JPH022342A - ｐＨ調整，アンモニア除去機能を有する生物細胞培養方法及びその培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物細胞の培養方法に係り、特に中和剤を培養
液中に添加せずに培養液のｐＨを調整し、かつ増殖を阻
害する代謝生成物であるアンモニアを除去することを特
徴とする生物細胞を効率よく増殖させる培養方法及びそ
の培養装置に関する。

〔従来の技術〕 動物細胞にはガラス面等に付着して生育する単層培養さ
れる付着性細胞と、浮遊状態で生育し浮遊培養される懸
濁性細胞がある。前者には上皮性細胞、線維芽細胞等が
含まれ、後者にはリンパ芽球様細胞、赤芽球様細胞、腹
水癌細胞等が含まれる。近年、インターフェロン等の生
理活性物質の生産にこれら動物細胞が用い得ることが明
らかになり、その大量培養に関して、多くの検討が試み
られてきた。

これらの細胞の培養には、細胞を損傷させずにｐｌ＋を
適値にコントロールすること、特に、細胞は浸透圧の変
化又は適応幅が狭いため、緩衝剤の添加なしにコントロ
ールすることが望まれてきた。

さらに、培養中に、細胞の代謝に伴い各種の老廃成分が
分泌されるが、その中で特にアンモニウムイオンの阻害
の影響が大きい。そのためアンモニウムイオンを選択的
に除去できることも望まれてきた。

従来、培養液中のｐＨ制御に関しては、■　細胞を培養
液から固液分離し、フレッシュ培地に再懸濁するいわゆ
る潅流培養により、酸性化の原因である乳酸や増殖を阻
害するアンモニウムイオンを除く方法。

■　Ｎａ）ＩＣＯ：ｌを添加した培地に適当量の炭酸ガ
スを接触させてｐＨ７付近に調整後、密栓状態で培養す
る。

■　Ｎａ１ｌＣＯ：＋を添加した培地に細胞を接種後、
炭酸ガス濃度を５％に調整した空気気流下で培養する（
特願昭５８−７６０８６号）。

■　ＮａＨＣＯ：＋を添加した培地に細胞を接種後、培
養槽気相部に導入する空気中の炭酸ガス濃度を変化させ
ながら培養する（特願昭５８−８１７８１号）。

等の方法がとられてきた。

しかし、これらの方法はいずれもコントロールできるｐ
Ｈの範囲は掻くせまく、乳酸が１１０００ｐｐを越えて
ｐＨが低下すると対応できなくなる。

アンモニアの除去については液の入れ換え、すなわち潅
流により対応する方法のみであるが、培地には高価な血
清やアミノ酸、ビタミン類の消耗が極めて大きく得策で
はない。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の通り、従来技術のｐＨコントロール方法は、乳酸
生成に伴うｐＨ低下に対応できず、かつアンモニアを選
択的に除去することができない。

本発明者らは、細胞の連続培養中に両課題を同時に解決
する培養方法につき鋭意検討を続けた。

培養中に培養濾液をシリコンゴム配管を通してポンプで
加圧移送中、シリコンチ工−プ中の液がアルカリ化する
ことに気すき、原因を検討した結果、炭酸ガスがシリコ
ンゴムを透過するためであることを見い出した。さらに
アルカリ化した培養濾液にＣｏ２除去空気を通気したと
ころ、アンモニウムイオンを効率よく気化させうること
を見出し、本発明に到達した。

本発明の目的は、ｐＨコントロールを緩衝剤の添加なし
にかつ細胞を損傷させずに行うと同時にアンモニアを選
択的に除去する培養方法及びそのための培養装置を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の特徴は、培養液、培養濾液、液体培地を
二酸化炭素透過性膜の片側と接触させ、液中から膜外に
二酸化炭素を除去することにより、液のｐＨを上昇させ
、処理液を培養槽に導入してｐＨを調整しつつ培養する
ことである。

本発明に適用できる生物細胞は主として動物細胞と植物
細胞であるが嫌気性微生物や原生動物にも適用できる。

特に、動物細胞の培養に適している。動物細胞としては
、懸濁性（浮遊性）や付着性を問わず使用できる。植物
細胞も単細胞はもちろん組織培養にも通用できる。

本発明に適用できる液体培地は特に限定されないが、炭
酸水素塩もしくは炭酸塩を含む培地に特に効果的である
。培地は使用する細胞の種類により適宜選択される。例
えば、動物のハイブリドーマ細胞ならイーグル培地であ
るように使用動物及び使用目的及び使用条件により、構
成栄養成分の組成を適宜選択して用いる。

