JPH0416183A

JPH0416183A - 動物細胞の培養方法及び装置

Info

Publication number: JPH0416183A
Application number: JP2117398A
Authority: JP
Inventors: Saichi Yamada; 佐一山田; Yoshihiro Kamiya; 神谷　佳宏; Takeshi Majima; 馬島　剛
Original assignee: NGK Insulators Ltd
Current assignee: NGK Insulators Ltd
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1990-05-07
Publication date: 1992-01-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は有用物質を産生ずる動物細胞を効率よく培養し
、かつ有用物質を高い濃度で得る方法及び装置に関する
ものである。

（従来の技術）動物細胞からホルモンや酵素、ワクチン、抗体などの生
理活性を有する有用物質を工業的に生産するプロセスに
おいて動物細胞の効率的な培養を行うこと、また、培養
液からの有用物質の分離精製を簡便な方法で行って有用
物質の濃度を高めることは近年の重要なテーマである。

従来、有用物質の産生を目的とする動物細胞の培養の一
手段としてサスペンジョン培養法があるが、一般にこの
方法において細胞が産生ずる有用物質の培養液中濃度は
極めて低く、同時に培養液から有用物質を分離精製する
ために煩雑な手段を必要とし、これらの要因による回収
率の低下、コストアップがサスペンジョン培養法におけ
る問題点であった。そこで提案されたのがたとえば特開
昭６１−２５７１８１号公報の記載にもあるように有用
物質と有効成分を含む培養液を長期間（１６〜１８日間
）Ｗｉ環することによって濃縮し、結果的に有用物質を
高い濃度で含む培養液を得ようとする方法である。

（発明が解決しようとする課題）ところで動物細胞の培養過程において動物細胞は通常、
多少とも培養液中にプロテアーゼ（蛋白質分解酵素）を
放出することが知られている。そこで動物細胞を培養、
有用物質を調製する際には細胞培養液中の有用物質がプ
ロテアーゼにより分解、失活を受けることがある。とく
に上記従来の方法（特開昭６１−２５７１８１号公報記
載の方法）においては、有用物質が培養液中で長時間維
持されるためプロテアーゼによる分解、失活を受けやす
く、また、有用物質を何回も循環することによっても分
解、失活の割合は高まるという問題点を有していた。

また、上記従来の方法は産生される有用物質自体が細胞
の生育、増殖を阻害する場合には有用物質が培養液に長
くとどまるため適用することができないという問題点を
有していた。

（課題を解決するための手段）本発明は上記問題点に鑑み、有用物質を産生ずる動物細
胞を効率良く培養し、かつ、有用物質を高い濃度で簡便
に得ることを目的としてなされた方法及び装置で、有用
物質を生産する動物細胞を培養槽中でサスペンジョン培
養する方法において（Ａ）前記培養槽内もしくは外でサ
スペンジョン培養液を動物細胞と有用物質を含有する培
養液に随時あるいは常時分離し、動物細胞を前記培養槽
へもどす工程、（Ｂ）前記工程（＾）で分離された有用物質を含有する
培養液を、前記有用物質と特異的に吸脱着する物質を固
定化したアフィニティカラムに注入し、前記有用物質を
吸着によって分離する工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で有
用物質を分離後に前記アフィニティカラムから流出した
培養液の少なくとも一部を前記培養槽へ戻す工程、（Ｄ）前記工程（Ｂ）で有用物質を吸着した前記カラム
内を吸着液で洗浄し、有用物質を精製する工程（Ｅ）前
記工程（Ｄ）で精製した有用物質を脱着液により溶出し
回収する工程、とからなることを特徴とする方法、及び培地貯留槽から
供給された培地と動物細胞により有用物質を生産する培
養槽と、培養槽で得られた培養液を動物細胞と有用物質
を含む培養液に分離する分離膜装置と、分離膜装置で分
離された有用物質を含む培養液から有用物質を特異的に
吸着分離する充填剤を詰めたアフィニティカラムと、ア
フィニティカラムから有用物質の１着分離中に流出する
培養液の少なくとも一部を培養槽に戻すための送液系路
と、あらかじめアフィニティヵラム内を平衡したり、ア
フィニティカラム内で吸着された有用物質を精製したり
するための吸着液を送るように設けられた送液系路と、
アフィニティカラム内で吸着された有用物質を溶出する
ための脱着液を送るように設けられた送液系路とからな
ることを特徴とする装置である。

