逭些顆粒舆寡核苷酸 JK8和JK8C反應，将33n»ole寡核苷酸的650jU 0.1M “11(：〇3溶液加到100ig激话的Dynal的穎粒中，溢育3小時 混合，再加入4·1乙酵胺（0.1M)封阻顆粒。将结合的顆 粒與〇.5*g/*l蛙魚精子單鍵DNA的ECL缓衡液混合，在 ECL缓衝掖中洗滌4-5次，再懸浮在10·8/·1含100/ig/ 1鞋魚精子單鍵DNA的ECL缓衝液中。 實施例23:抗生蛋白鏈菌素迸性顆粒I的製備 按常規方法（6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-卜甲基吡啶 本紙張尺度遗用中团國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁)

纒濟部中央*準屬ΛX消费合作杜<f製 Α6 Β6 五、發明説明（） 激活Dynal M450顆粒，然後将瀲活的颗粒舆抗生蛋白鐽菌 索（Sig*a Ltd)反«。用0.1M NaHC〇a洗滌激活顆粒（50 g)，再加入1.51S抗生蛋白鍵菌素，反應過夜。加人4 1乙酵胺（〇·1Μ)封阻顆粒。结合的顆粒舆〇.5«g/d鞋 魚精子單鍵DNA的ECL缓衝液混合，在ECL缓衝液中洗滌 4-5次，懸浮在含10〇jig/«l鲑魚精子單鐽DNA的1〇μ/·1 ECL缓銜液中。由Dynal Μ-280得到的抗生蛋白鏈菌素運 證明具有重要意義，但用現在的測量順序則倍號較低。爲 了進行免疫測量，可用被動包覆用的缓衝液结合抗原或抗 體後，再用BSA封阻所用籟粒。 實施例24:抗生蛋白鍵躕素进性顆粒I的裂備 将 105<ι1 含 50^g/al 生物-'x-NHS (Clontech, San Diego CA, 5002-1)的二甲亞礙加到 15^g BSA (於 2-3 屋 1 PBS中）中，混合後在室租下溫育30分鐘。加入30»il 1H甘 氨睃使反«终止，再在室溫下匾育10分鳙。該反應混合物 經II謬遇濾層析（Biorad, Bio-Gel P6)純化。生物素-BSA 用〇.2<1重注射器過濾。將5«8生物素-854的1〇1丨0.2»1磺酸 磺酸氫納缓衝掖（PH9.6)加到300m經硪酸納/磺酸 氳納缓衝液洗篇遇的Dynabead (Dynal 14002 )中，混合 物經潙動後，在室溫下#育通夜混合。逭些顆粒經磁力分 離後，加入10·1的ECL稀蘀液和100*il tRNA (10»g/籣1) ，再在室溫下瀛育3-4小時混合，用10·1的ECL稀釋薄一 次洗滌逭些顆粒，然後戆浮在10al·的ECL稀釋掖和lOOjxl tRNA(l〇M/il)中。混合後在2-6t!下溫育過夜，使蛋 白霣固定在顆粒上。颗粒經磁力分離後，绝浮在含15«g抗 衣紙張尺度適用中Η國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） _ 55 ^ 81.9.25,000 (諳先《讀背面之注意事項再填寫本Jf) 丨装* 訂· A6 __B6_ 五、發明説明（） 生蛋白鍵醣素（Scripps S1214)的10·1 PBS中，混合1 小時，顆粒在10·1的ECL稀釋液中洗滌4次，每次洗滌都 經5分鏟混合。最後将顆粒懸浮在29.7·1的ECL稀稼液和 300m1 tRNA (10Μ/·1)中，使最终濃度逢到1〇衫/111顆 粒 + 10〇Mg/ *1 tRNA。