ｐ　Ｈ１１街用の炭酸水素塩もしくは炭酸塩として、最
も使用しやすく、かつ経済的なものは炭酸水素ナトリウ
ムであるが、培養条件によっては炭酸水素カリウム、炭
酸ナトリウム、炭酸カリウムも用いられ、併用すること
も可能である。

培養方法は、懸濁培養が主な対象となるが、付着性細胞
の培養に際しても、担体が微細な場合や担体と付着して
いない状態の細胞を含む培養液の場合も包含される。例
えば担体としては、ビーズ、膜、センイ等があげられる
。

培養方法も使用細胞に適した方法が適宜選択されるが、
液体培地を用いる限り、特に限定されず公知の方法、例
えば懸濁性細胞では、槽内を撹拌して混合しながら、培
地と酸素を供給する完全混合型懸濁培養、付着性細胞で
はマイクロビーズ付着培養、フォロファイバー付着培養
等が用いられる。ｐＨのコントロール方法も特に限定さ
れるものではなく、前述したように炭酸水素塩もしくは
炭酸塩存在下で用いられる。多には、培養槽内に通ずる
気体の一つとして二酸化炭素もしくは二酸化炭素含有ガ
スが用いられる。スチーム殺菌を行う場合、膜には少な
くとも１２０°Ｃで１．２　ｋｇ　／　ｃｆ以上の耐圧
を有する硬さが必要である。膜の形状は中空系膜型や平
膜型環目的、用途、使用条件により適宜選択して用いる
。使用圧も処理対象となる液の種類及び含有乳酸濃度に
より適宜選択される。

液として、細胞を含まない液、例えば液体培地や培養濾
液は脱炭酸するために、必要な圧だけ加圧できるが、細
胞を含有する培養液そのものの処理では、高い圧力で処
理すると細胞が破壊や損傷をうける。そのため、一般に
２　ｋｇ　／　ｃｒＭ以下の操作圧で行われる。

処理する際の温度も適宜選択されるが、培養液では、培
養温度もしくは±５°Ｃの温度範囲が適している。培養
濾液や培地は特に限定されないが、室温で十分目的が達
せられる。

炭酸ガス透過膜も毒性溶解成分を含まなければ炭酸ガス
透過性の高い膜であれば使用できる。例えば、シリコン
ゴム、ポリエチレン、酢酸セルロース、塩化ビニル、塩
化ビニル−酢酸ビニル共重合体、フッカ有機樹脂、可塑
化フッ素樹脂、ポリスチレン、エチルセルロース、ポリ
イソブチレン、ブチルゴム、ポリビニルブチラール等の
公知の炭酸ガス透過性の高い有機材料の膜が用いられる
。

膜の厚さ、形状、集合化形態等は材料の種類、対象培養
液、操作条件により適宜選択される。例えば、管状や平
膜あるいは平膜の積層物、中空系モジュール等の中から
選ばれる。

膜を介して液側から膜外の気相部に炭酸ガスとして液中
の炭酸イオンを放出するには、液を加圧したり、逆に気
相部を減圧するなど、少なくとも液側の圧が気相部の圧
よりも相対的に大きくすればよい。両相の絶対圧及び差
圧は、液の種類、膜の性質、目標とする処理効率により
適宜選択される。例えば、シリコンゴムの場合、０．２
　ｋｇ　／　ｃｆ程度の差圧でも実用性の箭い除去効率
を有する。

加圧や減圧は、従来公知の方法が十分適用できる。例え
ば、加圧の際には、調圧弁で圧力を調節しながらポンプ
で液を圧送したり、膜構造物を減圧室に収納したりすれ
ばよい。また、拡散を助けるため、脱気相部をファン等
で撹拌するとさらに効果的である。

圧の調節は培養槽内の液のｐＨをｐＨセンサでモニタし
、設定ｐＨよりも上昇したときに、加圧用ポンプ又は減
圧用ポンプを作動させ、液を循環すればよい。圧力調節
は通常、設定圧でオンオフする圧力コントローラを用い
弁の開閉を上記ポンプと連動させればよい。

