EA042735B1 - Системы и способы рамановской спектроскопии in situ для контроля переменных процесса в культурах клеток - Google Patents
Системы и способы рамановской спектроскопии in situ для контроля переменных процесса в культурах клеток Download PDFInfo
- Publication number
- EA042735B1 EA042735B1 EA202090783 EA042735B1 EA 042735 B1 EA042735 B1 EA 042735B1 EA 202090783 EA202090783 EA 202090783 EA 042735 B1 EA042735 B1 EA 042735B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell culture
- post
- culture medium
- analytes
- glucose
- Prior art date
Links
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета предварительной заявки на патент США
62/572828, поданной 16 октября 2018 г. и 62/662322, поданной 25 апреля 2018 г., все из которых включены в качестве ссылки во всей их полноте, где это допустимо.
Область техники
Изобретение в целом относится к биореакторным системам и способам, включая способы и системы рамановской спектроскопии in situ для мониторинга и контроля одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток биореактора.
Уровень техники
Структура Процессно-Аналитической Технология (ПАТ) Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) поощряет добровольную разработку и внедрение инновационных решений по разработки процессов, анализа процессов и контроля процессов для лучшего понимания процессов и контроля качества продуктов. Параметры процесса мониторятся и контролируются в процессе производства. Например, подача питательных веществ к культуре клеток в биореакторе во время производства биопродуктов является важным параметром процесса. Современное производство биопродуктов включает стратегию кормления ежедневными болюсными подпитками. В соответствии с современными способами ежедневные болюсные подпитки увеличивают концентрацию питательных веществ в клеточных культурах по меньшей мере пять раз в день. Чтобы гарантировать, что культура не исчерпала питательные вещества между подпитками, ежедневные болюсные подпитки поддерживают концентрации питательных веществ на высоких уровнях. Действительно, каждая подпитка рассчитана на то, чтобы иметь все питательные вещества, необходимые культуре для поддержания ее до следующей подпитки. Тем не менее, большое количество питательных веществ в каждодневной болюсной подпитке может вызвать существенные колебания уровня питательных веществ в биореакторе, что приводит к несоответствиям в качестве продукта, производимого производственной культурой.
Кроме того, высокая концентрация питательных веществ в каждой ежедневной болюсной подпитке способствует увеличению посттрансляционных модификаций получаемого биопродукта. Например, высокие концентрации глюкозы в культуре клеток могут привести к увеличению гликирования конечного биопродукта. Гликация представляет собой неферментативное присоединение восстанавливающегося сахара к аминокислотному остатку белка, обычно встречающееся у N-терминального амина белков и положительно заряженной аминогруппы. Полученные продукты гликирования могут иметь желтую или коричневую окраску, что может привести к окрашиванию лекарственного продукта (Hodge J.E. (1953) J Agric Food Chem. 1:928-943). Гликация также может приводить к вариациям заряда в одной производственной партии терапевтического моноклонального антитела (mAb) и приводить к ингибированию связывания (Haberger M. et al. (2014) MAbs. 6:327-339).
Соответственно, в стремлении продвинуть инициативу ПАТ, остается потребность в способе или системе способной оптимизировать концентрации питательных веществ в культуре клеток, что приведет к получению более качественных продуктов.
Сущность изобретения
В данном документе раскрыты способы и системы рамановской спектроскопии in situ для мониторинга и контроля одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток биореактора.
Один вариант реализации настоящего изобретения включает способ контроля условий среды для культивирования клеток, включающий количественное определение одного или нескольких аналитов в среде для культивирования клеток с использованием рамановской спектроскопии in situ; и корректировку одной или нескольких концентраций аналита в среде для культивирования клеток для соответствия предварительно определенными концентрациям аналита, которые поддерживают посттрансляционные модификации белков в среде для культивирования клеток до 1,0-30%. В некоторых вариантах реализации посттрансляционная модификация включает гликирование. В других вариантах реализации белки в культуре клеток включают антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или слитый белок. В других вариантах реализации среда для культивирования клеток включает клетки млекопитающего, например, клетки яичника китайского хомячка.
В некоторых вариантах реализации аналит представляет собой глюкозу. В этом аспекте предварительно определенная концентрация глюкозы составляет от 0,5 до 8,0 г/л. В другом варианте реализации предварительно определенная концентрация глюкозы составляет от 1,0 до 3,0 г/л. В еще одном варианте реализации концентрация глюкозы составляет 2,0 или 1,0 г/л. В других вариантах реализации предварительно определенные концентрации аналита поддерживают посттрансляционные модификации белков в среде для культивирования клеток до 1,0-20% или от 5,0 до 10%. В еще других вариантах реализации количественное определение аналитов проводится непрерывно, периодически или с интервалами. Например, количественное определение аналитов проводится с 5-, 10- или 15-минутными интервалами. В еще других вариантах реализации количественное определение аналитов проводится ежечасно или, по меньшей мере, ежедневно. В некоторых вариантах реализации регулирование концентраций аналита проводится автоматически. В еще других вариантах реализации количественно определяют по меньшей мере два, или по меньшей мере три, или по меньшей мере четыре разных аналита.
- 1 042735
Другой вариант реализации настоящего изобретения включает способ уменьшения посттрансляционных модификаций секретируемого белка, включающий культивирование клеток, секретирующих белок, в среде для культивирования клеток, включающей 0,5-8,0 г/л глюкозы; постепенное определение концентрации глюкозы в среде для культивирования клеток во время культивирования клеток с использованием рамановской спектроскопии in situ; и регулирование концентрации глюкозы для поддержания концентрации глюкозы на уровне от 0,5 до 8,0 г/л путем автоматической подачи нескольких доз глюкозы в 1 ч для поддержания посттрансляционных модификаций секретируемого белка до 1,0-30,0%. В одном варианте реализации концентрация глюкозы составляет 1,0-3,0 г/л.
Еще один вариант реализации настоящего изобретения включает систему контроля условий среды для культивирования клеток, включающую один или несколько процессоров, взаимодействующих с машиночитаемым носителем, хранящим программный код для выполнения одним или несколькими процессорами, чтобы заставить систему принимать данные, включающие: концентрацию одного или нескольких аналитов в среде для культивирования клеток с помощью рамановского спектрометра in situ; и корректировать одну или несколько концентраций аналита в среде для культивирования клеток, чтобы соответствовать заранее определенным концентрациям аналита, которые поддерживают посттрансляционные модификации белков в среде для культивирования клеток до 1,0-30%. В одном варианте реализации программный код дополнительно сконфигурирован для того, чтобы заставить систему выполнять хемометрический анализ, например, моделирование регрессии данных методом дробных наименьших квадратов. В других вариантах реализации программный код дополнительно сконфигурирован для того, чтобы заставить систему выполнять один или несколько способов обработки сигналов, например, способ шумоподавления данных.
Другой вариант реализации настоящего изобретения включает систему уменьшения посттрансляционных модификаций секретируемого белка, включающую один или несколько процессоров, взаимодействующих с машиночитаемым носителем, хранящим программный код для выполнения одним или несколькими процессорами, чтобы заставить систему постепенно наращивать получение спектральных данных, включая концентрацию глюкозы в среде для культивирования клеток во время культивирования клеток, секретирующих белок, из рамановского анализатора in situ; и регулирование концентрации глюкозы для того, чтобы поддерживать концентрацию глюкозы на уровне от 0,5 до 8,0 г/л, например от 1,0 до 3,0 г/л, путем автоматической подачи нескольких доз глюкозы в 1 ч для поддержания посттрансляционных модификаций секретируемого белка до 1,030,0%. В одном варианте реализации программный код дополнительно сконфигурирован, чтобы заставить систему коррелировать пики в спектральных данных с концентрациями глюкозы. В другом варианте реализации программный код дополнительно сконфигурирован для выполнения моделирования регрессии спектральных данных методом дробных наименьших квадратов. В еще одном варианте реализации программный код дополнительно сконфигурирован для выполнения способа шумоподавления спектральных данных. В других вариантах реализации регулирование концентрации глюкозы выполняется с помощью программного обеспечения автоматического контроля с обратной связью.
Краткое описание графических материалов
Дополнительные признаки и преимущества изобретения могут быть установлены из следующего подробного описания, которое предоставлено в связи с чертежами, описанными ниже:
фиг. 1 представляет собой блок-схему последовательности операций способа контроля переменных процесса в культуре клеток в соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения;
фиг. 2 представляет собой принципиальную схему системы контроля переменных процесса в культуре клеток, связанной с фиг. 1, в соответствии с настоящим изобретением;
фиг. 3 представляет собой график, показывающий прогнозируемые значения процесса подачи питательных веществ, подтвержденные автономными образцами питательных веществ;
фиг. 4 представляет собой график, показывающий отфильтрованные конечные значения концентрации питательных веществ процесса подачи после обработки сигнала в соответствии с настоящим изобретением;
фиг. 5 представляет собой график, показывающий прогнозируемые значения концентрации питательных веществ процесса и отфильтрованные конечные значения концентрации питательных веществ процесса после сдвига в предварительно определенном заданном значении концентрации питательных веществ;
фиг. 6 представляет собой линейный график, показывающий влияние концентрации глюкозы на посттрансляционные модификации при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами;
фиг. 7 представляет собой график, показывающий предсказанные Раманом значения концентрации глюкозы in situ при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами;
фиг. 8 представляет собой линейный график, показывающий титр антитела при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами;
- 2 042735 фиг. 9 представляет собой гистограмму, показывающую нормализованный процент посттрансляционных модификаций как результат значения концентрации глюкозы;
фиг. 10 представляет собой график, показывающий концентрации глюкозы при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами;
фиг. 11 представляет собой график, показывающий, что культура клеток с обратной связью может снижать ПТМ вплоть до 50% по сравнению с культурой клеток со стратегией болюсной подпитки.
Подробное описание изобретения
Определения.
Используемые в данном документе формы единственного числа включают также формы множественного числа, если контекст явно не предписывает иное.
Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно указано в данном документе.
Использование термина около предназначено для описания значений выше или ниже заявленного значения в диапазоне приблизительно +/- 10%; в других вариантах реализации значения могут находиться в диапазоне либо выше, либо ниже заявленного значения в диапазоне приблизительно +/- 5%; в других вариантах реализации значения могут находиться в диапазоне либо выше, либо ниже заявленного значения в диапазоне приблизительно +/- 2%; в других вариантах реализации значения могут находиться в диапазоне либо выше, либо ниже заявленного значения в диапазоне приблизительно +/-1%. Предполагается, что предыдущие диапазоны будут понятны из контекста, и никаких дополнительных ограничений не предполагается. Все способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или примерных формулировок (например, таких как), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Ни одна из формулировок в описании не должен быть истолкована как указывающая на любой не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.
Термин биопродукт относится к любому антителу, фрагменту антитела, модифицированному антителу, белку, гликопротеину или слитому белку, а также к конечным лекарственным веществам, полученным в процессе биореактора.
Термины контроль и контролирование относятся к регулированию количества или уровня концентрации технологической переменной в культуре клеток до предварительно определенного заданного значения.
Термин мониторинг относится к регулярной проверке количества или уровня концентрации технологического параметра в культуре клеток или состояния процесса в культуре клеток.
Термин устойчивое состояние относится к поддержанию концентрации питательных веществ, параметров процесса или качественных признаков в культуре клеток на неизменном, постоянном или стабильном уровне. Понятно, что неизменный, постоянный или стабильный уровень относится к уровню в пределах предварительно определенных заданных значений. Определенные значения и, следовательно, уровни установившегося состояния могут быть смещены оператором во время культивирования культуры клеток.
Способы производства биопродуктов.
Один из вариантов реализации обеспечивает способы мониторинга и контроля одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток биореактора с целью улучшения качества и постоянства продукта. Переменные процесса включают, но не ограничиваются ими, концентрацию глюкозы, аминокислот, витаминов, факторов роста, белков, количества жизнеспособных клеток, кислорода, азота, рН, количества мертвых клеток, цитокинов, лактата, глютамина, других Сахаров, таких как фруктоза и галактоза, аммония, осмоляльность и их комбинации. В раскрываемых способах и системах используются способы рамановской спектроскопии in situ и хемометрического моделирования для оценки культуры клеток в режиме реального времени в сочетании со способами обработки сигналов для точной непрерывной обратной связи и прогнозирующего контроля параметров переменных процесса культивирования клеток. Рамановская спектроскопия in situ содержимого биореактора позволяет анализировать одну или несколько переменных процесса в биореакторе без физического извлечения образца, содержащегося в биореакторе, для тестирования. Благодаря использованию данных в реальном времени из рамановской спектроскопии, переменные процесса в культуре клеток могут непрерывно или периодически контролироваться, и автоматизированные контроллеры с обратной связью поддерживают переменные процесса на заданных значениях или поддерживают специальный протокол подпитки, который подает переменные количества агентов в биореактор для максимизации качества биопродуктов.
Раскрытые способы и системы контролируют одну или несколько переменных процесса в процессе культивирования клеток. Термины культура клеток и среда для культивирования клеток могут ис- 3 042735 пользоваться взаимозаменяемо и включают любое твердое, жидкое или полутвердое вещество, предназначенное для поддержки роста и поддержания микроорганизмов, клеток или клеточных линий. Такие компоненты, как полипептиды, сахара, соли, нуклеиновые кислоты, клеточный дебрис, кислоты, основания, буферы рН, кислород, азот, агенты для модуляции вязкости, аминокислоты, факторы роста, цитокины, витамины, кофакторы и питательные вещества могут присутствовать в среде для культивирования клеток. Один вариант реализации обеспечивает процесс культивирования клеток млекопитающих и включает клетки или линии клеток млекопитающих. Например, процесс культивирования клеток млекопитающих может использовать клеточную линию яичников китайского хомячка (СНО), выращенную в химически определенной базальной среде.
Процесс культивирования клеток можно проводить в биореакторе. Биореакторы включают систему посевных ферментеров, подпиточные и непрерывные биореакторы. Биореакторы могут иметь объем от около 2 до около 10000 л. В одном варианте реализации биореактор может представлять собой биореактор из нержавеющей стали на 60 л. В другом варианте реализации биореактор может представлять собой биореактор объемом 250 л. Каждый биореактор также должен поддерживать количество клеток в диапазоне от около 5x106 до примерно 100x106 клеток/мл. Например, биореактор должен поддерживать количество клеток от около 20x106 клеток/мл до около 80 клеток/мл.
Раскрытые способы и системы могут мониторить и контролировать любой аналит, который присутствует в культуре клеток и имеет детектируемый рамановский спектр. Например, способы настоящего изобретения могут использоваться для мониторинга и контроля любого компонента среды для культивирования клеток, включая компоненты, добавляемые в культуру клеток, вещества, выделяемые из клетки, и компоненты клетки, присутствующие при гибели клетки. Компоненты среды для культивирования клеток, которые могут мониториться и/или контролироваться раскрытыми системами и способами, включают, но не ограничиваются ими, питательные вещества, такие как аминокислоты и витамины, лактат, кофакторы, факторы роста, скорость роста клеток, рН, кислород, азот, количество жизнеспособных клеток, кислоты, основания, цитокины, антитела и метаболиты.
Один вариант реализации обеспечивает способы мониторинга и контроля концентраций питательных веществ в культуре клеток. Используемый в данном документе термин питательное вещество может относиться к любому соединению или веществу, которое обеспечивает питание, необходимое для роста и выживания. Примеры питательных веществ включают, но не ограничиваются ими, простые сахара, такие как глюкоза, галактоза, лактоза, фруктоза или мальтоза; аминокислоты; и витамины, такие как витамин А, витамины группы В и витамин Е. В другом варианте реализации способы настоящего изобретения могут включать мониторинг и контроль концентраций глюкозы в культуре клеток. Путем контроля концентрации питательных веществ, например, концентрации глюкозы в культуре клеток, было обнаружено, что биопродукты, такие как белки, могут продуцироваться в более низком диапазоне концентраций, чем это было возможно ранее с использованием стратегии ежедневной болюсной подпитки питательными веществами.
