JPH0373274B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (a) 産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための培養方法
に関するものである。さらに詳しくは、大規模に
かつ高密度に細胞培養を行う目的で作られたサス
ペンジヨン型細胞培養システムにおける細胞培養
方法に関するものである。 (b) 従来技術 細胞大量培養は例えばウイルス、ワクチン、イ
ンターフエロンなどの抗ウイルス剤、あるいはホ
ルモンなどの生物薬品の工業的製造に重要な技術
である。殊に近年特定のタンパク質などを標的と
するモノクローナル抗体の生産は抗体産生細胞と
ミエローマ細胞の配合によるハイブリドーマ細胞
の大量培養によるものであり、その技術の解決は
工業的に不可欠な問題である。 また、大規模であり、かつ高密度に細胞を培養
することは上記有用物質を低コストで生産するた
めに必須の技術であり、その技術の急速な解決が
望まれている。 従来、サスペンジヨン型の細胞培養は一般に培
養びんやスピンナーフラスコを用いて実験室的規
模で行なわれている。 しかしながら、上記の方法では一定量の栄養分
の中で培養されるため細胞の生長増殖は比較的低
い濃度で停止する。 近年、サスペンジヨン型の高密度細胞培養方法
およびそのための装置としていくつかの提案がな
されている。たとえば、マグネチツクスターラー
もしくはモーターで駆動される回転軸に平行な面
にフイルターを有する筒形回転体を回転させてフ
イルターのつまりを遠心力で防ぎながら培養液を
入れかえる高密度培養装置が提案されている。
（米国特許第3647632号明細書参照）。 しかしながら上記の方法では、単位細胞当りま
たは、培養液あたりの濾過面積を或る一定以上大
きくすることに制約があるため、スケールアツプ
が非常に困難である。 (c) 発明の構成 そこで本発明者らは前記のような従来法におけ
る欠点を克服し、サスペンジヨン型の細胞培養法
によつて大規模かつ高密度の培養が可能な培養方
法について研究を進めた結果、本発明に到達し
た。 すなわち、本発明は、サスペンジヨン型細胞培
養方法であつて、該方法の細胞培養槽としてサス
ペンジヨン液中に培養液は透過するが細胞は透過
しないフイルター領域を少なくとも部分的に有す
る盤状体の少なくとも１個が培養液を培養槽外へ
取り出す導管に該導管と同軸で回転し得るように
取りつけられた回転型フイルターが収納された培
養槽を用い、かつサスペンジヨン液中の培養液を
盤状体の該フイルターを介して回転軸と同軸の導
管を通じて培養槽外へ排出することを特徴とする
細胞培養方法である。 さらに、前記本発明方法は、培養槽外から細胞
に悪影響を与えない水性液体媒体を該導管を通じ
て該盤状体のフイルターを介してサスペンジヨン
液中に記入させ、前記排出と流入とを交互に繰返
すことによつて一層有利に培養することができ
る。 かくして、本発明の培養方法によれば、サスペ
ンジヨン型の培養槽におけるサスペンジヨン液中
に少なくとも１個の前記盤状体よりなる回転型フ
イルターが沈められており、細胞が産出した老廃
物、代謝産物、その他生育阻害物質を含んだ古い
培養液が、サスペンジヨン液から盤状体のフイル
ターを介して導管を経て、培養槽外へ排出され、
或る時間経過すると、この排出を停止し、次いで
培養槽外から細胞培養に悪影響を与えない水性液
体媒体を導管を通じて盤状体へ供給して該液体媒
体をフイルターを介してサスペンジヨン液へ流入
せしめられる。 従つて、本発明方法においてサスペンジヨン液
中に沈められた盤状体によつてそれに設けられた
フイルターを介して水性液体媒体のサスペンジヨ
ン液中への供給とサスペンジヨン液中からの古い
培養液の排出とが交互に繰返され、かつ盤状体が
回転する回転軸の方向とフイルター領域の面を垂
直にすることにより、遠心力が生ずるためフイル
ターの細孔に細胞やその他固型物が詰り、実質的
なフイルター面積の効率低下をきたすことはな
く、有利に水性液体媒体の供給と古い培養液の排