また、脱炭酸の対象とする液は、細胞を含む培養液その
ものでもよいが、操作範囲が広くかつ、効率を高く望む
場合は、−旦、培養液中から細胞を除去して、これを培
養槽に返送し、細胞を除去した培養液につき、脱炭酸を
行えばよい。さらに補助的手段として、液体培地の一部
を膜で脱炭酸してアルカリ化した培地を培養槽に添加す
ることも可能である。これらの運転形態は、適宜、各状
況により選択して用いればよい。

尚、培養液からの細胞の除去方法は特に限定されるもの
ではなく、従来公知の方法、例えば、遠心分離、濾過、
重力沈降等が適用される。

本発明の第２の特徴は、アルカリ化した培養濾液を二酸
化炭素非含有気体で曝気することにより増殖阻害成分で
あるアンモニアを気化させて除去し、除去した培養濾液
を培養槽に返送することである。

アンモニア除去に適した培養濾液のｐＨは少なくとも７
．０以上、好ましくは７．２以上である。曝気に用いる
通気ガスとしては二酸化炭素を含有しないでかつ生物前
でないガスであればよい。例えば、脱ＣＯ□空気や、酸
素と窒素の混合ガス等が用いられる。通気量も、液のｐ
Ｈ１装置により適宜選択されるが、Ｑ、０１ｃｍ／ｓｅ
ｃ以上の通気線速度が好ましい。

尚、培地中には血清を添加したり、培養中に生成する蛋
白や多糖類のため、試料液が発泡しやすい場合が多い。

このような場合には液面上に消泡機構が必要である。例
えば、ポリオルガノシリコンを含有する網を消泡層とし
て、液面上に設置する等の対策がとられる。

温度も適宜、選択される。アンモニアの気化からは高い
温度が好ましいが、培養濾液中の蛋白成分等が変質、変
性するため、培養温度付近かそれ以下で行うことが好ま
しい。

次に、本発明の具体例をあげ以下にさらに詳しく説明す
る。

ｌ）炭酸塩を含有する培養液、培養は液、液体培地のい
ずれか一種、もしくは二種以上を、二酸化炭素透過性を
有する膜と接触させ液圧を膜外の圧力に対して相対的に
高めて膜外にＣＯ□ガスを排出することにより液のｐＨ
を上昇させる第１工程と、第１工程で得られる処理液を
培養槽に返送する第２工程とからなる生物細胞の培養方
法。具体例を第１〜６図に示す。

２）炭酸塩を含有する培養液を二酸化炭素透過性を有す
る膜と接触させ液圧を膜外の圧力に対しし相対的に高め
て膜外にＣＯ，ガスを排出することにより液のｐＨを上
昇させる第１工程と、第１工程で得られる処理液を二酸
化炭素非含有気体で曝気処理してアンモニアを液中から
除去する第２工程と、第２工程で得られる処理液を培養
槽に返送する第３工程とからなる生物細胞の培養方法。

具体例を第３図、第６図に示す。

３）前記１）又は２）に於て、法例の圧力が外気圧に比
べ大きいことを特徴とする生物細胞の培養方法。

４）前記３）に於て、外圧が外気圧よりも小さいことを
特徴とする生物細胞の培養方法。

５）前記１）〜４）に於て、培養液中のｐＨを制御の設
定値以下の場合に、ｐＨ監視制御装置と液の処理系とを
連動化させてｐＨを上昇させることを特徴とする生物細
胞の培養方法。具体例を第１〜６図に示す。

６）上記１）又は２）に於て、二酸化炭素を有する膜が
シリコンゴム、ポリエチレン、酢酸セルロース、塩化ビ
ニル、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体、可塑化フッソ
樹脂、ポリスチレン、エチルセルロース、ポリイソブチ
レン、ブチルゴム又はポリビニルブチアールであること
を特徴とする生物細胞の培養方法。

７）培養槽から出て、培養槽に戻る培養液のループ状配
管の途中に、少なくとも炭酸ガス透過性膜、圧力調節弁
を挿設してなる生物細胞培養装置。具体例を第１〜６図
に示す。

８）前記７）に於て、該ループ状配管に少なくとも培養
液抜出しポンプ、アルカリ化培養液返送ポンプを挿設し
てなる生物細胞培養装置。具体例を第１〜６図に示す。

９）前記８）に於て、圧力調節弁を設定圧に調節する圧
力コントローラと、培養槽内培養液中に２’５　？ｆｌ
せるｐＨセンサの信号により培養液抜出しポンプ及びア
ルカリ化培養液返送ポンプの両ポンプの作動を調節する
ｐＨコントローラを系内に装着した生物細胞の培養装置
。具体例を第１〜６図に示す。