Кроме того, путем контроля концентрации питательных веществ и другие переменные процесса в культуре клеток, способы настоящего изобретения дополнительно обеспечивают модуляцию одной или нескольких посттрансляционных модификаций белка. Не будучи связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что обеспечивая более низкие концентрации питательных веществ в культуре клеток, могут быть уменьшены посттрансляционные модификации белков и антител. Примеры посттрансляционных модификаций, которые могут модулироваться настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, гликирование, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизация известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление и модификация не встречающимися в природе аминокислотами. В другом варианте реализации предложены способы и системы для модулирования гликирования белка. Например, обеспечивая более низкие диапазоны концентраций глюкозы в среде для культивирования клеток, уровни гликирования в секретируемом белке или антителе могут быть снижены в конечном биопродукте.
Фиг. 1 представляет собой блок-схему последовательности операций примерного способа контроля одной или нескольких переменных процесса, например, концентрации питательных веществ, в культуре клеток биореактора. Предварительно определенные значения для каждой из переменных процесса, которые должны мониториться и контролироваться, могут быть запрограммированы в системе. Предустановленные заданные значения представляют количество переменных процесса в культуре клеток, которое должно поддерживаться или корректироваться в течение всего процесса. Концентрация глюкозы является одним из примеров питательного вещества, которую можно контролировать и модулировать. Как кратко обсуждалось выше, было обнаружено, что биопродукты (например, белки, антитела, слитые белки и лекарственные вещества) могут продуцироваться клетками в среде для культивирования культуры, которая содержит низкие уровни глюкозы по сравнению с концентрациями глюкозы в среде с использованием стратегии подачи суточной болюсной дозы питательных веществ. В одном варианте реализации определенное заданное значение для концентрации питательных веществ является самой низкой концентрацией питательного вещества, необходимой для роста и размножения линии клеток. Раскрытые спосо
- 4 042735 бы и системы могут вводить множество небольших доз питательных веществ в среду для культивирования клеток в течение определенного периода времени или могут обеспечивать постоянный поток питательного вещества в среду для культивирования клеток. В некоторых вариантах реализации предварительно заданное значение может быть увеличено или уменьшено во время процесса, в зависимости от условий в среде для культивирования клеток. Например, если предварительно заданное значение концентрации питательных веществ приводит к гибели клеток или неоптимальным условиям роста в среде для культивирования клеток, предварительно заданное значение может быть увеличено. Тем не менее, концентрацию питательных веществ следует поддерживать на предварительно заданном значении от около 0,5 до около 10 г/л. В другом варианте реализации концентрацию питательного вещества следует поддерживать на предварительно заданном значении от около 0,5 до около 8 г/л. В еще одном варианте реализации концентрацию питательного вещества следует поддерживать на предварительно заданном значении от около 1 до около 3 г/л. В еще одном варианте реализации концентрацию питательного вещества следует поддерживать на предварительно заданном значении около 2 г/л. Эти предварительно заданные значения, по существу, обеспечивают базовый уровень, при котором концентрация питательных веществ должна поддерживаться на протяжении всего процесса.
В одном варианте реализации мониторинг одной или нескольких переменных процесса, например, концентрации питательных веществ, в культуре клеток проводят посредством рамановской спектроскопии (стадия 101). Рамановская спектроскопия - это форма вибрационной спектроскопии, которая предоставляет информацию о молекулярных колебаниях, которую можно использовать для идентификации и количественного определения образцов. В некоторых вариантах реализации мониторинг переменных процесса выполняется с использованием рамановской спектроскопии in situ. Рамановский анализ in situ это способ анализа образца в его исходном местоположении без необходимости извлечения части образца для анализа в рамановском спектрометре. Рамановский анализ in situ выгоден тем, что спектрометры рамановской спектроскопии неинвазивны, что снижает риск загрязнения и не разрушителен, не влияет на жизнеспособность культуры клеток или качество белка.
Рамановский анализ in situ может обеспечить оценку в реальном времени одной или нескольких переменных процесса в культурах клеток. Например, необработанные спектральные данные, полученные с помощью рамановской спектроскопии in situ, можно использовать для получения и мониторинга текущего количества концентрации питательных веществ в культуре клеток. В этом аспекте, чтобы гарантировать, что необработанные спектральные данные постоянно обновляются, спектральные данные из рамановской спектроскопии должны сниматься примерно каждые от 10 мин до 2 ч. В другом варианте реализации спектральные данные должны сниматься примерно каждые от 15 мин до 1 ч. В еще одном варианте реализации спектральные данные должны сниматься примерно каждые от 20 до 30 мин.
В этом аспекте мониторинг одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток можно анализировать с помощью любого коммерчески доступного рамановского спектроскопического анализатора, который позволяет проводить рамановский анализ in situ. Рамановский анализатор in situ должен быть способен получать необработанные спектральные данные в культуре клеток (например, рамановский анализатор должен быть снабжен зондом, который может быть вставлен в биореактор). Подходящие рамановские анализаторы включают, но не ограничиваются ими, анализаторы RamanRXN2 и RamanRXN4 (Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI).
На стадии 102 необработанные спектральные данные, полученные с помощью рамановской спектроскопии in situ, можно сравнить с автономными измерениями конкретной переменной процесса, которая должна мониториться или контролироваться (например, измерения концентрации питательных веществ в автономном режиме), чтобы сопоставить пики в спектральных данных с переменной процесса. Например, если переменная процесса, которая должна мониториться или контролироваться, представляет собой концентрацию глюкозы, измерения концентрации глюкозы в автономном режиме могут использоваться для определения того, какие спектральные области показывают сигнал глюкозы. Данные измерений в автономном режиме могут быть собраны любым подходящим аналитическим способом. Кроме того, любой тип пакета мультивариантного программного обеспечения, например, SIMCA 13 (MKS Data Analytic Solutions, Umea, Sweden), может использоваться для корреляции пиков в исходных спектральных данных с автономными измерениями конкретной переменной процесса, которая должна мониториться или контролироваться. Однако в некоторых вариантах реализации может потребоваться предварительная обработка необработанных спектральных данных спектральными фильтрами для удаления любых изменяющихся базовых линий. Например, необработанные спектральные данные могут быть предварительно обработаны любым типом техники сглаживания точек или техникой нормализации. Нормализация может потребоваться для корректировки любого изменения мощности лазера и времени экспозиции с помощью рамановского анализатора. В одном варианте реализации необработанные спектральные данные могут обрабатываться точечным сглаживанием, таким как 1-я производная с точечным сглаживанием 21см-1, и нормализацией, такой как нормализация стандартного отклонения случайной величины с нормальным распределением (SNV - англ. Standard Normal Variate).
Хемометрическое моделирование также может быть выполнено на полученных спектральных данных. В этом аспекте один или несколько многовариантных способов, включая, но не ограничиваясь ими,
- 5 042735 дробные наименьшие квадраты (ДНК), анализ главных компонент (АГК), ортогональные дробные наименьшие квадраты (ОДНК), мультивариантная регрессия, каноническая корреляция, факторный анализ, кластерный анализ, графические процедуры и т.п., могут быть использованы относительно спектральных данных. В одном варианте реализации полученные спектральные данные используются для создания модели регрессии методом ДНК. Модель регрессии ДНК может быть создана путем проецирования предсказанных переменных и наблюдаемых переменных в новое пространство. В этом аспекте модель регрессии ДНК может быть создана с использованием значений измерения, полученных из рамановского анализа и значений измерения в автономном режиме. Модель регрессии ДНК предоставляет прогнозируемые значения процесса, например, прогнозируемые значения концентрации питательных веществ.
После хемометрического моделирования способ обработки сигнала может быть применен к прогнозируемым значениям процесса (например, прогнозируемым значениям концентрации питательных веществ) (стадии 103). В одном варианте реализации методика обработки сигнала включает методику шумоподавления. В этом аспекте один или несколько методов шумоподавления могут применяться к прогнозируемым значениям процесса. Может быть использован любой способ шумоподавления, известный специалистам в данной области техники. Например, способ шумоподавления может включать сглаживание данных и/или подавление сигнала. Сглаживание достигается с помощью ряда алгоритмов сглаживания и фильтров, в то время как при подавлении сигнала используются характеристики сигнала для идентификации данных, которые не следует включать в анализируемые спектральные данные. В одном варианте реализации прогнозируемые значения процесса являются шумом, уменьшенным фильтром шумоподавления. Фильтр шумоподавления предоставляет конечные отфильтрованные значения процесса (например, конечные отфильтрованные значения концентрации питательных веществ). В этом аспекте способ шумоподавления объединяет необработанные измерения с оценкой на основе модели того, что измерение должно дать в соответствии с моделью. В одном варианте реализации способ шумоподавления объединяет текущее прогнозируемое значение процесса с его неопределенностями. Неопределенности могут быть определены повторяемостью предсказанных значений процесса и текущих условий процесса. После того как будет получено следующее прогнозируемое значение процесса, оценка прогнозируемого значения процесса (например, прогнозируемого значения концентрации питательных веществ) обновляется с использованием взвешенного среднего, где больший вес придается оценкам с более высокой достоверностью. Используя итеративный подход, окончательные значения процесса могут обновляться на основе предыдущего измерения и текущих условий процесса. В этом аспекте алгоритм должен быть рекурсивным и способен работать в режиме реального времени, чтобы использовать текущее прогнозируемое значение процесса, предыдущее значение и экспериментально определенные константы. Способ шумоподавления повышает надежность измерений, полученных из рамановского анализа и прогнозов ДНК, за счет снижения шума, на который будет воздействовать автоматический контроллер обратной связи.
После получения окончательных отфильтрованных значений процесса (например, конечных отфильтрованных значений концентрации питательных веществ) конечные значения могут быть отправлены в автоматический контроллер обратной связи (стадия 104). Автоматический контроллер обратной связи может использоваться для контроля и поддержания переменной процесса (например, концентрации питательных веществ) на предварительно определенном заданном значении. Автоматический контроллер обратной связи может включать любой тип контроллера, который способен вычислять значение ошибки как разность между желаемым заданным значением (например, предварительно заданное значение) и измеренной переменной процесса и автоматически применять точную и отзывчивую коррекцию. Контроллер автоматической обратной связи также должен иметь элементы контроля, которые можно изменять в режиме реального времени из интерфейса платформы. Например, автоматический контроллер обратной связи должен иметь пользовательский интерфейс, который позволяет регулировать предварительно заданное значение. Контроллер автоматической обратной связи должен быть способен реагировать на изменение предварительно заданного значения.
В одном варианте реализации автоматический контроллер обратной связи может быть пропорционально-интегральным дифференциальным (ПИД) регулятором. В этом аспекте ПИД-регулятор работает для вычисления разности между предварительно определенным значением и измеренной переменной процесса (например, измеренной концентрацией питательных веществ) и автоматически применяет точную коррекцию. Например, когда необходимо контролировать концентрацию питательных веществ в культуре клеток, ПИД-регулятор может быть в состоянии рассчитать разницу между отфильтрованным значением питательного вещества и предварительно заданным значением и обеспечить коррекцию в количестве питательных веществ. В этом аспекте ПИД-регулятор может быть оперативно подключен к питательному насосу на биореакторе, так что корректирующее количество питательного вещества может быть закачано в биореактор (стадия 105).
Посредством использования рамановского анализа в реальном времени и контроля с обратной связью способы настоящего изобретения способны обеспечить непрерывную и пониженную концентрацию питательных веществ для культуры клеток. Таким образом, способ настоящего изобретения способен обеспечить устойчивое добавление питательных веществ к культуре клеток. В одном варианте реализа
- 6 042735 ции для поддержания заданной концентрации питательных веществ, питательные вещества могут непрерывно закачиваться в клеточную культуру через питательный насос в течение определенного периода времени. В другом варианте реализации питательные вещества могут быть добавлены к клеточной культуре через питательный насос в рабочем цикле. Например, в этом аспекте добавление питательных веществ может осуществляться с перерывами или происходить периодически в течение некоторого периода времени.
Раскрытые способы и системы также позволяют производить биопродукты в культуральной среде, которая содержит более низкий диапазон концентраций питательных веществ, например, диапазон концентраций глюкозы, чем концентрации питательных веществ в культуральной среде, с использованием стратегии ежедневной болюсной подпитки питательными веществами. В одном варианте реализации концентрации питательных веществ, например, концентрации глюкозы по меньшей мере на 3 г/л ниже, чем при болюсной подпитке. В другом варианте реализации концентрации питательных веществ, например, концентрации глюкозы по меньшей мере на 5 г/л ниже, чем концентрации питательных веществ в культуральной среде, полученных с использованием болюсной подпитки питательными веществами. В еще одном варианте реализации концентрации питательных веществ, например, концентрации глюкозы по меньшей мере на 6 г/л ниже, чем концентрации питательных веществ, полученные с использованием болюсной подпитки питательными веществами.
Кроме того, более низкие концентрации питательных веществ в культуральной среде и добавление в стационарном состоянии, достигаемые раскрытыми системами и способами, позволяют снизить посттрансляционную модификацию белков и моноклональных антител. В одном варианте реализации раскрытые способы и системы обеспечивают введение питательных веществ около или со скоростью, с которой питательные вещества поглощаются или потребляются клетками в культуре. Постоянное добавление малых доз питательных веществ с течением времени позволяет получать биопродукты, имеющие более низкие уровни посттрансляционных модификаций, например, более низкие уровни гликирования, по сравнению со стандартной болюсной подпиткой. Важно, что постоянное добавление пониженных концентраций питательных веществ не влияет на выработку антител. В одном варианте реализации уменьшенные концентрации питательных веществ обеспечивают уменьшение посттрансляционной модификации на целых 30% по сравнению с посттрансляционными модификациями, наблюдаемыми при стандартной болюсной подпитке. В другом варианте реализации уменьшенные концентрации питательных веществ обеспечивают уменьшение посттрансляционной модификации на целых 40% по сравнению с посттрансляционными модификациями, наблюдаемыми при стандартной болюсной подпитке. В еще одном варианте реализации уменьшенные концентрации питательных веществ обеспечивают уменьшение посттрансляционной модификации на целых 50% по сравнению с посттрансляционными модификациями, наблюдаемыми при стандартной болюсной подпитке.
Биореакторные системы.
Другой вариант реализации обеспечивает системы для мониторинга и контроля одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток биореактора. Несколько компонентов интегрированы в единую систему с одним пользовательским интерфейсом. Ссылаясь на фиг. 2, рамановский анализатор 200 может быть функционально подключен к биореактору 300. В этом аспекте рамановский зонд может быть вставлен в биореактор 300 для получения необработанных спектральных данных одной или нескольких переменных процесса, например, концентрации питательных веществ, в культуре клеток. Рамановский анализатор 200 также может быть функционально подключен к компьютерной системе 500, так что полученные необработанные спектральные данные могут быть получены и обработаны.
Компьютерная система 500 обычно может быть реализована с использованием одной или нескольких программируемых компьютерных систем общего назначения, таких как встроенные процессоры, системы на чипе, персональные компьютеры, рабочие станции, серверные системы и мини-ЭВМ или мэйнфрейм-компьютеры или в распределенных сетевых вычислительных средах. Компьютерная система 500 может включать один или несколько процессоров (CPU) 502A-502N, схему 504 ввода/вывода, сетевой адаптер 506 и память 508. CPU 502A-502N выполняют программные инструкции для выполнения функций настоящих систем и способов. Как правило, процессоры CPU 502A-502N представляют собой один или несколько микропроцессоров, например, процессор INTEL CORE®.