（実施例）以下、実施例により本発明を詳述する。

〔培養システム装置〕

第１図は本発明を実施するのに好適な培養システム装置
であり、図中の符号（１）は培養槽、符号（２）は動物
細胞を透過させない細孔（細孔膜５μ以下）を有する膜
を備えた分ＭＨ装置であり、動物細胞培養が長時間にわ
たるため、使用する分離膜としては動物細胞の放出する
プロテアーゼ（蛋白質分解酵素）等の薬剤に対する耐久
性が強く、蒸気滅菌が可能なセラミック膜、好ましくは
回転セラミック膜モジュールが適しており、有機膜は薬
剤に対する耐久性や機械強度が弱いため膜に傷がつきや
すく、動物細胞に傷害を与えるため不適である。また、
通常動物細胞が８〜ｌＯμの大きさを有するため、膜の
孔径が５μより大きくなると、動物細胞がライン（財）
を通過するという問題が生じるしたがって、培養槽（１
）内の動物細胞密度を高め、精製された有用物質の純度
を高めるために、セラミック膜の孔径は５μ以下とする
必要がある。

符号（３）はＩｇＧ（イミュノグロブリンＧ）を特異的
吸着するプロティンＡ結合アフィニティカラム（この実
施例に用いたカラムは米国クロマトケム社製）で、充填
剤として０．２　ｃｍ／ｓｅｃ以上の高流速で培養液を
負荷できるシリカ系あるいはポリマー系充填剤を用いた
カラムである。ここで、アフィニティカラムに詰める充
填剤として、アガロース系、ポリマー系およびシリカ系
充填剤をあらかじめ検討し、その結果を第３図に示す。

アガロース系充填剤は軟質ゲルであるため、０．３　ｃ
ｄ／１１ｉｎ。

以上の高流速で有用物質を含む培養液を負荷すると、有
用物質が吸着されずにカラム内を素通りしてしまうとい
う問題が生じた。さらに、軟質ゲルであるために圧密現
象が起こり、充填剤がつぶれて破壊してしまうという間
匙が起きた。それに対し、ポリマー系、シリカ系のよう
な硬質ゲルでは高流速での操作が可能であり、圧力損失
が低く有用物質の分離、精製速度が大きくとれるという
利点があった。そこで、本培養システムでは、有用物質
を含む大量の培養液から有用物質を速やかに分離、精製
する性能を要求するため、アガロース系以外のポリマー
系もしくはシリカ系充填剤を用いるのが好適である。

そしてこれらの装置（１，２，３）はラインＱ２１、ラ
イン（ロ）、ライン０ω、ライン側により順次連結され
、アフィニティカラム（３）から出るラインａ９はライ
ン（２１）と、培養槽（１）への循環経路であるライン
（ハ）に分岐し、かつライン０ωにはアフイニテイ力ラ
ム（３）への培養液の注入をしない場合に培養槽（１）
へ帰還するためのライン（２２）が設けられている。

また、図中の符号（４）は培養槽（１）へラインＯＩに
より新培地を注入する培地貯留槽、符号（５）及び符号
（６）は有用物質の吸着緩衝液槽、及び有用物質の脱着
用緩衝液槽で、それぞれラインＯｅ及びラインｃ′Ｉ）
によりアフィニティカラム（３）と連結している。

さらに符号（７）は分離膜装置（２）の通過速度が非常
に遅い場合にもシステム装置全体が円滑に作動するよう
に設けられた有用物質を含有する培養液を一旦保留する
りザーバー、符号（Ｂ）はアフイニテイカラム（３）か
ら流出する培養液の有用物質を確認するための紫外線吸
収スペクトル測定器である。

なお、符号（３１）〜（３７）で示す部材はバルブであ
り、符号（３８）はパルプ（３２）〜（３７）の開閉及
びライン００の液流速を調節するように設けられたマイ
クロコンピュータ−内蔵の制御装置である。