１０）前記７）に於て、該炭素ガス透過膜の気相側を残
圧室内に収納もしくは減圧室と連通してなる生物細胞の
培養装置。

１１）前記７）〜１０）に於て、培養液の移動するルー
プ状配管の途中で、炭酸ガス透過膜と培養槽との間に少
なくとも細胞分離装置を挿設してなる生物細胞の培養装
置。具体例を第２＋　　３＋　　５＋６図に示す。

１２）前記１１）に於て、培養槽と細胞分離装置との間
に培養液移送ポンプ、細胞分離装置と炭酸ガス透過膜と
の間に、細胞除去培養液移送ポンプを挿設し、細胞分離
装置から細胞を培養槽に返送する系路を有し、培養液移
送ポンプ、細胞除去液移送ポンプ、細胞除去アルカリ化
培養液移送ポンプの作動を調節するｐＨコントローラを
系内に配してなる生物細胞の培養装置。具体例を第２．
３．４，５．６図に示す。

１３）前記１２）に於て、圧力調節弁と培養槽との間に
アンモニア除去装置を挿設してなる生物細胞の培養装置
。具体例を第３．第６図に示す。

１４）１）〜１３）に於て、培養槽と培地貯槽との培地
供給系路に並行して、両槽間に培地移送ポンプ、炭酸ガ
ス透過膜、圧力調節弁を挿設したもう一つの培地供給系
路を付加し、かつ両培地供給系路上の培地移送ポンプを
ｐＨコントローラにより作動させてなる生物細胞の培養
装置。具体例を第４．５．６図に示す。尚、培養液中か
ら目的生産物を分離回収する場合には、本発明なるプロ
セス中で適宜実施すればよい。

例えば第２図の細胞分離装置１６以降、培養槽１との間
の経路中に抗体蛋白を固定したアフィニティークロマト
等による分離回収用の分岐工程を適宜挿入すればよい。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により説明する。但し、本発明はこ
の実施例により限定されるものでない。

実施例１ ラット肝臓の癌細胞株Ｊ　Ｔ　Ｃ−１（Ｊａｐａｎ　ｔ
ｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ　Ｎｏ、　１株）をＭＥＭ培
地５ｒｎｌを分注した扁平フラスコ１５ケを静置培養し
た。培養温度は３７°Ｃ１気相ガスは炭酸ガスを５％（
Ｖ／Ｖ）混合添加した空気とした。３日間培養したフラ
スコの表面に付着した細胞をはく離し、細胞濃度１×ｌ
ｏ５細胞／ｄの種培養液７５ｒｎｌを得た。本培養液を
遠心分離し、上清をすて、同容量の液体培地に懸濁した
。

次に、直径７０ｍｍ、高さ３９０ｍｍ、容ｆｆｉ１５０
０ｍｌの円筒形のガラス製培養槽に上記の種細胞懸濁液
３０ｍ／、液体培地１２５ｄ　（０，５％Ｎａ１ｌＣＯ
：＋含有）、３７°Ｃに保温した。培養槽上部には有機
性硅素ポリマーを塗布したポリエチレン製網を消泡層上
して配置する他、槽底部に空気吸込用ガラス製多孔質ノ
ズルと、槽側壁から液中のｐＨ電極を配置した。槽底部
から滅菌した空気を通気線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃで通
気してｐＨを監視しながら５日間培養した。

一方、同型式の培養槽を用意し、同一培地に同一バッチ
の種細胞液を接種し、通気条件、温度条件を同一として
培養を開始した。培養槽から培養液を抜き出し細胞を濾
過分離する装置を接続し、さらに内径２　ｍｍ、外径４
ｍｍ、長さ１ｍのシリコンチューブを経て圧調節バルブ
を設けた。

ｐＨコントローラの設定下限ｐＨを６．８に設定した。

培養槽内ｐＨが６．８に達した時、培養液抜出しポンプ
が作動し、圧調節バルブの設定圧１．。

ｋｇ　／　ｃＪになるまでシリコンチューブに圧送した
。

その結果、培養液のｐＨは７．８０に上昇し、返送ポン
プにより培養槽に返送された。上述のｐＨ調整を培養期
間中、自動的に繰り返し５日間培養を継続して、培養液
中の細胞濃度を測定した結果、５．８×１０６細胞／ｄ
であった。また、アンモニウムイオン濃度は３８ｐｐｍ
であった。