Схема 504 ввода/вывода обеспечивает возможность ввода или вывода данных из компьютерной системы 500. Например, схема ввода/вывода может включать устройства ввода, такие как клавиатуры, мыши, сенсорные панели, трекболы, сканеры, аналого-цифровые преобразователи и т.д., устройства вывода, такие как видеоадаптеры, мониторы, принтеры и т.д., и устройства ввода/вывода, такие как модемы и т.д. Сетевой адаптер 506 связывает устройство 500 с сетью 510. Сеть 510 может быть любой общедоступной или проприетарной локальной или глобальной сетью, включая, но не ограничиваясь этим, Интернет.
Память 508 хранит программные инструкции, которые выполняются и данные, которые используются и обрабатываются процессором 502 для выполнения функций компьютерной системы 500. Память 508 может включать, например, электронные запоминающие устройства, такие как оперативное запоминающее устройство (RAM), постоянное запоминающее устройство (ROM), программируемое постоянное запоминающее устройство (PROM), электрически стираемое программируемое постоянное запоминаю
- 7 042735 щее устройство (EEPROM), флэш-память и т.д. и электромеханическую память, такую как магнитные дисководы, ленточные накопители, оптические дисководы и т.д., которые могут использовать встроенные интерфейсные накопители (IDE) или их изменения или расширения, такие как расширенный IDE (EIDE) или ультра-прямой доступ к памяти (UDMA), или интерфейс на основе интерфейса небольшой компьютерной системы (SCSI), или их разновидность или усовершенствование, такие как быстрый-SCSI, широкий-SCSI, быстрый и широкий-SCSI и т.д., или последовательный интерфейс обмена данными с накопителями информации (SATA), или их разновидность или усовершенствование, или интерфейс ответвления волоконно-оптического канала с арбитражной логикой (FC-AL).
Память 508 может включать контроллер регулярных операций 512, контроллер данных 514 и операционную систему 520. Контроллер регулярных операций 512 может включать программный продукт регулярных операций для обеспечения работы одного или нескольких контроллеров. Контроллер данных 514 может включать данные, необходимые контроллеру регулярных операций 512 для выполнения обработки. В одном варианте реализации контроллер регулярных операций 512 может включать мультивариантное программное обеспечение для выполнения мультивариантного анализа, такого как. модель регрессии ДНК. В этом аспекте контроллер регулярных операций 512 может включать SLMCA-QPp (MKS Data Analytic Solutions, Umea, Sweden) для выполнения хемометрического моделирования ДНК. В другом варианте реализации контроллер регулярных операций 512 также может включать программное обеспечение для выполнения шумоподавления для набора данных. В этом аспекте контроллер регулярных операций 512 может включать MATLAB Runtime (The Mathworks Inc., Natick, MA) для выполнения моделей фильтра шумоподавления. Кроме того, контроллер регулярных операций 512 может включать программное обеспечение, такое как MATLAB Runtime, для работы с автоматическим контроллером обратной связи, например, контроллером ПИД. Программное обеспечение для управления автоматическим контроллером обратной связи должно быть способно рассчитать разницу между предварительно заданным значением и измеренной переменной процесса (например, измеренной концентрацией питательных веществ) и автоматически применить точную коррекцию. Соответственно, компьютерная система 500 также может быть оперативно соединена с питательным насосом 400, так что корректирующее количество питательного вещества может быть закачано в биореактор 300.
Раскрытые системы могут контролировать и мониторить переменные процесса в одном биореакторе или множестве биореакторов. В одном варианте реализации система может контролировать и мониторить переменные процесса по меньшей мере в двух биореакторах. В другом варианте реализации система может контролировать и мониторить переменные процесса по меньшей мере в трех биореакторах или по меньшей мере в четырех биореакторах. Например, система может контролировать до четырех биореакторов в 1 ч.
Примеры
Следующие неограничивающие примеры демонстрируют способы контроля одной или нескольких переменных процесса в культуре клеток биореактора в соответствии с настоящим изобретением. Примеры являются просто иллюстрацией предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение, объем которого определяется прилагаемой формулой изобретения.
Пример 1.
Материалы и способы.
В процессе культивирования клеток млекопитающих использовали клеточную линию яичника китайского хомячка (СНО), выращенную в химически определенной базальной среде. Производство осуществлялось в экспериментальном 60-л биореакторе из нержавеющей стали с программным обеспечением RSLogix 5000 (Rockwell Automation, Inc. Milwaukee, WI).
Сбор данных для модели включал спектральные данные с анализаторов Kaiser RamanRXN2 и RamanRXN4 (Kaiser Optical Systems, Inc.Ann Arbor, MI) с использованием оптики BIO-PRO (Kaiser Optical Systems, Inc.Ann Arbor, MI). Рабочие параметры анализаторов RamanRXN2 и RamanRXN4 были установлены на время сканирования 10 с для 75 накоплений. ОРС Reader/Writer для RSLinx OPC Server был использован для передачи данных.
SIMCA 13 (MKS Data Analytic Solutions, Umea, Sweden) использовали для корреляции пиков в спектральных данных с измерениями глюкозы в автономном режиме. Последующая спектральная фильтрация была выполнена на необработанных спектральных данных: 1-я производная со сглаживанием точки 21 см-1 для удаления изменяющихся базовых линий и нормализации стандартной нормальной вариации (СНВ) для корректировки изменения мощности лазера и времени воздействия.
Регрессионная модель частичных наименьших квадратов была создана с соответствующими автономными измерениями, выполненными на Nova Bioprofile Flex (Nova Biomedical, Waltham, MA). В табл. 1А ниже приведены детальные данные хемометрической модели регрессии методом дробных наименьших квадратов значений концентрации питательных веществ.
- 8 042735
Таблица 1А
Детальные данные хемометрической модели регрессии методом дробных наименьших квадратов значений концентрации питательных веществ
| Переменная концентрации питательных веществ модели ДНК | Значение |
| Наблюдения | 223 |
| Диапазон длин волн (см-1) | 350-3100 |
| Диапазон концентрации питательных веществ (г/л) | 0,65-8,63 |
| RMSEE (среднеквадратичная погрешность оценки) | 0,430 |
| RSMECV (среднеквадратичная погрешность перекрестной проверки) | 0,662 |
| R2X | 0,982 |
| Q2 | 0,869 |
Также были выполнены способы обработки сигналов, в частности, фильтрация шумоподавления. Техника шумоподавления объединила необработанное измерение с оценкой на основе модели того, что измерение должно дать в соответствии с моделью. Используя итеративный подход, он позволяет обновлять отфильтрованное измерение на основе предыдущего измерения и текущих условий процесса.
Использовали обратнодействующее пропорционально-интегрально-дифференциальное (ПИД) регулирование, имеющее алгоритм, запрограммированный отдельно в MATLAB Runtime (The Mathworks Inc., Natick, MA). Все переменные ПИД-регулятора, такие как константы настройки, могут изменяться в режиме реального времени из интерфейса платформы.
Результаты.
Фиг. 3 показывает прогнозируемое значение процесса питания, подтвержденные автономными образцами питательных веществ. Как видно из фиг. 3, рамановский анализатор и хемометрическая модель предсказывали значения концентрации питательных веществ в пределах изменчивости автономного аналитического способа. Это демонстрирует, что рамановская спектроскопия in situ и хемометрическое моделирование в соответствии со способами настоящего изобретения обеспечивают точные измерения значений концентрации питательных веществ.
Фиг. 4 показывает отфильтрованные конечные значения процесса подачи питательных веществ после способа обработки сигнала. Как видно из фиг. 4, способ обработки сигнала уменьшает шум исходных прогнозированных значений процесса питания. Фильтрация прогнозируемых значений питательных веществ с помощью шумоподавления повышает надежность всей системы контроля с обратной связью.
Фиг. 5 показывает прогнозируемые значения процесса подачи питательных веществ и отфильтро ванные конечные значения процесса подачи питательных веществ после сдвига в предварительно определенном заданном значении концентрации питательных веществ в партии с непрерывной подпиткой с контролируемой обратной связью. Как видно из корректировки значений отфильтрованного процесса подачи питательных веществ, успешный отклик от контроллера обратной связи наблюдается, когда происходит сдвиг в значении концентрации питательных веществ. Действительно, ПИД-регулятор был способен быстро реагировать на изменение заданного значения, оперируя отфильтрованным значением шума питательных веществ процесса.
На основании результатов, показанных на фиг. 3-5, способы настоящего изобретения предоставляют данные в реальном времени, которые обеспечивают автоматическое управление с обратной связью для непрерывного и постоянного добавления питательных веществ.
Пример 2.
Материалы и способы.
Производство осуществлялось в отдельных биореакторах объемом 250 л. Была создана модель регрессии методом дробных наименьших квадратов. В табл. 1В ниже приведены детальные данные хемометрической модели регрессии методом дробных наименьших квадратов значений концентрации питательных веществ.
- 9 042735
Таблица 1В
Детальные данные хемометрической модели регрессии методом дробных наименьших квадратов значений концентрации питательных веществ
| Переменная концентрации питательных веществ модели ДНК | Значение |
| Наблюдения | 147 |
| Диапазон длин волн (см-1) | 350-3100 |
| Диапазон концентрации питательных веществ (г/л) | 0,6-3,61 |
| RMSEE (среднеквадратичная погрешность оценки) | 0,352 |
| RSMECV (среднеквадратичная погрешность перекрестной проверки) | 0,520 |
| R2X | 0,769 |
| Q2 | 0,617 |
Методы шумоподавления не использовались в этом примере.
Результаты.
Фиг. 6 показывает влияние концентрации глюкозы на посттрансляционные модификации. Как видно из фиг. 6, чем выше концентрация глюкозы, тем выше процент ПТМ. Данные на фиг. 6 для нормализованного % посттрансляционных модификаций (ПТМ) и концентрации глюкозы в день исследования серии показаны в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Нормализованный % ПТМ и данные концентрации глюкозы для фиг. 6
| Время (часы) | % ПТМ | Концентрация глюкозы | Нормализованный % ПТМ | Концентрация глюкозы (г/л) |
| 192 | 18,7 | 4,83 | 0,623333333 | 4,83 |
| 192 | 20,4 | 9,75 | 0,68 | 9,75 |
| 195 | 20,6 | 8,4 | 0,686666667 | 8,4 |
| 198 | 20,2 | 8,3 | 0.673333333 | 8,3 |
| 200 | 16,2 | 7,68 | 0,54 | 7,68 |
| 214 | 16,6 | 3,96 | 0,553333333 | 3,96 |
| 214 | 17,7 | 9,34 | 0,59 | 9,34 |
| 220 | 17,4 | 9,09 | 0.58 | 9,09 |
| 223 | 17,5 | 8,03 | 0,583333333 | 8,03 |
| 225 | 20,9 | 7,68 | 0,696666667 | 7,68 |
| 238 | 21,5 | 4,56 | 0,716666667 | 4,56 |
| 238 | 22,3 | 8,22 | 0,743333333 | 8,22 |
| 243 | 21,8 | 7,78 | 0.726666667 | 7,78 |
| 246 | 23,1 | 7,19 | 0,77 | 7,19 |
| 248 | 18,6 | 7,08 | 0,62 | 7,08 |
| 267 | 17 | 4,11 | 0,566666667 | 4,11 |
| 291 | 19,1 | 3,3 | 0.636666667 | 3,3 |
| 310 | 19,4 | 4,62 | 0,646666667 | 4,62 |
| 315 | 19 | 4,55 | 0,633333333 | 4,55 |
| 318 | 24 | 4,23 | 0,8 | 4,23 |
| 320 | 24,7 | 4 | 0,823333333 | 4 |
| 334 | 26 | 2,53 | 0,866666667 | 2,53 |
| 340 | 25,3 | 2,15 | 0,843333333 | 2,15 |
| 343 | 25,9 | 1,86 | 0,863333333 | 1,86 |
| 345 | 20,7 | 1,67 | 0,69 | 1,67 |
| 357 | 19,7 | 0,59 | 0,656666667 | 0,59 |
| 358 | 20,2 | 11,18 | 0,673333333 | 11,18 |
| 362 | 20,6 | 10,34 | 0,686666667 | 10,34 |
| 366 | 20,5 | 10,31 | 0,683333333 | 10,31 |
| 381 | 25,9 | 7,74 | 0.863333333 | 7,74 |
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий предсказанные рамановской спектроскопией in situ значения концентрации глюкозы при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами. Черная жирная линия на фиг. 7 представляет предварительно определенное заданное значение. Предварительно определенное заданное значение (ЗЗ1) первоначально было установлено на уровне 3 г/л (ЗЗ1) и было увеличено до 5 г/л (ЗЗ2). Как видно из фиг. 7, предсказанные рамановской спектроскопией концентрации глюкозы точно скорректированы во время сдвига в заранее заданных значениях. Данные наблюдений на фиг. 7 для рамановских значений концентрации глюкозы в день исследования серии показаны в табл. 3 ниже.