實施例25:通S舆ECL DNA探針的雜交檢拥固定在顆 粒上的DNA 通遇結合著JK8和JK8C的顙粒（實施例22)舆Ru(bpy)，" 檷記寡核苷醴JK7雜交，證明能夠檢澍與顆粒雜交後的ECL 。将於£0^缓_液中的大量顆粒（300以）分別舆含有12.5 、6.3、3.01 和 1.5faole 檷記 JK7 的 50m1 ECL 缓衡液混合， <請先《讀背面之注意事項存瑱寫本賣) —裝， 纒濟部中央樣準層ΛΧ消费合作社印製 逭些混合物在52t：下雜交4小時後》用U1 ECL缓銜液洗 滌，然後《浮在830^1 ECL缓銜液中。 按實施例1所述分 析上述樣品，探針JK7 舆JK8覼序互補 ,但不舆JK8C順序 互補。 表Α1 顆粒 探針置（f*〇le> ECLM JK8 12.5 5085 6.3 3035 3.01 1345 1.5 657 JK8C 12.5 451 6.3 345 3.01 256 1.5 212 訂 本紙張尺度適用中Η藹家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 緩濟部中央樓準屬貝工消费合作杜<f髮 五、發明説明（） 示於表VI的结果證明，經過専一性雜交，由ECL能夠 撿籣直接固定在顆粒表面上存在的專一性顒序。· 實施例26:根據珠粒结.合的ECL猗MRNA 按常規方法（實施例10)，用對RNA/DNA抗讎具有特 異性的抗讎（7)包覆Dynal M450顆粒，專一性RNA是用由 我們克K的水母發光蛋白基因（8)得到的質粒產生的。簡 要地說，質粒PA5'用純化的EcoRI切割，並用產生T3-RI RNA (炱RNA)的T3 RNA聚合鼸進行讎外轉錄。質粒pA5' 通用純化的BaiHI切割，並用產生T7-Ba· RNA (正RNA)的 T7 RNA聚合酶進行鼸外轉錄。因此，造兩檯RNA代表南種 互補RNA ，並且都用等«積的苯酚：«仿（50 : 50).提取 純化，再用氮仿提取和2.5齷積乙酵沈析出上淸掖，經凝 膠霣泳和分光光度法澜定RNA的量。埴些方法«已建立並 為本領域專業人貝所熟知（9)。按已知方法，以25 : 1 ( Ru(bpy)3n檷記物：抗生蛋白鍵菌索）的遇量摩爾比，用 Ru(bpy>3*·禰記物檷記抗生®白鋪0素（資施例13)。該 禰記的抗生蛋白鍵豳索按知方法（10)用亞氨基生物索柱進 行鈍化。經過拥定抗生蛋白鏈菌素，每键抗生蛋白鍵菌素 四聚物含有10倕R.u(bpy)3b禰記物。然後将該禰記的抗生 蛋白鐽_索舆含生物素的T35複合，寡核苷酸舆檷記抗生 蛋白«豳素的混合比為1: 1。每2〇pmole混合成最终鼸積 為15ul的ECL级衝液，在下瀵育過夜，形成檷記的抗 生蛋白鍵菌素-寡核苷酸（SA-T35)錯合物。正和ARNA (l〇ng)的樣品舆2*il SA-T35錯合物（一步測*)或輿25 (請先W讀背面之注意事項再填寫本I) L*. 丨装. 訂. < 象紙張夂度遑用中國》家樣準（CNS)规格（210 X 297公*) 81.9.25,000 316231 A6 B6 五、發明説明（） ng含生物素的T35(兩步澜量）雜交。将漾品配製成50»1 ，並在50C下雑交3小時，然後加入200ms抗DNA/ RNA抗 鎌包覆的顆粒（於20ul PBS 0.1% BSA中）。該混合物在 室溫下想合1小時後，在ECL緩衝液中洗滌2次。将舆SA -T35錯合物雜交後的樣品懸浮在530 wl ECL緩衝掖中， 並按資施例1所述方法進行分析。将僅舆含生物素的T35 雜交過的樣品舆50piole檷記抗生蛋白鏈»索一起混合S 育1小時，再在ECL缓衝液中洗滌2次。經遇雜交的樣品 懸浮在530W1 ECL缓衝掖中，並按實施例1所逑方法進行 分析。结果示於表IX。 請 先 聞 讀 背 面 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 表κ 澜量 RNA ECL平均 一步法 正 815 Λ 91 兩步法 正 1123 負 194 订 嫌濟部中喪#率场Λ工消费合作杜印製 實施例27 :聚合酶鏞反醮 基本上按（11,12,13)所述進行聚合酶鍵反應。除非另 有說明外，一般說來各反應都用100ul。PCR是以不對稱方 式摻入Ru(bpy)3〃檷記物，使用5p»ole含生物素的寡核苷 睃和50paole Ru(bpy)3a*檷記的寡核苷酸。Ha-ras黏突變 的澜量是在柑同條件下進行的，但不加Ru(bpy〉3”檷記的 寡核苷醴。不分鑪的HPV測量是Μ不對薷方式進行的，但 良紙張尺度遥t國國家標準（CNS) T 4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 Α6 Β6 五、發明説明（） 使用了 10倍過置的含生物素的寡核苷酸，一般為40piole 。熱周期的條件如下：直接摻入HPV18和16的测量為93亡 1秒，50Ό 1秒，60t 2分鐮；Ha-rasS突變的測景為 93t 1秒，69弋2分鐘；不分離的HPV测J15i93t： 10 秒，50T 30秒，60t： 2分幢。根雒拥*和所要求的靈敏 度，進行PCR的循環數爲30至40。 實施例28: DNA探針的拥量（1>:通通摻入酶檢拥和 定量分析人乳頭狀«病毒PCR產物 在直接摻入Ru(bpy)3a*檷記的寡核苷酸進行PCR後* 将整fi反應混合物（ 90-100ul)加到600μ抗生蛋白鋪® 素结合的磁性顆粒I中，在室S下拫*fi育20分鐘。用磁 條將樣品中的固相分離，經ECL缓衡液洗滌2次後，想浮 在530m1 ECL缓衝液中，按實施例1所述分析霣化學發光 。第3·解釋了逭值測置，用人乳頭狀鑼病籌樣品（2, 14) 證明該澜置的结果。《於将Ru(bpy)3〃檷記的寡核苷酸直 接摻入到含生物素的PCR產物中的特定硏究則使用了密切 相鼷的HPV16和HPV18型病毒，封於是否存在HPV16和18 的測置使用對病《型和病毒專一性寡核苷酸均為正反應的 MA樣品。各值引物如下：2PV16、2PV18是含有生物素 的，3PV16、3PV18是Ru(bpy)3»♦檷記的寡核苷酸。 2/3PV16和2/3PV18寡核苷K分別對HPV16和18具有專一 性。生成的珠粒俘獲的Ru(bpy)3» ♦檷記物按實施例1所述 方法分析ECL。结果Μ漾品引物的各種组合的ECL量示於 第6鼷。 衣紙張尺度適用中國团家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -59 - 81.9.25,000 r •裝. 訂 缓濟部肀喪#準屬貝工消费含作社印製 A6 B6 五、發明説明（） 請 In 先 1 閲 1 I 讀 背 w? 面 1 I 之 1 1 注 * 意 1 1 事 J 項 再 1 填 1 寫 1 -·Φ· 本 1 爲了說明我們所進行的測量的量的性質》姶出了將Ru (bpy),a*檷記物和含生物素的寡核苷酸直接摻入到HPV16 * PCR產物中的檷準曲線，生成的珠粒结合的Ru(bpy)s*♦檷 @物按實雄例1所述方法分析ECL。輿HPV16DNA濃度的 增加相比較，用病ft拷貝數舆總的细胞DNA拷貝數之比表 示，给出了 ECL光子的峰值。用於HPV16分析的引物是 1PV16 (生物素檷記）和2PV16 (Ru(bpy)3* ♦欏記）。用於 各PCR的DNA使用小牛胸腺保持在lMg的恒量。該禰準曲 線的结果示於第7·。W於該惻量的專一性和分量分析的 裝