比較例 実施例１と同型の培養槽及び同一バッチの種細胞及び培
地を用い培養した。但し、実施例１０方式でのｐＨコン
トロールは行わず、培養槽気相部にＣＯ□含有空気を通
気して、ｐＨコントローラ　（設定下限ｐＨ６，８）と
してＣＯ□濃度制御により培養した。５日培養後、ｐＨ
は６．１まで低下し、細胞濃度は２．５Ｘ１０６細胞／
ｍｌ、アンモニア濃度は３２ｐｐｍであった。

実施例２ ラット肝臓の癌細胞株Ｊ　Ｔ　Ｃ−ＨＪａｐａｎ　ｔｉ
ｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ　Ｎｏ、　１株）をＭＥＭ培地
培地５壱ｌ注した扁平フラスコ１５ケを静置培養した。

培養温度は３７°Ｃ１気相ガスは炭酸ガスを５％（Ｖ／
Ｖ）混合添加した空気とした。３日間培養したフラスコ
の表面に付着した細胞をはく離し、細胞濃度ｌＸｌ０’
細胞／ｒｎｌの種培養液７５−を得た。本培養液を遠心
分離し、上清をすて、同容量の液体培地に懸濁した。

次に、直径７０＋ｎｍ、高さ３９０＋ｎｆｆ１．容１１
５００ｒｎｌの円筒形のガラス製培養槽に上記の種細胞
懸濁液３０ｒｎ！、液体培地７２５ｍＺ　（０，５％Ｎ
ａ１ｌＣ０３含有）、３７°Ｃに保温した。培養槽上部
には有機性硅素ポリマーを塗布したポリエチレン製網を
消泡層として配置する他、槽底部に空気吸込用ガラス製
多孔質ノズルと、槽側壁から液中のｐＨ電極を配置した
。槽底部から滅菌した空気を通気線速度０．２ｃｍ／ｓ
ｅｃで通気してｐＨを監視しながら５日間培養した。

一方、同型式の培養槽を用意し、同一培地に同一バッチ
の種細胞液を接種し、通気条件、温度条件を同一として
培養を開始した。培養槽から培養液を抜き出し細胞を濾
過分離する装置を接続し、さらに内径２　ｍｍ、外径４
　ｍｍ、長さ１ｍのシリコンチューブを経て正調節バル
ブを設けた。

ｐＨコントローラの設定下限ｐＨを６．８に設定した。

培養槽内ｐＨが６．８に達した時、培養液抜出したポン
プが作動し、細胞を分離した残りの培養濾液が正調節パ
ルプの設定圧１．０　ｋｇ　／　ｃ＋ａになるまでシリ
コンチューブに圧送した。その結果、培養濾液のｐＨは
７．８２に上昇した。次いでアルカリ化した培養濾液を
直径２ｃｍ、長さ１５ｃｍの脱アルカリ塔に導入し、塔
底部から５０ｎｆ／ｓｅｃで脱炭酸空気を５分間通気し
て脱アンモニア化した。脱アンモニア化した培養濾液を
培養槽に返送した。培養槽内の細胞濃度及びアンモニア
濃度を測定した結果、８．２Ｘ１０６細胞／−１１０ｐ
ｐｍであった。

実施例３ 本発明の装置フローを第１図に示す。

培養槽１中の培養液は培養液抜出しポンプ６により炭酸
ガス透過性膜管３に加圧送入され、炭酸ガスが減少し、
アルカリ化した液はアルカリ化培養液返送用ポンプ１２
により培養槽１に返送される。

培養槽にはｐＨ電極５が付設してあり、培＃液のｐＨも
監視、ｐＨコントローラ４の設定ｐＨよりも低下した際
、ポンプ６．１２が作動し、中和作業が進行する。尚、
圧力調節弁８は脱炭酸に適した操作圧になる様、圧力コ
ントローラの設定圧で開閉を調節できるようになってい
る。

実施例４ 本発明の他の装置フローを第２図に示す。

培養槽Ｉ中の培養液はポンプ６で細胞分離装置１６に送
られ、精密濾過膜１７により細胞含有フラクションと、
培養濾液フラクションに分離される。

細胞フラクションは培養槽に返送される。培養濾液はポ
ンプ１９で炭酸ガス透過性膜管に加圧送入され、脱炭酸
してアルカリ化した培８濾液がポンプ１２により培養槽
１に返送され、ｐ　Ｈ８１１整が行われる。