- 10 042735
Таблица 3
Данные концентрации глюкозы, прогнозируемые раманом для фиг. 7
| Время (контроль с обратной связью по глюкозе) (прошедшие дни) | Рамановская концентрация глюкозы с обратной связью (г/л) | Время (болюсная подпитка глюкозой) (прошедшие дни) | Рамановская концентрация при болюсной подпитке (г/л) |
| 2 | 5,27449 | 2 | #н/д |
| 2,023263889 | 6,057528 | 2,023263889 | #н/д |
| 2,044097222 | 6,093102 | 2,044097222 | #н/д |
| 2,064930556 | 6,030814 | 2,064930556 | #н/д |
| 2,085763889 | 5,928053 | 2,085763889 | #н/д |
| 2,106597222 | 6,112341 | 2,106597222 | #н/д |
| 2,127430556 | 5,877689 | 2,127430556 | #н/ц |
| 2,148263889 | 5,881066 | 2,148263889 | #н/д |
| 2,169097222 | 5,929256 | 2,169097222 | #н/д |
| 2,189930556 | 5,928593 | 2,189930556 | #н/д |
| 2,210763889 | 5,929407 | 2,210763889 | #н/д |
| 2,231597222 | 5,672209 | 2,231597222 | #н/д |
| 2,252430556 | 5,796999 | 2,252430556 | #н/д |
| 2,273263889 | 5,572541 | 2,273263889 | #н/д |
| 2,294097222 | 5,771776 | 2,294097222 | #н/д |
| 2,31494213 | 5,521614 | 2,31494213 | #н/д |
| 2,335775463 | 5,630873 | 2,335775463 | #н/д |
| 2,356608796 | 5,53435 | 2,356608796 | #н/д |
| 2,37744213 | 5,628556 | 2,37744213 | #н/д |
| 2,398275463 | 5,575116 | 2,398275463 | #н/д |
| 2,419108796 | 5,675688 | 2,419108796 | #н/д |
| 2,43994213 | 5,356216 | 2,43994213 | #н/д |
| 2,460775463 | 5,019809 | 2,460775463 | #н/д |
| 2,481608796 | 5,571718 | 2,481608796 | #н/д |
| 2,50244213 | 5,424471 | 2,50244213 | #н/д |
| 2,523275463 | 4,974746 | 2,523275463 | #н/д |
| 2,544108796 | 5,105621 | 2,544108796 | #н/д |
| 2,56494213 | 4,882367 | 2,56494213 | #н/д |
| 2,585775463 | 5,156937 | 2,585775463 | #н/д |
| 2,606608796 | 4,882068 | 2,606608796 | #н/д |
| 2,62744213 | 5,054303 | 2,62744213 | #н/д |
| 2,648275463 | 5,034556 | 2,648275463 | 6,109157 |
| 2,669108796 | 4,835382 | 2,669108796 | 5,83853 |
| 2,689953704 | 5,057273 | 2,689953704 | 6,071649 |
| 2,710787037 | 4,504433 | 2,710787037 | 6.257731 |
| 2,73162037 | 4,725886 | 2,73162037 | 5.978051 |
| 2,752453704 | 4,707865 | 2,752453704 | 5,687498 |
| 2,773275463 | 4,474821 | 2,773275463 | 5,510823 |
| 2,794108796 | 4,595435 | 2,794108796 | 5,745687 |
| 2,814953704 | 4,846455 | 2,814953704 | 5.493782 |
| 2,835787037 | 4,349487 | 2,835787037 | 5.420269 |
| 2,85662037 | 4,623514 | 2,85662037 | 5,677184 |
| 2,877453704 | 4,35981 | 2,877453704 | 5,499728 |
| 2,898287037 | 4,580013 | 2,898287037 | 5,273839 |
| 2,91912037 | 4,233418 | 2,91912037 | 5.523314 |
| 2,939953704 | 4,033472 | 2,939953704 | 5.601781 |
| 2,960787037 | 3,875247 | 2,960787037 | 5,556786 |
| 3,0009375 | 4,083802 | 3,0009375 | 5,661055 |
| 3,023287037 | 3,564172 | 3,023287037 | 5,20255 |
| 3,04412037 | 3,788096 | 3,04412037 | 5.251106 |
| 3,064953704 | 3,721753 | 3,064953704 | 5.24757 |
| 3,12525463 | 3,615655 | 3,12525463 | 5.073968 |
| 3,166898148 | 3,759606 | 3,166898148 | 5.125836 |
| 3,208564815 | 3,402011 | 3,208564815 | 5.700113 |
| 3,250231481 | 3,312303 | 3,250231481 | 5.346854 |
- 11 042735
| 3,291898148 | 3,384652 | 3,291898148 | 5,366998 |
| 3,333553241 | 2,754262 | 3,333553241 | 5.469024 |
| 3,416898148 | 2,657981 | 3,416898148 | 4,906005 |
| 3,458564815 | 2,661131 | 3,458564815 | 4,953602 |
| 3,500231481 | 2,683549 | 3,500231481 | 5,018805 |
| 3,541909722 | 2,315241 | 3,541909722 | 5,040889 |
| 3,583564815 | 2,470533 | 3,583564815 | 4.669607 |
| 3,625243056 | 2,895316 | 3,625243056 | 4,677879 |
| 3,666909722 | 3,167133 | 3,666909722 | 4,748203 |
| 3,708564815 | 2,959319 | 3,708564815 | 4.306628 |
| 3,750243056 | 3,334286 | 3,750243056 | 4,003834 |
| 3,791898148 | 3,10766 | 3,791898148 | 4,363513 |
| 3,833587963 | 3,058263 | 3,833587963 | 4,014596 |
| 3,875243056 | 2,723771 | 3,875243056 | 4,028898 |
| 3,916909722 | 2,612081 | 3,916909722 | 4.080404 |
| 3,958576389 | 2,666911 | 3,958576389 | 3,442322 |
| 4,00025463 | 2,121485 | 4,00025463 | 3,755342 |
| 4,040208333 | 2,498356 | 4,040208333 | 3.691836 |
| 4,063460648 | 2,796938 | 4,063460648 | 3,801793 |
| 4,084293981 | 3,222628 | 4,084293981 | 3.397573 |
| 4,105127315 | 3,059871 | 4,105127315 | 3,198539 |
| 4,125960648 | 3,144483 | 4,125960648 | 6,444279 |
| 4,146793981 | 2,912629 | 4,146793981 | 6.634366 |
| 4,167627315 | 2,798553 | 4,167627315 | 6,147713 |
| 4,188460648 | 2,657885 | 4,188460648 | 6,247666 |
| 4,209305556 | 2,724152 | 4,209305556 | 6.187882 |
| 4,230127315 | 2,72257 | 4,230127315 | 6,114422 |
| 4,250960648 | 2,797554 | 4,250960648 | 5.93613 |
| 4,271793981 | 3,035758 | 4,271793981 | 5,516821 |
| 4,332094907 | 2,726879 | 4,332094907 | 5,486897 |
| 4,373726852 | 2,984358 | 4,373726852 | 5,457622 |
| 4,415405093 | 2,487146 | 4,415405093 | 5,381355 |
| 4,457060185 | 2,364557 | 4,457060185 | 5,195489 |
| 4,498738426 | 2,894607 | 4,498738426 | 4.731695 |
| 4,540393519 | 3,171245 | 4,540393519 | 4,725901 |
| 4,623738426 | 3,579278 | 4,623738426 | 4.398326 |
| 4,665405093 | 3,227408 | 4,665405093 | 4,601714 |
| 4,707071759 | 2,769516 | 4,707071759 | 3,739007 |
| 4,74875 | 3,303736 | 4,74875 | 4,125107 |
| 4,810706019 | 2,604359 | 4,810706019 | 3,918031 |
| 4,833958333 | 2,666446 | 4,833958333 | 3.87917 |
| 4,854791667 | 2,436089 | 4,854791667 | 3,812785 |
| 4,875625 | 2,365274 | 4,875625 | #н/д |
| 4,896458333 | 3,052339 | 4,896458333 | #н/д |
| 4,917291667 | 3,356655 | 4,917291667 | #н/д |
| 4,938125 | 3,536857 | 4,938125 | #н/д |
| 4,958958333 | 3,254377 | 4,958958333 | 8,184118 |
| 4,979803241 | 2,647855 | 4,979803241 | 7,679708 |
| 5,000625 | 2,479576 | 5,000625 | 7.4381 |
| 5,021458333 | 3,108576 | 5,021458333 | 6,956085 |
| 5,042291667 | 2,733165 | 5,042291667 | 6,785896 |
| 5,063136574 | 2,161332 | 5,063136574 | 6.765765 |
| 5,083958333 | 2,115124 | 5,083958333 | 6,793903 |
| 5,104803241 | 2,617033 | 5,104803241 | 6.765692 |
| 5,125636574 | 2,554023 | 5,125636574 | 6,222265 |
| 5,146458333 | 2,480167 | 5,146458333 | 6,749342 |
| 5,167291667 | 2,715101 | 5,167291667 | 5.725123 |
| 5,188136574 | 2,735876 | 5,188136574 | 5,549073 |
| 5,208969907 | 2,725627 | 5,208969907 | 5,06423 |
| 5,229803241 | 2,575811 | 5,229803241 | 5.338056 |
| 5,250636574 | 2,212894 | 5,250636574 | 5,471513 |
| 5,271458333 | 2,233998 | 5,271458333 | 5.151946 |
| 5,292303241 | 2,213399 | 5,292303241 | 5,546629 |
| 5,313136574 | 2,766555 | 5,313136574 | 5,259173 |
| 5,333969907 | 2,52938 | 5,333969907 | 4,601235 |
| 5,354803241 | 2,933614 | 5,354803241 | 4,772757 |
| 5,375636574 | 3,028033 | 5,375636574 | 4,52338 |
| 5,396469907 | 3,41555 | 5,396469907 | 4.513873 |
- 12 042735
| 5,417303241 | 3,193063 | 5,417303241 | 4,173473 |
| 5,438136574 | 3,138092 | 5,438136574 | 3.831865 |
| 5,458981481 | 2,893515 | 5,458981481 | 3,9247 |
| 5,479814815 | 3,43812 | 5,479814815 | 3,336164 |
| 5,500636574 | 3,013834 | 5,500636574 | 3,628655 |
| 5,521469907 | 3,132246 | 5,521469907 | 3,92468 |
| 5,542314815 | 3,046817 | 5,542314815 | 7.176596 |
| 5,563148148 | 3,078321 | 5,563148148 | 6,633468 |
| 5,583981481 | 2,615919 | 5,583981481 | 6,08785 |
| 5,604803241 | 2,751108 | 5,604803241 | 6.244726 |
| 5,625636574 | 2,824868 | 5,625636574 | 5.927638 |
| 5,646469907 | 2,517154 | 5,646469907 | 7,42588 |
| 5,667314815 | 1,988747 | 5,667314815 | 6,687646 |
| 5,688148148 | 2,344756 | 5,688148148 | 7,307424 |
| 5,708969907 | 3,218347 | 5,708969907 | 6.437283 |
| 5,729814815 | 2,85646 | 5,729814815 | 5,960429 |
| 5,750648148 | 2,43488 | 5,750648148 | 6,032461 |
| 5,771493056 | 2,792278 | 5,771493056 | 6.137525 |
| 5,811608796 | 2,982295 | 5,811608796 | 6.469258 |
| 5,833981481 | 2,991141 | 5,833981481 | 6.484286 |
| 5,854814815 | 3,201134 | 5,854814815 | 5,838443 |
| 5,875659722 | 2,563264 | 5,875659722 | 5,693282 |
| 5,896481481 | 2,42295 | 5,896481481 | 6.134384 |
| 5,917314815 | 2,673206 | 5,917314815 | 5,663696 |
| 5,938148148 | 2,654685 | 5,938148148 | 5,459308 |
| 5,958981481 | 2,747516 | 5,958981481 | 5.10138 |
| 5,979814815 | 2,548837 | 5,979814815 | 5,754516 |
| 6,019282407 | 2,525679 | 6,019282407 | 4.844961 |
| 6,060914352 | 2,808173 | 6,060914352 | 5,415936 |
| 6,102592593 | 2,547346 | 6,102592593 | 5,179432 |
| 6,144259259 | 2,485466 | 6,144259259 | 4,849273 |
| 6,185925926 | 2,707999 | 6,185925926 | 4,904904 |
| 6,227592593 | 3,150225 | 6,227592593 | 4,450798 |
| 6,269259259 | 2,60164 | 6,269259259 | 4.495592 |
| 6,310925926 | 2,741736 | 6,310925926 | 3,395906 |
| 6,352592593 | 2,407971 | 6,352592593 | 4.206471 |
| 6,394259259 | 1,757518 | 6,394259259 | 3,473652 |
| 6,435925926 | 2,549188 | 6,435925926 | 3,669552 |
| 6,477604167 | 3,543268 | 6,477604167 | 8,226236 |
| 6,519270833 | 3,739929 | 6,519270833 | 8,798409 |
| 6,5609375 | 3,384398 | 6,5609375 | 8.077047 |
| 6,602604167 | 3,33986 | 6,602604167 | 7,873461 |
| 6,644270833 | 2,969001 | 6,644270833 | 7,76911 |
| 6,6859375 | 2,726888 | 6,6859375 | 7.415218 |
| 6,727604167 | 2,846601 | 6,727604167 | 6.526413 |
| 6,769270833 | 2,275316 | 6,769270833 | 6,82022 |
| 6,8109375 | 2,198233 | 6,8109375 | 6,822738 |
| 6,852615741 | 3,320418 | 6,852615741 | 6,629892 |
| 6,894282407 | 3,746778 | 6,894282407 | 6.207532 |
| 6,935949074 | 3,943445 | 6,935949074 | 6,731417 |
| 6,977615741 | 3,363937 | 6,977615741 | 5,485258 |
| 7,019282407 | 2,890475 | 7,019282407 | 6.309702 |
| 7,060949074 | 3,262214 | 7,060949074 | 5.860365 |
| 7,102615741 | 2,954454 | 7,102615741 | 5.880978 |
| 7,144282407 | 2,153391 | 7,144282407 | 5,84526 |
| 7,185960648 | 2,378666 | 7,185960648 | 5,735903 |
| 7,227662037 | 2,9512 | 7,227662037 | 5.541218 |
| 7,269293981 | 3,551366 | 7,269293981 | 5,192567 |
| 7,310960648 | 3,218829 | 7,310960648 | 9,177272 |
| 7,352627315 | 3,12968 | 7,352627315 | 8.703374 |
| 7,394293981 | 2,593928 | 7,394293981 | 8,983128 |
| 7,435960648 | 2,394028 | 7,435960648 | 8.965026 |
| 7,477627315 | 2,21824 | 7,477627315 | 8,120359 |
| 7,519293981 | 3,134434 | 7,519293981 | 8,137175 |
| 7,560960648 | 2,766007 | 7,560960648 | 8,314145 |
| 7,602627315 | 2,512249 | 7,602627315 | 8,698809 |
| 7,644305556 | 2,630357 | 7,644305556 | 8,641541 |
| 7,685972222 | 2,416168 | 7,685972222 | 8.071362 |
- 13 042735
| 7,727638889 | 2,661644 | 7,727638889 | 8,489848 |
| 7,769305556 | 2,79807 | 7,769305556 | 8.062885 |
| 7,810960648 | 2,972875 | 7,810960648 | 7,448528 |
| 7,852638889 | 2,41065 | 7,852638889 | 8,106278 |
| 7,894305556 | 2,495323 | 7,894305556 | 7,770178 |
| 7,935972222 | 2,934737 | 7,935972222 | 8,291804 |
| 7,977638889 | 2,847816 | 7,977638889 | 7.42387 |
| 8,01931713 | 3,15902 | 8,01931713 | 8,205845 |
| 8,060983796 | 3,667069 | 8,060983796 | 7,910364 |
| 8,102638889 | 3,282952 | 8,102638889 | 7.724277 |
| 8,14431713 | 2,793275 | 8,14431713 | 7,616001 |
| 8,185983796 | 2,452958 | 8,185983796 | 7,379514 |
| 8,227650463 | 2,630365 | 8,227650463 | 7,477386 |
| 8,26931713 | 2,729709 | 8,26931713 | 6,807137 |
| 8,310983796 | 2,807003 | 8,310983796 | 6.842168 |
| 8,352650463 | 2,620657 | 8,352650463 | 9,308379 |
| 8,39431713 | 3,13093 | 8,39431713 | 8,968605 |
| 8,436030093 | 2,627208 | 8,436030093 | 9.14572 |
| 8,477662037 | 2,251114 | 8,477662037 | 8,747909 |
| 8,51931713 | 2,646687 | 8,51931713 | 8.726134 |
| 8,56099537 | 3,079137 | 8,56099537 | 8,391006 |
| 8,602662037 | 2,563705 | 8,602662037 | 8,450653 |
| 8,644328704 | 3,087527 | 8,644328704 | 7.990832 |
| 8,68599537 | 2,590317 | 8,68599537 | 8,18066 |
| 8,727662037 | 2,968817 | 8,727662037 | 7,942457 |
| 8,769340278 | 3,12238 | 8,769340278 | 7.713663 |
| 8,811006944 | 3,547524 | 8,811006944 | 8,415674 |
| 8,852673611 | 4,297379 | 8,852673611 | 7.626019 |
| 8,894340278 | 4,161104 | 8,894340278 | 8,069413 |
| 8,936018519 | 5,030762 | 8,936018519 | 8,045293 |
| 8,977673611 | 5,637126 | 8,977673611 | 8,527124 |
| 9,019351852 | 5,298599 | 9,019351852 | 7,610373 |
| 9,061006944 | 4,932112 | 9,061006944 | 7,099549 |
| 9,102685185 | 5,059932 | 9,102685185 | 7.573514 |
| 9,144351852 | 4,555223 | 9,144351852 | 7,538042 |
| 9,186018519 | 4,263374 | 9,186018519 | 7.441958 |
| 9,227685185 | 4,428963 | 9,227685185 | 7,639114 |
| 9,269351852 | 4,978399 | 9,269351852 | 6,761559 |
| 9,311018519 | 5,80515 | 9,311018519 | 7,284119 |
| 9,352685185 | 5,421699 | 9,352685185 | 7,794689 |
| 9,394351852 | 5,041867 | 9,394351852 | 9.245949 |
| 9,436018519 | 4,245652 | 9,436018519 | 10,85137 |
| 9,477685185 | 4,627719 | 9,477685185 | 10,59078 |
| 9,519363426 | 5,043918 | 9,519363426 | 10,01031 |
| 9,561030093 | 5,134606 | 9,561030093 | 9,805758 |
| 9,602696759 | 4,84806 | 9,602696759 | 10,12079 |
| 9,644398148 | 3,838338 | 9,644398148 | 10,16871 |
| 9,686030093 | 4,53542 | 9,686030093 | 9,679668 |
| 9,727696759 | 4,92595 | 9,727696759 | 9.62599 |
| 9,769351852 | 4,769973 | 9,769351852 | 9,378336 |
| 9,811030093 | 5,17225 | 9,811030093 | 10,05829 |
| 9,852696759 | 4,80986 | 9,852696759 | 8.640112 |
| 9,894363426 | 5,148977 | 9,894363426 | 9,457369 |
| 9,936030093 | 4,672589 | 9,936030093 | 9.403243 |
| 9,977708333 | 4,188494 | 9,977708333 | 9,422581 |
| 10,019375 | 4,707168 | 10,019375 | 9,496971 |
| 10,06104167 | 4,721385 | 10,06104167 | 8.947212 |
| 10,10269676 | 4,783384 | 10.10269676 | 8,878696 |
| 10,144375 | 4,512029 | 10,144375 | 9,005632 |
| 10,18604167 | 4,258463 | 10,18604167 | 8.788143 |
| 10,22770833 | 4,029292 | 10,22770833 | 8,814812 |
| 10,269375 | 4,322887 | 10,269375 | 8.966389 |
| 10,31104167 | 4,08165 | 10,31104167 | 8,892519 |
| 10,35265046 | 4,958148 | 10.35265046 | 9,361223 |
| 10,394375 | 5,847916 | 10,394375 | 8,628824 |
| 10,43604167 | 6,32333 | 10,43604167 | 8,199861 |
| 10,47770833 | 6,265306 | 10,47770833 | 7,797361 |
| 10,51938657 | 5,801625 | 10,51938657 | 8.34846 |
- 14 042735
| 10,56104167 | 5,735916 | 10,56104167 | 9.992476 |
| 10,60271991 | 5,45328 | 10,60271991 | 10,55201 |
| 10,64438657 | 5,33565 | 10.64438657 | 10,78163 |
| 10,68605324 | 5,542859 | 10,68605324 | 10,40103 |
| 10,72771991 | 5,033404 | 10,72771991 | 9,900923 |
| 10,76938657 | 4,913043 | 10,76938657 | 9.858058 |
| 10,81105324 | 5,076824 | 10,81105324 | 10,93733 |
| 10,85275463 | 4,666098 | 10.85275463 | 10,56453 |
| 10,89439815 | 4,554989 | 10,89439815 | 10,63292 |
| 10,93605324 | 4,729548 | 10,93605324 | 10,1317 |
| 10,97771991 | 4,089445 | 10,97771991 | 10,15173 |
| 11,01938657 | 3,973743 | 11,01938657 | 10,03745 |
| 11,06105324 | 4,564354 | 11,06105324 | 9,908442 |
| 11,10273148 | 4,511001 | 11,10273148 | 9.87036 |
| 11,14439815 | 5,108614 | 11,14439815 | 10,1959 |
| 11,18606481 | 4,441917 | 11.18606481 | 9,519185 |
| 11,22773148 | 4,69673 | 11,22773148 | 9.621466 |
| 11,26939815 | 4,755281 | 11,26939815 | 10,03958 |
| 11,31106481 | 4,227083 | 11,31106481 | 8.765776 |
| 11,35273148 | 4,190309 | ||
| 11,39439815 | 4,416976 | ||
| 11,43606481 | 4,467027 | ||
| 11,47773148 | 5,739811 | ||
| 11,51939815 | 5,667678 | ||
| 11,56107639 | 5,399963 | ||
| 11,60273148 | 5,114323 | ||
| 11,64440972 | 5,493369 | ||
| 11,68607639 | 4,566129 | ||
| 11,72774306 | 4,238223 | ||
| 11,76940972 | 4,256388 | ||
| 11,81107639 | 3,624721 | ||
| 11,85274306 | 4,105767 | ||
| 11,89440972 | 5,08095 | ||
| 11,93607639 | 5,102737 | ||
| 11,97775463 | 5,012239 |
Фиг. 8 показывает титр антитела при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью и при болюсной подпитке питательными веществами. Как видно на фиг. 8, на выработку антитела не влияет ни один из способов. В приведенных ниже табл. 4 и 5 показаны данные титра антитела при болюсной подпитке и контрольного титра антитела с обратной связью, соответсвенно, для фиг. 8.