〔培養液〕

培養槽（１）の容積は８００　ｍで培養液としてＲＰＭ
１１６４０培地５．５６ｇ　、ダルベツコ変法イーグル
培地２．６ｇ、ハム−１２培地２．８９ｇ　、水１１を
混合した基本培地に、増殖因子としてトランスフェリン
１２μｇ／ｄ、インスリン７μｇ７１ＩＩｌ、牛血清ア
ルブミン５■／−、エタノールアミン１２ｐｇ／ｄ、亜
セレンＭ２×１０−’ｍｏｌ／　ｊ２を混入したものを
用いる。

〔培養方法及び精製方法〕

あらかじめオートクレーブ滅菌した培養槽（１）に培養
容積が約１２０７になるように培養液を送入しここにマ
ウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウスＢセルを融合して
得られたマウス×マウスハイブリドーマ７０１１株を２
Ｘ１０’個／ｄとなるように播種した。培養槽にはライ
ン００から炭酸ガス５％を含む酸素ガスが培養液中の溶
存酸素が３１１１１１１となるよう調節して送入されて
いる。培養槽中の培養温度は３７℃に保持され、かつ培
養液はプロペラ型攪拌装置により攪拌速度６０ｒｐ■で
攪拌されている。

まず、播種後１０日間は半回分培養を行った。第１表に
示すように培養開始後１０日後に正味培養容積が５００
　ａｆとなるように培養液を供給した。そして培養開始
後１１日目に細胞密度は５．８　ＸＩＯ’個／ｄに、さ
らに、回分培養での限界と判断される細胞密度１〜２Ｘ
１０’個／ｄに到達した。

一方、アフィニティカラム（３）はあらかじめ、有用物
質の吸着用緩衝液と、有用物質の脱着用緩衝液とを繰り
返しラインＯｅ及びライン０７）から流入してυＶ検出
器（Ｂ）の２８ｏｎ−における吸収が零で安定するまで
洗浄を行い、最後に再度吸着用緩衝液を流してアフィニ
ティカラム（３）を平衡状態にしておくそして限界近く
の細胞密度まで培養された培養液をポンプＰ２を駆動す
ることにより分離膜装置（２）に導入、続いてセラミッ
ク膜を通過した有用物質を含む培養液をラインに）及び
ライン０５１を経て先に吸着用緩衝液で平衡状態に保た
れたアフィニティカラム（３）に注入する。なお、この
場合にはバルブ（３２）及びバルブ（３５）は開、バル
ブ（３６）及びバルブ（３７）は閉とし、有用物質であ
るＩｇＧをカラム（３ンで生物学的親和力で吸着させた
あと、カラムを素通りした培養液を培養槽（１）にライ
ン１２１で戻す。一方、分離膜装置（２）のセラミック
膜を通過しなかった液もライン面より培養槽（１）へ戻
される。ここで、有用物質のカラム吸着量はカラムの吸
着能力内に抑えるべきでその能力を越えては培養液はカ
ラム（３）に注入せず、バルブ（３２）、（３５）、（
３６）を閉じ、バルブ（３７）を開としてライン（２２
）、［相］を経て培養槽（１）に帰還される。

次に、有用物質（ＩｇＧ＞を充分に吸着したアフィニテ
ィカラム（３）を吸着用緩衝液を高速度でライン０ωか
ら注入し、ライン（２１）へ流出することによって洗浄
、続いて脱着用緩衝液をライン０７）から注入してカラ
ムに吸着されている有用物質をライン（２１）を経て迅
速に回収する。

その後、再び吸着用緩衝液でカラムを平衡状態にし、バ
ルブ（３２）、（３５）を開、バルブ（３６）、（３７
）を閉として先の吸着操作、及び脱着操作を１日当りの
ＩｇＧ生産量を回収するまで繰り返した。