出とをスムースに行うことができ、極めて容易に
高密度の細胞培養が可能となる。 特に本発明方法においては、盤状体を２個以上
簡単に直列に連結して使用することもできるの
で、細胞の種類と密度、培養条件、培養の規模の
変化に応じてフイルターの面積を適応させること
が可能である。 本発明の細胞培養方法はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら或いは
細胞を微小担体（マイクロキヤリアー）に担持し
て浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細胞
が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊に
本発明は細胞自体を浮遊させながら培養する方法
に有利に用いられる。 本発明の細胞培養方法を用いて培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的、或いは遺伝子操作により
変性された細胞であつてもよい。殊に本発明の培
養方法は動物細胞の培養に適している。 本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養槽
中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的に
水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン
類、補酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質など
の通常細胞培養に使用される添加成分が加えられ
ている。また培養液には血清を加えることもでき
るし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することもできる。 本発明方法において、培養槽外からサスペンジ
ヨン液中に供給される「細胞培養に悪影響を与え
ない水性媒体」としては滅菌水を主体としてこの
中に前記添加成分の一種又はそれ以上を加えて使
用することができる。この水性媒体は培養に必要
な全ての添加成分を含んでいる新しい培養液であ
つてもよく、また、これら成分を全て含んでいる
必要はない。また、水性媒体としては、本発明方
法に従つて盤状体を通じて培養槽外へ排出された
培養液（以下これを「古い培養液」ということが
ある）を一部として使用することも可能である。 本発明における盤状体のフイルター領域には培
養液は透過するが、細胞あるいはそれが付着した
微小担体又はそれが中に入つたマイクロカプセル
は透過しない大きさの細胞が多数設けられてい
る。細胞自体を浮遊させて培養させる場合、細孔
の大きさは細胞の大きさによつて左右されるが、
一般に平均孔径が10μ以下、好ましくは8μ以下が
適当である。一方微小担体（マイクロキヤリア
ー）の表面に細胞を付着させて培養させる場合、
又はマイクロカプセルを使用して培養させる場合
にはそれらが透過しない大きさの細孔である必要
がある。 また、該フイルターは、水を或る程度透過する
能力を有することが望ましい。すなわち該フイル
ターは水の透過係数（ml／m²・hr・mmHg）が10
以上、好ましくは100以上であるのが有利である。
一方上限は特にないが、20000以下、好ましくは
10000以下が望ましい。 さらに該フイルター領域には栄養分や細胞の老
廃物、代謝生産物などの如き分子量の小さい化合
物は透過するが分子量の大きい化合物（例えば分
子量1000以上、好ましくは5000以上）で透過しな
い膜、例えば限外濾過膜を使用することも可能で
ある。 本発明でいう盤状体とは、回転軸に垂直な面の
径をａ、回転軸方向の長さをｂとしたとき、ａ／
ｂの比が２以上100以下のものが適当であり、と
くに２以上30以下のものがよい。 また、培養槽における回転軸に垂直な培養槽の
断面積あたり盤状体のしめる面積比は10％以上95
％以下が好ましく、特に20％以上80％以下のもの