実施例５ 本発明の他の装置フローを第３図に示す。

培養槽１中の培養液はポンプ６で細胞分離装置１６に送
られ、精密濾過膜１７により細胞含有フラクションと、
培養濾液フラクションに分離される。

細胞フラクションは培養槽に返送される。

培養濾液はポンプ１９で炭酸ガス透過性膜管；３に加圧
送入され、脱炭酸してアルカリ化される。アルカリ化し
た培養濾液はアンモニア除去装置２０に導入され、装置
底部から導入される脱炭酸処理空気により曝気される過
程でアンモニアが除去される。アンモニア除去したアル
カリ化培養濾液はボンプ１２で培養槽Ｉに返送され、ｐ
Ｈコントロールが行われる。

実施例６ 本発明の他の装置フローを第４図に示す。

培養槽１中の培養液はポンプ６で炭酸ガス透過性膜３に
、さらに培地貯槽中の培地１５はポンプ１３′により炭
酸ガス透過性膜管３に加圧送入される。

脱炭酸によりアルカリ化した培養液及び培地はそれぞれ
培養槽１に返送される。

実施例７ 本発明の他の装置フローを第５図に示す。

培養槽１中の培養液２は移送ポンプ６で細胞分離装置１
９に送られ、精密濾過膜Ｉ７により細胞含有フラクショ
ンと、培養濾液フラクションに分離される。、細胞フラ
クションは培養槽に返送される。

アルカリ化した培養濾液はポンプ１２により培養槽に返
送されｐＨ調整が行われる。さらに、培地貯槽１４中の
培地の１部もポンプ１３′　で炭酸ガス透過性膜管３に
圧入され脱炭酸によりアルカリ化してｐＨ調整に用いら
れる。

実施例８ 本発明の他の装置フローを第６図に示す。

培養槽ｌ中の培養液２は移送ポンプ６で細胞分離装置１
６に送られ、精密濾過膜１７により細胞フラクションと
培養濾液フラクションとに分離される。

細胞フラクションは培養槽１に返送される。次に培養濾
液はポンプ１９により炭酸ガス透過性膜管３に送られ脱
炭酸されアルカリ化する。アルカリ化した培養濾液は脱
アンモニア装置２０に送られ、アンモニアを除去した後
、培養槽１に返送される。

さらに、培地１５の１部もポンプ１３′　で炭酸ガス透
過性膜管３に送られアルカリ化される。アルカリ化した
培地は培養槽ｌに導入され、アンモニア除去培養濾液と
合せてｐＨ調整のために使用される。

実施例９ ラット肝臓の癌細胞株Ｊ　Ｔ　Ｃ−１（Ｊａｐａｎ　ｔ
ｉｓｓｕｅｃｕｌ　Ｌｕｒｅ　Ｎｏ、　１株）をＭＥＭ
培地培地５壱ｌ注した扁平フラスコ１５ケを静置培養し
た。培養温度は３７°Ｃ２気相ガスは炭酸ガスを５％（
Ｖ／ν）混合添加した空気とした。３日間培養したフラ
スコの表面に付着した細胞をはく離し、細胞濃度１×１
０ｓ細胞／ｒｄの種培養液７５ｍＺを得た。本培養液を
遠心分離し、上清をすて、同容量の液体培地に懸濁した
。

次に、直径７０ｍｍ、　筋さ３９０＋ｎｍ、容［１５０
０−の円筒形のガラス製培養槽に上記の種細胞懸濁液３
０ｍｆ、液体培地７２５ｍＺ　（０，５％ＮａＨＣＯｚ
含有）、３７°Ｃに保温した。培養槽上部には有機性硅
素ポリマーを塗布したポリエチレン製網を消泡層として
配置する他、槽底部に空気吸込用ガラス製多孔質ノズル
と、槽側壁から液中のｐＨ電極を配置した。槽底部から
滅菌した空気を通気線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃで通気し
てｐＨを監視しながら５日間培養した。

一方、同型式の培養槽を用意し、同一培地に同一ハツチ
の種細胞液を接種し、通気条件、温度条件を同一として
培養を開始した。培養槽から培養液を抜き出し細胞を濾
過分離する装置を接続し、さらに内径２ｆｆＩＩ１１、
外径４ｆｆｌＩＩ＋、長さ１ｍのシリコンチューブを経
て正調節バルブを設けた。