Таблица 4
Данные титра антитела при болюсной подпитке для фиг. 8
| Время болюсной подпитки (прошедшие дни) | Титр АЬ при болюсной подпитке (мг/л) | Титр нормализованного АЬ при болюсной подпитке |
| 0 | 0,866 | 0,000721667 |
| 0,831180556 | 2,362 | 0,001968333 |
| 1,668321759 | #Н/Д | #н/д |
| 2,614583333 | 32,606 | 0,027171667 |
| 3,625787037 | 89,425 | 0,074520833 |
| 4,531863426 | 148,02 | 0,12335 |
| 5,726122685 | 301,873 | 0,251560833 |
| 6,67775463 | 421,186 | 0,350988333 |
| 7,65849537 | 519,165 | 0,4326375 |
| 8,641284722 | 670,959 | 0,5591325 |
| 9,714537037 | #н/д | #Н/Д |
| 10,66090278 | #н/д | #Н/Д |
| 11,64418981 | #н/д | #Н/Д |
| 12,62819444 | 1158,82 | 0,965683333 |
Таблица 5
Данные титра антитела при подпитке с обратной связью для фиг. 8
| Время подпитки при регуляции с обратной связью | Титр АЬ при подпитке с обратной связью (мг/л) | Титр нормализованного АЬ при подпитке с обратной связью |
| 0 | #н/д | #н/д |
| 0,753171296 | 2,556 | 0,00213 |
| 1,749884259 | 15,36 | 0,0128 |
| 2,757048611 | 48,048 | 0,04004 |
| 3,710439815 | 105,017 | 0,087514167 |
| 4,757465278 | 205,669 | 0,171390833 |
| 5,814016204 | #н/д | #н/д |
- 15 042735
Фиг. 9 показывает нормализованный процент ПТМ как результат концентрации глюкозы. Как видно из фиг. 9, наблюдается снижение ПТМ при снижении концентрации глюкозы от примерно 6-8 г/л (заданное значение (33) для сбора при болюсной подпитке) до 5 г/л (заданное значение 2) до 3 г/л (заданное значение 1). Другими словами, снижение воздействия питательных веществ приводит к снижению ПТМ.
Данные на фиг. 9 для нормированного процента ПТМ показаны в табл. 6 ниже.
| 6,735243056 | 423,018 | 0,352515 |
| 7,729918981 | 543,108 | 0,45259 |
| 8,767893519 | 683,645 | 0,569704167 |
| 9,742418981 | 795,66 | 0,66305 |
| 10,70917824 | 913,834 | 0,761528333 |
| 11,73123843 | 1034,809 | 0,862340833 |
| 12,79594907 | 1134,383 | 0,945319167 |
Таблица 6
Данные нормализованного % ПТМ для фиг. 9
| Условие | % Посттрансляционных модификаций | Нормализованный % посттрансляционных модификаций |
| День -1 Увеличения 33 | 12,03 | 0,401 |
| День 0 Увеличения 33 | 11,79 | 0.393 |
| День 1 Увеличения 33 | 14,88 | 0,496 |
| День 2 Увеличения 33 | 16,48 | 0,549333333 |
| День 3 Увеличения 33 | 17,58 | 0,586 |
| День 4 Увеличения 33 | 20,63 | 0,687666667 |
| Сбор при болюсной подпитке | 27,2 | 0,906666667 |
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий концентрации глюкозы при непрерывной подпитке питательными веществами с контролируемой обратной связью в соответствии с настоящим изобретением и при болюсной подпитке питательными веществами. Как видно из фиг. 10, способы настоящего изобретения способны обеспечить пониженные, устойчивые концентрации глюкозы. Данные на фиг. 10 для концентраций глюкозы показаны в табл. 7 ниже.
Таблица 7
Данные концентрации глюкозы для фиг. 10
| Время (час) Контроль с обратной связью | Контроль с обратной связью концентрации глюкозы (г/л) | Время (ч) Болюсная подпитка | Концентрация глюкозы при болюсной подпитке |
| (г/л) | |||
| 0 | 5,29985 | 0 | 3,9606 |
| 0,443888889 | 3,95717 | 0,443888889 | 3,92564 |
| 0,888055556 | 3,87786 | 0,888055556 | 3,82241 |
| 1,331944444 | 3,94245 | 1,554444444 | 3,84826 |
| 1,554444444 | 3,88536 | 1,998333333 | 3,78432 |
| 1,998333333 | 3,88327 | 2,442222222 | 3,81402 |
| 2,442222222 | 3,84436 | 4,382222222 | 3,83029 |
| 2,886111111 | 3,7485 | 5,334444444 | 3,75084 |
| 3,589444444 | 6,98909 | 6,226666667 | 3,80185 |
| 4,157777778 | 3,83584 | 7,119166667 | 3,72134 |
| 5,11 | 3,78798 | 8,011388889 | 3,68723 |
| 6,0025 | 3,7856 | 8,900833333 | 3,71741 |
| 6,894722222 | 3,73533 | 20,45444444 | 3,40678 |
| 7,787222222 | 3,68673 | 30,1175 | 4,74804 |
| 8,679444444 | 3,66978 | 31,01027778 | 4,80446 |
| 20,23388889 | 3,40307 | 31,90277778 | 4,76064 |
| 21,12222222 | 3,40884 | 32,79527778 | 4,69968 |
| 21,56944444 | 3,37754 | 33,68777778 | 4,7881 |
| 29,72194444 | 3,11293 | 43,51138889 | 4,50823 |
| 30,78583333 | 3,15921 | 44,40333333 | 4,44888 |
| 31,67833333 | 3,08833 | 45,295 | 4,56108 |
| 32,57111111 | 2,95089 | 46,18777778 | 4,44496 |
| 33.46333333 | 3,04687 | 47,07722222 | 4,43893 |
| 34,35305556 | 2,90941 | 56,46 | 4,27974 |
| 43,2875 | 2,92864 | 57,35194444 | 4,30659 |
| 44,17888889 | 2,81226 | 58,24444444 | 4,29294 |
| 45,07138889 | 2,85354 | 59,13638889 | 4,18843 |
| 45,96333333 | 2,83553 | 60,02611111 | 4,13743 |
| 46.85583333 | 2,79272 | 69,4075 | 4,95997 |
| 56,23555556 | 2,67934 | 71,02194444 | 4,9194 |
| 57,12805556 | 2,67136 | 71,46583333 | 4,41552 |
| 58,02 | 2,57063 | 71,90972222 | 4,38365 |
| 58,91194444 | 2,54624 | 72,35361111 | 4,42239 |
- 16 042735
| 59,80472222 | 2,50303 | 73,02027778 | 4,31899 |
| 69,18361111 | 2,97555 | 73,46416667 | 4,37885 |
| 70,07583333 | 3,77294 | 73,90805556 | 4,3449 |
| 70,80111111 | 4,34847 | 74,35194444 | 4,23448 |
| 71,46583333 | 4,08935 | 75,01861111 | 4,24824 |
| 71,90972222 | 4,00212 | 75,4625 | 4,14202 |
| 72,35361111 | 3,99123 | 75,90638889 | 4,14761 |
| 72,7975 | 4,01331 | 76,35027778 | 4,07654 |
| 73,02027778 | 3,99191 | 77,01694444 | 4,04303 |
| 73,46416667 | 3,91424 | 77,46083333 | 4,10848 |
| 73,90805556 | 3,85688 | 77,90472222 | 4,02519 |
| 74,35194444 | 3,84475 | 78,34861111 | 3,97673 |
| 74,79583333 | 3,67941 | 79,01527778 | 3,97045 |
| 75,01861111 | 3,64752 | 79,45916667 | 3,99019 |
| 75,4625 | 3,66484 | 79,90305556 | 3,90772 |
| 75,90638889 | 3,6525 | 80,34694444 | 4,13212 |
| 76,35027778 | 3,55085 | 81,01361111 | 3.94071 |
| 76,79416667 | 3,45215 | 81,4575 | 3.93964 |
| 77,01694444 | 3,42771 | 81,90138889 | 3.93305 |
| 77,46083333 | 3,5292 | 82,34527778 | 3.90002 |
| 77,90472222 | 3,47243 | 83,01194444 | 3,78135 |
| 78,34861111 | 3,48275 | 83,45583333 | 3.80974 |
| 78,7925 | 3,44748 | 83,89972222 | 3.72092 |
| 79,01527778 | 3,51503 | 84,34361111 | 3.54584 |
| 79,45916667 | 3,40908 | 85,01055556 | 3,79766 |
| 79,90305556 | 3,4091 | 85,45472222 | 3.73607 |
| 80,34694444 | 3,40949 | 85,89861111 | 3,6327 |
| 80,79083333 | 3,37424 | 86,34277778 | 3,60241 |
| 81,01361111 | 3,66927 | 87,01 | 3,64506 |
| 81,4575 | 3,40708 | 87,45416667 | 3,4821 |
| 81,90138889 | 3,29053 | 87,89805556 | 3,49399 |
| 82,34527778 | 3,33054 | 88,34194444 | 3,50496 |
| 82,78916667 | 3,3244 | 89,00888889 | 3,53164 |
| 83,01194444 | 3,2331 | 89,45305556 | 3,31505 |
| 83,45583333 | 3,24332 | 89,89722222 | 3,27601 |
| 83,89972222 | 3,39759 | 90,34111111 | 3,33213 |
| 84,34361111 | 3,15861 | 91,00805556 | 3,43951 |
| 84,78777778 | 3,22317 | 91,45222222 | 3,38503 |
| 85,01055556 | 3,24632 | 91,89611111 | 3,1468 |
| 85,45472222 | 3,31019 | 92,34027778 | 3,4265 |
| 85,89861111 | 3,17534 | 93,00694444 | 3,24971 |
| 86,34277778 | 3,14291 | 93,45083333 | 3,19635 |
| 86,78694444 | 3,11793 | 93,895 | 3,27543 |
| 87,01 | 3,16349 | 94,33888889 | 3,09075 |
| 87,45388889 | 3,0751 | 95,24694444 | 2,49991 |
| 87,89805556 | 2,9869 | 95,69111111 | 2,57693 |
| 88,34194444 | 3,00619 | 96,135 | 2,5465 |
| 88,78583333 | 2,95103 | 96,57916667 | 4,02104 |
| 89,00888889 | 3,05399 | 97,02305556 | 3,98664 |
| 89,45305556 | 2,81784 | 97,46722222 | 3,95544 |
| 89,89694444 | 2,94564 | 97,91138889 | 3.86852 |
| 90,34111111 | 2,82913 | 98,35527778 | 3.66631 |
| 90,785 | 2,83378 | 99,0225 | 3.62051 |
| 91,00805556 | 2,91134 | 99,46638889 | 3.76868 |
| 91,45222222 | 3,09505 | 99,91027778 | 3,69577 |
| 91,89611111 | 2,86231 | 100,3544444 | 3.74638 |
| 92,34027778 | 2,95479 | 101,0216667 | 3.61072 |
| 92,78416667 | 2,84231 | 101,4655556 | 3.65232 |
| 93,00694444 | 2,81938 | 101,9094444 | 3,65673 |
| 93,45083333 | 2,79815 | 102,3536111 | 3.50981 |
| 93,895 | 2,83839 | 103,0205556 | 3,59905 |
| 94,33888889 | 2,93334 | 103,4647222 | 3,50056 |
| 95,02611111 | 2,94485 | 103,9086111 | 3,58028 |
| 95,69083333 | 3,01962 | 104,3525 | 3,51239 |
| 96,135 | 3,08518 | 105,0194444 | 3,35906 |
| 96,57888889 | 2,90996 | 105,4636111 | 3,46452 |
| 97,02305556 | 2,822 | 105,9077778 | 3,4217 |
| 97,46722222 | 2,60949 | 106,3516667 | 3,52777 |
- 17042735
| 97,91111111 | 2,98458 | 107,0186111 | 3,37968 |
| 98,35527778 | 2,99921 | 107,4627778 | 3,24786 |
| 98.79944444 | 2,89195 | 107,9066667 | 3,17432 |
| 99,02222222 | 2,88476 | 108,3508333 | 3,26832 |
| 99,46638889 | 2,80296 | 109,0180556 | 3,09402 |
| 99,91027778 | 2,81875 | 109,4619444 | 3,19621 |
| 100,3544444 | 2,88799 | 109,9061111 | 3,15208 |
| 100,7986111 | 2,7446 | 110,3502778 | 3,08408 |
| 101,0213889 | 2,71513 | 111,0169444 | 3,12704 |
| 101,4655556 | 2,62124 | 111,4611111 | 3,09169 |
| 101,9094444 | 2,7469 | 111,905 | 3,13017 |
| 102,3536111 | 2,6358 | 112,3488889 | 3,10825 |
| 102,7977778 | 2,64662 | 113,0161111 | 3,05118 |
| 103,0205556 | 2,64383 | 113,4602778 | 2,96148 |
| 103,4644444 | 2,48012 | 113,9041667 | 3,13752 |
| 103,9086111 | 2,56149 | 114,3483333 | 3,07076 |
| 104,3525 | 2,61773 | 115,0152778 | 2,97416 |
| 104,7966667 | 2,58291 | 115,4594444 | 3,11854 |
| 105,0194444 | 2,49816 | 115,9033333 | 3,01764 |
| 105,4636111 | 2,46984 | 117,2877778 | 6,00949 |
| 105,9075 | 2,5008 | 117,7316667 | 5,96736 |
| 106,3516667 | 2,47808 | 118,1758333 | 5,92612 |
| 106,7955556 | 2,24744 | 118,6194444 | 5,64293 |
| 107,0186111 | 2,57076 | 119,2863889 | 5,49402 |
| 107,4625 | 2,47027 | 119,7302778 | 5,43498 |
| 107,9066667 | 2,43396 | 120,1741667 | 5,47254 |
| 108,3508333 | 2,43259 | 120,6180556 | 5,28723 |
| 108,7947222 | 2,4977 | 121,2847222 | 5,26741 |
| 109,0177778 | 2,38829 | 121,7286111 | 5,17114 |
| 109,4619444 | 2,34725 | 122,1725 | 5,22748 |
| 109,9058333 | 2,22657 | 122,6163889 | 5,18455 |
| 110,35 | 2,27469 | 123,2830556 | 5,05853 |
| 110,7941667 | 2,3519 | 123,7269444 | 5,09368 |
| 111,0169444 | 2,28667 | 124,1708333 | 5,06618 |
| 111,4608333 | 2,29553 | 124,6147222 | 4,92785 |
| 111,905 | 2,30401 | 125,2813889 | 4,95126 |
| 112,3488889 | 2,1131 | 125,7252778 | 5,12272 |
| 112.7930556 | 2,05542 | 126,1694444 | 5,04657 |
| 113,0158333 | 2,15201 | 126,6133333 | 4,89878 |
| 113.46 | 2,15773 | 127,28 | 4,89227 |
| 113,9041667 | 2,1462 | 127,7236111 | 4,83168 |
| 114.3480556 | 2,0095 | 128,1675 | 4,73809 |
| 114.7922222 | 2,00685 | 128,6113889 | 4,62723 |
| 115.015 | 2,08611 | 129,2783333 | 4,56662 |
| 115,4591667 | 2,23016 | 129.7222222 | 4,5413 |
| 115,9033333 | 1,89489 | 130,1661111 | 4,39996 |
| 116,3475 | 2,03546 | 130,61 | 4,36069 |
| 117,0672222 | 2,11907 | 131.2766667 | 4,47573 |
| 117.7316667 | 2,10383 | 131,7205556 | 4,19303 |
| 118,1755556 | 1,91726 | 132,1644444 | 4,17655 |
| 118,6194444 | 1,93228 | 132,6083333 | 4,24852 |
| 119,0636111 | 1,78201 | 133,275 | 4,07631 |
| 119,2863889 | 1,90199 | 133,7188889 | 4.01898 |
| 119,7302778 | 1,76972 | 134,1627778 | 3.97811 |
| 120,1741667 | 1,81882 | 134.6066667 | 3,7236 |
| 120,6180556 | 1,90338 | 135,2736111 | 3,78111 |
| 121,0619444 | 1,86254 | 135,7177778 | 3,82847 |
| 121,2847222 | 1,89595 | 136,1613889 | 3.56015 |
| 121,7286111 | 1,95022 | 136,6052778 | 3,56488 |
| 122,1725 | 2,03028 | 137,2722222 | 3.59907 |
| 122,6163889 | 2,02368 | 137,7158333 | 3,53736 |
| 123,0602778 | 1,80358 | 138,1597222 | 3,51143 |
| 123,2830556 | 1,86305 | 138,6036111 | 3,48144 |
| 123,7269444 | 1,68852 | 139,2705556 | 3,69714 |
| 124,1708333 | 2,16485 | 139,7144444 | 3,53598 |
| 124,6147222 | 2,68219 | 140,1583333 | 3,56975 |