结罘說明，逋些ECL檷記物能夠用於簡便快速地進行DNA 澜定。同時邐說明，該棲記物能麹很容易與酶反應相聯係 但並不彩響酶的方法。 實施例29 : DNA探針的澜量（I ):檢測和澜定人Ha- 訂

I ras致痛基因PCR擴增產物中的點突變 |

I

我們使用寡核苷酸HRP1和HRP2進行Ha-ras基因的PCR I

I 反應。使用帶未禰記HRP2的含生物索的HRP1，生成的PCR ^

產物能夠舆Ru(bpy)3〃檷記的探針2CHR和2T24雜交。反之 I ，使用蒂未禰記HPR1的含生物素的HRP2，則生成的PCR產 | 鳗濟部中夹樣準屬負工消t合作杜印製

物能夠輿Ru(bpy)3a*檷記的探針1CHR和1T24雜交。所甩的 I 1 « DNA是人胎盤细胞DNA (正常）和用由膀胱85T24得到的突 丨1 變Ha-ras基因轉染遇的鼠NIH3T3细胞DNA (15)。 丨· 澜量方法如下：将90»1 PCR反應混合物加到600ug抗 」 生蛋白鐽®素结合的磁性顆粒I，然後在室溫下溫育30分 | 鐘，用磁條分離出逭些镞品中的固相，先後用50·Μ NaOH ! 81.9.25,000 农紙張尺度邋用中a國家櫺革（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 A6 鎗濟#t夹樣攀屬Λ工消费合作社印« _B6__ 五、發明説明（） 和雜交缓衝液（0.9M NaCl，50·Μ NaPO*，PH7.7，5騰Μ EDTA，0.1% W/V聚蔗糖，0.1% W/V聚乙烯吡咯烷醑， 0..1% «/V牛血淸淸蛋白）洗滌，然後懸浮在含lOug/nl 記寡核苷醸的雜交缓衝液中。上述樣品在66 t下雜交15分鳙。 用磁條分離出固相後，經0.9M NaCl、50疆M NaPCU pH 7.7、5·Μ EDTA洗篇2次*再用3M«代四甲銨、50·Μ Tris -HC1 ρΗ8.0、2·Μ EDTA、0.025% triton X-100 在室溫 下洗滌1次，在66t：下洗濉2次，每次20分鏟。固柑用EC L緩衝液洗滌3次後，懸浮在530MECL緩衝液中，按 資施例1所述方法檢测《化學發光。第4·說明了該項澜 量。 用〃P檷記探針進行的Ha-ras PCR產物的澜量輿用Ru (bpy)e 〃檷記的相類似，只是将固相最終驗浮在250*il ECL缓衝《中，然後将逭些樣S轉移到5·1閃嫌液體中， 並用Beckian LS.-100C掖鼸閃爍計數苷計數。 由第8匾可以看到Ha-ras致癌基因點突變測量的數嬅 。如第4 所示，PCR的拥量使用了帶未檷記HRP1的含生 物素的HRP2 (用於探針1T24和1CHR)和帝未榧記HRP2的含 生物索的HRP1 (用於探針2T24和2CHR)，得到用於雑交的 珠粒结合的單鍵靶。DNA樣品是正常的（胎盤）Ha-ras基 因和突變的（NIH3T3-T24) Ha-ras基因。珠粒结合的DNA 舆 Ru(bpy)3*♦檷記的 1T24 (1T24)、Ru(bpy)a*♦檷記的 2T24(2T24)、Ru(bpy>3*♦檷記的 1CHR(1CHR〉和 Ru(bpy〉3* + 衣紙張尺度遍用中ΒΗ家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 81.9.25,000 (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) •-装 訂· *濟夹#丰屬Λ工消费合作杜** 316291 Afi A6 B6 五、發明説明（）