〔発明の効果〕

細胞の損傷させることなく　　ｐＨをコントロールでき
かつ増殖阻害を引きおこすアンモニウムイオンを除去し
て、効率よく細胞を増殖することができる。

実施例１及び実施例２と比較例との性能比較で明らかな
ように、本発明により、ｐＨを増殖に適した値にコント
ロールでき、さらに阻害成分のアンモニアを除去するこ
とにより、増殖量を大幅に向上することができた。

【図面の簡単な説明】

第１〜６図は本発明の一実施例の培養フローを示す図で
ある。 ｌ・・・培養槽、２・・・培養液、３・・・炭酸ガス透
過性膜管、４・・・ｐＨコントローラ、５・・・ｐＨ電
極、６・・・培養液抜出ポンプ、７・・・圧力コントロ
ーラ、８・・・圧力調節弁、９・・・空気、１０・・・
排気、１１・・・気体フィルタ、１２・・・アルカリ化
培養液返送ポンプ、　１３・・・培地移送ポンプ、１３
′　・・・培地移送ポンプ、１４・・・培地貯槽、１５
・・・培地、１６・・・細胞分離装置、１７・・・精密
濾過膜、１８・・・細胞返送用配管、１９・・・培養濾
液抜出ポンプ ２０・・・アンモニア除去装置。 ２１・・・脱炭酸空 メへ。 ２２・・・消泡層 ２３・・・アルカ ノ化培養濾液返送用 配管。 ２３′ ・・・アルカリ化・脱アンモニア培養濾液返送用配管

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、炭酸塩を含有する培養液、培養濾液、液体培地のい
   ずれか一種、もしくは二種以上を、二酸化炭素透過性を
   有する膜と接触させ、液圧を膜外の圧力に比して相対的
   に高めて膜外にＣＯ＿２ガスを排出することにより液の
   ｐＨを上昇させる第１工程と、第１工程で得られる処理
   液を培養槽に返送する第２工程とからなることを特徴と
   する生物細胞の培養方法。 ２、炭酸塩を含有する培養液を二酸化炭素透過性を有す
   る膜と接触させ、液圧を膜外の圧力に比して相対的に高
   めて膜外にＣＯ＿２ガスを排出することにより液のｐＨ
   を上昇させる第１工程と、第１工程で得られる処理液を
   二酸化炭素非含有気体で曝気処理してアンモニアを液中
   から除去する第２工程と、第２工程で得られる処理液を
   培養槽に返送する第３工程とからなることを特徴とする
   生物細胞の培養方法。 ３、培養液中のｐＨを制御の設定値以下の場合に、ｐＨ
   監視制御装置と液の処理系とを連動化させてｐＨを上昇
   させることを特徴とする生物細胞の培養方法。 ４、二酸化炭素透過性を有する膜がシリコンゴム、ポリ
   エチレン、酢酸セルロース、塩化ビニル、塩化ビニル−
   酢酸ビニル共重合体、可塑化フッソ樹脂、ポリスチレン
   、エチルセルロース、ポリイソブチレン、ブチルゴム又
   はポリビニルブチラールであることを特徴とする請求項
   １又は２記載の生物細胞の培養方法。 ５、培養槽から出て、培養、槽に戻る培養液のループ状
   配管の途中に、少なくとも炭酸ガス透過性膜、圧力調節
   弁を挿設してなることを特徴とする生物細胞培養装置。 ６、圧力調節弁を設定圧に調節する圧力コントローラと
   、培養槽内培養液中に浸漬せるｐＨセンサの信号により
   培養液抜出しポンプ及びアルカリ化培養液返送ポンプの
   両ポンプの作動を調節するｐＨコントローラを系内に装
   着したことを特徴とする請求項５記載の生物細胞の培養
   装置。 ７、培養槽と細胞分離装置との間に培養液移送ポンプ、
   細胞分離装置と炭酸ガス透過膜との間に、細胞除去培養
   液移送ポンプを挿設し、細胞分離装置から細胞を培養槽
   に返送する系路を有し、培養液移送ポンプ、細胞除去液
   移送ポンプ、細胞除去アルカリ化培養液移送ポンプの作
   動を調節するｐＨコントローラを系内に配してなること
   を特徴とする請求項５又は６記載の生物細胞の培養装置
   。