| 125,0586111 | 3,84445 | 140,6022222 | 3,46682 |
| 125,2813889 | 3,75849 | 141,5097222 | 3,27107 |
- 18 042735
| 125,7252778 | 3,05046 | 141,9536111 | 3,37317 |
| 126,1691667 | 1,60889 | 142,3975 | 3,19992 |
| 126.6133333 | 1,55251 | 142,8413889 | 3,29018 |
| 127,0569444 | 1,49635 | 143,285 | 5,29681 |
| 127.28 | 1,4625 | 143,7288889 | 5,42912 |
| 127,7238889 | 1,5599 | 144,1730556 | 5,31815 |
| 128,1675 | 1,411 | 144,6169444 | 5,49514 |
| 128,6113889 | 1,59737 | 145,2836111 | 5,31922 |
| 129,0555556 | 1,49927 | 145,7275 | 5,50698 |
| 129.2783333 | 1,55528 | 146,1713889 | 5,40168 |
| 129,7222222 | 1,68831 | 146,6152778 | 5,21572 |
| 130,1661111 | 1,65586 | 147,2819444 | 5,22277 |
| 130,61 | 1,69803 | 147,7258333 | 5,32597 |
| 131,0538889 | 1,51503 | 148.1697222 | 5,25509 |
| 131,2766667 | 1,62337 | 148.6133333 | 5,18307 |
| 131,7205556 | 1,56305 | 149.0683333 | 5,08164 |
| 132,1644444 | 1,53581 | 149.3183333 | 4,88397 |
| 132,6083333 | 1,39492 | 149.5683333 | 5,06794 |
| 133,0522222 | 1,35263 | 149.8183333 | 5,01549 |
| 133,275 | 1,2922 | 150.0686111 | 4,91031 |
| 133,7188889 | 1,21502 | 150.3186111 | 4,92284 |
| 134,1627778 | 1,38027 | 150.5686111 | 4,88071 |
| 134,6066667 | 1,30947 | 150.8186111 | 4,90576 |
| 135,0505556 | 1,3538 | 151.0686111 | 4,7337 |
| 135,2736111 | 1,36581 | 151.3186111 | 4,98071 |
| 135,7175 | 1,19768 | 151.5686111 | 4,66753 |
| 136,1613889 | 1,41395 | 151,8186111 | 4,73602 |
| 136,6052778 | 1,08014 | 152,2625 | 4,67663 |
| 137,0494444 | 1,32496 | 152,7066667 | 4,66436 |
| 137,2719444 | 1,34268 | 153,1505556 | 4,79716 |
| 137,7158333 | 1,45098 | 153,5947222 | 4,70976 |
| 138,16 | 1,3088 | 154,0388889 | 4,68658 |
| 138,6038889 | 1,39873 | 154,4827778 | 4,45627 |
| 139,0475 | 1,36488 | 154,9269444 | 4,69575 |
| 139,2705556 | 1,19001 | 155,3711111 | 4,61841 |
| 139,7144444 | 1,40293 | 156,0380556 | 4,58039 |
| 140,1583333 | 1,41103 | 156,4822222 | 4,6775 |
| 140.6022222 | 1,5462 | 156,9263889 | 4,4771 |
| 141,2888889 | 2,01927 | 157,3702778 | 4,35384 |
| 141,9536111 | 2,42777 | 158,0372222 | 4,4401 |
| 142,3975 | 2,63074 | 158,4811111 | 4,56737 |
| 142.8413889 | 2,83209 | 158,9252778 | 4,42704 |
| 143.285 | 2,72224 | 159,3691667 | 4,07445 |
| 143.7288889 | 2,63608 | 160,0361111 | 4,36575 |
| 144,1730556 | 2,69195 | 160,4802778 | 4,13995 |
| 144,6169444 | 2,71345 | 160,9241667 | 4,22379 |
| 145,0608333 | 2,50984 | 161,3680556 | 4,17469 |
| 145,2836111 | 2,6369 | 162.035 | 4,28975 |
| 145.7275 | 2,60541 | 162,4788889 | 4,13539 |
| 146,1713889 | 2,67274 | 162,9230556 | 3,87281 |
| 146,6152778 | 2,69351 | 163,3672222 | 4,87836 |
| 147,0591667 | 2,50699 | 164,0338889 | 5,2242 |
| 147,2819444 | 2,68272 | 164,4780556 | 5.24807 |
| 147,7258333 | 2,80848 | 165,165 | 5.03418 |
| 148,1697222 | 2,71963 | 165.8297222 | 4,81739 |
| 148,6133333 | 3,27574 | 166,2736111 | 4,73886 |
| 152,2625 | 1,84522 | 166,7177778 | 4,87246 |
| 152,7066667 | 2,02054 | 167,1616667 | 4.77461 |
| 153,1505556 | 1,89572 | 167,6058333 | 4,68469 |
| 153,5947222 | 1,7493 | 168,2725 | 4.5802 |
| 154,0386111 | 1,82994 | 168,7166667 | 4,5102 |
| 154,4827778 | 2,03299 | 169,1608333 | 4,70917 |
| 154,9269444 | 1,84201 | 169,6047222 | 4,54906 |
| 155,3708333 | 2,33961 | 170,2716667 | 4,58545 |
| 155,815 | 2,17287 | 170,7155556 | 4,46504 |
| 156,0380556 | 2,09251 | 171,1597222 | 4,47254 |
| 156,4822222 | 2,00326 | 171,6036111 | 4,42642 |
| 156,9263889 | 2,00972 | 172,2705556 | 4,48492 |
- 19042735
| 157,3702778 | 1,95632 | 172,7147222 | 4,27087 |
| 157,8144444 | 1,85693 | 173,1586111 | 4,16092 |
| 158,0372222 | 1,87511 | 173,6027778 | 4,23464 |
| 158.4811111 | 2,25587 | 174,2697222 | 4,18793 |
| 158,9252778 | 2,41394 | 174,7138889 | 4,17626 |
| 159,3691667 | 2,27275 | 175,1580556 | 4,12183 |
| 159,8133333 | 2,33431 | 175,6022222 | 4,31591 |
| 160.0361111 | 2,11631 | 176,2691667 | 3,96654 |
| 160.48 | 2,15315 | 176,7130556 | 3,86951 |
| 160.9241667 | 2,21482 | 177,1572222 | 4,05681 |
| 161,3680556 | 2,10691 | 177,6013889 | 3,80757 |
| 161,8119444 | 1,9879 | 178,2683333 | 3,88444 |
| 162,0347222 | 2,07513 | 178,7122222 | 3,7184 |
| 162,4788889 | 2,09918 | 179.1563889 | 3,76801 |
| 162.9230556 | 2,045 | 179,6002778 | 3,65193 |
| 163,3669444 | 2,0579 | 180,2672222 | 3,8665 |
| 163,8111111 | 1,9786 | 180,7113889 | 3,60753 |
| 164,0338889 | 2,04415 | 181,1552778 | 3,56228 |
| 164,4780556 | 2,11519 | 181,5994444 | 3.51562 |
| 164,9219444 | 2,04256 | 182,2663889 | 3.53538 |
| 165,8297222 | 1,92716 | 182.7105556 | 3,58554 |
| 166,2736111 | 1,74054 | 183,1544444 | 3,52299 |
| 166,7177778 | 2,17775 | 183,5986111 | 3,50055 |
| 167,1616667 | 2,21902 | 184,2655556 | 3.35449 |
| 167,6055556 | 2,23581 | 184,7097222 | 3,15678 |
| 168,0497222 | 2,1295 | 185,1536111 | 3.49221 |
| 168,2725 | 2,06408 | 185,5977778 | 3,31856 |
| 168,7166667 | 1,95822 | 186,2644444 | 3,1794 |
| 169,1608333 | 1,87785 | 186,7086111 | 3,261 |
| 169,6047222 | 2,38464 | 187,1525 | 3,26585 |
| 170,0486111 | 2,52549 | 187,5963889 | 3,11678 |
| 170,2716667 | 2,48755 | 188,0405556 | 3,29677 |
| 170,7155556 | 2,39386 | 188,4847222 | 3,13789 |
| 171,1594444 | 2,26082 | 188,9288889 | 3,04174 |
| 171,6036111 | 2,10124 | 189,8586111 | 2,84437 |
| 172,0477778 | 2,04631 | 190,7886111 | 2,97215 |
| 172.2705556 | 1,96783 | 191,7183333 | 2,74657 |
| 172,7144444 | 2,03789 | 192.6480556 | 2,85061 |
| 173.1586111 | 1,96485 | 193,5780556 | 2,71859 |
| 173,6025 | 1,75977 | 194,5077778 | 2,64369 |
| 174,0466667 | 2,13635 | 195,4377778 | 2,23807 |
| 174,2697222 | 2,35361 | 196,3675 | 2,16861 |
| 174,7138889 | 2,19967 | 197,2975 | 2,18502 |
| 175.1577778 | 2,2276 | 198,2275 | 2,02487 |
| 175,6019444 | 2,26713 | 199,1572222 | 2,00279 |
| 176,0461111 | 2,27076 | 200,0861111 | 2,05927 |
| 176,2688889 | 2,08234 | 201,0158333 | 1,77877 |
| 176,7130556 | 2,05613 | 201.9455556 | 3,21063 |
| 177,1569444 | 1,98094 | 202.8752778 | 5,70505 |
| 177,6011111 | 2,09971 | 203,8047222 | 5,55309 |
| 178,0452778 | 2,13739 | 204,7341667 | 5,62934 |
| 178,2683333 | 1,81014 | 205.6636111 | 5,40796 |
| 178,7122222 | 2,33795 | 206.5933333 | 5,26706 |
| 179,1561111 | 2,27909 | 207.5230556 | 5,24844 |
| 179,6002778 | 2,13411 | 208,4522222 | 5,04861 |
| 180,0441667 | 2,28842 | 208,8961111 | 4,9106 |
| 180,2672222 | 2,3228 | 209.3402778 | 4,83827 |
| 180,7113889 | 2,20826 | 209.7844444 | 5,05838 |
| 181,1552778 | 2,1662 | 210.2286111 | 4,83412 |
| 181,5991667 | 1,97546 | 210,6725 | 4,76257 |
| 182,0433333 | 2,11621 | 211,1166667 | 4,64707 |
| 182,2661111 | 2,07917 | 211,7836111 | 4,80408 |
| 182,7102778 | 1,95 | 212,2275 | 4,53231 |
| 183,1544444 | 2,00555 | 212,6716667 | 4,68255 |
| 183,5983333 | 2,1972 | 213,1155556 | 4,661 |
| 184,0425 | 1,99805 | 213,7827778 | 4,53894 |
| 184,2652778 | 1,90735 | 214,2266667 | 4,38914 |
| 184,7094444 | 2,07147 | 214,6705556 | 4,51892 |
-20042735
| 185.1536111 | 2,30457 | 215,1147222 | 4,35161 |
| 185.5975 | 1,94533 | 215,7816667 | 4,2933 |
| 186.0416667 | 2,04383 | 216,2255556 | 4,2022 |
| 186,2644444 | 2,02201 | 216.6697222 | 4,14232 |
| 186.7086111 | 2,00486 | 217,1136111 | 4,19824 |
| 187,1525 | 1,87491 | 217,7808333 | 3,98641 |
| 187,5963889 | 1,71041 | 218,225 | 4,17967 |
| 188,0405556 | 2,27353 | 218.6688889 | 4,12755 |
| 188,4844444 | 2,27361 | 219.1130556 | 3,98162 |
| 188.9286111 | 2,21939 | 219,7797222 | 4,18885 |
| 189,6158333 | 2,32112 | 220,2238889 | 3,99614 |
| 190,5455556 | 2,23684 | 220,6680556 | 3,88445 |
| 191,4752778 | 2,00438 | 221.1122222 | 4,00875 |
| 192,4052778 | 2,08773 | 221.7794444 | 4,02466 |
| 193,335 | 1,98721 | 222.2233333 | 4,92433 |
| 194,2647222 | 2,34499 | 222,6675 | 5,31792 |
| 195,1947222 | 2,07045 | 223.1116667 | 5,10258 |
| 196,1247222 | 1,87379 | 223.7786111 | 5,18651 |
| 197,9844444 | 2,44455 | 224.2227778 | 5,33129 |
| 198,9144444 | 1,43529 | 224.6669444 | 5,31647 |
| 199,8438889 | 2,10835 | 225.1111111 | 5,22186 |
| 200,7730556 | 2,16165 | 225.7780556 | 5,09756 |
| 201,7027778 | 2,03911 | 226.2219444 | 5,0919 |
| 202,6325 | 2,02224 | 226.6661111 | 5,09598 |
| 203,5619444 | 2,04709 | 227.1102778 | 5,20148 |
| 204,4916667 | 1,74866 | 227,7775 | 5,27139 |
| 205,4205556 | 2,42807 | 228,2213889 | 5,17647 |
| 206,3502778 | 2,3646 | 228,6655556 | 4,97104 |
| 207,28 | 2,29919 | 229,1097222 | 4.95102 |
| 208,2313889 | 2,37703 | 229,7766667 | 5.02617 |
| 208,8961111 | 2,39499 | 230,2208333 | 4.89217 |
| 209,3402778 | 1,97051 | 230,6647222 | 5.06075 |
| 209,7841667 | 2,24512 | 231,1088889 | 4.91127 |
| 210,2283333 | 2,25347 | 231,7758333 | 4.75924 |
| 210,6725 | 2,08371 | 232,6836111 | 4,86344 |
| 211,1166667 | 2,15365 | 233,1275 | 4,66869 |
| 211,5605556 | 2,29691 | 233,5713889 | 4,77352 |
| 211,7833333 | 2,03092 | 234,0155556 | 4,63601 |
| 212,2275 | 1,97129 | 234,4597222 | 4,71014 |
| 212,6716667 | 1,9721 | 234,9038889 | 4,69685 |
| 213,1155556 | 2,07924 | 235,3477778 | 4,83778 |
| 213,5597222 | 1,93054 | 235,7919444 | 4,73268 |
| 213,7825 | 2,09871 | 236,2358333 | 4,72232 |
| 214,2266667 | 2,01653 | 236,6797222 | 4,70191 |
| 214,6705556 | 1,97157 | 237,1238889 | 4,61924 |
| 215,1147222 | 2,08205 | 237,7908333 | 5,82279 |
| 215,5586111 | 2,20945 | 238,2347222 | 5,95289 |
| 215,7816667 | 1,90401 | 238,6788889 | 5,7376 |
| 216,2255556 | 2,25764 | 239,1227778 | 5,39835 |
| 216,6697222 | 2,20062 | 239,7897222 | 5,55047 |
| 217,1136111 | 2,38191 | 240,2336111 | 5,45566 |
| 217,5577778 | 2,30704 | 240,6777778 | 5,56575 |
| 217,7808333 | 2,3666 | 241,1219444 | 5,37954 |
| 218,225 | 2,21814 | 241,7888889 | 5,28663 |
| 218,6688889 | 2,22546 | 242,2330556 | 5,22091 |
| 219,1130556 | 2,29399 | 242,6769444 | 5,31419 |
| 219,5569444 | 2,35247 | 243,1211111 | 5,269 |
| 219,7797222 | 2,36244 | 243,7880556 | 5,33359 |
| 220,2238889 | 2,42202 | 244,2322222 | 5,20919 |
| 220,6677778 | 3,90842 | 244,6763889 | 5,16646 |
| 221,1119444 | 3,226 | 245,1202778 | 4,87647 |
| 221,5561111 | 3,24104 | 245,7872222 | 5,19865 |
| 221,7791667 | 3,44121 | 246,2313889 | 5,26332 |
| 222,2233333 | 2,10021 | 246,6755556 | 5,27455 |
| 222,6675 | 1,65588 | 247,1194444 | 4,9051 |
| 223,1116667 | 2,00054 | 247,7863889 | 4,96193 |
| 223,5555556 | 2,2584 | 248,2302778 | 4,95473 |
| 223,7786111 | 2,18337 | 248,6744444 | 4.87265 |
- 21 042735
| 224,2227778 | 2,22002 | 249,1186111 | 4,88933 |
| 224,6666667 | 2,02996 | 249,7855556 | 4,95339 |
| 225.1108333 | 2,11005 | 250,2297222 | 4,91535 |
| 225,555 | 1,98403 | 250.6738889 | 4,8415 |
| 225.7780556 | 1,97535 | 251,1180556 | 4,73406 |
| 226,2219444 | 2,1047 | 251,785 | 4,75863 |
| 226,6661111 | 2,14528 | 252,2291667 | 4,83177 |
| 227,1102778 | 2,11167 | 252.6733333 | 4,73776 |
| 227,5541667 | 1,96546 | 253.1175 | 4,80804 |
| 227.7772222 | 2,1583 | 253,7841667 | 4,47607 |
| 228,2213889 | 2,09114 | 254,2283333 | 4,44379 |
| 228,6655556 | 2,03119 | 254,6722222 | 4,61578 |
| 229,1097222 | 2,03169 | 255.1163889 | 4,35294 |
| 229,5536111 | 1,805 | 255.7833333 | 4,35565 |
| 229,7766667 | 1,75306 | 256.4702778 | 4,63822 |
| 230,2208333 | 2,03753 | 257,4 | 4,1795 |
| 230,6647222 | 1,98862 | 258.3291667 | 4,3277 |
| 231,1088889 | 1,85836 | 259.2588889 | 4,10085 |
| 231,5530556 | 1,81241 | 260.1886111 | 4,15495 |
| 231,7758333 | 1,83977 | 261.1183333 | 3,90911 |
| 232,4627778 | 1,76471 | 262,0477778 | 3,81073 |