檷記的2CHR(2CHR〉雜交後經TEMAC洗滌，生成的珠粒结合 的Ru(bPy)3h檷記物按實施例1所述方法進行ECL分析。 结果用櫬品探針的各種组合的ECL量表示。如所期望的结 果（示於第8_)，正常探針舆正常DNA雑交情況良好（ 見CHR探針），突變探針能舆突變基因雜交（見T24探針） 。頦有意義的是谊些探針的性能並非完全相同。爲了硏究 谊籲朋顯的異常情況，我們用含或不含Ru(l>py〉8n檷記物 的3 aP檷記探針對上述探針作進一步的硏究。按如下所述 ，用3βΡ櫃記探針硏究Ru(bpy)，-檷記探針對1^-1^3致檯 基因的專一性。如第8匾所示，僅用帶未棲記HRP1的含生 物素的HRP2 (用於探針1T24和1CHR)進行PCR测置。所用 的探針爲：K含3*P 的 1T24和 1CHR (1T24-P，1CHR-P)作 為對照，用含saP和Ru(bpy〉，a♦禰記物的1T24和lCHRgl量 Ru(bpy>3"檷記物的作用。樣品按上所述用TEMAC洗滌， 生成的珠粒结合的3βΡ在加入閃嫌合劑的閃爍計數管中進 行分析。结果用樣品探針的各種组合的每秒3*Ρ數表示（ 見第9圔）。該结果說明，a*P探針和Ru(bpy)3e ♦檷記的 探針的作用是相同的，醑於探針專一性的種種間題則是由 於所用專一性探針的各棰順序造成的。為了進一步說明我 們的Ru(bpy)a»+檷記物和〃 P的裙同性，我們對逋些檷記 探針進行了對比。按前所述，用胎盤DNA和帶未檷記HRP1 的含生物素的HRP2(用於探針1T24和1CHR)進行擴增。然 後從生成的PCB產物中取樣，得到一组含有不同產物數最 的樣品。将逭些樣品舆用3*P檷記的探針（1T24-P32和1CHR *纸張尺度逋用中Η國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公嫠> 81.9.25,000 (請先»讀背面之注意事項再填寫本1)

五、發明説明（） A6 B6 纒濟部中央樣率屬興工消费合作杜印製 -P32)轅交，或舆 Ru(bpy)3·* 檷記物（1T24-Ru(bpy)3*· 和1CHR-Ru(bpy>3a + )雜交。用從90*il樣品的各崔檷記物 的平均值，将上逑各項硏％结果檷_化，逭些禰準化可 使倍號舆本底進行更有效的對比，並且可對兩穩方法進行 對比。財麵10說明了在稀釋曲缠中含*較低時的反*。樣 岛按前所述方法進行處理（第8和9黼）。第10·中的结 果說明，兩ft檷記物舆我Π的Ru(bpy>3"檷記物探針的良 好反應具有相同性。逋些硏究證明，在B別樣品DNA中的 單嫡碱基的改變方面，Ru(bpy)s〃檷記探針舆檷記探 針都能起相同的作用。谊個事實可以說明，在雜交反*中 Ru(bpy)3e +檷記物對榷記探針的性霣幾乎沒有影馨。 實施例30 : DNA探針的拥量（1>:在不分離的拥置中 檢澜和定量分析人乳頭狀癱病毒PCR產物 W於HPV18的不分離籣置，我們用遇量含生构素的引 物進行不對稱PCR反應。該PCR反應可Μ通通用Ru(bpy)3at 檷記探針進行直接雜交，從而產生遇量的含生物素的軍鋪 DNA。為了雜交，在完成擴增後我們将對經過擴增的HPV基 因具有專一性的1000 ECL *的Ru(bpy),〃檷記寡核苷酸 (〜2ng)加到15m1 PCR中，然後在5010下S育15分鑪。 再將含有600ug抗生蛋白鰱菌素结合的磁性顆粒I的60κ1 ECL缓衡液加到該雜交混合物中，在室瀛下振動ffi育15分 鐘。加入ECL缓衝液，使懞品腥稹增至530<il，然後按實施 例1所述方法檢澜電化學發光。第5圈說明了該瀏量。 為了說明逭铒不分離澜量*我們作了 HPV18 DNA的檷準曲 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 勞 紙張尺度適用_國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 鱸濟♦中夹#準屬Λ工消费合作杜印髮 A6 _ B6_ 五、發明説明（） - 雄。用含生物素的2PV18、未檷記1PV18和HeLa DNA進行 PCRSIft (14)。生成的PCR反應物輿專一性探針Ru(bpy>ae + 檷記3PV18雜交。然後將雜交混合物加到抗生蛋白鍵®素 包覆的顆粒中，按實施例1所述方法生成的珠粒结合的Ru (bpy)3〃檷記物直接進行ECL·分析。结果用ECL置舆加到 含對照ras寡核苷酸探針的PCR中的HPV18拷貝數的两係 表示（見第11_)。瘇些结果說明，根據ECLii量条统的 性質，能夠快速不分離澜定核酸順序。 實施例31:專一性基因組DNA順序的測定 此例所述測定使用了 2届寡核苷酸，都與相互靠近的 相同的DNA_雜交，其中一®俘獲，另一值檷記錯合物（ 夾層雜交）。該拥定使用了對trp E/D基因B有専一性的 大腸榫® DMA和深針。大腸捍g DNA按常規方法（16)裂備 ，鍺魚精子對照DNA由Si gla公司提供。將14/1丨雜交缓衝 液（10XPBS，10·Μ EDTA 和 0.7% SDS)、2ng 生物素檷 記的 TRP.C04 和 5ng Ru(bpy>3*' 禰記 TRP.C03 加到 DNA 樣 品中，用水將樣品製備成100*11，加熱至97*0，再在971C 下溫育10分鐘，然後冷郤至50¾，雜交2小時。將20m1抗 生蛋白鍵皤素包覆的磁性顆粒I加到樣品中，在室#下混 合2小時，顆粒在ECL缓衝液中洗谁4次，再»浮在仰0 ill ECL缠衝液中，按實施例3所述方法進行分折。正DNA 是大腸桿菌，A DNA是鮭魚《子，结果示於表X。 本紙張尺度適用中困國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁)