そして以上の動物細胞の培養及び有用物質の回収操作を
１８日間継続した。

〔比較例〕

培養開始後、１１日目からバルブ（３７）を開とし、バ
ルブ（３２）、（３５）、（３６）を閉として培養を行
った以外は実施例とすべて同条件である。

なお、この比較例は第２図に示したシステム装置を用い
て培養を行ったことに相当する。

〔結果〕

実施例の結果を第１表に比較例の結果を第２表に示す。

第１表細胞：　ＩｇＧを産生ずるマウス×マウスハイプリドー
マ７１１１１株マうス×マウスバイブリド〜７７ｏ１１株の培養第２表細胞：　ＩｇＧを産生ずるマウス×マウスハイブリドー
マ７０１１株マウス×マウスハイブリドーマ７０１１株の培養（作用
及び効果）先の実施例及び比較例の実験結果から明らかなように培
養系内抗体濃度を常に低く抑えた本発明の実施例の方法
によると、比較例の方法に比べて抗体精製量がかなり高
くなっていることがわかるこれは、本発明の方法及び装
置においてはＩｇＧなどの有用物質を随時分離、精製し
ながら動物細胞を培養しているので、動物細胞が放出す
る蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）により有用物質が分
解、失活されるのを抑制できるためである。また、本発
明では有用物質を何回も循環することもなく、速やかに
アフィニティカラムに吸着された安定な状態に維持でき
ることも、有用物質の生産性をさらに高めることのでき
る要因である。そして、高流速で培養液を注入できるア
フィニティカラムを効率的に利用し、培養装置の中に組
み込んだことにより、濃縮工程を別途設ける必要がなく
、精製コストを削減できるとともに、培養槽（１）内の
血清や成長因子などの高価な物質を含む培養液をそのま
ま再利用できる点でも有用である。

なお、産生される有用物質自体が細胞の生育、増殖を阻
害するものである場合には有用物質を常時分離するこの
培養方法及び装置は特に有効であり、生産性は飛躍的に
向上する。

以上に説明したとおり、本発明は従来の問題点を一掃し
た動物細胞の培養方法及び装置として、産業の発展に大
いに寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の詳細な説明するための培養システム装
置の図、第２図は比較例を説明するための培養システム
装置の図、第３図はアフィニティ力うム用充填剤の精製
能力を検討したグラフである。第１図（１）：培養槽、（２）：分離膜装置、（３）：アフィ
ニティカラム。

Claims

【特許請求の範囲】１、有用物質を生産する動物細胞を培養槽中でサスペン
ジョン培養する方法において、（Ａ）前記培養槽内もしくは外でサスペンジョン培養液
を動物細胞と有用物質を含有する培養液に分離し、動物
細胞を前記培養槽へもどす工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）
で分離された有用物質を含有する培養液を、前記有用物
質と特異的に吸脱着する物質を固定化したアフィニティ
カラムに注入し、前記有用物質を吸着によって分離する
工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で有用物質を分離後に前記
アフィニティカラムから流出した培養液の少なくとも一
部を前記培養槽へ戻す工程、（Ｄ）前記工程（Ｂ）で有用物質を吸着した前記カラム
内を吸着液で洗浄し、有用物質を精製する工程（Ｅ）前
記工程（Ｄ）で精製した有用物質を脱着液により溶出し
回収する工程、とからなることを特徴とする動物細胞の培養方法２、培
地貯留槽（４）から供給された培地と動物細胞により有
用物質を生産する培養槽（１）と、培養槽（１）で得ら
れた培養液を動物細胞と有用物質を含む培養液に分離す
る分離膜装置（２）と、分離膜装置（２）で分離された
有用物質を含む培養液から有用物質を特異的に吸着分離
する充填剤を詰めたアフィニティカラム（３）と、アフ
ィニティカラム（３）から有用物質の吸着分離中に流出
する培養液の少なくとも一部を培養槽（１）に戻すため
の送液系路（２０）と、あらかじめアフィニティカラム
（３）内を平衡したり、アフィニティカラム（３）内で
吸着された有用物質を精製したりするための吸着液を送
るように設けられた送液系路（１６）と、アフィニティ
カラム（３）内で吸着された有用物質を溶出するための
脱着液を送るように設けられた送液系路（１７）とから
なることを特徴とする動物細胞の培養装置。