| 233,1275 | 1,63967 | 262.9772222 | 3,87842 |
| 233,5713889 | 1,79819 | 263.9061111 | 5,04643 |
| 234,0155556 | 1,74429 | 264.8347222 | 4,97527 |
| 234,4594444 | 1,77757 | 265.7641667 | 4,93942 |
| 234,9036111 | 1,82093 | 266.6936111 | 4,81825 |
| 235,3477778 | 1,75825 | 267,6225 | 4,80283 |
| 235,7919444 | 1,71644 | 268,2875 | 4,75164 |
| 236,2358333 | 1,64919 | 268,7313889 | 4,93642 |
| 236,6797222 | 1,65067 | 269,1755556 | 4.75401 |
| 237,1238889 | 1,59211 | 269,6197222 | 4.51092 |
| 237,5677778 | 2,09602 | 270,2866667 | 4.5984 |
| 237,7905556 | 2,0281 | 270,7308333 | 4.54899 |
| 238,2347222 | 2,0728 | 271,1747222 | 4.70999 |
| 238,6786111 | 1,96003 | 271,6188889 | 4,4307 |
| 239,1227778 | 2,13435 | 272,2858333 | 4,3134 |
| 239,5666667 | 2,14529 | 272,7297222 | 4,46242 |
| 239,7897222 | 2,12039 | 273,1738889 | 4,44403 |
| 240,2336111 | 2,1226 | 273,6177778 | 4,31874 |
| 240,6777778 | 2,17822 | 274,2847222 | 4,43482 |
| 241,1216667 | 2,09458 | 274,7286111 | 4,22428 |
| 241,5658333 | 1,93963 | 275,1727778 | 4,50794 |
| 241,7888889 | 1,78058 | 275,6166667 | 4,37905 |
| 242,2327778 | 1,92457 | 276,2836111 | 4,28183 |
| 242,6769444 | 2,54728 | 276,7277778 | 4,36293 |
| 243,1208333 | 2,7696 | 277,1716667 | 4,06209 |
| 243,565 | 2,96879 | 277.6155556 | 4,27271 |
| 243,7880556 | 3,0983 | 278.2825 | 4,05231 |
| 244,2322222 | 2,44977 | 278,7266667 | 4,19835 |
| 244,6761111 | 3,0513 | 279,1705556 | 4,10201 |
| 245,1202778 | 4,46037 | 279,6147222 | 4,0479 |
| 245,5641667 | 3,64992 | 280.2816667 | 4,14879 |
| 245,7872222 | 2,63717 | 280.7258333 | 4,01384 |
| 246,2311111 | 2,23246 | 281,1697222 | 3,94503 |
| 246,6752778 | 1,96177 | 281,6138889 | 3,82963 |
| 247,1194444 | 1,9733 | 282,2808333 | 4,01967 |
| 247,5633333 | 1,92291 | 282.725 | 4,08182 |
| 247,7863889 | 1,9421 | 283.1688889 | 3,83589 |
| 248,2302778 | 2,29655 | 283,6130556 | 3,8807 |
| 248,6744444 | 2,15675 | 284,28 | 3,60671 |
| 249,1186111 | 2,06017 | 284,7238889 | 3,74206 |
| 249,5625 | 1,83718 | 285.1680556 | 3,61191 |
| 249,7855556 | 2,26354 | 285.6119444 | 3,64284 |
| 250,2297222 | 2,15135 | 286.2788889 | 3,49373 |
| 250,6736111 | 2,13613 | 286.7227778 | 3,75384 |
| 251,1177778 | 2,01012 | 287.1666667 | 5,50193 |
| 251,5619444 | 1,91997 | 287.6108333 | 5,36619 |
| 251,785 | 2,04497 | 288.2777778 | 5,44722 |
- 22 042735
| 252,2288889 | 1,76215 | 288,7219444 | 5,23718 |
| 252,6730556 | 1,91976 | 289,1661111 | 5,48611 |
| 253.1172222 | 2,17963 | 289,61 | 5,29237 |
| 253,5613889 | 2,49015 | 290.2769444 | 5,09807 |
| 253.7841667 | 2,31233 | 290,7211111 | 5,27902 |
| 254,2280556 | 2,25077 | 291,165 | 5,21127 |
| 254,6722222 | 2,41304 | 291,8522222 | 4,93468 |
| 255,1161111 | 2,32947 | 292,5169444 | 5,3445 |
| 255,5602778 | 2,27885 | 292,9611111 | 4,9385 |
| 255.7833333 | 1,94173 | 293,4052778 | 5,0282 |
| 256,2272222 | 2,39855 | 293,8491667 | 4,92491 |
| 257,1572222 | 1,97358 | 294,2933333 | 4,94234 |
| 258,0863889 | 2,13599 | 294,7375 | 5,14301 |
| 259,0161111 | 2,20439 | 295.1813889 | 5,09006 |
| 259,9458333 | 2,07312 | 295.6252778 | 4,97926 |
| 260,8752778 | 2,35689 | 296.2922222 | 4,79825 |
| 261,8052778 | 2,16814 | 296.7363889 | 4,98856 |
| 262,7347222 | 2,00509 | 297.1802778 | 4,64638 |
| 263,6638889 | 2,06753 | 297.6241667 | 4,83557 |
| 264,5925 | 1,85036 | 298.2913889 | 4,66544 |
| 265,5213889 | 2,46909 | 298.7352778 | 4,46933 |
| 266,4508333 | 2,44871 | 299.1794444 | 4,42644 |
| 267,3797222 | 2,44656 | 299.6233333 | 4,40905 |
| 268,2872222 | 2,48505 | 300.2902778 | 4,48562 |
| 268,7313889 | 2,63435 | 300,7344444 | 4,29635 |
| 269,1755556 | 3,24711 | 301.1786111 | 4,21742 |
| 269,6194444 | 2,23888 | 301,6227778 | 4,5645 |
| 270,0636111 | 2,07904 | 302,2894444 | 4,37116 |
| 270,2863889 | 2,21563 | 302,7333333 | 4,30076 |
| 270,7305556 | 1,91896 | 303,1775 | 4,357 |
| 271,1747222 | 2,09629 | 303,6216667 | 4,19275 |
| 271,6188889 | 2,04491 | 304,2888889 | 4,3476 |
| 272,0627778 | 1,96894 | 304,7327778 | 4,12702 |
| 272,2858333 | 2,10447 | 305,1766667 | 4,22847 |
| 272,7297222 | 1,98481 | 305,6208333 | 4,14018 |
| 273,1736111 | 1,88517 | 306,2877778 | 3,91622 |
| 273,6177778 | 2,02339 | 306,7319444 | 4,0101 |
| 274,0616667 | 2,1536 | 307,1758333 | 4,08905 |
| 274,2844444 | 1,94488 | 307,62 | 3,69736 |
| 274,7286111 | 2,09537 | 308,2866667 | 3,89877 |
| 275,1725 | 1,94546 | 308,7308333 | 3,91969 |
| 275,6166667 | 1,97124 | 309,1747222 | 3,95032 |
| 276,0605556 | 2,10351 | 309,6188889 | 3,83547 |
| 276,2833333 | 2,15169 | 310,2858333 | 5,15943 |
| 276,7275 | 2,06851 | 310,73 | 4,85061 |
| 277,1713889 | 1,95511 | 311,1738889 | 4,90129 |
| 277,6155556 | 2,17411 | 311,6177778 | 4,69627 |
| 278,0594444 | 1,91116 | 312,2847222 | 4,98669 |
| 278,2825 | 1,89503 | 312,7286111 | 4,99629 |
| 278,7263889 | 2,13133 | 313,1727778 | 4,92192 |
| 279,1705556 | 2,23375 | 313,6166667 | 4,91592 |
| 279,6147222 | 2,07922 | 314,2838889 | 4,79179 |
| 280,0588889 | 2,15941 | 314,7277778 | 4,82191 |
| 280,2816667 | 2,10306 | 315,1719444 | 4,62895 |
| 280,7258333 | 2,09977 | 315,6158333 | 4,68028 |
| 281,1697222 | 1,90922 | 316,5236111 | 4,39498 |
| 281,6138889 | 1,97935 | 316,9675 | 4,51145 |
| 282,0577778 | 1,98323 | 317,4116667 | 4,64399 |
| 282,2808333 | 2,13178 | 317,8558333 | 4,35246 |
| 282,725 | 2,05535 | 318,5230556 | 4,39085 |
| 283,1688889 | 2,17687 | 318,9669444 | 4,51255 |
| 283,6130556 | 2,10914 | 319,4111111 | 4,26767 |
| 284,0569444 | 1,88863 | 319,855 | 4,41338 |
| 284,28 | 1,90439 | 320,5225 | 4,04934 |
| 284,7238889 | 2,27687 | 320,9663889 | 4,54584 |
| 285,1680556 | 2,27819 | 321.4105556 | 4,21321 |
| 285,6119444 | 1,97363 | 321.8547222 | 4,26114 |
| 286,0561111 | 2,474 | 322.5219444 | 4,16462 |
- 23 042735
| 286,2788889 | 2,08995 | 322,9658333 | 4,03369 |
| 286,7227778 | 2,25392 | 323,41 | 4,07753 |
| 287.1666667 | 2,16887 | 323,8541667 | 4,06638 |
| 287,6108333 | 2,53164 | 324.5213889 | 4,03094 |
| 288.0547222 | 2,19634 | 324,9652778 | 4,01644 |
| 288,2777778 | 2,18478 | 325,4094444 | 4,21972 |
| 288,7219444 | 2,05544 | 325,8536111 | 4,08692 |
| 289,1661111 | 2,28481 | 326,5205556 | 3,84686 |
| 289,61 | 2,18665 | 326,9644444 | 4,04213 |
| 290.0538889 | 2,44092 | 327,4086111 | 3,77223 |
| 290,2769444 | 2,30768 | 327,8527778 | 3,9225 |
| 290,7208333 | 2,09997 | 328,52 | 3,99757 |
| 291,165 | 2,13653 | 328,9638889 | 3,76221 |
| 291,6091667 | 2,29461 | 329.4080556 | 3,68814 |
| 292,5166667 | 1,89174 | 329,8522222 | 3,89506 |
| 293,405 | 3,35168 | 330,5194444 | 3,79475 |
| 293,8491667 | 3,81949 | 330,9636111 | 3,69956 |
| 294,2933333 | 1,83112 | 331.4075 | 3,64703 |
| 294,7372222 | 1,8642 | 331.8516667 | 3,57235 |
| 295,1813889 | 2,16381 | ||
| 295,6252778 | 2,17022 | ||
| 296,0691667 | 1,98928 | ||
| 296,2919444 | 1,90433 | ||
| 296,7361111 | 2,24558 | ||
| 297,1802778 | 2,07294 | ||
| 297,6241667 | 2,00742 | ||
| 298,0680556 | 2,04407 | ||
| 298,2911111 | 1,82856 | ||
| 298,7352778 | 2,18444 | ||
| 299,1791667 | 2,38328 | ||
| 299,6233333 | 1,94764 | ||
| 300,0675 | 2,35273 | ||
| 300,2902778 | 2,10771 | ||
| 300,7344444 | 2,18582 | ||
| 301,1783333 | 2,28062 | ||
| 301,6225 | 2,18726 | ||
| 302,0666667 | 2,01366 | ||
| 302,2894444 | 2,08052 | ||
| 302,7333333 | 2,115 | ||
| 303,1775 | 2,1862 | ||
| 303,6213889 | 2,23513 | ||
| 304,0655556 | 1,88516 | ||
| 304,2886111 | 2,01393 | ||
| 304,7327778 | 2,13416 | ||
| 305,1766667 | 1,95372 | ||
| 305,6205556 | 2,34303 | ||
| 306,0647222 | 2,20315 | ||
| 306,2877778 | 2,26925 | ||
| 306,7316667 | 2,10713 | ||
| 307,1758333 | 2,12814 | ||
| 307,62 | 2,36701 | ||
| 308,0636111 | 2,16943 | ||
| 308,2866667 | 1,82948 | ||
| 308,7308333 | 2,26683 | ||
| 309,1747222 | 2,1141 | ||
| 309,6188889 | 2,49 | ||
| 310,0630556 | 2,27842 | ||
| 310,2858333 | 2,20096 | ||
| 310,73 | 2,17509 | ||
| 311,1738889 | 2,15439 | ||
| 311,6177778 | 2,33172 | ||
| 312,0616667 | 2,19789 | ||
| 312,2847222 | 2,15463 | ||
| 312,7286111 | 2,27852 | ||
| 313,1725 | 1,99785 | ||
| 313,6166667 | 1,96589 | ||
| 314,0608333 | 2,49224 | ||
| 314,2836111 | 2,40053 |
- 24 042735
| 314,7277778 | 2,37773 | ||
| 315,1716667 | 2,46324 | ||
| 315.6158333 | 2,55963 | ||
| 316.3027778 | 2,42319 | ||
| 317,4113889 | 3,20763 | ||
| 317,8558333 | 4,52655 | ||
| 318,2997222 | 2,16813 | ||
| 318,5227778 | 1,901 | ||
| 318.9669444 | 1,79215 | ||
| 319.4111111 | 2,46673 | ||
| 319.855 | 2,19232 | ||
| 320,2991667 | 2,22674 | ||
| 320,5222222 | 2,16041 | ||
| 320,9663889 | 2,30146 | ||
| 321,4102778 | 2,35759 | ||
| 321.8544444 | 2,06147 | ||
| 322.2986111 | 2,2465 | ||
| 322,5216667 | 1,90065 | ||
| 322,9658333 | 2,42279 | ||
| 323,41 | 2,29138 | ||
| 323,8541667 | 2,21841 | ||
| 324,2980556 | 2,42145 | ||
| 324.5211111 | 2,35336 | ||
| 324.9652778 | 2,25286 | ||
| 325,4094444 | 2,25769 | ||
| 325,8536111 | 2,31652 | ||
| 326,2975 | 2,24343 | ||
| 326,5205556 | 2,28121 | ||
| 326,9644444 | 2,32713 | ||
| 327,4086111 | 2,38217 | ||
| 327,8527778 | 2,14074 | ||
| 328.2966667 | 2,30334 | ||
| 328,5197222 | 2,2444 | ||
| 328.9638889 | 2,10546 | ||
| 329,4080556 | 2,16617 | ||
| 329,8522222 | 2,30982 | ||
| 330,2961111 | 2,12672 | ||
| 330,5191667 | 2,19646 | ||
| 330,9633333 | 1,81375 | ||
| 331,4075 | 2,20783 |
Пример 2. Сравнение контроля с обратной связью и стратегии болюсной подпитки.
Материалы и способы.
Клетки культивировали под контролем обратной связи и с использованием стратегии болюсной подпитки, как описано выше.
Результаты.
На фиг. 11 показаны различия ПТМ в клетках, культивируемых с использованием обратной связи и стратегии болюсной подпитки. Каждая пара колонок соответствует дню исследования серии. В каждой паре колонок левая колонка соответствует данным контроля с обратной связью, а правая колонка соответствует данным болюсной подпитки. Подтверждали, что стратегия контроля с обратной связью (левая колонка в каждой паре колонок) снижала уровень % ПТМ в последующем эксперименте по сравнению со стратегией болюсной подпитки (правая колонка в каждой паре колонок). Контролируя заданное значение концентрации питательных веществ на постоянном уровне, надежно поддерживали % ПТМ в течение производства. % ПТМ также снижался относительно стратегии болюсной подпитки, что, таким образом, демонстрирует возможность контроля качества антитела благодаря контролю с обратной связью посредством рамановской спектроскопии.
Описанные контролируемые обратной связью системы культивирования и способы обеспечивают многокомпонентный анализ без удаления образца. Данные, полученные в реальном времени, делают возможным автоматический контроль с обратной связью для непрерывного добавления питательных веществ. Сниженные установившиеся концентрации активных питательных веществ в биореакторе приводят к уровню ПТМ антитела, на 50% более низкому, чем при стандартной болюсной подпитке, что, таким образом, улучшает качество и постоянство продукта.
Хотя в изложенном выше описании настоящее изобретение описано со ссылкой на некоторые варианты его осуществления, и множество деталей использовано в иллюстративных целях, специалисту в этой области будет очевидно, что изобретение предусматривает дополнительные варианты осуществления, и что некоторые из деталей, представленных в настоящем описании, могут значительно варьироваться без отклонения от основных принципов настоящего изобретения.