がよい。 盤状体の回転軸方向の断面の形状は薄い長方
形、変形、三角形、楕円、半楕円などが適当であ
る。 かかる盤状体には前記フイルター領域が少くと
も部分的に設けられており、そのフイルター領域
は盤状体のほぼ全面に設けられてもよく、一部で
あつてもよい。一部である場合には、上面或いは
下面、又はそれら面の一部であつてもよい。 以下、添付図面により本発明の細胞培養方法を
更に詳細に説明する。 添付第１図は、本発明の細胞培養方法を実施す
るための概略図の一例を示すものであり、第２−
Ａ図は本発明の方法に使用される盤状体の一例の
外観図で、第２−Ｂ図はその盤状体の断面構造を
示すもので、また第３−Ａ図は他の例の盤状体の
外観図であり、第３−Ｂ図はその断面構造を示す
ものである。また第４図は第１図とは別個の細胞
培養槽の概略図を示したものである。 第１図は盤状体５を回転作動させて培養する場
合を示したものであり、第１図において、１はサ
スペンジヨン型培養槽における培養槽本体であ
り、栄養物などを含む水性媒体はその供給槽２か
らポンプ３により供給導管４を通り、切り換え弁
１１を径て培養槽中へ送られる。培養槽１にはフ
イルター部分を有する盤状体５がそのフイルター
領域がサスペンジヨン液につかるように備えられ
ており、この盤状体は駆動部６により回転し、細
胞を培養液中に効果的に浮遊させる。盤状体の上
部又は下部又は中間にとりつけられた撹拌翼によ
つて撹拌をさらに効果的に行うことも可能であ
る。また別途に設けられたマグネチツクスターラ
ーでもよい。さらに培養液中の細胞を効果的に浮
遊させることのできる他の撹拌効果を有する手段
であつてもよい。 一方、古い培養液はポンプ３′によつて盤状体
５の下面に設けられたフイルター領域を透過し、
回転軸の中を経て導管４′を通つて培養槽外へ取
り出される。 第２−Ａ図の盤状体およびその断面を示した第
２−Ｂ図において、７はフイルター領域であり、
回転軸と同軸の導管８にとりつけられている。第
２−Ｂ図においてフイルターは平面の円型で下面
についているが、これは他の形状であつてもよ
い。例えば第３−Ａ図およびその断面を示す第３
−Ｂ図に示されているようにドーナツ型で上下両
面にフイルター領域（斜線部分）があつてもよ
い。 さらに培養槽には、酸素、二酸化炭素や栄養素
の濃度、PHの値を測定し、それらを或る範囲に維
持する装置が一般に設置されているが、本発明の
方法の実施にもこれらの装置が備えられていても
よいことはいうまでもない。しかし第１図及び第
４図にはこれらの付属装置は省略されている。 本発明の方法に用いられる新しい培養液は、こ
の中にブドウ糖、タンパク質の如き栄養源、種々
のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培養に
必要な成分を水溶液として含むものが使用される
が、さらに血清を含んでいてもよく、また含んで
いなくてもよい。これらの成分は必要なすべてを
培養液として供給してもよいが、一部の成分は、
他の供給手段によつて培養液中へ導入することも
可能である。 一般に細胞培養には酸素、二酸化炭素なども必
要であるが、これらは新しい培養液に溶存させて
供給してもよく、さらに第１図に示すように弁１
２を通してガス供給管１３より直接サスペンジヨ
ン液へ供給してもよい。 本発明方法においてひとつの盤状体は、いずれ
も水性体媒体（例えば新しい培養液）の供給と古
い培養液の排出とを交互に繰返しながら操作され
るが、その間隔は細胞の種類、密度、培養条件な
どによつて左右されるが、一般には１分乃至１
日、好ましくは５分乃至10時間の範囲で切り換え
ることができる。 第４図は本発明における盤状体の４個を９のよ
うに多段に直列につないだ列を示したものであ
り、盤状体の数およびフイルター部分の面積を増
減することにより培養槽に応じた撹拌と濾過面積
を容易に得ることが可能である。第４図におい
て、１，２，３，４，３′および１１，１４は第
１図と同様のものを意味する。 以上説明した本発明の方法によれば、サスペン