316291 Α6 Β6 DNA 含 1 電化學發光平均量 正 10 184 25 257 50 266.5 k 10 87 25 70 50 75 上述结果說明，使用夾層雜交蘭置方法在未擴增的 DNA上，《化學發光測量条統能夠用於檢測大腸桿菌中的 基因组基因。在逋値實施例中，舆抗生蛋白鍵醣索包覆的 磁性顆粒I —樣，也可使用抗生蛋白鍵龆素包覆的磁性顆 粒I 〇 實施例32:在渐消失波費光檢拥器上顆粒的富集 使用渐消失波檢拥器在檢測表面上檷記錯合物的《集 可用於提离拥ft的S敏度。逭類檢测器可Μ使用光學鑛鎗 銳濟#t夹樣率>«霣工消#合作杜印製 或平面光波導300将光310由光源帶至液體環境。由於入射 光束射到髙折射指數《介質（γη〉和低折射指數霣介質（n，> 間的界面產生的繡内部反射（TIR)31(T，光反射穿遇波導 或光鑛。當光束入射角大於臨界角Θ。315 (該角表示垂 直線300 '和光程3UT之間的角度），e^sSirr1 (na/ tu)，光在界面處100%的内反射。在光波導和光鐵中，光 以大於豳界角的入射角傳播，並且Μ缠内部反射穿《介質 衣紙張尺度通用中國团家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -65 - 81.9.25,000 嫌濟♦肀央#率屬典工消费合作杜印製 A6 B6 五、發明説明（） 。第22·表示在波導或光殲中TIR的傳播。 _然光線在舆界面相互作用的各黏上能隽完全反射， 但是在介質外的《磁埸並不等於0 。當霣磁場由光鑛或波 導外部透入到外部環境時，建續穿《界面«物理學要求而 言，《磁壜需要按指黢衮減。瘇鴒1磁場稱爲渐消失場 320 ，並且能将螯光釀瀲發為螢光。渐消失場的衰滅率決 定於入射波長、折射指數^和〜和入射角。在水環塊中使 甩石英波導和可見光，在由波導/溶液界面的100η·距離 内，漸消失場320約衮«90%。在第22圓中，周園介質320 具有折射指數和光编或波導300 Μ及折射指數iu。 光在波導和光编中傳播1生渐消失場的同樣原理也可 使螯光園發生時產生的光有效地被吸收到光學元件中。此 外，在渐消失Β 320外產生的任何光都可有效地由進入光 學元件中返回。將逭些作用结合起來就能使光鐵或波導作 爲有效的光學元件用於水環塊中在费光鼷檷記物的表面上 或表面附近澜ft螢光蘭檷記物的存在和濃度。美团專利 4447546 (係本文的參考文獻）介绍了使用光學集觼激發 和測量檷記免疫反應物的渐消失B螢光進行躉光免疫测量 的一棰適宜方法和裝置。 , · 本發明使用光编或波導能夠提高螢光结合澜1的靈敏 度，該拥(M可使用由螢光檷記的試爾來完成。将顆粒、樣 品和試«進行瀑育後，顆粒窗集在波導或光鑛的表面上。 由於顆粒的表面稹大於波導或光繼的幾何面積，在光學元 件周圃的渐消失匾能夠收集更多的躉光圃。由此，由顆粒 本纸張尺度適用+明B家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本霣)