Все ссылки, процитированные в настоящем описании, включены в него в полном объеме. Настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или существенных признаков, и, соответственно, следует ссылаться на прилагаемую формулу изобретения, а не на предшествующее описание, как на указание объема изобретения.
-
Claims (35)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ контроля условий среды для культивирования клеток, включающий количественную оценку одного или нескольких аналитов в среде для культивирования клеток с использованием рамановской спектроскопии in situ для определения концентраций одного или нескольких аналитов; и регулирование с использованием непрерывной подпитки питательными веществами с контролируемой обратной связью в ходе рабочего цикла концентраций одного или несколько аналитов в среде для культивирования клеток для обеспечения устойчивого добавления дозы питательных веществ в течение времени около или со скоростью, с которой питательные вещества поглощаются или потребляются клетками в среде для культивирования, где по меньшей мере одна из предварительно определенных концентраций аналита поддерживает посттрансляционные модификации биопродуктов в среде для культивирования клеток до 1,0-30%, где посттрансляционные модификации включают более одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из гликирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации защитной/блокирующей группой, протеолитического расщепления и модификации не встречающейся в природе аминокислотой.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что посттрансляционная модификация включает гликирова ние.
- 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что биопродукт представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
- 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что биопродукт представляет собой слитый белок.
- 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда для культивирования клеток содержит клетки млекопитающего.
- 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что клетки млекопитающего содержат клетки яичника китайского хомячка.
- 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что аналит представляет собой глюкозу.
- 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что предварительно определенная концентрация глюкозы составляет от 0,5 до 8,0 г/л.
- 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрация глюкозы составляет от 1,0 до 3,0 г/л.
- 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрация глюкозы составляет 2,0 г/л.
- 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрация глюкозы составляет 1,0 г/л.
- 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно определенные концентрации аналита поддерживают посттрансляционные модификации белков в среде для культивирования клеток до 1,020%.
- 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно определенные концентрации аналита поддерживают посттрансляционные модификации белков в среде для культивирования клеток до 5,010%.
- 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят непрерывно.
- 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят периодически.
- 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят с интервалами.
- 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят с 5-минутными интервалами.
- 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят с 10-минутными интервалами.
- 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят с 15-минутными интервалами.
- 20. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят ежечас но.
- 21. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественное определение аналитов проводят, по меньшей мере, ежедневно.
- 22. Способ по п.1, отличающийся тем, что регулирование концентраций аналита проводится автоматически.
- 23. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественно определяют по меньшей мере два разных аналита.
- 24. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественно определяют по меньшей мере три разных аналита.
- 25. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественно определяют по меньшей мере четыре разных аналита.- 26 042735
- 26. Способ уменьшения посттрансляционных модификаций секретируемого биопродукта, включающий кул ьтивирование клеток, секретирующих биопродукт, в среде для культивирования клеток, содержащей 0,5-8,0 г/л глюкозы;постепенное определение концентрации глюкозы в среде для культивирования клеток во время культивирования клеток с использованием рамановской спектроскопии in situ с использованием непрерывной подпитки питательными веществами с контролируемой обратной связью в ходе рабочего цикла для обеспечения устойчивого добавления дозы питательных веществ в течение времени около или со скоростью, с которой питательные вещества поглощаются или потребляются клетками в среде для культивирования;регулирование концентрации глюкозы для поддержания концентрации глюкозы до 0,5-8,0 г/л путем автоматической подачи нескольких доз глюкозы в 1 ч для поддержания посттрансляционных модификаций секретируемого биопродукта до 1,0-30,0%, где посттрансляционные модификации включают более одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из гликирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации защитной/блокирующей группой, протеолитического расщепления и модификации не встречающейся в природе аминокислотой.
- 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что концентрация глюкозы составляет от 1,0 до 3,0 г/л.
- 28. Система контроля условий среды для культивирования клеток, включающая один или несколько процессоров во взаимодействии с машиночитаемым носителем, хранящим программный код для выполнения одним или несколькими процессорами, чтобы заставить систему получать данные, содержащие концентрацию одного или нескольких аналитов в среде для культивирования клеток, с помощью рамановского спектрометра in situ; и регулирование с использованием непрерывной подпитки питательными веществами с контролируемой обратной связью в ходе рабочего цикла концентраций одной или нескольких аналитов в среде для культивирования клеток для обеспечения устойчивого добавления дозы питательных веществ в течение времени около или со скоростью, с которой питательные вещества поглощаются или потребляются клетками в среде для культивирования, где по меньшей мере одна из предварительно определенных концентраций аналита поддерживает посттрансляционные модификации биопродукта в среде для культивирования клеток до 1,0-30%, где посттрансляционные модификации включают более одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из гликирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации защитной/блокирующей группой, протеолитического расщепления и модификации не встречающейся в природе аминокислотой.
- 29. Система по п.28, отличающаяся тем, что программный код дополнительно сконфигурирован, чтобы заставить систему выполнять хемометрический анализ данных.
- 30. Система по п.29, отличающаяся тем, что хемометрический анализ включает моделирование регрессии методом дробных наименьших квадратов.
- 31. Система по п.28, отличающаяся тем, что программный код дополнительно сконфигурирован, чтобы заставить систему выполнять один или несколько способов обработки данных сигналов.
- 32. Система по п.31, отличающаяся тем, что способ обработки сигнала содержит способ шумоподавления.
- 33. Система уменьшения посттрансляционных модификаций секретируемого биопродукта, включающая один или несколько процессоров во взаимодействии с машиночитаемым носителем, хранящим программный код для выполнения одним или несколькими процессорами, чтобы заставить систему постепенно получать спектральные данные, включающие концентрацию глюкозы в среде для культивирования клеток во время культивирования клеток, секретирующих белок, из рамановского анализатора in situ с использованием непрерывной подпитки питательными веществами с контролируемой обратной связью в ходе рабочего цикла для обеспечения устойчивого добавления дозы питательных веществ в течение времени около или со скоростью, с которой питательные вещества поглощаются или потребляются клетками в среде для культивирования; и регулирование концентрации глюкозы для поддержания концентрации глюкозы до уровня 0,5-8,0 г/л путем автоматической подачи нескольких доз глюкозы в 1 ч для поддержания посттрансляционных модификаций секретируемого биопродукта до 1,0-30,0%, где посттрансляционные модификации включают более одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из гликирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации защитной/блокирующей группой, протеолитического расщепления и модификации не встречающейся в природе аминокислотой.
- 34. Система по п.33, отличающаяся тем, что программный код дополнительно сконфигурирован так, чтобы система коррелировала пики в спектральных данных с концентрациями глюкозы.
- 35. Система по п.33, отличающаяся тем, что программный код дополнительно сконфигурирован для выполнения моделирования регрессии способом дробных наименьших квадратов спектральных данных.-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/572,828 | 2017-10-16 | ||
| US62/662,322 | 2018-04-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA042735B1 true EA042735B1 (ru) | 2023-03-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2018350890B2 (en) | In situ Raman spectroscopy systems and methods for controlling process variables in cell cultures | |
| JP2020195370A5 (ru) | ||
| Schwarz et al. | Monitoring of amino acids and antibody N-glycosylation in high cell density perfusion culture based on Raman spectroscopy | |
| Chen et al. | Viable cell density on-line auto-control in perfusion cell culture aided by in-situ Raman spectroscopy | |
| JP2017029162A (ja) | 細胞培養物のフィードバック制御を伴わない予めプログラムされた連続供給 | |
| US11774287B2 (en) | Raman spectroscopy integrated perfusion cell culture system for monitoring and auto-controlling perfusion cell culture | |
| Dowd et al. | Predictive control of hollow‐fiber bioreactors for the production of monoclonal antibodies | |
| EA042735B1 (ru) | Системы и способы рамановской спектроскопии in situ для контроля переменных процесса в культурах клеток | |
| US20210180003A1 (en) | Systems and Methods for Auto-Inoculation in Seed Train and Production Processes | |
| AU2024223985A1 (en) | In situ raman spectroscopy systems and methods for controlling process variables in cell cultures | |
| KR20240149973A (ko) | 세포 배양에서 공정 변수를 제어하기 위한 원위치 라만 분광법 시스템 및 방법 | |
| US20240132835A1 (en) | Dynamic monosaccharide control processes | |
| US20240166984A1 (en) | Multiparameter materials, methods and systems for bioreactor glycated species manufacture | |
| US20240168033A1 (en) | Multiparameter materials, methods and systems for enhanced bioreactor manufacture | |
| Romann et al. | Raman‐controlled pyruvate feeding to control metabolic activity and product quality in continuous biomanufacturing | |
| JP2024514265A (ja) | 動的栄養制御プロセス | |
| Feidl | Digitalization platform and supervisory control of an integrated continuous bioprocess | |
| EA044918B1 (ru) | Системы и способы автоматической инокуляции в системе посевных ферментеров и способы производства |