ジヨン型の細胞培養において連続的に培養液を供
給できかつ連続的に老廃物、代謝生産物、生育阻
害物質などを除去でき、またフイルターのめづま
りもおこらないため、高密度でしかも大量の細胞
を長期間にわたつて培養することが可能となる。 以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。 実施例 (1) 盤状体の性状； ガラスを用いて、添付図面２−Ａ図、２−Ｂ
図に示されるような盤状体を作つた。フイルタ
ー領域の径は8.0cmであつてフイルターは平均
孔径が3μの多数の微細孔を有しており、透水
率は４／m²・hr・mmHgであつた。 (2) 培養槽の形状； 添付第１図に示したような構造をした内容積
が500mlのガラス容器を培養槽として使用した。
この培養槽には第１図に示されているように１
つの盤状体が収納されており、盤状体を回転さ
せるモーターがふた上部に装着されている。ま
た、培養槽内にはCO₂ガスおよびO₂ガスの供給
導管が挿入されているが、これは第１図の１０
に該当する。 (3) 培養方法； 前期培養槽に液容積が300mlとなるように新
しい培養溶を入れ、その中にひとつの盤状体を
入れた。培養液には10％の牛胎児血清を含む
RPMI−1640培地を用いた。盤状体には第１図
の２に示すような新しい培養槽が切り換え弁を
介して導管で結合されている。また、古い培養
液は、盤状体のフイルターを介して導管を通つ
て培養槽外へ排出される。 培養槽のサスペンジヨン液中には、系内のPH
が6.5〜７、溶存酸素が３〜4ppmと一定になる
ようにCO₂ガスおよびO₂ガスを供給した。 培養槽の培養液中にマウスミエローマ細胞
P3U1を親株とするマウスハイブリドーマ
4C10B6細胞株を2.0×10⁵個／mlとなるように
加えた。この細胞は免疫グロプリン（IgG）生
産型の株である。 培養中のサスペンジヨン液は37.0℃に保持さ
れ、また盤状体は100rpmの回転数で回転させ
た。培養開始後、細胞密度が1.0×10⁶個／mlに
なつてから、新しい培養液の供給と古い培養液
の排出を行なつた。盤状体における供給と排出
の間隔はほぼ１時間単位で行い、１日における
新しい培養液の培養槽への供給量は約300mlで
あつた。しかし、培養開始後５日経過後はこの
新しい培養液の供給量を除々に増加させ、１日
あたり最高600mlとした。 (4) 培養結果； かくして９日間培養を行つた結果は下記の表
の通りであつた。 なお、新しい培地を全く供給しない以外は全
く同一の条件で培養を行つた時の最高の細胞密
度は、培養開始後４日経過後の1.2×10⁶個／ml
であつた。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養槽の全体を示す該略
図の一例を示すものである。第２−Ａ図は本発明
の細胞培養槽に使用される盤状体を示すものであ
り、第２−Ｂ図は、その断面図である。第３−Ａ
図は本発明に使用される盤状体の他の一例の外観
図であり、第３−Ｂ図はその断面図である。第４
図は、該盤状体を多段に直列につないだ培養槽の
一例の概略図を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サスペンジヨン型細胞培養方法であつて、該
   方法の細胞培養槽としてサスペンジヨン液中に培
   養液は透過するが、細胞は透過しないフイルター
   領域を少なくとも部分的に有する盤状体の少なく
   とも１個が培養液を培養槽外へ取り出す導管に該
   導管と同軸で回転し得るように取りつけられた回
   転型フイルターが収納された培養槽を用い、かつ
   サスペンジヨン液中の培養液を盤状体の該フイル
   ターを介して回転軸と同軸の導管を通じて培養槽
   外へ排出することを特徴とする細胞培養方法。 ２ 培養槽外から細胞に悪影響を与えない水性液
   体媒体を導管を通じて該盤状体の該フイルターを
   介してサスペンジヨン液中へ流入させ、第１項記
   載の排出と流入とを交互に繰り返すことを特徴と
   する細胞培養方法。