A6 B6 316291 五、發明説明（ 產生的發光倍號将較強，使定量分析的靈敏度更高，從而 使各種檢測限度得到改進。 上述較佳實施例詳细介绍了本發明，但不能因此限制 本發明，在不脫離本發明實質的情況下，根據說明耆的介 绍，顯然可以作出各種改變，但無疑逋也應羼本發明的範 蘭。 請 先 Η 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 觼濟部中夹#準屬霣工消费合作杜印製 -----ili·^---* 本紙張尺度遑用t國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25.000

Claims (1)

1. 經濟部中央樣準局貝工消费合作杜印裂 '申:請專利範圍 第81102075號再審査案申請專利範園修正本 修正日期：84年Θ月 ΓΊ. 一種對一存在於一樣品中之有意義的分析物進行结合 分析之方法，其包含下述步》: (a) 形成一組成物，其包含有： (i) 該樣品， (ii) 一分析進行物質，其包含有一與一有能力誘導 發光之檫記化合物速接的組成份，和 (Πί)多僭有能力與該分析物和/或該分析進行用物 質專一结合之顆粒； (b) 溫育該组成物，以形成一含有一顆粒與該禳記化 合物之錯合物； (c) 應用下述任一種收集方法·在薄量B收集該錯合 物： (i)藉由重力來收集該錯合物； (ii)藉由離心力來收集該錯合物； (iii)藉由遇濾方式來收集該錯合物； (iv)藉由對該穎粒施加一磁場來收集該錯合物； .(d)藉由霣化學發光現象而誘發在該錯合知中的檩記 化合物發光；以及 - (e)SI^發射出之光，以拥Λ出該樣品中該分析物之 存在量。 2.如申請專利範画第1項的方法，其中該錯合物是在一 轚極表面收集的。 本纸法尺度適用中國國家揉率（CNS ) Λ4规格（210X297公釐） X (請先閱讀背面之注^^項再填寫本頁)

   經濟部中夹櫺率局Λ工消费合作社印裂 316S31 戠 C8 ____ D8 六、申請專利範圍 3. —種依據在«柘表面測量«化學發光之瀏董而對一存 在於一搛品中之有意義的分析物進行結合分析之方法 *其包含下述步驟： (a) 形成一組成物，其含有： (i)該漾品， (U)—分析進行物質，其包含有一與一有能力誘導 霣化學發光之標記化合物連接的組成份，和 (i i i)多傕有能力與該分析物和/或該分析進行用物 質專一結合之顆粒； (b) 溫育該組成物，以形成一含有一顆粒和該標記 化合物的錯合物； (c) 收集該錯合物； (d) 經由將電壓施加在一霣極上，使所收集的錯合物 與該霣極表面接觸，並誘發該錯合物中的標記化 合物發光；以及 (e) 潮量在該«棰表面上射出之光•以測置出在該樣 品中該分析物之存在量。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該颗粒像以遇濾 ，方式收集。 5. 如申讅專利範圍第4項之方法，其中該過濾步驟僳在 該轚棰的表面上收集該錯合物。 6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該遇濾偽在一帶 孔洞的金屬«極表面上進行，其中該孔徑大小以平均 直徑計算之為該顆粒平均直徑的10至90%。 -2 - 本紙張尺度遑用中國國家揉率（〇呢）八4规格（210父297公釐） — (請先《讀背面之注$項再填寫本頁)

   3x6291 A8 B8 C8 D8 鐘濟部中央榣準肩Λ工消费含作社印*. 六、申請專利範圍 7. 如申請專利範匾第3項之方法，其中該顆粒偽懸浮於· 該组成物中。 8. 如申讅專利範謳第4項之方法*其中該顆粒大小以平 均直徑來計算為0.001至100»·。 9. 如申請專利範醑第8項之方法，其中該g粒大小愾在 0.01至10u·的範園内。 10. 如申請專利範園第7項之方法，其中該懸浮的顆粒你 為磁性反應者。 11. 如申請專利範園第10項之方法，其中該錯合物之收集 傜藉由對該顆粒施加一磁場而逹成之。 12. —種基於在一霉極表面之霣化學發光的拥量而對一存 在於一樣品中之有意義的分析物進行结合分析的方法 ，該方法包括下述步想： (a) 形成一组成物，其包含有： (i) 該樣品， (ii) 一分析進行物質，其包含有一與一有能力誘導 霣化學發光之橛記化合物連接的组成份•和 (iii)多健魅浮顆粒，其具有一大於該组成物平衡置 之密度，且有能力與該分析物或該分析進行物 質專一地結合； (b) 溫育該组成物，以形成含有一顆粒和該檫記化 合物的錯合物； (c) 將該組成物導入分析室； (d) 使該組成物在該分析室中滞留足夠的時間，而使 -3 - (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) ‘®·ίι _^_ I _

   訂 { 本纸張尺度逍用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央樣率局貝工消费合作社印氧 316S31 b8 -^-_______ D8 '申請專利範圍 該组成物經由重力作用而沈澱•以在一霣極表面 上收集該錯合物•該《棰葆位於該分析室之容稹 之至少一實質部份的下方； (e) 經由将一電壓施加在該電極上，而誘導所收集之 錯合物中的標記化合物發光；以及 (f) 潮量在該霣極·表面之發射光，以澜置在該樣品中 該分析物存在*。 13. 如申請專科範圍第12項之方法·其傜以批次方式進行 ，且該组成物傜溜留在該分析室中足夠的時間，而使 該顆粒沉澱在該霣極表面上。 14. 如申誚專利範園第12項之方法·其僳以批次方法進行 ，其中該组成物换以足夠低的速率流遇該分析室，以 使至少一部分顆粒沉澱在該«極表面上。 15. 如申讅專利範園第12項之方法*其中該顆粒的密度為 0 .1至 5g/ 道 1。 16. 如申讅專利範圍第15項之方法，其中該顆粒的密度為 〇_5至 2g/ b1。 17. 如申請專利範圍第12項之方法*其中該顆粒僳大小以 .平均直徑來計算為在0.01至100/iB之範匾内。 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該顆粒的大小像 在0.01至ΙΟίΐΒ之範圍内。 19. 如申請專利範鼷第12項之方法，其中在該組成物中之 顆粒灌度為1至10,000ttg/ml。 20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該顆粒潘度傣在 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS〉A4規格（210X297公釐）

   經濟部中央樣準高員工消费合作社印*. 316291 C8 ________D8 _ ·、申請專利範圍 5至lOOOiig/ ·1之範園内。 21. 如申誚專利範園第12項之方法，其中在該组成物中之 顆粒密度、大小舆濃度像可使在其沉澱速率至少為 0.5β·/ 分鐘。 22. 如申請專利範酾第12項之方法，其中在誘導霣化學發 光前•該霣極表面之至少一實質部分像為該錯合物之 箪層所覆蓋的。 23. —種基於霣極表面當化學發光的澜量而對一存在於一 樣品中之有意義的分析物進行結合分析的方法，該方 法包含下述步想： (a) 形成一組成物，其包含有： (i) 該櫬品， (ii) 一分析進行物質，其包含有一舆一有能力誘導 電化學發光之禳記化合物連接的組成份，和 Uii)多镔懸浮顆粒，其具有一大於該组成物平衡ft 之密度，且有能力與該分析物或該分析進行物 質專一地結合； (b) 溫育該组成物，以形成一含有一顆粒和該欏記化 合物的錯合物； (c) 離心收集該錯合物； (d) 經由將霣壓施加在一 S極上，使所收集的錯合物 與該電極表面接觸，並誘發在該錯合物中的，檩記 化合物發光；以及 (e) 測量在該電掻表面之發射光，以澜置在該樣品中 (請先閲讀背面之注^^項再填寫木頁)

   訂 UT. 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐） It- 316291 A8 B8 C8 D8 經濟部中夬棣率局員工消费合作社印裂 、申請專利範圍 該分析物的存在量。 24. 如、申請專利範圍第23項之方法*其中該離心步驟是在 該*棰的表面上收集該錯合物。 25. 如申誧萼利範匾第23項之方法，其中該顆粒具有一在 0.1至5g/il之間的密度。 26. 如申請專利範園第25項之方法，其中該顆粒具有一在 0.5至2g/il之間的密度。 27. 如申請專利範匾第25項之方法，其中該發光傜在離心 該樣品時予以潮量。 28. —種基於電極表面的電化學發光之測1而對一存在一 樣a中之有意義的分析物進行结合分析的方法，該方 法包括下述步驟： (a)形成一组成物，其包含有： (i) 該樣品， (ii) 一分析進行物霣，其包含有一與一有能力誘導 電化學發光之標記化合物連接的組成份，和 (iii)多侮有能力舆該分析物或該分析進行物霣專一 结合之磁性感應戀浮顆粒； ...(b)溫育該組成物*以形成一含有一顆粒和該檫記 化合物的錯合物； (c) 將該组成物導入分析室； (d) 經由将一磁場施加在該顆粒上，以在一霄棰表面 上收集該錯合物； (e) «由将一電壓施加在該電極上，而誘發所收集之 本紙張尺度適用中«國家揲率（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本f) .kr-a#-

   訂 u^r. Μ濟部中央檬準局工消费合作社印«. A8 B8 C8 D8__ 六、申請專利範圍 錯合物中的標記化合物發光；以及 (〇濟量在霄掻表面之發射光，以澜置在該樣品中的 分析物的存在量。 29. 如申請專利範園第28項之方法，其中該磁場之施加可 使得該錯合物在該«極的表面上被收集。 30. 如申誚專利範圍第28項之方法*其像批次方式進行， 且該组成物在該分析室中滞留足夠時間，以使得該磁 場能造成該顆粒沈澱在該«極表面上。 31. 如申讅專利範園第28項之方法，其偽以流動方式進行 ，且其中該組成物以足夠低的速率流過該分析室•以 使得該磁場能造成該颗粒沈澱在該霣掻表面上。 32. 如申請專利範園第28項的方法，其中該顆粒具有一 至少為O.OOlcgs單位之磁化率。 33. 如申讅專利範圍第32項之方法，其中該磁化率至少為 0.Olegs 單位。 34. 如申請專利範匾第28項之方法，其中該顆粒具有一在 0.5至2g/nl之間的密度。 35. 如申誚專利範圍第34項之方法，其中該顆粒的密度傜 .在0.5至2g/nl之間。 36. 如申請專利範匾第28項之方法·其中該頼粒大小以平 均直徑計算係在0.001至ΙΟΟίΐη之間。 37. 如申諌專利範臞第28項之方法，其中該顆粒大小俱在 0.01至10ua之間，且該顆粒具有低共振性。 38. 如申請專利範園第28項之方法，其中在該組成物中的 -7 - 本紙張尺度逋用中國國家輮率（CNS ) A4规格（210X297公釐） — hr __i___ (請先W讀背面之注$項再填寫本頁) 订- f UK! A8 B8 C8

   、申請專利範圍 經濟部中央梯率局貝工消费合作社印*. 顆粒濃度係在1至lOOOOug/nl之間。 39. 如申請專利範鼷第38項之方法，其中該顆粒濃度涤在 5至 lOOOiig/.id之間。 40. 如申請專利範園第28項之方法，其中在該组成物中之 該顙粒之磁化率、密度、大小和濃度樣使得該顆粒的 沉澱速率至少為〇.5·β/分鐘。 41. 如申請專利範醒第28項之方法，其中在誘導®化學發 光前*該«極表面之至少一實質部分為該錯合物的單 層所覆蓋。 42. 如申請專利範匾第28項之方法，其中在該電掻表面區 域内，該磁場的磁力線基本上是與該《檯的表面相平 行的。 43. 如申讅專利範園第28項之方法，其中在·收集該錯合物 後且在誘導發光前，除考該磁場。 44. 一種基於霣棰表面之霣化學發光的潮量而對存在於一 樣品中之的有意義分析物進行結合分析之裝置，該裝 置包括： (a) —界定出一含有一容稹之樣品之室*其具有一垂 直柱狀區和一進料裝置及一排料装置•邇更進一 步包括一位於該樣品室和柱狀區主要部分下方之 基本上是沿水平方向的霣極； (b) —在該電搔上施加一電壓之裝置；以及 (c) 一測董在該霣棰上所産生的電化學發光之裝置。 45. —種基於電極表面之電化學發光的潮Λ而對存在於一 本纸張尺度逋用中國國家橾隼（CNS ) Α4规格（210X297公釐） (請先Μ讀背面之注$項再填寫本筲)

   訂 kr 5l6S9l λ8 B8 C8

   、申請專利範園 經濟部t央樑率局貝工消费合作社印装 搛品中之的有意義分析物進行結合分析之裝置，該裝 置包括： u) —界定出一含有一容稹之分析樣品之室，其具有 一進料裝置、一進料装置、一抹料装置、一《極 ，其進一步包含一供在該霣極表面上獲得一該銪 合物之實質上均匀分布的装置； 0>)—在該電極上施加一霣壓的裝置；以及 (c)一測量在該堪極上所産生霣化學發光的裝置。 46. 如申讅專利範圍第45項之裝置，其中該獲得錯合物之 均勻分布的装置包括有一在該霣極的表面區内産生輿 該«極表面基本上平行的磁力線的磁埸之産生磁場装 置。 47. 如申謅專利範園第46項的装置，其中該産生磁場的裝 置包括一垂直配置在該霣極下面之南北向的磁«8。 48. —種供用於一基於結合反應與一霣化學發光現象之分 析的分析試劑，其包含： (a) —霣解質； ' (b)多傾磁想應穎粒，其具有一可能力結合至該分析 组成物中之組成份的表面；以及 (c) 一種具有结合性質的標記物質，該棟記物質包括 一具有《化學發光性質的化學部分。 49. 一種供用於一基於結合反應與一《化學發光現象之分 析的分析試劑，其包含： ______ - 9 -_ 本紙張尺度適用中國家輮率（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先《讀背面之注$項再填寫本茛) 一！ 订 f Ur. A8 B8 C8 D8 ⑴ 經濟部中夬揉率局貝工消费合作社印家 申請專利範固 “）磁性感應顆粒和至少一種選自下述族群的試劑 霄解質； (ii) 一含有ECL部分的槺記化合物； (iii) 一有意義的分析物或其類似物； (iv) —有意義的分析物之结合夥伴或其類似物； (v) —能與（iii)或（iv)反慝的反應组成份； (vi) —遢原劑；以及 (vii) —霉化學發光反醮促進劑，或 (b) —種或多種成份，其中至少一種含有磁性慼應 顆粒，該試ίί係選自上述成份（i)-(vH)。 10 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐）